釀酒酵母：合成生物學(xué)新技術(shù)驅(qū)動(dòng)下的中心代謝流重編程與應(yīng)用拓展一、引言1.1研究背景與意義釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）作為一種重要的模式微生物，在工業(yè)領(lǐng)域有著極為廣泛的應(yīng)用。它與人類的關(guān)系源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，在食品釀造、生物燃料生產(chǎn)、藥物合成等諸多行業(yè)中都占據(jù)著不可或缺的地位。在食品釀造方面，其發(fā)酵工藝成熟，生物安全性高，是制作面包、饅頭等食品以及釀造白酒、葡萄酒、啤酒等酒類的關(guān)鍵微生物。例如在葡萄酒釀造中，釀酒酵母將葡萄汁中的糖類轉(zhuǎn)化為酒精和二氧化碳，賦予葡萄酒獨(dú)特的風(fēng)味和口感；在面包制作過程中，它產(chǎn)生的二氧化碳使面團(tuán)膨脹，形成松軟的質(zhì)地。在生物燃料領(lǐng)域，釀酒酵母能夠利用糖類發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，為緩解能源危機(jī)提供了一種可持續(xù)的生物能源解決方案，在燃料乙醇生產(chǎn)中，它高效的發(fā)酵能力可將大量的糖類原料轉(zhuǎn)化為乙醇，減少對(duì)傳統(tǒng)化石燃料的依賴。此外，在藥物合成方面，由于其具有真核生物的翻譯后修飾和細(xì)胞器系統(tǒng)，有利于酶的定位和表達(dá)，可用于生產(chǎn)一些藥用蛋白和天然產(chǎn)物，如利用釀酒酵母成功表達(dá)膜結(jié)合真核細(xì)胞色素P450基因cyp5150l8并產(chǎn)生抗腫瘤靈芝酸。然而，隨著科技的不斷進(jìn)步和工業(yè)需求的日益增長(zhǎng)，傳統(tǒng)的釀酒酵母在生產(chǎn)效率、產(chǎn)物種類和品質(zhì)等方面逐漸難以滿足實(shí)際需求。例如，在生物燃料生產(chǎn)中，釀酒酵母的生長(zhǎng)速度相對(duì)較慢，限制了乙醇的生產(chǎn)效率，且發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生大量二氧化碳排放，不利于可持續(xù)發(fā)展；在天然產(chǎn)物合成方面，其產(chǎn)量往往較低，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，如從植物中提取的一些萜類化合物，若利用釀酒酵母合成，產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求。合成生物學(xué)作為一門新興的交叉學(xué)科，融匯了生命科學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)、信息科學(xué)、材料科學(xué)和工程科學(xué)等多學(xué)科知識(shí)，為解決上述問題提供了新的契機(jī)。它通過“設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試-學(xué)習(xí)”這一循環(huán)，基于基因線路的設(shè)計(jì)原理，對(duì)生物系統(tǒng)進(jìn)行重新設(shè)計(jì)和改造，使細(xì)胞獲得新的能力以控制細(xì)胞行為，從而能夠按照人們的意愿設(shè)計(jì)和構(gòu)建具有特定功能的生物體系。在釀酒酵母的改造中，合成生物學(xué)技術(shù)可以精確地調(diào)控其基因表達(dá)、代謝途徑和生理功能。通過對(duì)釀酒酵母中心代謝流的重編程，能夠優(yōu)化其代謝網(wǎng)絡(luò)，使細(xì)胞的代謝通量更多地流向目標(biāo)產(chǎn)物的合成途徑，從而提高產(chǎn)物的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率。中心代謝流是細(xì)胞代謝的核心部分，包括糖酵解、三羧酸循環(huán)和磷酸戊糖途徑等，這些途徑相互關(guān)聯(lián)，為細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖和各種生理活動(dòng)提供能量、前體物質(zhì)和輔酶（如NADPH等）。對(duì)中心代謝流進(jìn)行重編程，就是改變這些代謝途徑中酶的活性、表達(dá)水平以及代謝物的流向，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞代謝的精確調(diào)控。例如，通過上調(diào)糖酵解途徑中關(guān)鍵酶的基因表達(dá)，可增強(qiáng)糖酵解代謝流，為細(xì)胞提供更多的能量和丙酮酸，而丙酮酸又可作為多種代謝途徑的前體物質(zhì)；通過調(diào)節(jié)三羧酸循環(huán)和磷酸戊糖途徑的代謝通量比例，可優(yōu)化細(xì)胞的能量供應(yīng)和還原力（NADPH）生成，以滿足不同產(chǎn)物合成的需求。本研究旨在深入探究釀酒酵母合成生物學(xué)新技術(shù)，并運(yùn)用這些技術(shù)對(duì)其中心代謝流進(jìn)行重編程，從而構(gòu)建出高效、穩(wěn)定的釀酒酵母細(xì)胞工廠。期望通過本研究，能夠在提高釀酒酵母現(xiàn)有產(chǎn)品生產(chǎn)效率的同時(shí)，拓展其可合成產(chǎn)物的種類，為其在工業(yè)領(lǐng)域的更廣泛應(yīng)用提供理論支持和技術(shù)基礎(chǔ)，推動(dòng)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，在生物燃料領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)更高效、低碳的乙醇生產(chǎn)，在天然產(chǎn)物合成領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)高附加值化合物的大量合成，滿足市場(chǎng)對(duì)這些產(chǎn)品的需求，促進(jìn)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在釀酒酵母合成生物學(xué)新技術(shù)方面，近年來取得了諸多顯著進(jìn)展?；蚓庉嫾夹g(shù)作為合成生物學(xué)的核心技術(shù)之一，在釀酒酵母研究中得到了廣泛應(yīng)用。CRISPR/Cas9系統(tǒng)憑借其操作簡(jiǎn)便、編輯效率高、成本低等優(yōu)勢(shì)，成為了釀酒酵母基因編輯的有力工具。研究者利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)釀酒酵母的基因進(jìn)行精準(zhǔn)敲除、插入和替換，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)其代謝途徑的改造。在構(gòu)建生產(chǎn)特定天然產(chǎn)物的釀酒酵母菌株時(shí)，通過CRISPR/Cas9敲除某些競(jìng)爭(zhēng)性代謝途徑的關(guān)鍵基因，可使細(xì)胞代謝流更多地流向目標(biāo)產(chǎn)物的合成途徑，有效提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。此外，CRISPR/Cas9技術(shù)還可用于調(diào)控釀酒酵母基因的表達(dá)水平，通過設(shè)計(jì)特定的sgRNA，引導(dǎo)Cas9蛋白結(jié)合到基因的啟動(dòng)子區(qū)域，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的激活或抑制，為精細(xì)調(diào)控釀酒酵母的生理功能提供了可能。除了CRISPR/Cas9系統(tǒng)，其他新興的基因編輯技術(shù)也在不斷發(fā)展。堿基編輯技術(shù)能夠在不引入雙鏈DNA斷裂的情況下實(shí)現(xiàn)單堿基的精準(zhǔn)替換，這對(duì)于釀酒酵母中一些關(guān)鍵基因的點(diǎn)突變改造具有重要意義。通過堿基編輯技術(shù)，可以改變釀酒酵母中某些酶的氨基酸序列，優(yōu)化其催化活性和特異性，進(jìn)而提高代謝途徑的效率。另一種是引導(dǎo)編輯技術(shù)，它可以實(shí)現(xiàn)更加靈活的DNA序列編輯，包括堿基的插入、缺失和替換等，為釀酒酵母基因編輯提供了更多的選擇。這些新興基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)，進(jìn)一步拓展了釀酒酵母合成生物學(xué)的研究范圍和深度，為構(gòu)建更加高效、精準(zhǔn)的釀酒酵母細(xì)胞工廠提供了技術(shù)支持。在元件工程方面，對(duì)釀酒酵母的啟動(dòng)子、終止子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)等遺傳元件的研究不斷深入。啟動(dòng)子作為基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵元件，其強(qiáng)度和特異性直接影響基因的表達(dá)水平和時(shí)空特異性。通過對(duì)釀酒酵母天然啟動(dòng)子的改造和優(yōu)化，以及設(shè)計(jì)合成全新的人工啟動(dòng)子，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的精確調(diào)控。通過對(duì)啟動(dòng)子序列中的順式作用元件進(jìn)行修飾，改變其與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力，從而調(diào)控基因的表達(dá)強(qiáng)度；還可以設(shè)計(jì)具有特定誘導(dǎo)條件的啟動(dòng)子，如溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子等，使基因在特定條件下表達(dá)，滿足不同的生產(chǎn)需求。此外，對(duì)終止子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)等元件的優(yōu)化也能夠提高基因表達(dá)的效率和穩(wěn)定性，這些元件工程的研究成果為構(gòu)建高效的釀酒酵母基因表達(dá)系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。代謝工程作為合成生物學(xué)的重要組成部分，在釀酒酵母的研究中也取得了豐碩成果。通過對(duì)釀酒酵母代謝途徑的分析和改造，實(shí)現(xiàn)了多種高附加值產(chǎn)物的合成。在萜類化合物的合成方面，研究人員通過在釀酒酵母中引入外源的萜類合成途徑關(guān)鍵基因，并對(duì)其內(nèi)源代謝途徑進(jìn)行優(yōu)化，成功實(shí)現(xiàn)了多種萜類化合物的高效合成。通過過表達(dá)甲羥戊酸途徑中的關(guān)鍵酶基因，增加前體物質(zhì)的供應(yīng)，同時(shí)敲除競(jìng)爭(zhēng)性代謝途徑的基因，減少前體物質(zhì)的分流，使得釀酒酵母能夠大量合成角鯊烯、β-胡蘿卜素等萜類化合物。在有機(jī)酸的合成方面，通過對(duì)釀酒酵母的三羧酸循環(huán)和糖酵解途徑進(jìn)行改造，優(yōu)化了有機(jī)酸的合成途徑，提高了有機(jī)酸的產(chǎn)量。通過敲除丙酮酸脫氫酶基因，阻斷丙酮酸向乙酰輔酶A的轉(zhuǎn)化，使丙酮酸更多地轉(zhuǎn)化為乳酸等有機(jī)酸；還可以通過過表達(dá)相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，促進(jìn)有機(jī)酸的分泌，提高細(xì)胞內(nèi)有機(jī)酸的積累量。這些代謝工程的研究成果不僅為釀酒酵母在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了更多的選擇，也為其他微生物的代謝改造提供了借鑒。在中心代謝流重編程研究方面，國內(nèi)外學(xué)者也開展了大量工作。研究人員通過多種手段對(duì)釀酒酵母的中心代謝流進(jìn)行調(diào)控，以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的高效合成。通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵酶的活性和表達(dá)水平來改變代謝流的分布是一種常用的方法。在糖酵解途徑中，通過過表達(dá)己糖激酶、磷酸果糖激酶等關(guān)鍵酶的基因，可增強(qiáng)糖酵解代謝流，為細(xì)胞提供更多的能量和丙酮酸；而在三羧酸循環(huán)中，通過下調(diào)某些關(guān)鍵酶的表達(dá)水平，可減少三羧酸循環(huán)的代謝通量，使更多的代謝物流向其他途徑。除了調(diào)節(jié)酶的活性和表達(dá)水平，還可以通過改變代謝途徑的分支點(diǎn)來調(diào)控代謝流。在磷酸戊糖途徑和糖酵解途徑的分支點(diǎn)處，通過調(diào)節(jié)相關(guān)酶的活性，可控制葡萄糖進(jìn)入不同的代謝途徑，以滿足細(xì)胞對(duì)能量、還原力和前體物質(zhì)的不同需求。此外，利用系統(tǒng)生物學(xué)和代謝組學(xué)等技術(shù)手段，對(duì)釀酒酵母的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行全面分析，也為中心代謝流重編程提供了重要的理論依據(jù)。通過系統(tǒng)生物學(xué)方法構(gòu)建釀酒酵母的代謝模型，模擬不同條件下代謝流的分布情況，預(yù)測(cè)基因敲除或過表達(dá)對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)的影響，從而為代謝工程改造提供指導(dǎo)。代謝組學(xué)則可以對(duì)釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)的代謝物進(jìn)行全面分析，揭示代謝物的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為發(fā)現(xiàn)潛在的代謝調(diào)控靶點(diǎn)提供線索。將這些技術(shù)手段與合成生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，能夠更加精準(zhǔn)地對(duì)釀酒酵母的中心代謝流進(jìn)行重編程，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞代謝的優(yōu)化和目標(biāo)產(chǎn)物的高效合成。盡管釀酒酵母合成生物學(xué)新技術(shù)及中心代謝流重編程的研究取得了上述諸多成果，但仍存在一些不足之處。目前的基因編輯技術(shù)雖然高效，但在某些情況下仍存在脫靶效應(yīng)等問題，可能會(huì)對(duì)釀酒酵母的基因組穩(wěn)定性和生理功能產(chǎn)生潛在影響。元件工程中，雖然對(duì)一些遺傳元件進(jìn)行了研究和優(yōu)化，但對(duì)于復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，還缺乏深入的理解和全面的調(diào)控手段。在中心代謝流重編程方面，雖然已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但對(duì)于代謝網(wǎng)絡(luò)中各途徑之間的相互作用和協(xié)同調(diào)控機(jī)制，還需要進(jìn)一步深入研究。此外，目前的研究大多集中在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，如何將這些研究成果高效地轉(zhuǎn)化為工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)，還面臨著諸多挑戰(zhàn)，如發(fā)酵過程的優(yōu)化、細(xì)胞穩(wěn)定性和耐受性的提高等。這些問題的存在為后續(xù)研究指明了方向，需要進(jìn)一步深入探究和解決。1.3研究?jī)?nèi)容與方法本研究聚焦于釀酒酵母合成生物學(xué)新技術(shù)的探索以及中心代謝流重編程的研究，旨在通過一系列實(shí)驗(yàn)與分析，實(shí)現(xiàn)釀酒酵母細(xì)胞工廠的高效構(gòu)建與性能優(yōu)化。在新技術(shù)研究方面，深入探究新型基因編輯技術(shù)在釀酒酵母中的應(yīng)用。運(yùn)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對(duì)釀酒酵母特定基因進(jìn)行精準(zhǔn)編輯，如敲除影響目標(biāo)產(chǎn)物合成的冗余基因、插入外源高效表達(dá)基因等，以優(yōu)化其遺傳背景。同時(shí)，探索堿基編輯技術(shù)和引導(dǎo)編輯技術(shù)在釀酒酵母基因修飾中的可行性，通過單堿基替換或更靈活的DNA序列編輯，實(shí)現(xiàn)對(duì)關(guān)鍵基因功能的精細(xì)調(diào)控，為后續(xù)代謝流重編程奠定堅(jiān)實(shí)的遺傳基礎(chǔ)。針對(duì)元件工程，系統(tǒng)研究釀酒酵母啟動(dòng)子、終止子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)等元件的功能與特性。通過對(duì)天然啟動(dòng)子的序列分析和改造，設(shè)計(jì)合成具有不同強(qiáng)度和誘導(dǎo)特性的人工啟動(dòng)子，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的精確時(shí)空調(diào)控。利用高通量實(shí)驗(yàn)技術(shù)，篩選和優(yōu)化終止子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)，提高基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的效率，構(gòu)建高效穩(wěn)定的基因表達(dá)系統(tǒng)，確保代謝途徑中關(guān)鍵基因的高效表達(dá)。在中心代謝流重編程研究中，首先運(yùn)用代謝通量分析技術(shù)，借助^{13}C標(biāo)記實(shí)驗(yàn)和代謝物定量檢測(cè)，精確測(cè)定釀酒酵母在不同培養(yǎng)條件下中心代謝途徑中各代謝物的流量分布，全面解析其代謝網(wǎng)絡(luò)。基于代謝通量分析結(jié)果，運(yùn)用基因工程手段對(duì)中心代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因進(jìn)行調(diào)控。過表達(dá)糖酵解途徑中限速酶基因，增強(qiáng)糖酵解代謝流，提高丙酮酸的生成速率；下調(diào)三羧酸循環(huán)中部分關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，減少三羧酸循環(huán)代謝通量，使更多代謝物流向目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑。此外，通過調(diào)節(jié)磷酸戊糖途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，優(yōu)化細(xì)胞內(nèi)還原力（NADPH）的供應(yīng)，滿足不同產(chǎn)物合成對(duì)還原力的需求。為了深入理解代謝調(diào)控機(jī)制，采用系統(tǒng)生物學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)。構(gòu)建釀酒酵母代謝模型，結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行模擬分析，預(yù)測(cè)基因改造和環(huán)境變化對(duì)代謝流分布的影響，為代謝工程改造提供理論指導(dǎo)。利用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)，對(duì)釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)代謝物進(jìn)行全面分析，通過差異分析和聚類分析，挖掘潛在的代謝調(diào)控靶點(diǎn)，揭示代謝物之間的相互作用和動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，進(jìn)一步優(yōu)化中心代謝流重編程策略。本研究綜合運(yùn)用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如PCR擴(kuò)增、基因克隆、質(zhì)粒構(gòu)建等，實(shí)現(xiàn)基因的編輯與表達(dá)調(diào)控；采用生物化學(xué)分析方法，測(cè)定酶活性、代謝物含量等；借助儀器分析技術(shù)，如液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）等對(duì)代謝物進(jìn)行定性和定量分析；運(yùn)用生物信息學(xué)工具，對(duì)基因序列、代謝網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)等進(jìn)行分析和處理，通過多學(xué)科交叉的研究方法，深入開展釀酒酵母合成生物學(xué)新技術(shù)及中心代謝流重編程的研究。二、釀酒酵母合成生物學(xué)新技術(shù)2.1基因編輯技術(shù)在釀酒酵母中的應(yīng)用2.1.1CRISPR-Cas系統(tǒng)CRISPR-Cas系統(tǒng)源自細(xì)菌和古細(xì)菌的適應(yīng)性免疫防御機(jī)制，能夠精準(zhǔn)識(shí)別并切割外源入侵的噬菌體或質(zhì)粒DNA序列。在這一系統(tǒng)中，CRISPR序列由一系列重復(fù)的DNA序列以及間隔序列組成，其中間隔序列來源于之前入侵的外源DNA，起著免疫記憶的作用；Cas蛋白則是一類核酸內(nèi)切酶，在CRISPR序列的引導(dǎo)下對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行定點(diǎn)切割。在釀酒酵母基因編輯中，CRISPR-Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用尤為廣泛。其工作原理如下：首先，根據(jù)目標(biāo)基因序列設(shè)計(jì)并合成向?qū)NA（gRNA），gRNA包含與目標(biāo)DNA互補(bǔ)的序列，能夠引導(dǎo)Cas9蛋白識(shí)別并結(jié)合到目標(biāo)基因位點(diǎn)。當(dāng)Cas9-gRNA復(fù)合物與目標(biāo)DNA結(jié)合后，Cas9蛋白的核酸內(nèi)切酶活性被激活，對(duì)目標(biāo)DNA雙鏈進(jìn)行切割，造成雙鏈斷裂（DSB）。細(xì)胞內(nèi)存在兩種主要的修復(fù)機(jī)制來應(yīng)對(duì)這種雙鏈斷裂：非同源末端連接（NHEJ）和同源重組（HR）。在非同源末端連接修復(fù)過程中，斷裂的DNA末端會(huì)直接連接在一起，這個(gè)過程容易引入堿基的插入或缺失突變，從而導(dǎo)致基因敲除；而在同源重組修復(fù)過程中，細(xì)胞會(huì)以提供的同源DNA序列為模板進(jìn)行修復(fù)，利用這一特性可以實(shí)現(xiàn)基因的插入或替換。例如，在一項(xiàng)關(guān)于釀酒酵母合成番茄紅素的研究中，研究人員利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除了釀酒酵母中編碼角鯊烯環(huán)氧酶（ERG1）的基因。角鯊烯環(huán)氧酶是麥角甾醇合成途徑中的關(guān)鍵酶，敲除該基因后，阻斷了麥角甾醇的合成代謝流，使更多的代謝前體流向番茄紅素的合成途徑。同時(shí)，研究人員還通過同源重組的方式將來自外源的番茄紅素合成相關(guān)基因（如crtE、crtB、crtI）整合到釀酒酵母基因組中，成功構(gòu)建出能夠高效合成番茄紅素的釀酒酵母工程菌株。與野生型釀酒酵母相比，該工程菌株的番茄紅素產(chǎn)量顯著提高，證明了CRISPR-Cas9系統(tǒng)在釀酒酵母基因編輯和代謝途徑改造中的有效性和高效性。CRISPR-Cas系統(tǒng)在釀酒酵母基因編輯中具有諸多優(yōu)勢(shì)。其操作相對(duì)簡(jiǎn)便，只需設(shè)計(jì)特定的gRNA即可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的精準(zhǔn)編輯，無需像傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)那樣構(gòu)建復(fù)雜的重組載體。編輯效率高，能夠快速獲得大量基因編輯的釀酒酵母菌株，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期?？蓪?shí)現(xiàn)多基因編輯，通過同時(shí)設(shè)計(jì)多個(gè)gRNA，可以對(duì)釀酒酵母基因組中的多個(gè)基因進(jìn)行同步編輯，為復(fù)雜代謝途徑的改造提供了有力工具。2.1.2其他基因編輯工具除了CRISPR-Cas系統(tǒng)，鋅指核酸酶（ZFNs）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALENs）也是較早應(yīng)用于釀酒酵母基因編輯的工具。ZFNs由鋅指蛋白（ZFP）結(jié)構(gòu)域和核酸酶結(jié)構(gòu)域組成。其中，鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域能夠特異性識(shí)別并結(jié)合特定的DNA序列，每個(gè)鋅指蛋白可以識(shí)別3個(gè)堿基對(duì)，通過串聯(lián)多個(gè)鋅指蛋白模塊，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)較長(zhǎng)DNA序列的特異性識(shí)別；核酸酶結(jié)構(gòu)域則通常采用FokI核酸酶，當(dāng)兩個(gè)ZFNs分別結(jié)合到目標(biāo)DNA序列的上下游時(shí)，F(xiàn)okI核酸酶形成二聚體并切割DNA雙鏈，從而實(shí)現(xiàn)基因編輯。在釀酒酵母中，ZFNs曾被用于敲除某些特定基因以研究其功能，通過精心設(shè)計(jì)鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，使其特異性結(jié)合到目標(biāo)基因序列，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)釀酒酵母基因的敲除，為深入了解釀酒酵母的基因功能提供了重要手段。TALENs的原理與ZFNs類似，由轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物（TALE）結(jié)構(gòu)域和核酸酶結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。TALE結(jié)構(gòu)域中的重復(fù)單元能夠特異性識(shí)別DNA堿基，每個(gè)重復(fù)單元識(shí)別一個(gè)堿基對(duì)，通過組裝不同的重復(fù)單元，可以精確識(shí)別目標(biāo)DNA序列。同樣，當(dāng)兩個(gè)TALENs結(jié)合到目標(biāo)DNA的特定位置后，核酸酶結(jié)構(gòu)域切割DNA雙鏈，引發(fā)細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制，實(shí)現(xiàn)基因的敲除、插入或替換。在釀酒酵母基因編輯中，TALENs也發(fā)揮了一定作用，在構(gòu)建釀酒酵母的營養(yǎng)缺陷型菌株時(shí)，利用TALENs技術(shù)敲除了相關(guān)營養(yǎng)物質(zhì)合成基因，為后續(xù)的基因工程操作和發(fā)酵工藝優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。然而，與CRISPR-Cas系統(tǒng)相比，ZFNs和TALENs存在一些局限性。它們的設(shè)計(jì)和構(gòu)建過程較為復(fù)雜，需要對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和DNA序列進(jìn)行精細(xì)的分析和組裝，耗時(shí)費(fèi)力。在特異性方面，雖然它們能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的特異性識(shí)別，但仍存在一定的脫靶風(fēng)險(xiǎn)，且脫靶效應(yīng)的檢測(cè)和評(píng)估相對(duì)困難。此外，ZFNs和TALENs的成本較高，大規(guī)模應(yīng)用受到一定限制。而CRISPR-Cas系統(tǒng)憑借其操作簡(jiǎn)便、成本低、編輯效率高和特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，逐漸成為釀酒酵母基因編輯的主流技術(shù)，盡管CRISPR-Cas系統(tǒng)也存在脫靶效應(yīng)等問題，但隨著研究的不斷深入，一系列優(yōu)化策略的提出，如優(yōu)化gRNA設(shè)計(jì)、開發(fā)高保真的Cas蛋白變體等，在一定程度上降低了脫靶風(fēng)險(xiǎn)，使其在釀酒酵母基因編輯中的應(yīng)用更加安全和可靠。2.2途徑工程技術(shù)2.2.1構(gòu)建新的代謝途徑在釀酒酵母中構(gòu)建非天然代謝途徑是合成生物學(xué)的重要研究方向之一，這一過程旨在賦予釀酒酵母合成特定化合物的能力，拓展其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用范圍。構(gòu)建新代謝途徑的方法和策略涉及多個(gè)關(guān)鍵步驟，從基因元件的選擇與獲取到代謝途徑的整體設(shè)計(jì)與優(yōu)化，每一步都需要精細(xì)的規(guī)劃和嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。首先，確定目標(biāo)化合物及其合成途徑是構(gòu)建新代謝途徑的基礎(chǔ)。研究人員需要深入了解目標(biāo)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物合成機(jī)制，通過查閱文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫，篩選出合適的合成途徑。若目標(biāo)是合成青蒿素前體——青蒿酸，已知青蒿酸可通過甲羥戊酸途徑合成，該途徑涉及多個(gè)關(guān)鍵酶，如3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMG-CoA還原酶）、甲羥戊酸激酶（MVK）、異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶（IDI）等。這些酶的基因序列和功能特性是后續(xù)構(gòu)建代謝途徑的關(guān)鍵信息。獲取外源基因是構(gòu)建新代謝途徑的關(guān)鍵步驟之一。對(duì)于在釀酒酵母中原本不存在的合成途徑，需要從其他生物中克隆相關(guān)基因?？赏ㄟ^PCR技術(shù)從含有目標(biāo)基因的生物基因組中擴(kuò)增出目的基因片段。若要引入來自青蒿的青蒿酸合成相關(guān)基因，需設(shè)計(jì)特異性引物，以青蒿基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增出如紫穗槐-4,11-二烯合酶（ADS）基因等。在克隆過程中，需注意基因的密碼子優(yōu)化，使其符合釀酒酵母的密碼子偏好性，以提高基因在釀酒酵母中的表達(dá)效率。將外源基因?qū)脶劸平湍覆?shí)現(xiàn)高效表達(dá)是構(gòu)建新代謝途徑的核心環(huán)節(jié)。通常需要構(gòu)建合適的表達(dá)載體，將目標(biāo)基因與啟動(dòng)子、終止子、篩選標(biāo)記等元件組裝在一起。選擇強(qiáng)啟動(dòng)子，如釀酒酵母的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）啟動(dòng)子，可驅(qū)動(dòng)基因的高水平表達(dá)；選擇合適的終止子，確?；蜣D(zhuǎn)錄的準(zhǔn)確終止。將構(gòu)建好的表達(dá)載體通過轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入釀酒酵母細(xì)胞，利用篩選標(biāo)記篩選出成功轉(zhuǎn)化的菌株。以合成β-胡蘿卜素的釀酒酵母工程菌株構(gòu)建為例，研究人員首先從歐文氏菌（Erwiniauredovora）中克隆了八氫番茄紅素合成酶（crtB）、八氫番茄紅素脫氫酶（crtI）和番茄紅素β-環(huán)化酶（crtY）基因。將這些基因分別與釀酒酵母的GAPDH啟動(dòng)子和ADH1終止子連接，構(gòu)建成表達(dá)載體。通過電轉(zhuǎn)化法將表達(dá)載體導(dǎo)入釀酒酵母細(xì)胞，篩選得到重組菌株。在該重組菌株中，crtB基因編碼的酶催化兩分子的牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP）合成八氫番茄紅素，crtI基因編碼的酶將八氫番茄紅素逐步脫氫轉(zhuǎn)化為番茄紅素，crtY基因編碼的酶將番茄紅素環(huán)化形成β-胡蘿卜素。通過優(yōu)化基因表達(dá)水平和代謝途徑的調(diào)控，該工程菌株能夠高效合成β-胡蘿卜素，產(chǎn)量達(dá)到了較高水平。在構(gòu)建新代謝途徑的過程中，還需要考慮代謝途徑的平衡和調(diào)控。新引入的代謝途徑可能會(huì)與釀酒酵母的內(nèi)源代謝途徑競(jìng)爭(zhēng)底物、能量和輔酶等資源，因此需要對(duì)代謝途徑進(jìn)行合理的調(diào)控，以確保細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和目標(biāo)產(chǎn)物的高效合成。通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平，優(yōu)化代謝途徑的通量分配；還可以通過引入反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，避免代謝產(chǎn)物的過度積累對(duì)細(xì)胞造成毒性。2.2.2優(yōu)化現(xiàn)有代謝途徑優(yōu)化釀酒酵母現(xiàn)有代謝途徑是提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的關(guān)鍵策略，通過調(diào)整基因表達(dá)、酶工程等手段，能夠使代謝流更加合理地分配，增強(qiáng)目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑的代謝通量，減少不必要的代謝分支，從而提升產(chǎn)物的合成效率和產(chǎn)量。調(diào)整基因表達(dá)是優(yōu)化現(xiàn)有代謝途徑的重要手段之一。通過改變基因的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等調(diào)控元件，可以調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平。在釀酒酵母的乙醇發(fā)酵過程中，乙醇脫氫酶（ADH）基因的表達(dá)水平對(duì)乙醇產(chǎn)量有著重要影響。研究人員通過將ADH基因的天然啟動(dòng)子替換為強(qiáng)啟動(dòng)子，如磷酸甘油酸激酶（PGK）啟動(dòng)子，使ADH基因的表達(dá)量顯著提高，從而增強(qiáng)了乙醇合成途徑的代謝通量，乙醇產(chǎn)量得到明顯提升。此外，利用轉(zhuǎn)錄因子工程技術(shù)，設(shè)計(jì)和改造轉(zhuǎn)錄因子，使其能夠特異性地調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)，也是一種有效的策略。通過改造釀酒酵母中的轉(zhuǎn)錄因子，使其能夠激活參與丁醇合成途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)，成功提高了丁醇的產(chǎn)量。酶工程技術(shù)在優(yōu)化現(xiàn)有代謝途徑中也發(fā)揮著重要作用。通過對(duì)酶的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行改造，可以提高酶的催化活性、底物特異性和穩(wěn)定性。定向進(jìn)化是一種常用的酶工程方法，通過易錯(cuò)PCR、DNA改組等技術(shù)，對(duì)酶基因進(jìn)行隨機(jī)突變，然后在特定的篩選條件下，篩選出具有優(yōu)良性能的酶突變體。在釀酒酵母合成脂肪酸的研究中，利用定向進(jìn)化技術(shù)對(duì)脂肪酸合成酶（FAS）進(jìn)行改造，獲得了催化活性更高的FAS突變體，使得脂肪酸的合成量顯著增加。此外，理性設(shè)計(jì)也是一種重要的酶工程手段，通過對(duì)酶的三維結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制的深入了解，有針對(duì)性地對(duì)酶的氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變，優(yōu)化酶的性能。根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)信息，對(duì)參與萜類化合物合成途徑的關(guān)鍵酶進(jìn)行定點(diǎn)突變，改變其底物結(jié)合口袋的形狀和氨基酸組成，提高了酶對(duì)底物的親和力和催化效率，從而促進(jìn)了萜類化合物的合成。除了調(diào)整基因表達(dá)和酶工程外，還可以通過阻斷旁路代謝途徑來優(yōu)化現(xiàn)有代謝途徑。釀酒酵母的代謝網(wǎng)絡(luò)中存在一些旁路代謝途徑，這些途徑會(huì)消耗目標(biāo)產(chǎn)物的前體物質(zhì)或能量，降低目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。通過基因敲除技術(shù)，阻斷這些旁路代謝途徑，可以使更多的代謝物流向目標(biāo)產(chǎn)物的合成途徑。在釀酒酵母合成異戊二烯的過程中，甲羥戊酸途徑是異戊二烯合成的主要途徑，但同時(shí)存在一些旁路代謝途徑會(huì)消耗甲羥戊酸。研究人員通過敲除參與旁路代謝途徑的關(guān)鍵基因，如角鯊烯環(huán)氧酶（ERG1）基因，阻斷了甲羥戊酸向麥角甾醇合成途徑的分流，使更多的甲羥戊酸流向異戊二烯合成途徑，從而提高了異戊二烯的產(chǎn)量。優(yōu)化現(xiàn)有代謝途徑還需要考慮代謝途徑之間的協(xié)同調(diào)控。釀酒酵母的代謝網(wǎng)絡(luò)是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，各個(gè)代謝途徑之間相互關(guān)聯(lián)、相互影響。在優(yōu)化某一代謝途徑時(shí)，需要綜合考慮其他代謝途徑的變化，以確保整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)的平衡和穩(wěn)定。在提高釀酒酵母中有機(jī)酸產(chǎn)量的研究中，不僅要優(yōu)化有機(jī)酸合成途徑，還要考慮糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)等相關(guān)代謝途徑的協(xié)同調(diào)控。通過調(diào)整這些代謝途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)水平和活性，使代謝流在各個(gè)途徑之間合理分配，實(shí)現(xiàn)了有機(jī)酸產(chǎn)量的大幅提高。2.3基因組規(guī)模工程技術(shù)2.3.1全基因組重編程全基因組重編程是一種對(duì)生物體整個(gè)基因組進(jìn)行重新設(shè)計(jì)與改造的技術(shù)，它突破了傳統(tǒng)基因編輯僅針對(duì)個(gè)別基因的局限性，能夠從全局層面改變生物的遺傳信息，賦予生物體全新的代謝特性和功能。這一技術(shù)通常涉及對(duì)基因組中大量基因的刪除、插入、替換以及調(diào)控元件的重新設(shè)計(jì)等操作，通過這些操作，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物代謝網(wǎng)絡(luò)、生理特性等方面的全面優(yōu)化。在釀酒酵母中，全基因組重編程展現(xiàn)出了巨大的潛力。通過對(duì)釀酒酵母全基因組進(jìn)行重編程，可以顯著改變其代謝特性，使其能夠適應(yīng)不同的工業(yè)生產(chǎn)需求。在構(gòu)建耐受高濃度乙醇的釀酒酵母菌株時(shí)，研究人員利用全基因組重編程技術(shù)，對(duì)釀酒酵母基因組中的多個(gè)基因進(jìn)行了改造。通過敲除某些與乙醇敏感性相關(guān)的基因，同時(shí)上調(diào)一些參與乙醇代謝和細(xì)胞膜穩(wěn)定性維持的基因表達(dá)，成功獲得了能夠在高濃度乙醇環(huán)境下正常生長(zhǎng)和發(fā)酵的釀酒酵母工程菌株。這種菌株在生物燃料生產(chǎn)中具有重要應(yīng)用價(jià)值，能夠提高乙醇發(fā)酵的效率和產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。全基因組重編程還可以賦予釀酒酵母新的功能。在合成生物學(xué)領(lǐng)域，研究人員嘗試通過全基因組重編程，將釀酒酵母改造成能夠合成特定高附加值化合物的細(xì)胞工廠。通過在釀酒酵母基因組中引入外源的合成途徑基因，并對(duì)其內(nèi)源代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行重編程，實(shí)現(xiàn)了多種天然產(chǎn)物和生物活性物質(zhì)的合成。在合成黃酮類化合物的研究中，研究人員將來自植物的黃酮合成相關(guān)基因?qū)脶劸平湍富蚪M，并對(duì)其中心代謝流進(jìn)行重編程，使釀酒酵母能夠利用簡(jiǎn)單的碳源合成黃酮類化合物。這種通過全基因組重編程賦予釀酒酵母新功能的方法，為高附加值化合物的生產(chǎn)提供了新的途徑，具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，全基因組重編程技術(shù)在釀酒酵母中的應(yīng)用仍面臨一些挑戰(zhàn)。釀酒酵母基因組的復(fù)雜性使得重編程的設(shè)計(jì)和操作難度較大，需要對(duì)其基因功能和代謝網(wǎng)絡(luò)有深入的了解。重編程過程中可能會(huì)引入一些未知的遺傳變化，對(duì)釀酒酵母的生長(zhǎng)、代謝和穩(wěn)定性產(chǎn)生潛在影響，需要進(jìn)行全面的評(píng)估和監(jiān)測(cè)。此外，全基因組重編程技術(shù)的成本較高，技術(shù)難度較大，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。未來，隨著基因組測(cè)序技術(shù)、基因編輯技術(shù)和生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，全基因組重編程技術(shù)有望在釀酒酵母研究中取得更大的突破，為釀酒酵母細(xì)胞工廠的構(gòu)建和工業(yè)應(yīng)用提供更強(qiáng)大的技術(shù)支持。2.3.2基于合成基因組的釀酒酵母構(gòu)建人工合成釀酒酵母基因組是合成生物學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)重大研究成果，其研究歷程充滿了挑戰(zhàn)與突破。2011年，美國、中國、英國、新加坡、澳大利亞等國共同啟動(dòng)了“人工合成酵母基因組計(jì)劃（Sc2.0Project）”，旨在從頭設(shè)計(jì)并合成釀酒酵母的全部16條染色體。該計(jì)劃是人類首次嘗試對(duì)真核生物的基因組進(jìn)行從頭合成，標(biāo)志著合成生物學(xué)進(jìn)入了一個(gè)新的階段。在這一計(jì)劃中，研究人員取得了一系列重要進(jìn)展。2014年，紐約大學(xué)JefD.Boeke教授領(lǐng)銜的研究團(tuán)隊(duì)成功創(chuàng)建出第一條人工酵母染色體——酵母最小的3號(hào)染色體。這一成果證明了人工合成酵母染色體的可行性，為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。2017年，Sc2.0計(jì)劃取得了重大突破，酵母基因組中的三分之一完成了設(shè)計(jì)合成，《科學(xué)》雜志以特刊形式對(duì)這一成果進(jìn)行了報(bào)道。中國科學(xué)家在此次計(jì)劃中發(fā)揮了重要作用，天津大學(xué)元英進(jìn)教授領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)成功實(shí)現(xiàn)了酵母5號(hào)和10號(hào)染色體的化學(xué)合成；當(dāng)時(shí)任職于清華大學(xué)的戴俊彪研究員帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)合成了12號(hào)染色體，并開發(fā)了長(zhǎng)染色體分級(jí)組裝的策略；中國科學(xué)院院士楊煥明院士與當(dāng)時(shí)任職于愛丁堡大學(xué)的蔡毅之博士合作領(lǐng)導(dǎo)的項(xiàng)目完成了2號(hào)染色體的從頭設(shè)計(jì)與全合成；JefD.Boeke教授與同事們則完成了6號(hào)染色體的合成。經(jīng)過多年的努力，2023年11月8日，Sc2.0項(xiàng)目的最新研究成果在Cell及其子刊發(fā)布，標(biāo)志著世界首個(gè)真核生物全部染色體的從頭設(shè)計(jì)與合成正式完成。此次成果中，科學(xué)家們不僅合成了釀酒酵母的全部16條染色體，還創(chuàng)造出了16種部分合成的酵母菌株，每種細(xì)胞內(nèi)包含15條天然染色體和1條合成染色體。通過進(jìn)一步的雜交和染色體置換等技術(shù)，研究人員成功將多條合成染色體整合到同一個(gè)酵母細(xì)胞中，得到了含有7.5條合成染色體的酵母菌株，其合成DNA占比超過50%，且該菌株具有和天然酵母菌株相似的生存和復(fù)制能力。人工合成釀酒酵母基因組對(duì)釀酒酵母的改造具有重要作用和廣闊前景。從基礎(chǔ)研究角度來看，合成基因組為深入研究釀酒酵母的基因功能和調(diào)控機(jī)制提供了全新的工具。通過對(duì)合成基因組的設(shè)計(jì)和改造，可以精確地研究基因之間的相互作用、基因表達(dá)的調(diào)控方式以及染色體結(jié)構(gòu)對(duì)基因功能的影響等，有助于揭示真核生物基因組的奧秘。在工業(yè)應(yīng)用方面，基于合成基因組的釀酒酵母有望展現(xiàn)出更優(yōu)異的性能。通過去除基因組中的冗余序列、優(yōu)化基因表達(dá)調(diào)控元件以及引入新的代謝途徑等，可以構(gòu)建出具有更高發(fā)酵效率、更強(qiáng)環(huán)境適應(yīng)性和更豐富產(chǎn)物合成能力的釀酒酵母工程菌株。這些菌株可應(yīng)用于生物燃料、食品釀造、藥物合成等多個(gè)領(lǐng)域，提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，推動(dòng)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。例如，在生物燃料生產(chǎn)中，合成基因組的釀酒酵母可能具有更高的乙醇發(fā)酵效率和耐受性，能夠在更惡劣的條件下進(jìn)行發(fā)酵，從而提高生物燃料的產(chǎn)量和質(zhì)量；在藥物合成領(lǐng)域，可通過合成基因組技術(shù)構(gòu)建能夠高效合成特定藥物或藥物前體的釀酒酵母菌株，為新藥研發(fā)和生產(chǎn)提供新的途徑。三、釀酒酵母中心代謝流重編程3.1中心代謝途徑概述3.1.1糖酵解途徑糖酵解途徑是葡萄糖在細(xì)胞內(nèi)分解為丙酮酸的過程，這一過程在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行，無需氧氣參與，是釀酒酵母等生物獲取能量和代謝前體的重要途徑。其過程可分為兩個(gè)階段：準(zhǔn)備階段和放能階段。在準(zhǔn)備階段，葡萄糖首先在己糖激酶的催化下，消耗1分子ATP，磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸，該反應(yīng)需要Mg^{2+}的參與，己糖激酶對(duì)葡萄糖具有高度特異性，可確保葡萄糖被準(zhǔn)確地?cái)z入細(xì)胞代謝途徑；隨后，葡萄糖-6-磷酸在葡萄糖磷酸異構(gòu)酶的作用下，異構(gòu)化為果糖-6-磷酸，此異構(gòu)化反應(yīng)為后續(xù)的磷酸化反應(yīng)創(chuàng)造了更有利的條件；果糖-6-磷酸在磷酸果糖激酶-1（PFK-1）的催化下，再次消耗1分子ATP，磷酸化生成果糖-1,6-二磷酸，PFK-1是糖酵解途徑的關(guān)鍵限速酶，其活性受到多種因素的調(diào)控，如ATP、ADP、檸檬酸等，ATP作為反饋抑制劑，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ATP含量較高時(shí)，會(huì)抑制PFK-1的活性，從而減緩糖酵解的速率，以避免能量的過度消耗；果糖-1,6-二磷酸在醛縮酶的作用下，裂解為3-磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮，這兩種物質(zhì)可以在丙糖磷酸異構(gòu)酶的催化下相互轉(zhuǎn)化，最終都進(jìn)入后續(xù)的代謝步驟。在放能階段，3-磷酸甘油醛在3-磷酸甘油醛脫氫酶的催化下，發(fā)生氧化脫氫反應(yīng)，生成1,3-二磷酸甘油酸，同時(shí)將2個(gè)電子和1個(gè)質(zhì)子傳遞給NAD^{+}，生成NADH+H^{+}，這一步反應(yīng)不僅產(chǎn)生了還原力，還將能量轉(zhuǎn)移到高能磷酸鍵中；1,3-二磷酸甘油酸在磷酸甘油酸激酶的作用下，將高能磷酸鍵轉(zhuǎn)移給ADP，生成1分子ATP和3-磷酸甘油酸，這是糖酵解途徑中第一次底物水平磷酸化反應(yīng)；3-磷酸甘油酸在磷酸甘油酸變位酶的催化下，重排生成2-磷酸甘油酸；2-磷酸甘油酸在烯醇化酶的作用下，脫水生成磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），PEP具有很高的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移勢(shì)能；最后，PEP在丙酮酸激酶的催化下，將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移給ADP，生成ATP和丙酮酸，這是糖酵解途徑中的第二次底物水平磷酸化反應(yīng)。在釀酒酵母代謝中，糖酵解途徑占據(jù)著重要地位。它為細(xì)胞提供了快速的能量來源，在有氧或無氧條件下都能進(jìn)行。在無氧發(fā)酵條件下，如釀酒過程中，糖酵解途徑是產(chǎn)生能量的主要方式，丙酮酸進(jìn)一步被還原為乙醇和二氧化碳，乙醇是釀酒的主要產(chǎn)物，而二氧化碳則賦予酒類獨(dú)特的氣泡和口感；在有氧呼吸條件下，糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸進(jìn)入線粒體，參與三羧酸循環(huán)，進(jìn)一步氧化釋放能量，為細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖和代謝活動(dòng)提供充足的能量。此外，糖酵解途徑還為其他代謝途徑提供了重要的中間代謝物，如磷酸二羥丙酮可用于合成甘油，3-磷酸甘油醛可用于合成氨基酸等，這些中間代謝物在釀酒酵母的物質(zhì)合成和代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。3.1.2三羧酸循環(huán)三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)），又稱檸檬酸循環(huán)或克雷布斯循環(huán)，是需氧生物體內(nèi)普遍存在的一種代謝途徑，主要發(fā)生在線粒體內(nèi)。這一循環(huán)由一系列酶促反應(yīng)組成，在真核生物的線粒體基質(zhì)中進(jìn)行，而在原核生物中則位于細(xì)胞質(zhì)中。整個(gè)循環(huán)涉及多個(gè)關(guān)鍵酶和中間代謝物，其中檸檬酸、異檸檬酸、α-酮戊二酸等三羧酸化合物是主要的中間產(chǎn)物。其反應(yīng)步驟如下：在三羧酸循環(huán)之前，葡萄糖等有機(jī)物通過糖酵解、脂肪酸氧化或氨基酸代謝分解為乙酰輔酶A，這是三羧酸循環(huán)的起點(diǎn)。以糖酵解為例，丙酮酸通過丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的催化，脫去一個(gè)二氧化碳分子并與輔酶A結(jié)合，生成乙酰輔酶A。隨后，乙酰輔酶A與草酰乙酸結(jié)合，在檸檬酸合成酶的催化下生成檸檬酸，這一步反應(yīng)是三羧酸循環(huán)的起始步驟，檸檬酸合成酶對(duì)乙酰輔酶A和草酰乙酸具有高度特異性，確保了循環(huán)的準(zhǔn)確啟動(dòng)；檸檬酸經(jīng)過檸檬酸異構(gòu)酶催化，轉(zhuǎn)變?yōu)楫悪幟仕幔悩?gòu)化后的異檸檬酸更易于進(jìn)行后續(xù)的氧化反應(yīng)；異檸檬酸首先經(jīng)過脫氫反應(yīng)，生成α-酮戊二酸，并釋放出一個(gè)NADH和一個(gè)二氧化碳，這個(gè)反應(yīng)由異檸檬酸脫氫酶催化，異檸檬酸脫氫酶是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵限速酶之一，其活性受到細(xì)胞內(nèi)NAD^{+}和NADP^{+}水平的調(diào)控，當(dāng)細(xì)胞需要更多能量時(shí)，NAD^{+}濃度升高，會(huì)激活異檸檬酸脫氫酶的活性，從而加速三羧酸循環(huán)的進(jìn)行；α-酮戊二酸再經(jīng)過脫羧反應(yīng)，生成琥珀酰輔酶A，同時(shí)釋放出一個(gè)二氧化碳，并產(chǎn)生一個(gè)NADH，這個(gè)反應(yīng)由α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體催化，α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體的活性也受到多種因素的調(diào)節(jié)，包括底物濃度、產(chǎn)物抑制等；琥珀酰輔酶A經(jīng)過一系列反應(yīng)生成琥珀酸，同時(shí)生成一個(gè)GTP或ATP（取決于細(xì)胞類型），這個(gè)步驟由琥珀酰輔酶A合成酶催化，此反應(yīng)是三羧酸循環(huán)中唯一的一次底物水平磷酸化反應(yīng)，直接產(chǎn)生了高能磷酸化合物；琥珀酸通過脫氫反應(yīng)轉(zhuǎn)化為富馬酸，在此過程中生成FADH_{2}（用于電子傳遞鏈），該反應(yīng)由琥珀酸脫氫酶催化，琥珀酸脫氫酶是一種結(jié)合在線粒體內(nèi)膜上的酶，其催化的反應(yīng)是三羧酸循環(huán)中唯一與電子傳遞鏈直接相關(guān)的步驟；富馬酸與水反應(yīng)，生成蘋果酸，此反應(yīng)由富馬酸水合酶催化，水合反應(yīng)為后續(xù)的氧化反應(yīng)提供了合適的底物；最后，蘋果酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸，并生成NADH，該反應(yīng)由蘋果酸脫氫酶催化，生成的草酰乙酸又可以與新的乙酰輔酶A結(jié)合，重新啟動(dòng)循環(huán)。三羧酸循環(huán)與其他代謝途徑有著緊密的關(guān)聯(lián)。它與糖酵解途徑相連，糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸在細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A后，進(jìn)入線粒體參與三羧酸循環(huán)，實(shí)現(xiàn)了糖類物質(zhì)的徹底氧化分解；與脂肪酸氧化也密切相關(guān)，脂肪酸在細(xì)胞質(zhì)中經(jīng)過β-氧化生成乙酰輔酶A，隨后進(jìn)入三羧酸循環(huán)進(jìn)行進(jìn)一步的代謝；在氨基酸代謝方面，某些氨基酸（如谷氨酸、天冬氨酸）在代謝過程中會(huì)轉(zhuǎn)化為三羧酸循環(huán)的中間代謝物，參與循環(huán)代謝，同時(shí)三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物也可用于合成非必需氨基酸。三羧酸循環(huán)在釀酒酵母的代謝網(wǎng)絡(luò)中起著核心樞紐的作用，它不僅為細(xì)胞提供了大量的能量，通過氧化磷酸化過程，產(chǎn)生的NADH和FADH_{2}進(jìn)入電子傳遞鏈，最終生成大量ATP，滿足細(xì)胞的能量需求；還為其他代謝途徑提供了豐富的中間代謝物，參與細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)合成和代謝調(diào)節(jié)，維持細(xì)胞的正常生理功能。3.1.3磷酸戊糖途徑磷酸戊糖途徑是一種在生物體內(nèi)進(jìn)行的糖類代謝途徑，主要在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行。它具有獨(dú)特的特點(diǎn)，不僅能產(chǎn)生葡萄糖-6-磷酸，還能產(chǎn)生果糖-6-磷酸和核酮糖-5-磷酸等多種代謝物，這些代謝物是許多生物合成反應(yīng)的重要前體。其關(guān)鍵酶主要有6-磷酸葡萄糖脫氫酶，該酶催化6-磷酸葡萄糖脫氫生成6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯，同時(shí)將NADP^{+}還原為NADPH，這是磷酸戊糖途徑的限速步驟，6-磷酸葡萄糖脫氫酶的活性受到NADPH和NADP^{+}濃度的調(diào)節(jié)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)NADPH含量較高時(shí)，會(huì)反饋抑制該酶的活性，減少NADPH的生成；6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶則催化6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯水解并進(jìn)一步脫氫脫羧，生成核酮糖-5-磷酸和CO_{2}，同時(shí)產(chǎn)生NADPH。磷酸戊糖途徑在提供還原力和中間代謝物方面發(fā)揮著重要作用。在還原力供應(yīng)方面，該途徑通過生成大量的NADPH，為細(xì)胞內(nèi)的多種還原反應(yīng)提供了充足的還原力。在脂肪酸合成過程中，需要大量的NADPH作為還原劑，將乙酰輔酶A逐步轉(zhuǎn)化為脂肪酸，磷酸戊糖途徑產(chǎn)生的NADPH為脂肪酸合成提供了關(guān)鍵的物質(zhì)基礎(chǔ)；在膽固醇合成等生物合成過程中，NADPH也起著不可或缺的作用，參與各種還原步驟，促進(jìn)生物大分子的合成。在中間代謝物供應(yīng)方面，磷酸戊糖途徑產(chǎn)生的5-磷酸核糖是核苷酸和核酸生物合成的重要原料。細(xì)胞在進(jìn)行DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄等過程中，需要大量的核苷酸，而5-磷酸核糖作為核苷酸的組成部分，為這些遺傳信息傳遞和表達(dá)過程提供了必要的物質(zhì)保障。此外，磷酸戊糖途徑與糖酵解、三羧酸循環(huán)等其他代謝途徑有著密切的聯(lián)系。磷酸戊糖途徑產(chǎn)生的果糖-6-磷酸和3-磷酸甘油醛可以進(jìn)入糖酵解途徑，參與能量代謝和物質(zhì)合成；糖酵解產(chǎn)生的葡萄糖-6-磷酸也可進(jìn)入磷酸戊糖途徑，根據(jù)細(xì)胞的需求，調(diào)節(jié)代謝通量的分配，共同維持細(xì)胞內(nèi)代謝的平衡和穩(wěn)定。3.2中心代謝流重編程的策略3.2.1基因調(diào)控策略基因調(diào)控策略在釀酒酵母中心代謝流重編程中起著關(guān)鍵作用，通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)能夠改變代謝流的分配，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑的優(yōu)化。在釀酒酵母的中心代謝途徑中，關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平直接影響著代謝流的走向和強(qiáng)度。在糖酵解途徑中，己糖激酶（HK）基因和磷酸果糖激酶-1（PFK-1）基因的表達(dá)量對(duì)糖酵解代謝流的速率有著決定性作用。HK催化葡萄糖磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸，是糖酵解的起始步驟，若上調(diào)HK基因的表達(dá)，可使更多的葡萄糖進(jìn)入糖酵解途徑，增強(qiáng)糖酵解代謝流；PFK-1是糖酵解途徑的關(guān)鍵限速酶，其活性受到多種因素的調(diào)控，通過過表達(dá)PFK-1基因，可提高其蛋白表達(dá)量，從而增加糖酵解途徑的代謝通量，為細(xì)胞提供更多的能量和丙酮酸。丙酮酸作為重要的代謝中間物，可進(jìn)一步參與三羧酸循環(huán)、乙醇發(fā)酵等多種代謝途徑。在三羧酸循環(huán)中，異檸檬酸脫氫酶（IDH）基因的表達(dá)調(diào)控對(duì)代謝流也有著重要影響。IDH催化異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸，是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵限速步驟之一。當(dāng)細(xì)胞需要更多能量時(shí)，通過激活I(lǐng)DH基因的表達(dá)，增加IDH蛋白的合成，可加速三羧酸循環(huán)的進(jìn)行，提高能量生成效率。相反，在某些情況下，若要減少三羧酸循環(huán)的代謝通量，使更多代謝物流向其他途徑，可通過抑制IDH基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。通過RNA干擾（RNAi）技術(shù)，設(shè)計(jì)針對(duì)IDH基因的小干擾RNA（siRNA），使其與IDH基因的mRNA結(jié)合，從而抑制mRNA的翻譯過程，降低IDH蛋白的表達(dá)量，進(jìn)而減少三羧酸循環(huán)的代謝通量。此外，轉(zhuǎn)錄因子在基因調(diào)控中也發(fā)揮著重要作用。轉(zhuǎn)錄因子能夠與基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定DNA序列結(jié)合，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄速率。在釀酒酵母中，一些轉(zhuǎn)錄因子參與了中心代謝途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子Hap4可與參與三羧酸循環(huán)和呼吸鏈相關(guān)基因的啟動(dòng)子結(jié)合，激活這些基因的表達(dá)，從而促進(jìn)三羧酸循環(huán)和有氧呼吸過程。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)釀酒酵母處于有氧條件下，Hap4的表達(dá)水平升高，它與相關(guān)基因啟動(dòng)子的結(jié)合增強(qiáng)，使得三羧酸循環(huán)和呼吸鏈相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性提高，代謝流更多地流向有氧呼吸途徑，以滿足細(xì)胞對(duì)能量的需求。而在厭氧條件下，Hap4的表達(dá)受到抑制，細(xì)胞代謝流則更多地轉(zhuǎn)向發(fā)酵途徑。通過對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)中心代謝途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)的間接調(diào)控，進(jìn)而改變代謝流的分配。3.2.2酶工程策略酶工程策略是重編程釀酒酵母中心代謝流的重要手段，通過改造關(guān)鍵酶的性質(zhì)，能夠提高其催化效率和特異性，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)代謝流的有效調(diào)控。在釀酒酵母的中心代謝途徑中，許多關(guān)鍵酶的性能直接影響著代謝流的走向和代謝途徑的效率。在糖酵解途徑中，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）催化甘油醛-3-磷酸氧化脫氫生成1,3-二磷酸甘油酸，這一反應(yīng)不僅產(chǎn)生了還原力NADH+H^{+}，還將能量轉(zhuǎn)移到高能磷酸鍵中，對(duì)糖酵解途徑的能量產(chǎn)生和代謝流的推進(jìn)起著關(guān)鍵作用。通過酶工程技術(shù)對(duì)GAPDH進(jìn)行改造，可以優(yōu)化其催化性能。利用定點(diǎn)突變技術(shù)，對(duì)GAPDH的活性中心氨基酸殘基進(jìn)行替換，改變其與底物和輔酶的結(jié)合能力，從而提高其催化效率。研究發(fā)現(xiàn)，將GAPDH活性中心的某個(gè)氨基酸殘基替換后，其催化甘油醛-3-磷酸氧化脫氫的反應(yīng)速率提高了數(shù)倍，使得糖酵解途徑的代謝通量顯著增加，為細(xì)胞提供了更多的能量和代謝前體。在三羧酸循環(huán)中，琥珀酸脫氫酶（SDH）是一種結(jié)合在線粒體內(nèi)膜上的酶，它催化琥珀酸氧化生成富馬酸，并產(chǎn)生FADH_{2}，是三羧酸循環(huán)中唯一與電子傳遞鏈直接相關(guān)的步驟。通過酶工程改造SDH，可以優(yōu)化三羧酸循環(huán)的代謝流和能量產(chǎn)生效率。利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，對(duì)SDH的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和改造，提高其穩(wěn)定性和催化活性。通過對(duì)SDH的亞基結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，增強(qiáng)了其與底物琥珀酸和輔酶FAD的結(jié)合穩(wěn)定性，使得SDH的催化活性提高，三羧酸循環(huán)的代謝通量更加順暢，細(xì)胞能夠更高效地利用三羧酸循環(huán)產(chǎn)生能量。除了定點(diǎn)突變和蛋白質(zhì)工程技術(shù)外，定向進(jìn)化也是一種常用的酶工程策略。定向進(jìn)化通過對(duì)酶基因進(jìn)行隨機(jī)突變，然后在特定的篩選條件下，篩選出具有優(yōu)良性能的酶突變體。在釀酒酵母合成脂肪酸的研究中，利用易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)脂肪酸合成酶（FAS）基因進(jìn)行隨機(jī)突變，構(gòu)建了一個(gè)包含大量FAS突變體的文庫。在篩選過程中，將文庫中的突變體導(dǎo)入釀酒酵母細(xì)胞，通過檢測(cè)脂肪酸的合成量，篩選出了催化活性更高的FAS突變體。這些突變體在釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)能夠更高效地催化脂肪酸的合成，使得脂肪酸的產(chǎn)量顯著增加。定向進(jìn)化技術(shù)不需要對(duì)酶的結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制有深入的了解，只需通過隨機(jī)突變和篩選，就能夠獲得性能優(yōu)良的酶突變體，為酶工程改造提供了一種高效、便捷的方法。3.2.3代謝物調(diào)控策略代謝物調(diào)控策略是通過調(diào)節(jié)代謝物濃度、反饋抑制等機(jī)制來調(diào)控釀酒酵母中心代謝流的重要手段，其原理基于代謝網(wǎng)絡(luò)中代謝物與酶之間的相互作用，以及代謝途徑之間的協(xié)同調(diào)控關(guān)系。在釀酒酵母的中心代謝途徑中，代謝物的濃度變化會(huì)影響酶的活性和基因表達(dá)，從而改變代謝流的分配。在糖酵解途徑中，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖濃度較高時(shí)，葡萄糖會(huì)作為誘導(dǎo)物，促進(jìn)己糖激酶（HK）基因的表達(dá)，使HK的合成增加，從而加速葡萄糖的磷酸化過程，增強(qiáng)糖酵解代謝流。隨著糖酵解的進(jìn)行，細(xì)胞內(nèi)的ATP濃度逐漸升高，ATP作為反饋抑制劑，會(huì)抑制磷酸果糖激酶-1（PFK-1）的活性，減緩糖酵解的速率，避免能量的過度消耗。這種代謝物濃度的變化和反饋抑制機(jī)制，使得糖酵解途徑能夠根據(jù)細(xì)胞的能量需求和底物供應(yīng)情況，自動(dòng)調(diào)節(jié)代謝流的強(qiáng)度，維持細(xì)胞代謝的平衡。在三羧酸循環(huán)中，代謝物的調(diào)控作用也十分顯著。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的NADH濃度升高時(shí)，NADH會(huì)作為反饋抑制劑，抑制異檸檬酸脫氫酶（IDH）和α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體（OGDH）的活性，這兩種酶分別催化三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵步驟，它們的活性受到抑制后，會(huì)導(dǎo)致三羧酸循環(huán)的代謝通量降低。這是因?yàn)镹ADH濃度的升高意味著細(xì)胞內(nèi)的能量水平較高，此時(shí)減少三羧酸循環(huán)的代謝通量，可以避免能量的過度產(chǎn)生，維持細(xì)胞內(nèi)的能量平衡。相反，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的NAD^{+}濃度升高時(shí)，會(huì)激活I(lǐng)DH和OGDH的活性，加速三羧酸循環(huán)的進(jìn)行，以滿足細(xì)胞對(duì)能量的需求。此外，代謝物之間的相互轉(zhuǎn)化和平衡也對(duì)中心代謝流的調(diào)控起著重要作用。在磷酸戊糖途徑和糖酵解途徑的分支點(diǎn)處，葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）可以進(jìn)入磷酸戊糖途徑生成NADPH和5-磷酸核糖，也可以進(jìn)入糖酵解途徑生成丙酮酸。當(dāng)細(xì)胞需要更多的NADPH用于脂肪酸合成等還原反應(yīng)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的代謝物濃度會(huì)發(fā)生變化，促使更多的G-6-P進(jìn)入磷酸戊糖途徑。例如，脂肪酸合成過程中會(huì)消耗大量的NADPH，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)NADPH濃度降低，NADP^{+}濃度升高，NADP^{+}作為變構(gòu)效應(yīng)劑，會(huì)激活6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PD）的活性，G6PD是磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵限速酶，其活性被激活后，會(huì)使更多的G-6-P進(jìn)入磷酸戊糖途徑，從而滿足細(xì)胞對(duì)NADPH的需求。同時(shí)，磷酸戊糖途徑產(chǎn)生的5-磷酸核糖也可用于核苷酸和核酸的生物合成，進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝活動(dòng)。3.3中心代謝流重編程的研究方法3.3.1代謝通量分析技術(shù)13C標(biāo)記代謝通量分析技術(shù)是一種用于深入研究釀酒酵母代謝流的強(qiáng)大工具，其原理基于穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)。在這一技術(shù)中，利用13C標(biāo)記的底物（如13C-葡萄糖）作為釀酒酵母的碳源，由于13C與普通的12C在質(zhì)量上存在差異，在代謝過程中，13C標(biāo)記的底物會(huì)隨著代謝途徑進(jìn)入到各個(gè)代謝產(chǎn)物中，使得代謝產(chǎn)物中碳原子的同位素組成發(fā)生變化。通過高分辨率的質(zhì)譜技術(shù)（如氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀GC-MS、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀LC-MS等）對(duì)代謝產(chǎn)物中13C的豐度和分布模式進(jìn)行精確測(cè)定，再結(jié)合代謝網(wǎng)絡(luò)模型和數(shù)學(xué)計(jì)算方法，就能夠推斷出代謝途徑中各反應(yīng)的速率和代謝通量分布情況。在釀酒酵母代謝流測(cè)定中，13C標(biāo)記代謝通量分析技術(shù)有著廣泛的應(yīng)用。在研究釀酒酵母的乙醇發(fā)酵過程時(shí)，采用13C-葡萄糖作為碳源，通過13C標(biāo)記代謝通量分析技術(shù)，能夠清晰地測(cè)定糖酵解途徑中各中間代謝物的代謝通量。研究發(fā)現(xiàn)，在乙醇發(fā)酵初期，葡萄糖快速進(jìn)入糖酵解途徑，己糖激酶催化的葡萄糖磷酸化反應(yīng)通量較高，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，磷酸果糖激酶-1（PFK-1）的活性逐漸成為限制糖酵解代謝通量的關(guān)鍵因素。通過調(diào)節(jié)PFK-1基因的表達(dá)，提高其蛋白表達(dá)量，可增強(qiáng)糖酵解代謝通量，進(jìn)而提高乙醇的產(chǎn)量。在分析釀酒酵母的三羧酸循環(huán)代謝流時(shí)，13C標(biāo)記代謝通量分析技術(shù)也發(fā)揮了重要作用。利用13C-葡萄糖標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，結(jié)合質(zhì)譜分析，研究人員能夠準(zhǔn)確測(cè)定三羧酸循環(huán)中各中間代謝物的碳同位素分布，從而計(jì)算出各反應(yīng)步驟的代謝通量。研究表明，在有氧條件下，三羧酸循環(huán)代謝通量較高，異檸檬酸脫氫酶催化的反應(yīng)是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵限速步驟之一，其代謝通量對(duì)細(xì)胞的能量供應(yīng)和物質(zhì)合成有著重要影響。當(dāng)細(xì)胞處于高能量需求狀態(tài)時(shí)，異檸檬酸脫氫酶的活性增強(qiáng)，三羧酸循環(huán)代謝通量加快，為細(xì)胞提供更多的能量。對(duì)13C標(biāo)記代謝通量分析結(jié)果的深入分析，可以為釀酒酵母中心代謝流重編程提供關(guān)鍵的理論依據(jù)。通過比較不同培養(yǎng)條件下或不同基因工程菌株的代謝通量分布差異，能夠準(zhǔn)確地識(shí)別出代謝途徑中的瓶頸步驟和關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點(diǎn)。在研究釀酒酵母合成脂肪酸的過程中，通過13C標(biāo)記代謝通量分析發(fā)現(xiàn)，磷酸戊糖途徑中6-磷酸葡萄糖脫氫酶的活性較低，導(dǎo)致NADPH的生成量不足，限制了脂肪酸的合成。基于這一結(jié)果，通過基因工程手段過表達(dá)6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因，增強(qiáng)了磷酸戊糖途徑的代謝通量，提高了NADPH的供應(yīng)，從而顯著提高了脂肪酸的合成量。此外，通過對(duì)代謝通量數(shù)據(jù)的系統(tǒng)分析，還可以構(gòu)建更準(zhǔn)確的代謝網(wǎng)絡(luò)模型，預(yù)測(cè)基因改造和環(huán)境變化對(duì)代謝流分布的影響，為進(jìn)一步優(yōu)化釀酒酵母的代謝途徑和中心代謝流重編程提供有力的指導(dǎo)。3.3.2組學(xué)技術(shù)在代謝流研究中的應(yīng)用組學(xué)技術(shù)，包括轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)，為深入研究釀酒酵母代謝流調(diào)控機(jī)制提供了全面且系統(tǒng)的視角，它們從不同層面揭示了細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)、蛋白質(zhì)水平和代謝物變化與代謝流之間的緊密聯(lián)系。轉(zhuǎn)錄組學(xué)通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析，能夠全面反映基因的表達(dá)情況。在釀酒酵母代謝流研究中，轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)可以揭示不同代謝狀態(tài)下基因表達(dá)的變化規(guī)律。在釀酒酵母從有氧呼吸轉(zhuǎn)變?yōu)闊o氧發(fā)酵的過程中，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，參與糖酵解途徑的基因表達(dá)顯著上調(diào)，而參與三羧酸循環(huán)和呼吸鏈的基因表達(dá)則明顯下調(diào)。這表明在無氧條件下，釀酒酵母通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)，使代謝流更多地流向糖酵解途徑，以滿足細(xì)胞對(duì)能量的需求。進(jìn)一步分析還發(fā)現(xiàn)，一些轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)也發(fā)生了變化，這些轉(zhuǎn)錄因子可能通過調(diào)控相關(guān)代謝基因的表達(dá)，參與了代謝流的調(diào)控。例如，轉(zhuǎn)錄因子Adr1在無氧發(fā)酵條件下表達(dá)上調(diào)，它可以與糖酵解途徑關(guān)鍵酶基因的啟動(dòng)子結(jié)合，激活這些基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)糖酵解代謝流。蛋白質(zhì)組學(xué)則聚焦于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾和相互作用。在釀酒酵母中，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)能夠直接檢測(cè)代謝途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)水平和修飾狀態(tài)。在研究釀酒酵母合成乙醇的過程中，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，乙醇脫氫酶（ADH）的表達(dá)水平在發(fā)酵過程中逐漸升高，并且其磷酸化修飾狀態(tài)也發(fā)生了變化。磷酸化修飾可以調(diào)節(jié)ADH的活性，進(jìn)而影響乙醇合成途徑的代謝通量。此外，蛋白質(zhì)組學(xué)還可以研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，揭示代謝途徑中酶的復(fù)合物組成和功能。通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)參與三羧酸循環(huán)的一些酶之間存在相互作用，形成復(fù)合物，這種復(fù)合物的形成可能對(duì)三羧酸循環(huán)的代謝通量調(diào)控具有重要作用。代謝組學(xué)是對(duì)細(xì)胞內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定性和定量分析。在釀酒酵母代謝流研究中，代謝組學(xué)技術(shù)可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)代謝物的動(dòng)態(tài)變化。在釀酒酵母的生長(zhǎng)過程中，通過代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)的代謝物濃度隨著生長(zhǎng)階段的不同而發(fā)生變化。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，葡萄糖等碳源被快速消耗，代謝物主要集中在糖酵解和三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物；而在穩(wěn)定期，乙醇等發(fā)酵產(chǎn)物的濃度逐漸升高，一些參與能量代謝和物質(zhì)合成的代謝物濃度則發(fā)生相應(yīng)的變化。通過對(duì)代謝物變化規(guī)律的分析，可以深入了解代謝流的走向和調(diào)控機(jī)制。在研究釀酒酵母響應(yīng)滲透壓脅迫的過程中，代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)的甘油等相容性溶質(zhì)的濃度顯著增加，這是釀酒酵母通過調(diào)節(jié)代謝流，合成更多的甘油來維持細(xì)胞的滲透平衡。將轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，能夠更全面、深入地揭示釀酒酵母代謝流調(diào)控機(jī)制。通過整合多組學(xué)數(shù)據(jù)，可以構(gòu)建基因-蛋白質(zhì)-代謝物的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從系統(tǒng)生物學(xué)的角度解析代謝流的調(diào)控過程。在研究釀酒酵母合成特定天然產(chǎn)物的過程中，綜合運(yùn)用多組學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)一些基因的表達(dá)變化會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)和修飾改變，進(jìn)而影響代謝物的合成和代謝流的分布。通過對(duì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分析，可以識(shí)別出關(guān)鍵的調(diào)控節(jié)點(diǎn)和潛在的代謝工程改造靶點(diǎn)，為優(yōu)化釀酒酵母的代謝途徑和提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量提供更精準(zhǔn)的指導(dǎo)。四、合成生物學(xué)新技術(shù)與中心代謝流重編程的協(xié)同作用4.1新技術(shù)助力代謝流重編程的實(shí)現(xiàn)4.1.1基因編輯技術(shù)精確調(diào)控代謝流CRISPR-Cas等基因編輯技術(shù)在釀酒酵母中心代謝流重編程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)代謝流的精確調(diào)控。以CRISPR-Cas9系統(tǒng)為例，其通過向?qū)NA（gRNA）引導(dǎo)Cas9核酸酶對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行精確切割，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)基因的敲除、插入或替換。在釀酒酵母的中心代謝途徑中，CRISPR-Cas9技術(shù)可針對(duì)關(guān)鍵酶基因進(jìn)行編輯。在糖酵解途徑中，磷酸果糖激酶-1（PFK-1）是關(guān)鍵限速酶，其活性對(duì)糖酵解代謝流起著決定性作用。通過CRISPR-Cas9技術(shù)，研究人員可以對(duì)編碼PFK-1的基因進(jìn)行精確編輯。若要增強(qiáng)糖酵解代謝流，可通過定點(diǎn)突變技術(shù)，對(duì)PFK-1基因的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行改造，使其與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力增強(qiáng)，從而提高PFK-1基因的轉(zhuǎn)錄水平，增加PFK-1蛋白的表達(dá)量，進(jìn)而提升糖酵解途徑的代謝通量。在一項(xiàng)研究中，科研人員利用CRISPR-Cas9技術(shù)對(duì)釀酒酵母的PFK-1基因啟動(dòng)子進(jìn)行改造，結(jié)果顯示糖酵解代謝流顯著增強(qiáng)，丙酮酸的生成量提高了30%，為后續(xù)的代謝途徑提供了更充足的前體物質(zhì)。在三羧酸循環(huán)中，異檸檬酸脫氫酶（IDH）基因的表達(dá)調(diào)控對(duì)代謝流也至關(guān)重要。當(dāng)需要減少三羧酸循環(huán)的代謝通量，使更多代謝物流向其他途徑時(shí)，可利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除IDH基因，或?qū)ζ渚幋a區(qū)進(jìn)行突變，降低IDH酶的活性。通過這種精確的基因編輯操作，能夠有效改變?nèi)人嵫h(huán)的代謝流，實(shí)現(xiàn)對(duì)釀酒酵母中心代謝流的重編程。有研究通過CRISPR-Cas9敲除釀酒酵母的IDH基因，成功使三羧酸循環(huán)代謝通量降低了40%，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)其他代謝途徑的代謝流得到了相應(yīng)的增強(qiáng)，為目標(biāo)產(chǎn)物的合成提供了更多的底物和能量。除了CRISPR-Cas9系統(tǒng)，其他基因編輯技術(shù)也在釀酒酵母代謝流調(diào)控中發(fā)揮著作用。堿基編輯技術(shù)能夠在不引入雙鏈DNA斷裂的情況下實(shí)現(xiàn)單堿基的精準(zhǔn)替換，對(duì)于釀酒酵母中一些關(guān)鍵基因的點(diǎn)突變改造具有重要意義。在參與磷酸戊糖途徑的6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PD）基因中，通過堿基編輯技術(shù)將某個(gè)特定堿基進(jìn)行替換，可改變G6PD酶的氨基酸序列，優(yōu)化其催化活性，使磷酸戊糖途徑的代謝流得到調(diào)控，從而提高細(xì)胞內(nèi)NADPH的生成量，滿足細(xì)胞對(duì)還原力的需求。引導(dǎo)編輯技術(shù)則可以實(shí)現(xiàn)更加靈活的DNA序列編輯，包括堿基的插入、缺失和替換等，為釀酒酵母基因編輯提供了更多的選擇，在調(diào)控釀酒酵母代謝流方面展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。4.1.2途徑工程與代謝流重編程的整合途徑工程通過構(gòu)建和優(yōu)化代謝途徑，能夠有效地引導(dǎo)釀酒酵母的代謝流流向目標(biāo)產(chǎn)物合成方向，在釀酒酵母中心代謝流重編程中具有重要作用。在構(gòu)建新的代謝途徑方面，研究人員可以將外源基因?qū)脶劸平湍?，使其獲得合成特定產(chǎn)物的能力。在合成青蒿酸的研究中，研究人員從青蒿中克隆了紫穗槐-4,11-二烯合酶（ADS）基因、細(xì)胞色素P450單加氧酶（CYP71AV1）基因和醛脫氫酶（ALDH1）基因等，這些基因編碼的酶參與青蒿酸的合成途徑。將這些外源基因?qū)脶劸平湍负螅瑯?gòu)建了一條全新的青蒿酸合成途徑。在這個(gè)過程中，為了使代謝流能夠順利流向青蒿酸合成方向，需要對(duì)釀酒酵母的內(nèi)源代謝途徑進(jìn)行調(diào)整。通過基因編輯技術(shù)敲除釀酒酵母中與青蒿酸合成競(jìng)爭(zhēng)底物或中間代謝物的相關(guān)基因，如角鯊烯環(huán)氧酶（ERG1）基因，阻斷了麥角甾醇合成途徑，使更多的代謝前體物質(zhì)流向青蒿酸合成途徑。經(jīng)過一系列的途徑構(gòu)建和優(yōu)化，成功實(shí)現(xiàn)了釀酒酵母對(duì)青蒿酸的合成，產(chǎn)量達(dá)到了一定水平。優(yōu)化現(xiàn)有代謝途徑也是途徑工程與代謝流重編程整合的重要策略。在釀酒酵母的乙醇發(fā)酵過程中，乙醇脫氫酶（ADH）基因的表達(dá)水平對(duì)乙醇合成代謝流有著重要影響。通過途徑工程手段，調(diào)整ADH基因的表達(dá)調(diào)控元件，將ADH基因的天然啟動(dòng)子替換為更強(qiáng)的啟動(dòng)子，如甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）啟動(dòng)子，可使ADH基因的表達(dá)量顯著提高，從而增強(qiáng)乙醇合成途徑的代謝通量，提高乙醇產(chǎn)量。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過啟動(dòng)子替換的釀酒酵母菌株，乙醇產(chǎn)量相比野生型菌株提高了25%。此外，還可以通過對(duì)代謝途徑中其他關(guān)鍵酶基因的表達(dá)調(diào)控，以及對(duì)代謝途徑分支點(diǎn)的調(diào)節(jié)，進(jìn)一步優(yōu)化乙醇發(fā)酵過程中的代謝流分配，提高發(fā)酵效率。途徑工程與代謝流重編程的整合還需要考慮代謝途徑之間的協(xié)同調(diào)控。釀酒酵母的代謝網(wǎng)絡(luò)是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，各個(gè)代謝途徑之間相互關(guān)聯(lián)、相互影響。在構(gòu)建或優(yōu)化某一代謝途徑時(shí)，需要綜合考慮其他代謝途徑的變化，以確保整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)的平衡和穩(wěn)定。在提高釀酒酵母中有機(jī)酸產(chǎn)量的研究中，不僅要優(yōu)化有機(jī)酸合成途徑，還需要考慮糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)等相關(guān)代謝途徑的協(xié)同調(diào)控。通過調(diào)節(jié)這些代謝途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)水平和活性，使代謝流在各個(gè)途徑之間合理分配，實(shí)現(xiàn)了有機(jī)酸產(chǎn)量的大幅提高。4.2代謝流重編程對(duì)新技術(shù)應(yīng)用的反饋4.2.1基于代謝流需求優(yōu)化新技術(shù)應(yīng)用根據(jù)代謝流分析結(jié)果來優(yōu)化基因編輯和途徑工程等技術(shù)的應(yīng)用策略，是實(shí)現(xiàn)釀酒酵母高效代謝調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。通過對(duì)釀酒酵母中心代謝流的精準(zhǔn)分析，能夠明確代謝途徑中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)和限速步驟，從而有針對(duì)性地調(diào)整基因編輯和途徑工程的實(shí)施策略。在基因編輯技術(shù)方面，代謝流分析結(jié)果為基因編輯靶點(diǎn)的選擇提供了重要依據(jù)。當(dāng)代謝流分析顯示糖酵解途徑中磷酸果糖激酶-1（PFK-1）的活性成為限制代謝通量的瓶頸時(shí)，基因編輯的重點(diǎn)就可放在對(duì)PFK-1基因的改造上。通過CRISPR-Cas9技術(shù)，對(duì)PFK-1基因的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行精準(zhǔn)編輯，引入特定的順式作用元件，增強(qiáng)其與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力，從而提高PFK-1基因的轉(zhuǎn)錄效率，增加PFK-1蛋白的表達(dá)量，最終提升糖酵解途徑的代謝通量。若代謝流分析表明三羧酸循環(huán)中異檸檬酸脫氫酶（IDH）基因的表達(dá)過高，導(dǎo)致代謝流過度流向三羧酸循環(huán)，而影響了目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑的底物供應(yīng)，此時(shí)可利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除IDH基因的部分調(diào)控序列，降低其表達(dá)水平，使代謝流重新分配，更多地流向目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑。對(duì)于途徑工程技術(shù)，代謝流分析有助于優(yōu)化代謝途徑的構(gòu)建和調(diào)整。在構(gòu)建新的代謝途徑時(shí)，通過代謝流分析了解細(xì)胞內(nèi)的底物供應(yīng)和能量代謝情況，能夠合理選擇外源基因和調(diào)控元件，確保新構(gòu)建的代謝途徑與細(xì)胞內(nèi)的原有代謝網(wǎng)絡(luò)相協(xié)調(diào)。在釀酒酵母中構(gòu)建合成青蒿酸的代謝途徑時(shí)，代謝流分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的甲羥戊酸供應(yīng)不足，限制了青蒿酸的合成?；诖?，在途徑工程中，可通過過表達(dá)甲羥戊酸途徑中的關(guān)鍵酶基因，如3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMG-CoA還原酶）基因，增加甲羥戊酸的合成，為青蒿酸合成途徑提供充足的底物，從而提高青蒿酸的產(chǎn)量。在優(yōu)化現(xiàn)有代謝途徑時(shí)，代謝流分析能夠幫助確定需要強(qiáng)化或弱化的代謝分支。在乙醇發(fā)酵過程中，代謝流分析發(fā)現(xiàn)存在一些旁路代謝途徑消耗丙酮酸，導(dǎo)致乙醇合成量降低。通過途徑工程手段，利用基因編輯技術(shù)敲除參與旁路代謝途徑的關(guān)鍵酶基因，阻斷這些旁路，使更多的丙酮酸流向乙醇合成途徑，提高乙醇的產(chǎn)量。此外，代謝流分析結(jié)果還可用于評(píng)估基因編輯和途徑工程技術(shù)的實(shí)施效果。在實(shí)施基因編輯或途徑工程操作后，再次進(jìn)行代謝流分析，對(duì)比操作前后代謝流的變化情況，能夠判斷技術(shù)應(yīng)用是否達(dá)到了預(yù)期目標(biāo)。若代謝流的調(diào)整未達(dá)到理想效果，可根據(jù)分析結(jié)果進(jìn)一步優(yōu)化技術(shù)方案，如調(diào)整基因編輯的位點(diǎn)、優(yōu)化途徑工程中調(diào)控元件的選擇等，不斷完善技術(shù)應(yīng)用策略，以實(shí)現(xiàn)對(duì)釀酒酵母代謝流的精準(zhǔn)調(diào)控，提高目標(biāo)產(chǎn)物的合成效率和產(chǎn)量。4.2.2代謝流變化推動(dòng)新技術(shù)發(fā)展代謝流重編程過程中出現(xiàn)的問題，成為了推動(dòng)合成生物學(xué)新技術(shù)不斷研發(fā)和改進(jìn)的重要?jiǎng)恿?。在釀酒酵母中心代謝流重編程的實(shí)踐中，隨著對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)研究的深入和重編程技術(shù)的應(yīng)用，一系列問題逐漸凸顯，這些問題促使科研人員不斷探索和創(chuàng)新，以研發(fā)出更有效的合成生物學(xué)新技術(shù)。基因編輯技術(shù)的脫靶效應(yīng)是代謝流重編程中面臨的一個(gè)重要問題。在利用CRISPR-Cas9等基因編輯技術(shù)對(duì)釀酒酵母進(jìn)行代謝途徑改造時(shí)，脫靶效應(yīng)可能導(dǎo)致非預(yù)期基因的編輯，影響細(xì)胞的正常生理功能和代謝穩(wěn)定性。這一問題促使科研人員致力于研發(fā)更加精準(zhǔn)的基因編輯技術(shù)，如優(yōu)化gRNA的設(shè)計(jì)，通過生物信息學(xué)算法預(yù)測(cè)和篩選具有高特異性的gRNA序列，降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)；開發(fā)高保真的Cas蛋白變體，提高Cas蛋白對(duì)目標(biāo)序列的識(shí)別和切割特異性。這些新技術(shù)的研發(fā)不僅有助于解決釀酒酵母代謝流重編程中的基因編輯安全問題，也為其他生物的基因編輯研究提供了借鑒。在途徑工程中，構(gòu)建的新代謝途徑與釀酒酵母內(nèi)源代謝網(wǎng)絡(luò)的兼容性問題是一個(gè)亟待解決的難題。新引入的代謝途徑可能與內(nèi)源代謝途徑競(jìng)爭(zhēng)底物、能量和輔酶等資源，導(dǎo)致代謝失衡，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和目標(biāo)產(chǎn)物的合成。為了解決這一問題，科研人員開始探索新的途徑工程策略，如利用動(dòng)態(tài)調(diào)控元件，根據(jù)細(xì)胞代謝狀態(tài)實(shí)時(shí)調(diào)節(jié)新代謝途徑和內(nèi)源代謝途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)代謝流的動(dòng)態(tài)平衡；開發(fā)基于系統(tǒng)生物學(xué)的途徑設(shè)計(jì)方法，通過構(gòu)建代謝網(wǎng)絡(luò)模型，模擬新代謝途徑與內(nèi)源代謝網(wǎng)絡(luò)的相互作用，預(yù)測(cè)和優(yōu)化代謝途徑的構(gòu)建方案，提高新代謝途徑與內(nèi)源代謝網(wǎng)絡(luò)的兼容性。此外，隨著對(duì)釀酒酵母代謝流調(diào)控精度要求的不斷提高，傳統(tǒng)的合成生物學(xué)技術(shù)在實(shí)現(xiàn)復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)的精細(xì)調(diào)控方面逐漸顯得力不從心。這推動(dòng)了多組學(xué)技術(shù)與合成生物學(xué)的深度融合，如整合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，構(gòu)建基因-蛋白質(zhì)-代謝物的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從系統(tǒng)層面深入理解代謝流的調(diào)控機(jī)制，為開發(fā)更加精準(zhǔn)的代謝調(diào)控技術(shù)提供理論支持?；跈C(jī)器學(xué)習(xí)和人工智能的算法也開始應(yīng)用于代謝流分析和預(yù)測(cè)，通過對(duì)大量代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的學(xué)習(xí)和分析，挖掘潛在的代謝調(diào)控模式和靶點(diǎn)，為代謝流重編程提供新的技術(shù)手段。這些新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，將進(jìn)一步推動(dòng)釀酒酵母合成生物學(xué)的發(fā)展，為實(shí)現(xiàn)釀酒酵母細(xì)胞工廠的高效構(gòu)建和工業(yè)應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)。五、釀酒酵母合成生物學(xué)新技術(shù)及中心代謝流重編程的應(yīng)用5.1在生物能源生產(chǎn)中的應(yīng)用5.1.1乙醇生產(chǎn)的優(yōu)化在生物能源領(lǐng)域，釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇是一項(xiàng)重要的技術(shù)。利用合成生物學(xué)新技術(shù)及中心代謝流重編程，能夠顯著提高乙醇的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率。通過基因編輯技術(shù)對(duì)釀酒酵母的代謝途徑進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控，可增強(qiáng)乙醇合成相關(guān)基因的表達(dá)，減少副產(chǎn)物的生成。研究人員運(yùn)用CRISPR-Cas9技術(shù)，敲除了釀酒酵母中編碼甘油-3-磷酸脫氫酶（GPD1）和甘油-3-磷酸磷酸酶（GPP2）的基因，這兩個(gè)基因參與甘油的合成代謝。敲除后，甘油合成途徑受阻，代謝流更多地流向乙醇合成途徑，甘油產(chǎn)量顯著降低，而乙醇產(chǎn)量提高了15%-20%。優(yōu)化釀酒酵母的中心代謝流，能夠提高底物利用率和能量轉(zhuǎn)化效率。在糖酵解途徑中，通過過表達(dá)己糖激酶（HK）和磷酸果糖激酶-1（PFK-1）等關(guān)鍵酶基因，增強(qiáng)糖酵解代謝流，使葡萄糖能夠更快速地轉(zhuǎn)化為丙酮酸，為乙醇合成提供充足的前體物質(zhì)。在一項(xiàng)研究中，科研人員將HK和PFK-1基因的啟動(dòng)子替換為強(qiáng)啟動(dòng)子，使這兩個(gè)基因的表達(dá)量提高了2-3倍，糖酵解代謝通量顯著增強(qiáng)，乙醇產(chǎn)量提高了約25%。同時(shí)，調(diào)控三羧酸循環(huán)和磷酸戊糖途徑的代謝通量，使其與乙醇合成途徑相協(xié)調(diào)，可進(jìn)一步提高乙醇生產(chǎn)效率。降低三羧酸循環(huán)的代謝通量，減少丙酮酸的消耗，使更多丙酮酸用于乙醇合成；增強(qiáng)磷酸戊糖途徑的代謝通量，為細(xì)胞提供更多的還原力（NADPH），促進(jìn)乙醇合成過程中的氧化還原反應(yīng)。此外，利用途徑工程技術(shù)，構(gòu)建新的乙醇合成途徑或優(yōu)化現(xiàn)有途徑，也能提高乙醇產(chǎn)量。在釀酒酵母中引入來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonasmobilis）的丙酮酸脫羧酶（PDC）和乙醇脫氫酶（ADH）基因，這些基因編碼的酶具有更高的催化活性，能夠更高效地將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醇。通過優(yōu)化表達(dá)條件，使引入的基因在釀酒酵母中高效表達(dá)，結(jié)果顯示乙醇產(chǎn)量提高了30%以上。同時(shí)，對(duì)釀酒酵母自身的乙醇脫氫酶基因進(jìn)行改造，提高其對(duì)底物的親和力和催化效率，也有助于提高乙醇產(chǎn)量。利用定向進(jìn)化技術(shù)對(duì)釀酒酵母的乙醇脫氫酶基因進(jìn)行隨機(jī)突變，篩選出催化活性提高的突變體，在發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，攜帶突變體乙醇脫氫酶基因的釀酒酵母菌株乙醇產(chǎn)量比野生型菌株提高了20%左右。5.1.2新型生物燃料的合成除了乙醇，釀酒酵母在新型生物燃料合成方面也展現(xiàn)出了巨大的潛力。丁醇作為一種新型生物燃料，具有能量密度高、揮發(fā)性低、與汽油兼容性好等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是一種極具前景的替代燃料。利用合成生物學(xué)技術(shù)，在釀酒酵母中構(gòu)建丁醇合成途徑是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。研究人員通過引入外源基因，逐步構(gòu)建了從丙酮酸到丁醇的合成途徑。從丙酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum）中克隆了一系列參與丁醇合成的關(guān)鍵酶基因，包括乙酰乙酰輔酶A硫解酶（thl）、3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶（hbd）、巴豆酸酶（crt）、丁酰輔酶A脫氫酶（bcd）和丁醇脫氫酶（adhE2）等。將這些基因?qū)脶劸平湍?，并?duì)其表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化，成功實(shí)現(xiàn)了丁醇的合成。在優(yōu)化過程中，研究人員發(fā)現(xiàn)，調(diào)整基因的表達(dá)順序和表達(dá)強(qiáng)度對(duì)丁醇產(chǎn)量有著重要影響。通過將關(guān)鍵酶基因按照合理的順序串聯(lián)在同一表達(dá)載體上，并使用不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子調(diào)控基因表達(dá)，使丁醇合成途徑中的酶活性得到了有效協(xié)調(diào)，丁醇產(chǎn)量得到了顯著提高。在最佳條件下，釀酒酵母工程菌株的丁醇產(chǎn)量達(dá)到了2.5g/L，為丁醇的生物合成提供了新的途徑。生物柴油是另一種重要的生物燃料，通常由植物油或動(dòng)物脂肪與醇類（如甲醇或乙醇）在催化劑作用下發(fā)生酯交換反應(yīng)制備而成。利用釀酒酵母合成生物柴油的研究也取得了一定進(jìn)展。釀酒酵母本身能夠合成脂肪酸，通過對(duì)其脂肪酸合成途徑進(jìn)行改造和優(yōu)化，可提高脂肪酸的產(chǎn)量和質(zhì)量，為生物柴油的合成提供充足的原料。通過過表達(dá)脂肪酸合成酶（FAS）基因，增強(qiáng)脂肪酸合成途徑的代謝通量，使釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的積累量顯著增加。同時(shí)，敲除脂肪酸β-氧化途徑中的關(guān)鍵酶基因，減少脂肪酸的分解代謝，進(jìn)一步提高脂肪酸的含量。在一項(xiàng)研究中，經(jīng)過基因工程改造的釀酒酵母菌株脂肪酸產(chǎn)量比野生型菌株提高了50%以上。為了將脂肪酸轉(zhuǎn)化為生物柴油，研究人員在釀酒酵母中引入了脂肪酶基因，該基因編碼的脂肪酶能夠催化脂肪酸與醇類發(fā)生酯交換反應(yīng)，生成生物柴