DB13DB13/T1721—2013辣椒輕斑駁病毒檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)規(guī)程TechnicalRegulationsforDetectionofPeppermildmottlevirus2013-05-27發(fā)布2013-06-15實(shí)施河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王亞南、曹克強(qiáng)、王樹桐12術(shù)語(yǔ)和定義依據(jù)PMMoV具有很強(qiáng)的免疫原性，可采用ELISA或免疫膠體金試紙條方法進(jìn)行檢測(cè)；依據(jù)PMMoV基因4材料、儀器、用具及藥品4.1材料4.2儀器、用具）；）；）；2各種量程的可調(diào)移液器（1000L、200L、20L、10L、5L各種吸頭（1000L、200L、20L、10L、5L4.3主要試劑5調(diào)查與取樣5.2種子取樣在11月～翌年2月份對(duì)市場(chǎng)銷售的甜（辣）椒種子進(jìn)行扦樣（數(shù)量以滿足檢測(cè)鑒定所需為限），然的樣品應(yīng)放入超低溫冰箱中（-80℃)保存，要盡早進(jìn)行檢測(cè)與鑒定。6檢測(cè)與鑒定免疫膠體金試紙條適用于田間快速診斷，DAS-ELISA適合于樣品批量檢測(cè)，RT-PCR技術(shù)適用于3完整的實(shí)驗(yàn)記錄包括：樣品來(lái)源、品種、時(shí)間、地點(diǎn)、方法和結(jié)果等。PCR檢測(cè)需要有電泳結(jié)果照4A.1分類和命名A.1.2分類地位A.2病原特征A.2.1病毒粒子A.2.2核酸A.2.3蛋白A.2.4致病型L3、L4等抗性基因群。煙草花葉病毒屬病毒能否克服L基因介導(dǎo)的抗性能力由其自身的致病型決定，分5辣椒輕斑駁病毒的寄主范圍、地理分布、生物學(xué)特性、為害癥狀、傳播辣椒輕斑駁病毒的稀釋限點(diǎn)為10-6mL/L～10-8m6PMMoV有多種傳播方式：1.種子傳播；2.接觸傳染（包括）；用作肥料的牛糞）。其中帶毒種子是遠(yuǎn)距離傳播B.6.3昆諾藜（ChenopodiumquB.6.6珊西煙（NicotianaXanth7使用前將試紙條恢復(fù)至室溫（15℃~30℃)。從包裝中取出試紙條，有“箭頭”標(biāo)記端為樣品端。樣品端垂直向下，插入準(zhǔn)備好的樣品液中。樣品液不要超過(guò)膠體金試紙條上的MAX線。在檢測(cè)過(guò)程中，無(wú)效結(jié)果：質(zhì)控線和測(cè)試點(diǎn)線均未顯色，說(shuō)明試紙條失效，C.4.2試紙條應(yīng)在2℃~8℃冰箱內(nèi)密封干燥保存。使用時(shí)注意未用的要密封。以免吸濕而失效。使用溫度應(yīng)在15℃~30℃。C.4.3樣品制備對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響明顯。如樣品液中有大量組織塊，會(huì)影響檢測(cè)條吸取樣品液；如樣品8PVP（MW24,000～40,000）20.0g，亞硫酸鈉1.3g，疊氮化鈉0.2g，調(diào)整pH至7.4，溶解于1L1碳酸鈉1.59g，碳酸氫鈉2.93g，疊氮化鈉0.2g，調(diào)整pg，氯化鉀0.2g，吐溫-200牛血清蛋白（BSA）或脫脂奶粉2.0g，PVP（MW24,000～40,000）20.0g二乙醇胺97.0mL，氯化鎂0.1g，疊氮化鈉0.2g將PMMoV抗體按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行稀釋，加入酶聯(lián)板孔中，每孔加100μL9取樣品按1:10（W/V）加入提取緩沖液研磨勻漿。2000r/在酶聯(lián)板中加入待測(cè)樣品，同時(shí)加入陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，每孔加100μL，放入保濕將酶標(biāo)抗體按照試劑盒說(shuō)明用酶標(biāo)抗體緩沖液稀釋，加入酶聯(lián)板中，于每孔100μL，放入保濕盒將NPP加入底物緩沖液使終濃度為1mg/mL（現(xiàn)配現(xiàn)用），混合均勻，加入酶聯(lián)板，每孔100μL。OD405值應(yīng)小于0.15，當(dāng)陰性對(duì)照OD405值小于0.05按0以微孔中陰性對(duì)照的2倍為標(biāo)準(zhǔn)，大于這個(gè)數(shù)值的辣椒輕斑駁病毒反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)（TrizolReagent購(gòu)自Invitrogen植株葉片組織0.1g，加入1mlTrizol裂解液充分研磨，室溫放置5min；蕩15sec，室溫放置2min～3min；12000rpm，4℃離心15min；取上層水相至新管中，加入2/3體積上游引物（5’-引物5′-atttgccttcaaattgatcccg-3′；下游引物（3’-引物5′-tacatgtgtgacgtgtatttgcgPCR擴(kuò)增體系及程序反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4min；94℃變性1min，55℃退火1min，取8μL擴(kuò)增產(chǎn)物加6×loadingbuffe