速凍機削(切)牛、羊肉片河北省質(zhì)量技術監(jiān)督局發(fā)布本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由邢臺市質(zhì)量技術監(jiān)督局提出。本標準由河北省食品標準化技術委員會歸口。本標準起草單位：邢臺市標準化協(xié)會、邢臺市質(zhì)量技術監(jiān)督局橋東區(qū)分局。本標準主要起草人：謝群英、田文閣、郭少英、范淑敏、傅鋒、劉榮琴。1速凍機削(切)牛、羊肉片本標準規(guī)定了速凍牛、羊肉片的要求、試驗方法、檢驗規(guī)則、標志、包裝、運輸及貯存。本標準適用于以速凍生牛、羊肉為原料，經(jīng)過切片、整理、速凍、包裝制成的速凍牛、羊肉片(以下簡稱肉片)。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB2707鮮(凍)畜肉衛(wèi)生標準GB2762食品中污染物限量GB2763食品中農(nóng)藥最大殘留限量GB/T5009.11食品中總砷及無機砷的測定GB/T5009.12食品中鉛的測定GB/T5009.15食品中鎘的測定GB/T5009.17食品中總汞及有機汞的測定GB/T5009.33食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定GB/T5009.44肉與肉制品衛(wèi)生標準的分析方法GB/T5009.123食品中鉻的測定GB/T6543運輸包裝用單瓦楞紙箱和雙瓦楞紙箱GB7718預包裝食品標簽通則GB/T9695.19肉與肉制品取樣方法GB18406.3農(nóng)產(chǎn)品安全質(zhì)量無公害畜禽肉產(chǎn)品安全要求GB/T20940肉類制品企業(yè)良好操作規(guī)范JJF1070定量包裝商品凈含量計量檢驗規(guī)則《定量包裝商品計量監(jiān)督管理辦法》國家質(zhì)檢總局(2005)第75號令《食品標識管理規(guī)定》國家質(zhì)檢總局(2007)第102號令《動物性食品中獸藥殘留最高限量》農(nóng)業(yè)部2002年第235號公告3.1.1原料肉應來自非疫區(qū)，并持有當?shù)貏游锓酪弑O(jiān)督機構出具的檢疫證明。3.1.2原料肉的污染物限量應符合GB2762的規(guī)定。23.1.4原料羊肉的衛(wèi)生標準應符合GB2707規(guī)定的要求，原料質(zhì)量應符合GB/T9961規(guī)定的要求。羔羊肉應符合NY1165規(guī)定的要求。3.1.5原料牛肉的衛(wèi)生標準應符合GB2707規(guī)定的要求，原料質(zhì)量應符合GB/T17238中胴體牛肉各感官要求應符合表1的規(guī)定。煮沸后肉湯澄清透明，脂肪團聚集于表面，具有該品種肉眼可見異物無脆骨、硬骨及血管、臟器、淋巴、毛、絨。其他雜揮發(fā)性鹽基氮/(mg/100g)≤應符合GB2707的規(guī)定總汞(以Hg計)/(mg/kg)≤鉛(以Pb計)/(mg/kg)≤無機砷(以As計)/(mg/kg)≤鎘(以Cd計)/(mg/kg)≤鉻(以Cr計)/(mg/kg)≤應符合GB2762的規(guī)定亞硝酸鹽(以NaNO?計)/(mg/kg)≤農(nóng)藥殘留應符合GB2763的規(guī)定。3應符合GB/T20940規(guī)定的條件。將樣品置于白色磁盤內(nèi)，觀察凍結、顏色和肌肉組織狀態(tài)，嗅其氣味。采用直尺測量將樣品置于白色磁盤內(nèi)，用手觸、目測。稱取20g絞碎試樣，置于200ml燒杯中加100ml水，用表面皿蓋上加熱50℃~60℃,開蓋檢查氣味，繼續(xù)加熱煮沸20min～30min,檢查肉湯的氣味、滋味和透明度，在成品中隨機抽取樣品1000g,視室溫環(huán)境而定，待樣品完全解凍完畢后，稱4.3.3結果計算：按下式計算失水率X(%)=(M?-M?)/M×100………(1)X一解凍失水率(%);使用±1℃的非水銀溫度計，插入包裝中間部分2min,讀取溫度計度數(shù)。44.5.1揮發(fā)性鹽基氮：按GB/T5009.44的規(guī)定執(zhí)行。4.5.2鉛：按GB/T5009.12的規(guī)定執(zhí)行。4.5.3無機砷：按GB/T5009.11的規(guī)定執(zhí)行。4.5.4總汞：按GB/T5009.17的規(guī)定執(zhí)行。4.5.5鎘：按GB/T5009.15的規(guī)定4.5.6鉻：按GB/T5009.123的規(guī)定執(zhí)行。按GB18406.3的規(guī)定執(zhí)行。同一班次、同一規(guī)格、同一品種的產(chǎn)品為一批。5.2.4凈含量、感官、菌落總數(shù)為每批必檢項目，其它項目做——原料、工藝有較大改變，影響到產(chǎn)品性能時；——產(chǎn)品停產(chǎn)三個月以上恢復生產(chǎn)時；——出廠檢驗結果與上次型式檢驗有較大差異時；5——國家質(zhì)量監(jiān)督機構提出進行型式檢驗要求時。5.3.2型式檢驗的抽樣方法和數(shù)量5.3.3從任一批產(chǎn)品中，隨機抽取2kg。1kg用于檢驗，1kg留樣備用。5.3.4型式檢驗項目：包括本標準3.2～3.8中的項目。5.4.1.1出廠檢驗項目全部符合本標準，判為合格品。5.4.1.2出廠檢驗項目有一項不符合本標準，可以加倍抽樣復檢。復檢后仍不符合本標準則判為不合5.4.1.3微生物指標一項不符合本標準，判為不合格品，不應復檢。5.4.2.2型式檢驗項目不超過3項不符合本標準，可以加倍抽樣復檢。復檢后有一項不符合本標準，判為不合格品。超過3項不符合本標準，不應復檢，判為不合格品。5.4.2.3微生物指標不符合本標準，判銷售包裝的標簽應符合GB7718的規(guī)定的要求。應標明：產(chǎn)品名稱、凈含量、廠名、廠址、產(chǎn)地、產(chǎn)品的標識應符合《食品標識管理規(guī)定》的要求。產(chǎn)品的運輸標志應符合GB/T6388的規(guī)定。內(nèi)包裝材料應符合國家衛(wèi)生標準和有關規(guī)定，外包裝箱應符合GB/T6543的規(guī)定。輛應采用機械制冷冷藏車在—15℃環(huán)境下運輸。運輸中防止擠壓、雨淋，裝卸時輕搬輕放。應在冷凍條件下銷售，低溫陳列柜內(nèi)產(chǎn)品的溫度不得高于-18℃,產(chǎn)品的儲存和陳列應與未包裝的67.4.1倉庫要求；庫溫應達到-18℃,溫度升降幅度不超過2℃,并且保持衛(wèi)生潔凈。7(規(guī)范性附錄)聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)方法及即時聚合酶鏈反應(real-timepolymerasechainreaction,RT-PCR)方法。A.2.1裝置(注1)A.1.1.2旋渦混合器(VortexA.1.1.3真空干燥裝置：供DNA干燥用。A.1.1.4真空冷凍干燥裝置：溫度可達-40℃以下，真空度可達133mBar以下，供檢體干燥用。A.1.1.5加熱震蕩器：具55℃溫控及震蕩功能。A.1.1.6微量冷凍離心機：可達20,000×g,并具4℃溫控功能。A.1.1.7離心機：供各式離心管離心用。A.1.1.8聚合酶鏈反應器：ABIPRISM9700SequenceDetectoA.1.1.9即時聚合酶鏈反應器(注2):ABIPRISM7700SequenceDetector或A.1.1.11震蕩型粉碎機：RetschMM200,或同級品。A.1.1.12照相裝置：供拍攝電泳膠片用。A.1.1.13紫外燈箱：具波長312nm、365nm紫外燈。A.1.1.14冷凍設備：具冷藏及凍結功能。A.1.1.17水浴裝置：溫差在±1℃以內(nèi)者。A.1.1.18天平：最大秤重量為2,000g,靈敏度為0.1g;最大秤重量為100g,靈敏度為1mA.1.2試劑A.1.2.1DNA抽取用：RNase、乙醇(96-100%)均采分子生物分析級試劑，DNeasyTissue套組。8A.1.2.2.2動物類(標的基因：16SribosomalRNA)引子F:SF,5'-AAGACGAGAAGACCCT(A/G)TGGA(A/G)CTTTA-3'引子R:SR,5'-GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA-3'PCR增幅產(chǎn)物大小234-265bpA.1.2.2.3哺乳類及家禽類(標的基因：myostatin)引子F:MYF,5'-TTGTGCAAATCCTGAGACTCAT-3'引子R:MYR,5'-ATACCAGTGCCTGGGTTCAT-3'PCR增幅產(chǎn)物大小97bpA.1.2.2.4魚類(標的基因：16SribosomalRNA)引子F:FSF,5'-CGCAAGGGAAAGCTGAAAGAGA-3'引子R:FSR,5'-TCGGTAGGTTTGTCACCTCTACTC-3'PCR增幅產(chǎn)物大小234bpA.1.2.3.1動物類(標的基因：16SribosomalRNA)引子F:SF,5'-AAGACGAGAAGACCCT(A/G)TGGA(A/G)CTTTA-3'引子R:SR,5'-GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA-3'探針P:SP,5'-(FAM)-TT(C/T)GGTTGGGGTGACCTCGG(A/G)GT-(TAMRA)-3'PCR增幅產(chǎn)物大小234-265bpA.1.2.3.2哺乳類及家禽類(標的基因：myostatin)引子F:MYF,5'-TTGTGCAAATCCTGAGACTCAT-3'引子R:MYR,5'-ATACCAGTGCCTGGGTTCAT-3'探針P:MYP,5'-(FAM)-CCCATGAAAGACGGTACAAGGTATACTG-(TAMRA)-3'PCR增幅產(chǎn)物大小97bpA.1.2.3.3魚類(標的基因：16SribosomalRNA)引子F:FSF,5'-CGCAAGGGAAAGCTGAAAGAGA-3'引子R:FSR,5'-TCGGTAGGTTTGTCACCTCTACTC-3'探針P:FSP,5'-(FAM)-TCCCACTCTTTTGCCACAGAGACGG-(TAMRA)-3'PCR增幅產(chǎn)物大小234bpA.1.2.4去氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate,dNTP)含去氧腺苷三磷酸(deoxyadenosinetriphosphate,dATP),去氧胞苷三磷酸(deoxycytidinetriphosphate,dCTP),去氧鳥嘌呤苷A.1.2.5聚合酶TaqDNApolymA.1.2.6TaqManUniversalPCRMasterMix(確認試驗用，適用于ABIPRISM7700)內(nèi)含PCR所需去氧核糖核苷三磷酸、聚合酶等試劑，使用者僅需自行添加引子、探針及待測檢體9A.1.2.7LightCycler-FastStartDNAMasterHybridizationProbes(確認試驗用，適用于RocheLightCycler)內(nèi)含PCR所需去氧核糖核苷三磷酸、聚合酶等試劑，使用者僅需自行添加引子、探針及待測檢體A.1.2.8電泳用：溴化乙錠(ethidiumbromide)、瓊脂(agarose)、溴酚藍(-EDTA)、三羥甲基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)amino物分析級試劑。DNA分子量標記物質(zhì)(DA.1.2.9對照用物質(zhì)：肉類、血液及其組織器官等皆可，或使用行政院衛(wèi)生署藥物食品檢驗局提供編A.1.4試劑的配制A.1.4.15倍TBE(Tris-borate-EDTA稱取三羥甲基氨基甲烷54g、硼酸27.5g及0.5MpH8.0EDTA溶液20mL,加水溶解后定容至1000mL,供作5倍TBE緩沖溶液。臨用前以水稀釋為0.5倍。稱取瓊脂2g,加入0.5倍TBE緩沖溶液100mL,加熱攪拌至瓊脂完全溶解，適當冷卻后，倒A.1.4.36倍載入膠片緩沖溶液(6×gelloadingbuffer)稱取溴酚藍25g、二甲苯藍0.25g及量取甘油30mL,加入無菌純水使成100mL,并置于4℃A.1.4.4膠片染液稱取溴化乙錠0.1g,加水10mL溶解，供作原液(含溴化乙錠10mg/mL),使用前需以水稀鑒別試驗用10倍PCR緩沖溶液(含15mMMgCl?)2.5μL模版DNA溶液(總量100ng)5.0μL總體積25.0μL5μM引子F1.25μL5μM引子R1.25μL3.3μM探針P1.7μL模版DNA溶液(總量100ng)5.0μL無菌純水3.3μLA.1.4.5.3RocheL5μM引子F1.5μL5μM引子R1.5μL3.3μM探針P1.5μL模版DNA溶液(總量100ng)5.0μLA.1.5檢體DNA的制備檢體為干燥肉干或粉(碎)狀者，可直接以粉碎機研磨成細粉。檢體為涇狀肉塊或肉加工品，經(jīng)冷凍干燥處理后，再以粉碎機研磨成細粉備用。檢體需貯存于干燥及冷藏或冷凍環(huán)境中。A.1.5.2DNA的抽取(DNeasyspincolumn)、收集管、AW1、AW2與AE試劑),亦可采用其他市售套組。A.1.5.2.3于55℃振蕩反應直到檢體溶解。A.1.5.2.5水浴70℃,10分鐘。A.1.5.2.6加入乙醇(96-100%)200μL,以旋渦混合器混合均勻。A.1.5.2.7取混合液注入離心管柱，以≥6,000×g(8,000rpm)離心1分鐘，并將收集管及濾液丟rpm)離心1分鐘后，將收集管及濾液丟棄。A.1.5.2.9將離心管柱套入新的收集管，注入AW2試劑500μL到離心管柱，以20,000×g(14,000rpm)離心3分鐘后，將收集管及濾液丟棄。A.1.5.2.10將離心管柱套入新的1.5mL離心管。A.1.5.3.1檢體DNA溶液于使用前自冷凍庫中取出，于室溫下進行溶解。A.1.5.3.2取適當量的DNA溶液以無菌純水做適當倍數(shù)的稀釋，分別測定260nm及280nm的吸光值 /0.D.280比值作判斷，其比值應介于1.7～2.0間。(注9)以無菌純水適當稀釋DNA溶液、引子備用。取PCR反應管，并依照2.5.5.1.節(jié)配制PCR溶液，依序加入無菌純水、10倍PCR緩沖溶液、dNTP、引子、DNApolymerase及DNA溶后，將反應管置于離心機瞬間離心，使混合液聚集于反應管的底部。移入PCR反應器，依據(jù)引子類別并參照節(jié)設定反應條件，進行反應，結束后，取出PCR增幅產(chǎn)物，進行電泳分析。溫度時間1.最初變性測試動物類基因測試哺乳類及家禽類基因測試魚類基因5.最終延展步驟2至步驟4,共進行40個循環(huán)反應。A.1.6.3膠片電泳分析取適量的6倍載入膠片緩沖溶液，分別與無菌純水(空白組)及PCR增幅產(chǎn)物混合均勻，注入2%膠片孔中，以50或100伏特電壓進行電泳。同時，必須取DNA分子量標記物質(zhì)進行電泳，作為PCR增幅產(chǎn)物大小的判別與計算依據(jù)。經(jīng)電泳后的膠片置入膠片染液中進行染色約15分鐘，續(xù)置入水中漂洗及褪染，再置于紫外燈箱上，以波長365nm的紫外光照射觀察是否有明顯的DNA熒光判，并判讀結A.1.6.4鑒別檢體DNA的PCR增幅產(chǎn)物電泳結果，須與正反應對照組及DNA分子量標記物質(zhì)的電泳結果進行相互比對，當檢體DNA與正反應對照組DNA二者皆出現(xiàn)PCR增幅產(chǎn)物，且經(jīng)由DNA分子量標記物質(zhì)估算PCR增幅產(chǎn)物大小介于234-265bp者(10),即判定該檢體含有動物性成分。A.1.6.4.2測試哺乳類及家禽類基因：檢體DNA的PCR增幅產(chǎn)物電泳結果，須與正反應對照組及DNA分子量標記物質(zhì)的電泳結果進行相互比對，當檢體DNA與正反應對照組DNA二者皆出現(xiàn)PCR增幅產(chǎn)物，且經(jīng)由DNA分子量標記物質(zhì)估算PCR增幅產(chǎn)物大小為97bp者，即判定該檢體含有哺乳類或家禽類動物性成分。檢體DNA的PCR增幅產(chǎn)物電泳結果，須與正反應對照組及DNA分子量標記物質(zhì)的電泳結果進行相互比對，當檢體DNA與正反應對照組DNA二者皆出現(xiàn)PCR增幅產(chǎn)物，且經(jīng)由DNA分子量標記物質(zhì)估算PCR增幅產(chǎn)物大小為234bp者，即判定該檢體含有魚類動物性成分。A.1.7.1.1RT-P以無菌純水適當稀釋檢體DNA溶液、引子及探針備用。取適量無菌純水，并依照2.5.5.2.節(jié)配再各別加入稀釋過的檢體DNA溶液5μL,最后將PCR反應管置于離心機中，以200×g(1,500rpm)瞬間離心，移入RT-PCR反應器，依下列條件進行反應。每次實驗皆須制作負反應及正反應對照組。溫度時間1.熱活化測試動物類基因測試哺乳類及家禽類基因測試魚類基因5.冷卻步驟3至步驟4,共進行45個循環(huán)反應。A.1.7.1.2RT-PCR-RocheLightCycler以無菌純水適當稀釋檢體DNA溶液、引子及探針備用。取適量無菌純水，并依照2.5.5.3.節(jié)配混合均勻后，分裝1