bb基因診斷與基因治療基因診斷與基因治療

GeneDiagnosisandGeneTherapyLaboratoryofMolecularVirology,InstituteofVirology,WuhanUniversitySchoolofMedicine6/6/20252第一節(jié)基因診斷（genediagnosis）一、定義：Definitionofgenediagnosis基因診斷：用分子生物學技術對導致疾病的原因進行病原學和細胞遺傳基因的檢測分析,從而對相應疾病進行診斷。

Geneticdiagnosisisatestusingmolecularbiologytechnologiestoseekthecausesofdiseasesthroughanalysisofpathogensandgenes.6/6/20253基因診斷的靶分子是基因。

Thetargetsofgenediagnosisaregenes6/6/20254傳統(tǒng)的疾病診斷：Conventionaldiagnosticapproaches

細胞形態(tài)、數(shù)量celluarmorphology&celluarquantity生化反應、酶活性biochemicalreaction,activitiesofenzymes免疫學檢驗Immunologictests

6/6/20255檢測表型或形態(tài)學改變detectionofphenotypicormorphologicfeatures

檢測對象是基因的產物--蛋白質、多肽。Detectionobjectsareproductsofgenes,suchasprotein,polypeptide

6/6/20256二、基因診斷常用的技術：

Technologiesincommonuse

分子雜交技術(Nucleicacidmolecularhybridization

)PCR技術(Polymerase-Chain-Reaction)3.以上二者的衍生技術（包括DNA芯片）derivativetechnologiesfromabovetwotechnologies,DNA-Chips4.DNA序列測定DNAsequencing

6/6/20257基因診斷獨特的優(yōu)點：Advantagesofgenetherapy

從分子水平上找到特異的致病基因Tofindpathogenicgenes

atthemolecularlevels

具有很高的靈敏度Highsensitivity

6/6/20258獲得穩(wěn)定的結果StableResults

核酸比蛋白質穩(wěn)定Nucleicacidismorestablethanthatofprotein.快速、早期診斷技術Speedy&early

甚至在未出現(xiàn)癥狀的情況下早期診斷應用廣、適用性強Wideapplicability6/6/20259三、基因診斷策略Strategiesforgenetherapy（一）通過致病基因的檢測診斷疾病Diagnosisofdiseasesviapathogenicgenes

6/6/202510基因的結構清楚、突變點明確、致病機制基本清楚。Structure,mutation

andpathogenicmechanismofpathogenicgenesareclearlyunderstood.6/6/2025116/6/2025121)單基因遺傳病eg.monogeneticorsingle-genedisease

鐮狀細胞貧血Sicklecellanemia

→珠蛋白基因globingene

Codon6GAG→GTGA-T突變(mutation)谷氨酸(glutamic)→纈氨酸(valine)

6/6/2025132)、Gene缺失遺傳病的診斷1)α地貧的Gene診斷α基因不同程度的缺失引起不同類型的α地貧，α基因缺失1～4個。正常Gene組用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一個αGene時可得到10kb片段。BamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobe6/6/202514以αGene為探針，Southernblot方法檢測αα/αααα/α-αα/--α-/----/--

正常缺1缺2缺3缺414kb10kb6/6/2025153)DMD/BMD的缺失診斷

（進行性肌營養(yǎng)不良或假肥大型）DMD是一種嚴重致死性疾病（XR），臨床癥狀表現(xiàn)肌肉進行性萎縮和乏力。BMD臨床癥狀與DMD相似，但癥狀較輕。Gene定位Xp21，Gene2300kb,79個Exon，cDNA全長13974bp編碼3685Aa，分子量427kD。DMD/BMD70%左右為缺失型，基因很大，缺失可能發(fā)生在不同的部位。應用多重PCR擴增檢測，判斷缺失狀態(tài)。6/6/202516（二）通過連鎖遺傳標志檢測診斷疾病Diagnosisvialinkagegeneticmarker

基因結構、突變情況不清楚，但已知定位在染色體的特定位置上。Chromosomelocationofpathologicgenesisclear,butthestructureandmutationofthegenesareunclear.

6/6/202517同一染色體上位置十分靠近的基因或其他遺傳標志,常常一起遺傳,形成連鎖（linkage）.Thegenesorothergeneticmarkerslocatednearatthesamechromosomecanbeinheritedtogether,andtoformlinkage.6/6/202518例如：具體基因不明的遺傳病Hereditarydiseasecausedby

unidentifiedgenes用內切酶切正常母親DNA，雜交后出現(xiàn)7.6kb帶；同酶同方法檢查有遺傳病的父親，發(fā)現(xiàn)6.0和7.6kb兩種片斷，表明6.0kb與基因病有連鎖關系。這樣當胎兒羊水或胚胎絨毛細胞同樣處理后，僅出現(xiàn)7.6kb片段，表明胎兒正常，如果同時有6.0和7.6時，表明胎兒攜帶有父親的遺傳病基因。

6/6/2025191、Gene異常不明確的遺傳病的診斷例：成年型多囊腎病——APKD，AD，臨床表現(xiàn)為腰痛，蛋白尿，血尿，高血壓，腎盂性腎炎，腎結石。最終導致腎功能衰竭和尿毒癥。APKD——Gene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因產物的生化性質和疾病發(fā)病機理也尚未闡明，但已證實APKDGene與α珠蛋白基因3`端附近的一段小衛(wèi)星DNA序列（3`HVR）緊密連鎖，因此，可以通過RFLP連鎖分析進行診斷。6/6/202520

以3`HVR為probe與PvuII酶切后的家系有關成員的Gene組DNA雜交——SouthernBlot雜交Gene組DNAprobe（3`HVR）PvuII酶切

DNA片段

雜交結果6/6/202521

英國女王維多利亞。她帶有血友病的基因，并將其傳給了她的兒女。血友病是一種遺傳性凝血障礙疾病，患者可能因很小的傷口而出血不止導致死亡。血友病在女性一般表現(xiàn)為隱性遺傳，較少發(fā)病，但會傳給后代；在男性則表現(xiàn)為顯性遺傳，顯示出病癥。維多利亞女王在科堡主持的一次歐洲王室成員集會，與會者有17人是她的后裔，其中有她的孫女亞歷山德拉（21），她同俄國沙皇尼古拉二世結婚，導致他們的兒子患有血友病。6/6/202522PCR—RFLP診斷甲型血友病的基因診斷，已知甲型血友病XR，獲得家系成員基因組DNA。PCR142bpBcLI

142bp99bp43bp電泳結果分析？p1p2142bp99bp43bpBclIBclI-BclI+6/6/202523問:1/Ⅱ2、Ⅲ1診斷；2/Ⅲ1是男或是女發(fā)?。?/p>

142bp99bp12123ⅠⅡIII16/6/202524結果分析1）先癥者II2具有99bp片段而發(fā)病，該片段來自母親。2）II2有142bp/99bp雜合子。142bp來自父親，為正常片段，99bp片段是來自母親而成為攜帶者。3）Ⅲ1為99bp片段如果是男性為患者（99bp片段來自母親）；女性為攜帶者（來自父母雙方）6/6/202525連鎖分析(geneticlinkageanalysis

)就是在家系成員中尋找患病成員共同具有的比正常成員出現(xiàn)頻率更高的染色體片段.Thesearchforcertain

chromosomefragmentsthatarefoundinpeoplewithadisorderaremorefrequentlythanyouwouldexpectinpeoplewithoutthedisorder.6/6/202526在這個區(qū)域內具有疾病傾向的基因Thegenewithsusceptibilitytodiseaseislocatedintheregion.6/6/202527遺傳標記選擇Geneticmarkerselection

：多標記原則Mult-markerprinciple靠近原則Convergenceprinciple6/6/202528不是尋找DNA缺陷(DNAdeficiency),而是通過分析DNA遺傳標記多態(tài)性來判斷被檢者是否具有帶致病基因的染色體,判斷被檢者患病的可能性Itisananalysisofpolymorphismofgeneticmarkertodecidewhetherthechromosomeiscarryingthepathogenicgene,butnotasearchforDNAdeficiency.6/6/202529（三）通過基因表達的定量分析診斷疾病Diagnosisofdisordersviaquantitativeanalysisofgeneexpression基因表達水平的變化,可引起相應蛋白質的含量變化。variationin

geneexpressionlevelsisrelatedtovariationin

itsproteinlevels

6/6/202530定量PCR技術可用于基因診斷，也可用于治療效果監(jiān)控。Applicationofreal-timepolymerasechainreactiontogenediagnosisandmonitoringoutcomeoftherapy6/6/2025316/6/202532四、基因診斷存在的問題及前景Problemsandprospects

inthegenediagnosis1、理論問題theoryproblems.6/6/202533已找到的致病基因不多，弄清機制的就更少?；蛟\斷失去了基礎。Littleisknownaboutpathogenicgenes,andlessisknownaboutthemechanism.Genediagnosislosesitsfoundation6/6/2025342、技術問題technicalproblems

對設備及條件要求高、所需試劑價格昂貴。highrequirementsforequipmentsandconditions&highexpenseforessentialregents

6/6/202535技術復雜、精細，對操作人員的要求高。Thevarietyandcomplexityoftechnologyhasalsogrownandweneedaprofessionthatdealswiththissituation6/6/202536技術靈敏度高，很容易受到污染而出現(xiàn)假陽性。Falsepositiveresultsmaybeobtainedbycontaminationduetothehighsensitivityoftechniques

.6/6/2025373、倫理問題ethicalconcerns可能引起基因歧視（Itmaycauseageneticdiscriminationbygenediagnosis）

6/6/2025386/6/202539基因診斷的發(fā)展前景Futureprospectsforgenediagnosis

呈現(xiàn)十分廣闊的應用前景，發(fā)展?jié)摿薮蟆?/p>

genediagnosishasawideapplicationandagreatpotentialinfuture.6/6/202540五、已進行基因診斷的遺傳病Inheriteddisordersdetectedbygenediagnosis（一）血紅蛋白病（hypochromia）鐮狀細胞貧血（sicklecellanemia）→珠蛋白基因globingeneCodon6GAG→GTGA-T突變谷氨酸(Ghe)→纈氨酸（vol）

6/6/202541α（β）地中海貧血α（β）MediterraneanSeaanemia

α（β）珠蛋白基因缺失，珠蛋白mRNA含量減少，珠蛋白α（β）鏈合成不平衡。Defectinα（β）globin,andreductionofglobinmRNAproduction,whichleadstoanimbalanceinα:βchainratio.6/6/202542診斷Diagnosis：PCR-ASO（allelespecificoligonucleotide,ASO)6/6/202543定性分析(qualitativeanalysis)：PCR定量分析(quantitativeanalysis)

：實時定量RT-PCRReal-timequantitativePCRassay

6/6/202544杜氏肌營養(yǎng)不良（Duchennemusculardystrophy,DMD)---性連鎖隱性遺傳?。⊿ex-LinkedRecessiveInheritance），抗肌萎縮蛋白（dystrophin）基因突變所致DuchenneMuscularDystrophyiscausedbythegenemutationofdystrophin.6/6/202545苯丙酮尿癥（phenylketonuria，ＰＫＵ）－－常染色體隱性遺傳氨基酸代謝病autosomalrecessivegeneticdisorders

ofaromaticaminoacidmetabolism

苯丙氨酸羥化酶基因突變phenylalaninehydroxylasegenemutation丙氨酸羥化酶缺乏phenylalaninehydroxylasedeficiency6/6/202546脆性Ｘ綜合癥fragileXsyndromeFMR-1基因的微衛(wèi)星序列（CGG）n改變，導致功能變異。ThemutationinCGGrepeatofFMR1geneleadstoalteredfunction.6/6/202547可通過檢測串聯(lián)重復序列的長度來進行。Wecanexaminethediseasebydetectingthelengthoftandemrepeatsequences.6/6/202548

基因診斷技術檢測腫瘤Therolesofgenediagnosistechnologyindetectionofcancer１）腫瘤的早期診斷和預警診斷Earlydiagnosis&earlywarningoftumours6/6/202549２）高危（易感）人群篩查及危險性評估Screenforhighriskorsusceptiblegroup&RiskAssessment

6/6/202550３）腫瘤鑒別診斷、分期、預后判斷Distinctivelydiagnosis,stagingandprognosis４）微小轉移灶識別Detectionofmicrometastases

6/6/202551５）治療效果監(jiān)測及評價Assessment&surveillanceof

therapyeffects6/6/202552對不同腫瘤、不同目的，采取不同的基因診斷策略

Differentstrategiesfor

differenttumorcells,

differentpurposes6/6/202553腫瘤基因診斷主要策略有Mainstrategiesforidentifyinggenesinvolvedintumours檢查腫瘤染色體易位及融合基因Detectionofchromosometranslocation&fusiongenes

6/6/202554檢查癌基因與抗癌基因Detectionofoncogenes&tumorsuppressorgenes6/6/202555檢測腫瘤相關基因Detectionoftumor-relatedgene

檢測腫瘤標志物或mＲＮＡ等DetectionofmarkersandmRNAoftumor6/6/202556基因診斷技術檢測感染性疾病Genetherapytechnologies

inthediagnosisofinfectiousdiseases

細菌、病毒、寄生蟲感染(infectionofbacteria,virusandparasite）6/6/2025576/6/202558第二節(jié)基因治療（genetherapy）是現(xiàn)代分子生物學技術與醫(yī)學學科交叉滲透而形成的一個全新治療領域。Genetherapyisanewcross-discipline,whichcoverstechnologiesinmodernmolecularbiologyandmedicalscience.6/6/2025596/6/202560基因治療早期是將目的基因導入靶細胞內，成為宿主細胞遺傳物質的一部分，Earlypurposeofgenetherapyistomaketargetgenesbecomeapermanentpartofthehostcell'sgeneticmaterialbyinsertingtheirgeneticmaterialintothechromosomesofhostcells.

6/6/202561目的基因的表達產物對疾病起治療作用。

Therapeuticeffectofexpressionproductsofgenesofinterestondiseases.6/6/202562現(xiàn)在:將正?；驅氩∽兗毎?，替代或與缺陷基因共存，產生正常表達產物補充缺陷蛋白質Delivernormalcopyofageneintopathologicalcellstosupplementtheproteinthatarenotexpressingenough.6/6/202563抑制細胞內過度表達的基因；Delivernucleicacidthatwillinactivateanover-expresseddeleteriousprotein.6/6/202564將特定基因導入非病變細胞，在體內表達特定產物；andtransfergivengeneintonormalcellstoletitexpressgivengeneproducts.6/6/202565向功能異常細胞中導入該細胞中本來不存在的基因，利用表達產物達到治療疾病的目的。addafunctionalcopyofthetherapeuticgenetocellswithdysfunctionthatoriginallydonotexpressit.

利用基因產生治療效應。andmakeuseofgenestoproducethetreatmenteffect6/6/202566第一節(jié)基因治療策略

Strategiesforgenetherapy基因置換（genereplacement）或基因矯正（genecorrection）－－將特定目的基因導入特定細胞置換原有的缺陷基因。Anormalcopyofagenemaybeintroducedintocellstoreplaceadefectivecopy.6/6/202567必要條件是：Essentialconditions對導入的基因及其產物有詳盡的了解.Fullunderstandingaboutthetransferredgeneanditsgeneproductisessential.能有效的導入靶細胞Theabilityofbeing

transferredefficientlyintotargetcells

在靶細胞中長期穩(wěn)定存在Long-termandstablegeneexpressionintargetcellsisdesired.6/6/202568導入基因有適度水平的表達Keepingtransferredgeneexpressingatamoderatelevel.導入方法及載體對細胞無害Themethodsofgenetransferandvectorsmustbeharmlesstothetargetcells.6/6/202569一般采用同源重組技術（homologousrecombination）又稱基因打靶（genetargeting）Generallyadoptthistechniqueofhomologousrecombination,genetargeting.6/6/2025706/6/2025716/6/202572２.基因替代(genereplacement)、基因添加(geneaddition)、基因補充(genesupplement)、

.6/6/2025731)針對特定的缺陷基因,導入相應的正?；?缺陷基因并未除去)Transferafunctionalcopyofthegeneintotargetcellsbyaimingataparticulardefectgene

(andthedefectedgenecanbekept).2)導入靶細胞本來不表達的基因(將細胞因子導入腫瘤細胞)Transfertheinterestgeneintotargetcellsthatareoriginallynotexpressingthegeneproduct(bygettingcytokineintotumorcells)6/6/2025743.基因干預(geneinterference)采用某些方式抑制某個基因的表達或通過破壞某個基因的結構使之不能表達,達到治療目的.Toattainthetreatmentpurpose,geneinterferenceiseithertoextinguishexpressionfromthemutationalleleorbreakthestructureofacertaingene.6/6/202575三種策略是以恢復細胞正常功能或干預細胞功能為目的.Thepurposeofabovethreestrategiesistoresumethenormalfunctionorintervenethefunctionofcells.6/6/2025764.細胞自殺效應Suicidegenetherapy

通過導入自殺基因,誘發(fā)細胞自殺效應也是重要的治療策略.Inductionofsuicideeffectviadeliveryof“suicide”genesintotargetcells,suchastumorcellsisalsoanimportanttreatmentstrategy

6/6/202577自殺基因是病毒、細菌等原核生物中具有特殊功能的酶類基因，此類基因轉入哺乳動物細胞后產生的酶能將無毒或毒性極低的藥物前體轉化成細胞毒性代謝產物，導致腫瘤細胞自殺，因此又稱為病毒導向酶解藥物前體療法(VDEPT).6/6/2025786/6/2025795、基因修飾(genemodification)也屬于基因添加，但目的不是修復、改善細胞功能，而是改變細胞功能。6/6/2025801）基因修飾腫瘤細胞的“疫苗”療法：將IL-2、TNF-導入腫瘤細胞，誘發(fā)抗腫瘤細胞毒性淋巴細胞反應；另分泌的細胞因子增強CTL和效應細胞反應。6/6/2025812）基因修飾TIL的過繼療法：將細胞因子導入腫瘤侵潤淋巴細胞中，使TIL具有更強的抗腫瘤作用6/6/2025823）免疫增強基因療法：將MHC-I類基因導入腫瘤細胞，增加其免疫原性。6/6/202583

第二節(jié)基因轉移技術Genetransfertechnologies

基因治療方式有兩種：Mannersofgenetherapy1）體內法（invivo）2）回體法（exvivo）6/6/202584CellsremovedfrombodyTransgenedeliveredCellsculturedCellsreturnedtothebodyExVivoInVivoTransgenedelivereddirectlyintohostStrategiesforTransgeneDelivery6/6/202585invivo即將外源性功能基因以逆轉錄病毒、質粒載體或脂質體類包囊，或以裸露DNA的形式直接注入體內，讓基因在體內表達。Amethodoflettingaforeignfunctionalgeneexpressinvivobytransferofretrovirusvector,plasmidvector,liposomeorthedirectinjectionof'nude'DNA.

6/6/202586exviro即將受體細胞（例如淋巴細胞、骨髓干細胞、皮膚或纖維細胞等）在體外培養(yǎng)導入外源性功能基因，然后把這種經遺傳修飾的受體細胞輸回或移植入患者體內，讓外源基因表達。Amethodoflettingaforeignfunctionalgeneexpressbytransferringthegeneintotargetcells(eg.Lymphocytes,hematopoieticstemcells,skinorfibercells,etc.)culturedexviro,andthentransfusingortransplantingthegeneticmodifiedcellsintothepatientbody.

6/6/2025876/6/2025886/6/202589基因治療必須通過適當?shù)幕蜣D移(genetransfer)技術,將外源基因轉移至特定細胞內.Genetherapyreliesintheconceptthat“foreign”genesmaybetransfertotargetcellsusingappropriategenetransfertechnologies6/6/202590基因轉移技術有兩大類Methodsofgenedelivery:生物學方法Biologicalmethods(病毒介導的基因轉移系統(tǒng)Viralmethods)非生物學方法Non-Biologicalmethods

(物理或化學方法PhysicalorChemicalmethods)6/6/202591逆轉錄病毒載體(retrovirusvector)是基因治療中最常用的載體,轉移效率較高.Themostcommonvirusvectorsthatareusedingenetherapyareretrovirusvectors一、基因轉移生物學方法Biologicmethodsofgenetransfer6/6/2025926/6/202593基因組是二倍體ss+RNAThegenomeisdiploid.類似真核mRNA，similarinstructuretoeucaryoticmRNA5`端帽狀結構，5`cappingstructure3`端多聚A尾,3`poly-Atail6/6/202594前病毒基因組結構特點：Charactersofprovirusgenome1)兩端各有一長末端重復序列LTR（由U3、R、和U5組成），LTR中含有啟動子、增強子、加尾信號。Alongterminalrepeat(LTR)ofendogenousretrovirusislocatedateitherendofgenome(composeofU3,RandU5).LTRcontainstheelementsincludingpromoter,enhancerandtailingsignal.6/6/202595

是病毒整合進細胞基因組的過程的關鍵結構。Itisthekeystructurefortheintegrationofviralgenomeintothechromosomeofhostcells,formingtheprovirus.

6/6/2025962）有三個結構基因:gag、plo和envItcontains3structuregenes,gag,ploandenv

分別編碼核心蛋白、逆轉錄酶和外殼（包膜）糖蛋白,encodingcoreprotein,reversetranscriptaseandenvelopeglycoprotein,respectively.6/6/202597

6/6/2025983）5‘端LTR下游有病毒包裝所必需的序列、引物結合位點等。Thereareasequencerequiredforefficientpackagingofvirusandaregionofprimerbindingsiteatthedownstreamof5’LTR.6/6/202599retrovirusvector6/6/2025100用于基因治療的逆轉錄病毒載體系統(tǒng)由兩部分組成：Retroviralvectorsystemthatcanbeusedforgenetherapyisconstitutedbytwoparts.將前病毒DNA中編碼蛋白的基因切除，Cutoffthegenegenesencodingviralproteins,保留順式元件、包裝信號,andkeepcis-actingelementsandpackagingsignals插入質粒toinsertaplasmid----逆轉錄病毒載體formingaretroviralvector.6/6/2025101包裝細胞（packagingcell）是將缺失了包裝信號及相關序列的缺陷型逆轉錄病毒（輔助病毒）導入哺乳動物細胞而制備成的特殊細胞。Packagingcellsareakindofspecialcelllinesthatcanenabledefectiveretrovirus(helpervirus)thatlackpackagingsignalsandcorrelationsequencetotransferintomammalcells.6/6/2025102將上兩部分結合使用即可產生攜帶治療基因，而只有一次感染能力的病毒顆粒------假病毒顆粒（pseudoviralparticles）Combineabovetwoparttoformpseudoviralparticlesthatcarrytherapygeneandcaninfect(ortransduce)targetcellsonlyonce.6/6/2025103假病毒感染效率非常高Highefficiencyoftransfection.用于體內基因治療時，只能感染增殖期細胞，有一定局限性。Thelimitedabilityofonlyinfectingdividingcellswhenusedingenetherapy.6/6/2025104逆轉錄病毒載體(retrovirusvectors)腺病毒載體（adenovirus,Advectors）腺相關病毒（adenoassociatedvirus，AAvvectors）載體單純皰疹病毒（herpessimpexvirusvectors）載體TypesOfViruses6/6/2025105NakedDNATargetCellTherapeuticProteinAAVRetrovirus/LentivirusAdenovirusNucleusGeneTherapyPrinciples6/6/20251066/6/20251076/6/2025108二、基因轉移非生物學方法脂質體（liposome）介導基因轉移利用陽離子脂質單體與DNA混合，可自動形成包埋外源DNA的脂質體，再通過細胞的內吞作用（endocytosis）將外源DNA轉移至細胞內。Liposome,positivelychargedlipiddroplets,caninteractwithnegativelychargedforeignDNAtowrapitupanddelivertocellsviaendocytosis.

6/6/20251092.細胞表面受體介導的基因轉移Genetransferviacellsurfacereceptors

受體介導的細胞內吞作用是轉移特異性外源物質進入細胞的一種方式。Receptor-mediatedendocytosis

isoneofmannersoftransferringforeignmatterintocells.6/6/2025110細胞膜上存在一些專一性受體，與相應的配體結合后，通過細胞的內吞作用，實現(xiàn)配體向細胞內轉移。Thespecificreceptorsofcellmembranecancombinewithcorrespondingligands,andtransfertheligandsintocellsviaendocytosis.6/6/20251116/6/2025112將外源DNA與已證明有細胞或組織親和性的配體偶聯(lián)，可使DNA具有靶向性。Thetarget-specificactionofgenedeliverycanbeincreasedbycouplingligandswithhighcellortissueaffinity

withforeignDNA..6/6/2025113偶聯(lián)通常用多聚陽離子(condensedcation)，如多聚賴氨酸(polylysine)來實現(xiàn)。Couplingcanberealizedbycondensedcation,suchaspolylysine6/6/2025114如：僅在肝細胞表面的去唾液酸糖蛋白（ASGP）受體，它的天然配體是ASGP。帶有這種配體的DNA復和物可被定向送入肝細胞。Asialoglycoproteinreceptor(ASGP—R)isonlyexpressonthesurfaceofhepatocytes,anditsnaturalligandisasialoglycoprotein.DNAcomplexcarryingtheligandcanbetransferreddirectionallyintohepatocytes.6/6/20251153.直接注射進行基因轉移(DNAinjection)–直接將裸DNA注入動物或器官組織內。‘Nude’DNAisdirectlyinjectedintoanimalsor

tissues.

6/6/2025116外源基因在肌肉中的表達量與注入的DNA含量成正比；TheamountofforeigngeneexpressionsinmuscleisindirectratiotothatofDNAdeliveredbyintramuscularinjection.重復注射比一次注射效果好。Theeffectofrepeatedinjectionismoreeffectivethanthatofsingleinjection.6/6/20251176/6/2025118優(yōu)點：Advantages制備簡單easytohandle排除病毒致癌的潛在危險withoutcarcinogenic

riskofvirus6/6/2025119不需整合即可表達expressionwithoutneedingintegration可反復使用andcanbeadministeredagainandagain.6/6/2025120三、基因轉移的靶細胞

Targetcellsusedingenetransfer目前條件下，基因治療僅限于體細胞（嚴禁進行生殖細胞的基因治療操作）Allcurrenthumangenetherapyapproachesaretargetedtosomaticcellsnotgerm-linecells.6/6/20251216/6/2025122

Somaticgenetherapy

6/6/2025123

選擇轉移基因的靶細胞，要考慮幾點：Howtoselecttargetcellsforgenetransfer?1）最好是組織特異性細胞Tissuespecificcellsarebetter.2）細胞較易獲得，Itiseasytoobtain.3)生命周期較長Lifecycleislong.

6/6/20251244）易受外源物質轉化Itiseasytobetransformbyforeignfactors5）轉染后細胞仍易成活Itiseasytosurviveaftertransfection.

6/6/2025125目前已開展的研究的靶細胞有：Targetcellsinpresentstudies造血干細胞(hematopoieticstemcells)、淋巴細胞(lymphocytes)、皮膚成纖維細胞(skinfibroblasts)、肝細胞(hepatocytes)、血管內皮細胞(vascularendothelialcells,)、肌細胞(muscularcells,)、神經元和神經膠質細胞(neurons&glialcells)、腫瘤細胞(tumourcells)等andsoon.6/6/2025126exvivoretroviralvectors(oncoretroviralorlentiviral)invivoadenoviralvectorsAAVvectorslentiviralvectors6/6/2025127第三節(jié)基因治療的應用

applicationsofgenetherapy1990年基因治療的第一個病例是先天性腺苷脫氨酶(ADA)缺乏癥Thefirstdiseaseapprovedfortreatmentwithgenetherapywasadenosinedeaminase(ADA)deficiencyin1990.

6/6/2025128

美國醫(yī)學家W·F·安德森等人對腺甘脫氨酶缺乏癥（ADA缺乏癥）的基因治療，是世界上第一個基因治療成功的范例。

1990年9月14日，安德森對一例患ADA缺乏癥的4歲女孩謝德爾進行基因治療。這個4歲女孩由于遺傳基因有缺陷，自身不能生產ADA，先天性免疫功能不全，只能生活在無菌的隔離帳里。他們將含有這個女孩自己的白血球的溶液輸入她左臂的一條靜脈血管中，這種白血球都已經過改造，有缺陷的基因已經被健康的基因所替代。在以后的10個月內她又接受了7次這樣的治療，同時也接受酶治療。經治療后，免疫功能日趨健全，能夠走出隔離帳，過上了正常人的生活。

謝德爾，19996/6/2025129一、對遺傳病進行基因治療Genetherapyofhumangeneticdisease

研究范圍十分有限，須符合以下條件：Therangeofresearchisverylimited,whichmustmatchthefollowingconditions.1）在DNA水平上明確發(fā)病原因及機制Todefinethecausesandmechanisms

ofdiseasesattheDNAlevel.6/6/20251302）必須是單基因遺傳病Itmustbeamonogeneticorsingle－genedisease.6/6/20251313）表達不需要精確調控Accurateregulationofgeneexpression

isnotessential.4）該遺傳病不經治療有嚴重的后果Severeresultsmaybegotwithouttreatment.6/6/2025132二、對惡性腫瘤的基因治療CancerGeneTherapy較少涉及倫理問題，Lessethicsproblems臨床迫切需要，Itisneededurgentlyintheclinic.腫瘤的基因治療已走在前列。Thegenetreatmentoftumorshasalreadywalkedinadvance.6/6/2025133基因療法成為不少癌癥病人挽救生命的唯一選擇。Theonlychoiceistosavecancerpatients.6/6/2025134治療策略StrategiesofTherapy：導入抑癌基因以抑制癌的發(fā)展、轉移Transferoftumorsuppressorgenestoinhibittumorgrowthandmetastasis.6/6/2025135干擾癌基因的轉錄和翻譯，抑制癌基因活性Interferewithtranscriptionortranslationofoncogeneinordertoinhibitoncogeneactivity6/6/2025136對瘤組織進行細胞因子修飾，增強腫瘤細胞的免疫原性Modifycytokinegeneexpressionintumortissuebytransferring

genesto

enhanceimmuneresponse.導入自殺基因，殺傷癌細胞Transferofsuicidegenestocausedeathofcancercells.6/6/2025137三、病毒病的基因治療GeneTherapyofvirusdisease抗病毒基因治療十分引人注目。包括調節(jié)機體免疫功能和針對病毒本身兩個方面。Theanti-virusgenetherapyisveryarrestive.Regulationofimmunologicalfunctionanddirecttreatmentofvirusaretwowaysofanti-virusgenetherapy.6/6/2025138前者主要是將細胞因子（干擾素、白介素）的基因導入免疫細胞，誘導機體對病毒的細胞和體液免疫應答。

Transductionof

cytokinegeneseg.interferonandinterleukin

toinduceshumoralandcellularimmuneresponsesagainstvirus.6/6/2025139后者Thelatter：1）誘導對病毒RNA的降解inducedegradationofviralRNA2）抑制病毒與宿主細胞結合inhibitvirustocontactwithhostcells

3）干擾病毒基因組的轉錄起始interferethetranscriptioninitiationofviralgenome.6/6/2025140抑制病毒復制和蛋白合成inhibitviralreplicationandprotein

synthesisRNA干擾(RNAinterference,RNAi)6/6/2025141.干擾RNA，RNAi哺乳動物中的研究1999年才開始被認為是最有前途的核酸藥物《Science》雜志將這一新發(fā)現(xiàn)評為2002年度世界十大科學成就之首.6/6/2025142In1990,RNAsilencingwasfirstobservedinplants.Thisphenomenawascalled“cosuppression”or“PTGS”(posttranscriptionalgenesilencing).PlantCell,vanderKroletal.1990,2(4):291-299ThehistoryofsiRNA6/6/2025143a起始階段：由于RNA病毒感染、轉座子轉錄和外源導入基因表達等原因,生物體細胞內出現(xiàn)雙鏈RNA(dsRNA),dsRNA在一種具有RNaseⅢ樣活性的dsRNA特異性核酸內切酶(dsRNAspecificendonuclease,Dicer)作用下,被裂解成由正義和反義鏈組成的21～23nt的干擾性小RNA(smallinterferingRNA,或shortinterferingRNAs,siRNA).6/6/2025144b效應階段：目前認為該階段存在兩種假說模式,一種假說模式是認為siRNA作為向導序列,與RNA誘導的沉默復合物(RNAinducedsilencingcomplex,RISC)的無活性前體結合,在ATP參與下siRNA雙鏈結構解旋誘導形成有活性的RISC,活性RISC隨即與同源性靶向mRNA結合,在與siRNA反義鏈配對區(qū)域的中部切斷同源性靶向mRNA,使其降解,從而干擾基因表達,這稱為內源性核苷酸裂解(endonucleolyticcleavage)6/6/2025145另一種假說模式為隨機降解性多聚酶鏈反應(randomdegradativePCR),即siRNA作為針對靶向mRNA特殊引物,在RNA依賴性RNA多聚酶(RNAdependentRNApolymerase,RdRP)的作用下以靶向mRNA為模板合成靶向mRNA的互補鏈,使單鏈mRNA成為dsRNA,然后在Dicer酶的作用下被降解形成新的siRNA,新的siRNA又進入上述過程,反復循環(huán)，從而形成信號擴增系統(tǒng).6/6/2025146MechanismofShortinterferingRNAs—post-transcriptionalgenesilencing.6/6/2025147四、其他疾病的基因治療Genetherapyofotherdisorders人神經退化疾病humanneurodegenerativediseases

（如帕金森氏病Parkinson'sdisease)6/6/2025148Morethan1.5millionAmericanssufferfromParkinson'sdisease.Thereisnocure.Butnowthereisanewtreatmentthatmayimprovepatients'qualityoflif