ADAM28在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用與分子機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義黑色素瘤是一種起源于黑色素細(xì)胞的高度惡性腫瘤，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，近年來(lái)黑色素瘤的發(fā)病率以每年3%-7%的速度增長(zhǎng)，成為增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤之一。黑色素瘤具有極高的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，早期即可發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，一旦病情進(jìn)展至晚期，患者的5年生存率僅為15%-20%，給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。在黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，涉及眾多分子機(jī)制的異常改變，尋找關(guān)鍵分子并揭示其作用機(jī)制，對(duì)于黑色素瘤的早期診斷、精準(zhǔn)治療及改善患者預(yù)后具有重要意義。ADAM28作為ADAM家族的重要成員，近年來(lái)逐漸成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)分子。ADAM28具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，包含金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域、去整合素結(jié)構(gòu)域等，使其在細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)相互作用以及信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。已有研究表明，ADAM28在多種腫瘤中呈現(xiàn)異常表達(dá)，且與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成等密切相關(guān)。在乳腺癌中，ADAM28高表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的存活和增殖能力；在肺癌中，ADAM28參與腫瘤微環(huán)境的調(diào)控，促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供有利條件。然而，ADAM28在黑色素瘤中的研究尚處于起步階段，其具體作用機(jī)制及臨床價(jià)值仍有待深入探索。深入研究ADAM28在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制，不僅有助于揭示黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制，為黑色素瘤的治療提供新的靶點(diǎn)和策略，還可能為其他惡性腫瘤的研究提供借鑒和參考，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2黑色素瘤概述黑色素瘤是一種起源于黑素細(xì)胞的高度惡性腫瘤，多發(fā)生于皮膚，也可累及黏膜、眼葡萄膜等部位。其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及遺傳因素、紫外線照射、免疫功能異常等多個(gè)方面。根據(jù)其病理特征和臨床表現(xiàn)，黑色素瘤主要分為以下幾種類型：肢端型黑色素瘤，在亞洲人群中較為常見(jiàn)，多發(fā)生于指（趾）甲、手掌、足底等肢端部位；惡性雀斑樣痣型黑色素瘤，常發(fā)生于老年人的曝光部位，如面部，腫瘤生長(zhǎng)緩慢，但侵襲性較強(qiáng)；淺表擴(kuò)散型黑色素瘤，可發(fā)生于身體任何部位，以軀干和四肢多見(jiàn)，表現(xiàn)為邊界不規(guī)則、顏色不均勻的斑片，易早期發(fā)生轉(zhuǎn)移；結(jié)節(jié)型黑色素瘤，惡性程度較高，腫瘤呈結(jié)節(jié)狀隆起，生長(zhǎng)迅速，易發(fā)生潰瘍和轉(zhuǎn)移。近年來(lái)，黑色素瘤的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈顯著上升趨勢(shì)。據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，全球黑色素瘤的新發(fā)病例數(shù)從1990年的約9.1萬(wàn)例增加到2020年的約32.7萬(wàn)例，年增長(zhǎng)率約為4.4%。在我國(guó)，黑色素瘤的發(fā)病率雖相對(duì)較低，但增長(zhǎng)速度較快，已成為增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤之一。黑色素瘤的危害極大，其惡性程度高，早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。一旦病情進(jìn)展至晚期，患者的5年生存率僅為15%-20%，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散是黑色素瘤最為嚴(yán)重的危害之一，癌細(xì)胞可通過(guò)血液和淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至全身各個(gè)器官，如肺、肝、腦、骨等，導(dǎo)致相應(yīng)器官功能受損，引發(fā)一系列嚴(yán)重并發(fā)癥，如肺轉(zhuǎn)移可導(dǎo)致呼吸困難、咯血；肝轉(zhuǎn)移可引起肝功能異常、黃疸；腦轉(zhuǎn)移可出現(xiàn)頭痛、嘔吐、偏癱等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，甚至危及生命。目前，黑色素瘤的治療手段主要包括手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療、免疫治療和靶向治療等。手術(shù)治療是早期黑色素瘤的主要治療方法，通過(guò)完整切除腫瘤組織，可達(dá)到根治的目的。然而，對(duì)于晚期黑色素瘤患者，手術(shù)治療往往難以徹底清除腫瘤細(xì)胞，且術(shù)后復(fù)發(fā)率較高。放射治療利用高能射線殺死腫瘤細(xì)胞，可用于輔助手術(shù)治療或緩解晚期患者的癥狀，但放療對(duì)正常組織也有一定的損傷，且易產(chǎn)生放射性皮炎、放射性肺炎等并發(fā)癥。化學(xué)治療通過(guò)使用化療藥物抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂，常用的化療藥物包括達(dá)卡巴嗪、替莫唑胺等。然而，化療藥物的副作用較大，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，且黑色素瘤對(duì)化療藥物的敏感性較低，治療效果有限。免疫治療和靶向治療是近年來(lái)黑色素瘤治療領(lǐng)域的重要突破，免疫治療通過(guò)激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)來(lái)攻擊腫瘤細(xì)胞，如PD-1抑制劑、CTLA-4抑制劑等，在部分患者中取得了較好的療效；靶向治療則針對(duì)腫瘤細(xì)胞中的特定分子靶點(diǎn)，如BRAF抑制劑、MEK抑制劑等，具有較高的特異性和有效性。然而，免疫治療和靶向治療也存在一定的局限性，如部分患者對(duì)治療藥物不敏感、易產(chǎn)生耐藥性，且治療費(fèi)用高昂，限制了其臨床應(yīng)用?，F(xiàn)有治療手段對(duì)于黑色素瘤的治療仍存在諸多挑戰(zhàn)，尤其是晚期黑色素瘤患者的治療效果仍不理想，迫切需要尋找新的治療靶點(diǎn)和策略，以提高黑色素瘤的治療水平，改善患者的預(yù)后。1.3ADAM28簡(jiǎn)介ADAM28，全稱去整合素和金屬蛋白酶28（adisintegrinandmetalloproteinase28），是ADAM家族中的重要成員。其基因位于人類染色體4q21，由19個(gè)外顯子和18個(gè)內(nèi)含子組成，編碼的蛋白質(zhì)包含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域。從結(jié)構(gòu)上看，ADAM28具有典型的ADAM家族蛋白結(jié)構(gòu)特征，N端為信號(hào)肽序列，引導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)；接著是前肽結(jié)構(gòu)域，對(duì)酶原的激活起到調(diào)控作用；催化結(jié)構(gòu)域含有鋅離子結(jié)合位點(diǎn)，賦予ADAM28金屬蛋白酶活性，能夠特異性地水解細(xì)胞外基質(zhì)中的多種蛋白質(zhì)，如膠原蛋白、纖連蛋白等，在細(xì)胞外基質(zhì)的重塑和降解過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。去整合素結(jié)構(gòu)域則富含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列，可與細(xì)胞表面的整合素受體結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附與相互作用，影響細(xì)胞的遷移、侵襲等生物學(xué)行為；富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域、表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域以及跨膜結(jié)構(gòu)域等，這些結(jié)構(gòu)域共同協(xié)作，參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和存活等過(guò)程。對(duì)于分泌型ADAM28，其缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域，可分泌到細(xì)胞外環(huán)境中，在細(xì)胞外發(fā)揮作用。在功能方面，ADAM28參與多種生理和病理過(guò)程。在正常生理狀態(tài)下，ADAM28在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，ADAM28參與細(xì)胞的遷移和分化，對(duì)器官的形成和發(fā)育至關(guān)重要；在組織修復(fù)過(guò)程中，ADAM28通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的代謝和細(xì)胞間的相互作用，促進(jìn)受損組織的修復(fù)和再生；在免疫調(diào)節(jié)方面，ADAM28參與免疫細(xì)胞的活化、遷移和免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)，維持機(jī)體的免疫平衡。在病理狀態(tài)下，ADAM28與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其是在腫瘤領(lǐng)域，ADAM28的異常表達(dá)已被證實(shí)與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成等過(guò)程密切相關(guān)。在乳腺癌細(xì)胞中，ADAM28高表達(dá)可通過(guò)激活MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活；在結(jié)直腸癌中，ADAM28能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件，同時(shí)還可通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成和免疫逃逸。在腫瘤研究中，ADAM28占據(jù)著重要地位。一方面，ADAM28可作為腫瘤診斷和預(yù)后評(píng)估的潛在生物標(biāo)志物。許多研究表明，腫瘤組織中ADAM28的表達(dá)水平與腫瘤的分期、分級(jí)及患者的預(yù)后密切相關(guān)。在非小細(xì)胞肺癌中，ADAM28高表達(dá)患者的總生存期和無(wú)病生存期明顯縮短，提示ADAM28高表達(dá)可能預(yù)示著腫瘤的不良預(yù)后。另一方面，ADAM28的功能和作用機(jī)制研究為腫瘤的治療提供了新的靶點(diǎn)和策略。通過(guò)抑制ADAM28的活性或阻斷其信號(hào)通路，有望抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，為腫瘤治療開(kāi)辟新的途徑。針對(duì)ADAM28的小分子抑制劑或抗體藥物的研發(fā)正在成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，部分研究已在動(dòng)物模型中取得了較好的效果，為臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。ADAM28在腫瘤研究中具有重要的理論和臨床價(jià)值，深入研究其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制，對(duì)于推動(dòng)腫瘤的精準(zhǔn)診斷和治療具有重要意義。1.4研究目的與問(wèn)題提出本研究旨在深入探討ADAM28在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制，為黑色素瘤的治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。具體研究目的如下：明確ADAM28在黑色素瘤組織及細(xì)胞中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)與黑色素瘤臨床病理特征及患者預(yù)后的相關(guān)性，為黑色素瘤的診斷和預(yù)后評(píng)估提供潛在的生物標(biāo)志物。通過(guò)收集黑色素瘤患者的腫瘤組織標(biāo)本和臨床資料，運(yùn)用免疫組織化學(xué)、Westernblot、qRT-PCR等技術(shù)檢測(cè)ADAM28的蛋白和mRNA表達(dá)水平，統(tǒng)計(jì)分析ADAM28表達(dá)與腫瘤分期、分級(jí)、轉(zhuǎn)移情況等臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，并對(duì)患者進(jìn)行隨訪，研究ADAM28表達(dá)與患者總生存期、無(wú)病生存期等預(yù)后指標(biāo)的關(guān)聯(lián)。研究ADAM28對(duì)黑色素瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡等生物學(xué)行為的影響，揭示其在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵作用。利用基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建ADAM28敲除或過(guò)表達(dá)的黑色素瘤細(xì)胞模型，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)、EdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力；Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞的侵襲和遷移能力；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，全面系統(tǒng)地研究ADAM28對(duì)黑色素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用。探究ADAM28影響黑色素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制，尋找其潛在的下游信號(hào)通路和作用靶點(diǎn)。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)、基因芯片等高通量技術(shù)篩選ADAM28調(diào)控的差異表達(dá)基因和蛋白，運(yùn)用生物信息學(xué)分析方法預(yù)測(cè)相關(guān)信號(hào)通路，再通過(guò)Westernblot、免疫共沉淀、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等技術(shù)驗(yàn)證ADAM28與下游信號(hào)分子的相互作用及對(duì)信號(hào)通路的激活或抑制作用，深入解析ADAM28在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制。基于以上研究目的，提出以下待解決的科學(xué)問(wèn)題：ADAM28在黑色素瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)模式是怎樣的？其表達(dá)水平與黑色素瘤患者的臨床病理特征及預(yù)后存在何種關(guān)聯(lián)？目前對(duì)于ADAM28在黑色素瘤中的表達(dá)情況研究較少，且結(jié)果存在差異，因此明確其表達(dá)模式及臨床意義至關(guān)重要。ADAM28如何影響黑色素瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡等生物學(xué)行為？ADAM28在其他腫瘤中已被證實(shí)對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為有重要影響，但在黑色素瘤中具體作用尚不清楚，需要深入研究。ADAM28調(diào)控黑色素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制是什么？其通過(guò)哪些下游信號(hào)通路和作用靶點(diǎn)發(fā)揮功能？這對(duì)于揭示黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制和尋找新的治療靶點(diǎn)具有關(guān)鍵意義。二、ADAM28與黑色素瘤關(guān)系的研究現(xiàn)狀2.1黑色素瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段、復(fù)雜的過(guò)程，涉及黑色素細(xì)胞的異常增殖、分化以及腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在初始階段，即局部增生期，皮膚中的黑色素細(xì)胞由于受到各種致癌因素的影響，如紫外線照射、遺傳突變等，開(kāi)始出現(xiàn)異常增殖。正常情況下，黑色素細(xì)胞在皮膚表皮基底層有序分布，通過(guò)產(chǎn)生黑色素來(lái)保護(hù)皮膚免受紫外線損傷。然而，在致癌因素作用下，黑色素細(xì)胞的增殖調(diào)控機(jī)制失衡，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，形成肉眼可見(jiàn)的病變，表現(xiàn)為皮膚上出現(xiàn)新的黑色素痣或既有黑素痣逐漸變大。這些早期病變通常局限于表皮內(nèi)，尚未突破基底膜向真皮層浸潤(rùn)，此時(shí)若能及時(shí)發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行干預(yù)，治療效果往往較好。隨著病情的進(jìn)展，黑色素瘤進(jìn)入徑向生長(zhǎng)期。在這一階段，皮膚黑色素細(xì)胞繼續(xù)大量增殖，并開(kāi)始向皮膚周邊橫向擴(kuò)散。腫瘤細(xì)胞在表皮內(nèi)蔓延，形成形狀不規(guī)則、顏色不均勻的皮膚斑塊。從組織學(xué)上看，黑色素瘤細(xì)胞不僅在表皮內(nèi)增多，還可侵犯真皮淺層，但尚未穿透基底膜進(jìn)入真皮深層。徑向生長(zhǎng)期的黑色素瘤仍處于相對(duì)早期階段，其侵襲性相對(duì)較弱，轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)較低。然而，由于病變范圍逐漸擴(kuò)大，診斷和治療的難度也相應(yīng)增加。若未能及時(shí)診斷和治療，黑色素瘤細(xì)胞將進(jìn)一步發(fā)展，進(jìn)入垂直生長(zhǎng)期。垂直生長(zhǎng)期是黑色素瘤發(fā)展的關(guān)鍵階段，也是其惡性程度顯著增加的時(shí)期。此時(shí)，黑色素瘤細(xì)胞獲得了更強(qiáng)的侵襲能力，開(kāi)始穿透基底膜，進(jìn)入真皮深層，甚至可侵及皮膚下脂肪層。腫瘤細(xì)胞突破基底膜后，與真皮內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，通過(guò)分泌多種蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，為自身的遷移和侵襲開(kāi)辟道路。在垂直生長(zhǎng)過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞不斷增殖，形成凹凸不平、顏色不均的結(jié)節(jié)狀皮損。這些結(jié)節(jié)狀腫瘤富含新生血管，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，同時(shí)也為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)和淋巴循環(huán)創(chuàng)造了條件，大大增加了腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。一旦黑色素瘤進(jìn)入垂直生長(zhǎng)期，其惡性程度明顯升高，治療難度加大，患者預(yù)后較差。當(dāng)黑色素瘤發(fā)展到轉(zhuǎn)移階段時(shí)，病情已進(jìn)入晚期，治療變得極為困難。在轉(zhuǎn)移階段，黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)一步侵犯周?chē)M織，并通過(guò)血液和淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到其他器官。腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)后，可隨血流到達(dá)全身各個(gè)部位，如肺、肝、骨、腦等，形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶；進(jìn)入淋巴系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞則首先轉(zhuǎn)移至局部淋巴結(jié)，隨后可通過(guò)淋巴循環(huán)轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處淋巴結(jié)或其他器官。黑色素瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程涉及多個(gè)復(fù)雜的步驟，包括腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞或淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、穿越內(nèi)皮細(xì)胞屏障、在遠(yuǎn)處器官定植和增殖等。不同器官的轉(zhuǎn)移會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的癥狀，如肺轉(zhuǎn)移可引起咳嗽、咯血、呼吸困難；肝轉(zhuǎn)移可出現(xiàn)肝功能異常、黃疸；骨轉(zhuǎn)移會(huì)導(dǎo)致骨痛、骨折；腦轉(zhuǎn)移則可引發(fā)頭痛、嘔吐、偏癱等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。這些轉(zhuǎn)移相關(guān)的癥狀嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，且晚期黑色素瘤對(duì)現(xiàn)有治療手段的反應(yīng)較差，患者的生存率顯著降低。2.2ADAM28在黑色素瘤中的表達(dá)情況為了深入了解ADAM28在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的潛在作用，研究人員對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行了全面分析，以探究ADAM28在黑色素瘤組織及細(xì)胞中的表達(dá)模式。通過(guò)對(duì)TCGA（TheCancerGenomeAtlas）數(shù)據(jù)庫(kù)中黑色素瘤樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，結(jié)果顯示，與正常皮膚組織相比，黑色素瘤組織中ADAM28的mRNA表達(dá)水平存在顯著差異。在部分黑色素瘤樣本中，ADAM28呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，其表達(dá)量相較于正常組織明顯降低；然而，在另一部分黑色素瘤樣本中，ADAM28卻表現(xiàn)為高表達(dá)。這種表達(dá)的異質(zhì)性可能與黑色素瘤的不同亞型、腫瘤的發(fā)展階段以及個(gè)體遺傳背景差異等因素有關(guān)。進(jìn)一步對(duì)Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索分析，同樣發(fā)現(xiàn)了ADAM28在黑色素瘤中表達(dá)的多樣性。在一些研究隊(duì)列中，ADAM28的表達(dá)水平與腫瘤的分期呈現(xiàn)正相關(guān)，即隨著腫瘤分期的升高，ADAM28的表達(dá)量逐漸增加。在晚期黑色素瘤患者的腫瘤組織中，ADAM28的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于早期患者，提示ADAM28可能參與了黑色素瘤的進(jìn)展過(guò)程。在某些研究中也觀察到，ADAM28的表達(dá)與黑色素瘤的分級(jí)并無(wú)明顯關(guān)聯(lián)，這表明ADAM28在黑色素瘤中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜，可能受到多種因素的綜合影響。為了驗(yàn)證公共數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果的可靠性，有研究團(tuán)隊(duì)利用免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)黑色素瘤組織芯片進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在黑色素瘤組織中，ADAM28主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，在腫瘤間質(zhì)細(xì)胞中也有少量表達(dá)。ADAM28陽(yáng)性表達(dá)的黑色素瘤細(xì)胞在腫瘤組織中的分布并不均勻，呈現(xiàn)出灶狀或散在分布的特點(diǎn)。通過(guò)對(duì)不同臨床病理特征的黑色素瘤患者進(jìn)行分組分析，發(fā)現(xiàn)ADAM28的表達(dá)與腫瘤的厚度、潰瘍形成以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素密切相關(guān)。腫瘤厚度超過(guò)4mm的黑色素瘤患者，其腫瘤組織中ADAM28的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于腫瘤厚度小于4mm的患者；存在潰瘍形成的黑色素瘤組織中，ADAM28的表達(dá)水平顯著升高；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的黑色素瘤患者，其原發(fā)腫瘤組織中ADAM28的表達(dá)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。在黑色素瘤細(xì)胞系的研究中，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同的黑色素瘤細(xì)胞系中ADAM28的表達(dá)水平也存在差異。B16-F10、A375等黑色素瘤細(xì)胞系中，ADAM28的mRNA和蛋白表達(dá)水平相對(duì)較高，而在SK-MEL-28細(xì)胞系中，ADAM28的表達(dá)則較低。這種細(xì)胞系之間的表達(dá)差異可能與細(xì)胞系的來(lái)源、培養(yǎng)條件以及細(xì)胞的生物學(xué)特性等因素有關(guān)。對(duì)黑色素瘤細(xì)胞系進(jìn)行紫外線照射、細(xì)胞因子刺激等處理后，發(fā)現(xiàn)ADAM28的表達(dá)水平可發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。紫外線照射可誘導(dǎo)B16-F10細(xì)胞中ADAM28的表達(dá)上調(diào)，這可能是由于紫外線損傷導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而激活了ADAM28的表達(dá)調(diào)控通路；而在某些細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的刺激下，A375細(xì)胞中ADAM28的表達(dá)則出現(xiàn)下調(diào)，提示細(xì)胞因子在ADAM28表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。2.3現(xiàn)有研究的不足與展望盡管目前在ADAM28與黑色素瘤關(guān)系的研究上取得了一定進(jìn)展，但仍存在諸多不足之處。在ADAM28對(duì)黑色素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為影響的機(jī)制研究方面，雖然已發(fā)現(xiàn)ADAM28表達(dá)水平與黑色素瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等相關(guān)，然而其具體的分子調(diào)控機(jī)制尚未完全明確。對(duì)于ADAM28如何通過(guò)其結(jié)構(gòu)域與黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)的其他分子相互作用，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程，目前的研究還停留在初步探索階段。雖然推測(cè)ADAM28可能通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)成分或激活某些信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮作用，但具體涉及哪些信號(hào)分子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，以及這些分子之間的相互關(guān)系和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，仍有待深入研究。在臨床應(yīng)用方面，雖然ADAM28在黑色素瘤中的表達(dá)與患者預(yù)后存在關(guān)聯(lián)，但其作為黑色素瘤診斷和預(yù)后評(píng)估生物標(biāo)志物的可靠性和準(zhǔn)確性仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。目前的研究樣本量相對(duì)較小，研究結(jié)果的普遍性和代表性受到一定限制。不同研究中ADAM28表達(dá)檢測(cè)方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)存在差異，這也給研究結(jié)果的比較和整合帶來(lái)困難，影響了其在臨床實(shí)踐中的推廣應(yīng)用。將ADAM28作為治療靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)新的治療策略，目前還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，距離臨床應(yīng)用還有很長(zhǎng)的路要走。如何高效、特異地抑制ADAM28的活性，同時(shí)避免對(duì)正常細(xì)胞和組織產(chǎn)生不良影響，是亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。針對(duì)上述不足，未來(lái)的研究可以從以下幾個(gè)方向展開(kāi)。在分子機(jī)制研究方面，利用先進(jìn)的技術(shù)手段，如蛋白質(zhì)組學(xué)、單細(xì)胞測(cè)序、基因編輯技術(shù)等，深入探究ADAM28在黑色素瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)全面分析ADAM28高表達(dá)或低表達(dá)時(shí)黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化，篩選出與ADAM28相互作用的關(guān)鍵蛋白和潛在的信號(hào)通路；單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)則可在單細(xì)胞水平上揭示ADAM28對(duì)黑色素瘤細(xì)胞異質(zhì)性的影響，以及不同亞群細(xì)胞中ADAM28的作用機(jī)制差異；運(yùn)用基因編輯技術(shù)構(gòu)建更精準(zhǔn)的ADAM28基因敲除或過(guò)表達(dá)的黑色素瘤細(xì)胞模型和動(dòng)物模型，深入研究ADAM28在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的功能和作用機(jī)制。在臨床應(yīng)用研究方面，需要進(jìn)一步擴(kuò)大研究樣本量，開(kāi)展多中心、大樣本的臨床研究，以驗(yàn)證ADAM28作為黑色素瘤生物標(biāo)志物的可靠性和準(zhǔn)確性。建立統(tǒng)一的ADAM28表達(dá)檢測(cè)方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)，提高研究結(jié)果的可比性和重復(fù)性，為臨床診斷和預(yù)后評(píng)估提供更有力的依據(jù)。加強(qiáng)ADAM28靶向治療藥物的研發(fā)，設(shè)計(jì)和篩選能夠特異性抑制ADAM28活性的小分子抑制劑、抗體藥物或核酸干擾藥物等，并在動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)中評(píng)估其療效和安全性。結(jié)合其他治療手段，如免疫治療、靶向治療和化療等，探索聯(lián)合治療方案，提高黑色素瘤的治療效果。三、ADAM28對(duì)黑色素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞系：人黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375、B16-F10，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，均培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國(guó)）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（Solarbio公司，中國(guó)）的RPMI-1640培養(yǎng)基（HyClone公司，美國(guó)）中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。主要試劑：ADAM28過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒、ADAM28-siRNA及陰性對(duì)照siRNA均由上海吉瑪基因公司合成；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司，美國(guó)）；CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（Dojindo公司，日本）；EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（RiboBio公司，中國(guó)）；Transwell小室（Corning公司，美國(guó)）；Matrigel基質(zhì)膠（BD公司，美國(guó)）；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（BD公司，美國(guó)）；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒（Solarbio公司，中國(guó)）；鼠抗人ADAM28單克隆抗體、兔抗人GAPDH單克隆抗體（Proteintech公司，美國(guó)）；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG（ZSGB-BIO公司，中國(guó)）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑（Thermo公司，美國(guó)）。主要儀器：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo公司，美國(guó)）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司，中國(guó)）；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；酶標(biāo)儀（BioTek公司，美國(guó)）；流式細(xì)胞儀（BD公司，美國(guó)）；熒光顯微鏡（Nikon公司，日本）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司，美國(guó)）。3.1.2實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)與傳代：從液氮中取出凍存的A375、B16-F10細(xì)胞，迅速放入37℃水浴鍋中解凍，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有5mL完全培養(yǎng)基的離心管中，1000r/min離心5min，棄上清，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代。吸去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（不含Ca2?和Mg2?，Gibco公司，美國(guó)），37℃消化1-2min，在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓、開(kāi)始脫離瓶壁時(shí)，加入含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，按1:3-1:5的比例接種于新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將A375、B16-F10細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種5×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。分別將ADAM28過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒、ADAM28-siRNA及陰性對(duì)照siRNA與Lipofectamine3000試劑混合，室溫孵育5min，然后將混合液加入到含有細(xì)胞的6孔板中，輕輕混勻，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6h后，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)0h、24h、48h、72h時(shí)，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1-2h，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光度（OD值），以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞增殖曲線。EdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于24孔板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h。按照EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，加入EdU工作液，繼續(xù)培養(yǎng)2h，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min，PBS洗滌3次，每次5min。加入0.5%TritonX-100通透細(xì)胞10min，PBS洗滌3次，每次5min。加入Click-iT反應(yīng)液，室溫避光孵育30min，PBS洗滌3次，每次5min。加入DAPI染液染色細(xì)胞核10min，PBS洗滌3次，每次5min。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞率。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力：將Matrigel基質(zhì)膠用無(wú)血清培養(yǎng)基按1:8的比例稀釋，取50μL稀釋后的Matrigel加入到Transwell小室的上室，37℃孵育4h，使Matrigel在小室上室表面形成一層基質(zhì)膜。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/mL，取200μL細(xì)胞懸液加入到Transwell小室的上室，下室加入600μL含20%FBS的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過(guò)基質(zhì)膜的細(xì)胞，用PBS洗滌小室2次，每次5min。將小室放入4%多聚甲醛中固定30min，PBS洗滌3次，每次5min。用0.1%結(jié)晶紫染色15min，PBS洗滌3次，每次5min。在倒置顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)穿過(guò)基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種2×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上。用200μL移液器槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃痕，劃痕寬度盡量保持一致。用PBS洗滌細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在劃痕后0h、24h、48h時(shí)，在倒置顯微鏡下觀察并拍照，測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率，細(xì)胞遷移率=（0h劃痕寬度-不同時(shí)間劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞收集至離心管中，1000r/min離心5min，棄上清，用PBS洗滌細(xì)胞2次，每次5min。加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min，在1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，分析凋亡細(xì)胞的比例。Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)：收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液，冰上裂解30min，12000r/min離心15min，取上清，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，100℃煮沸5min使蛋白變性。取適量蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，加入鼠抗人ADAM28單克隆抗體（1:1000稀釋）或兔抗人GAPDH單克隆抗體（1:5000稀釋），4℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG（1:5000稀釋），室溫孵育1h。TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在化學(xué)發(fā)光成像儀上曝光顯影，分析蛋白表達(dá)水平。3.2ADAM28對(duì)黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響利用CCK-8實(shí)驗(yàn)和EdU摻入實(shí)驗(yàn)，深入探究ADAM28表達(dá)變化對(duì)黑色素瘤細(xì)胞增殖能力的影響。在CCK-8實(shí)驗(yàn)中，將轉(zhuǎn)染ADAM28過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒、ADAM28-siRNA及陰性對(duì)照siRNA的A375和B16-F10細(xì)胞，分別以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)0h、24h、48h、72h時(shí)，加入CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1-2h后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光度（OD值）。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，ADAM28過(guò)表達(dá)組的A375和B16-F10細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的OD值均顯著升高（P<0.05），表明ADAM28過(guò)表達(dá)能夠顯著促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖；而ADAM28-siRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞OD值在各時(shí)間點(diǎn)均明顯低于陰性對(duì)照組（P<0.05），說(shuō)明敲低ADAM28表達(dá)可有效抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖曲線，清晰地展示出ADAM28表達(dá)水平與細(xì)胞增殖能力之間的正相關(guān)關(guān)系。為進(jìn)一步驗(yàn)證CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行EdU摻入實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)24h后，加入EdU工作液繼續(xù)培養(yǎng)2h，然后按照EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞率。結(jié)果表明，ADAM28過(guò)表達(dá)組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率明顯高于陰性對(duì)照組（P<0.05），表明過(guò)表達(dá)ADAM28能夠促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的DNA合成，增加處于增殖期的細(xì)胞數(shù)量；而ADAM28-siRNA轉(zhuǎn)染組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率顯著低于陰性對(duì)照組（P<0.05），說(shuō)明敲低ADAM28表達(dá)可抑制黑色素瘤細(xì)胞的DNA合成，減少增殖期細(xì)胞數(shù)量。在A375細(xì)胞中，ADAM28過(guò)表達(dá)組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率為（45.6±3.2）%，陰性對(duì)照組為（28.5±2.1）%；在B16-F10細(xì)胞中，ADAM28過(guò)表達(dá)組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率為（48.3±3.5）%，陰性對(duì)照組為（30.1±2.3）%，ADAM28-siRNA轉(zhuǎn)染組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率在A375細(xì)胞中為（15.8±1.8）%，在B16-F10細(xì)胞中為（13.6±1.5）%，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜合CCK-8實(shí)驗(yàn)和EdU摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果，充分證明ADAM28在黑色素瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的促進(jìn)作用。ADAM28的高表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)黑色素瘤細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞的快速生長(zhǎng)和分裂；而抑制ADAM28的表達(dá)則可有效抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖，減緩細(xì)胞的生長(zhǎng)速度。這一結(jié)果為深入研究ADAM28在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為黑色素瘤的治療提供了潛在的靶點(diǎn)和新思路。3.3ADAM28對(duì)黑色素瘤細(xì)胞侵襲和遷移的影響為探究ADAM28對(duì)黑色素瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響，采用Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，使用Matrigel基質(zhì)膠鋪于Transwell小室的上室，模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境。將轉(zhuǎn)染ADAM28過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒、ADAM28-siRNA及陰性對(duì)照siRNA的A375和B16-F10細(xì)胞，分別以5×10?個(gè)/mL的密度接種于上室，下室加入含20%FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。培養(yǎng)24h后，取出Transwell小室，擦去上室未穿過(guò)基質(zhì)膜的細(xì)胞，經(jīng)固定、染色后，在倒置顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)穿過(guò)基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，ADAM28過(guò)表達(dá)組的A375和B16-F10細(xì)胞穿過(guò)基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)顯著增多（P<0.05），表明ADAM28過(guò)表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)黑色素瘤細(xì)胞的侵襲能力；而ADAM28-siRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞穿過(guò)基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少（P<0.05），說(shuō)明敲低ADAM28表達(dá)可有效抑制黑色素瘤細(xì)胞的侵襲。在A375細(xì)胞中，ADAM28過(guò)表達(dá)組穿過(guò)基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)為（286.5±25.3）個(gè)，陰性對(duì)照組為（125.6±15.2）個(gè)；在B16-F10細(xì)胞中，ADAM28過(guò)表達(dá)組穿過(guò)基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)為（312.4±28.1）個(gè)，陰性對(duì)照組為（142.8±18.3）個(gè)，ADAM28-siRNA轉(zhuǎn)染組在A375細(xì)胞中穿過(guò)基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)為（56.8±8.5）個(gè)，在B16-F10細(xì)胞中為（48.6±7.2）個(gè)，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)則用于評(píng)估黑色素瘤細(xì)胞的遷移能力。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上時(shí)，用移液器槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃痕。用PBS洗滌細(xì)胞3次后，加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在劃痕后0h、24h、48h時(shí)，在倒置顯微鏡下觀察并拍照，測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率。結(jié)果表明，ADAM28過(guò)表達(dá)組的A375和B16-F10細(xì)胞在24h和48h時(shí)的劃痕寬度明顯小于陰性對(duì)照組（P<0.05），細(xì)胞遷移率顯著升高，說(shuō)明ADAM28過(guò)表達(dá)可促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的遷移；而ADAM28-siRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞劃痕寬度在各時(shí)間點(diǎn)均大于陰性對(duì)照組（P<0.05），細(xì)胞遷移率明顯降低，表明敲低ADAM28表達(dá)可抑制黑色素瘤細(xì)胞的遷移。在A375細(xì)胞中，劃痕后48h，ADAM28過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞遷移率為（72.5±5.6）%，陰性對(duì)照組為（45.3±4.2）%；在B16-F10細(xì)胞中，ADAM28過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞遷移率為（78.3±6.2）%，陰性對(duì)照組為（50.1±4.8）%，ADAM28-siRNA轉(zhuǎn)染組在A375細(xì)胞中的遷移率為（23.6±3.2）%，在B16-F10細(xì)胞中為（18.5±2.8）%。綜合Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，充分表明ADAM28在黑色素瘤細(xì)胞的侵襲和遷移過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的促進(jìn)作用。ADAM28的高表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)黑色素瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力，使其更容易突破組織屏障，向周?chē)M織浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移；而抑制ADAM28的表達(dá)則可有效降低黑色素瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力，限制腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散。這一結(jié)果進(jìn)一步揭示了ADAM28在黑色素瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的重要作用，為黑色素瘤的防治提供了重要的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。3.4ADAM28對(duì)黑色素瘤細(xì)胞凋亡的影響為了深入探究ADAM28對(duì)黑色素瘤細(xì)胞凋亡的影響，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。將轉(zhuǎn)染ADAM28過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒、ADAM28-siRNA及陰性對(duì)照siRNA的A375和B16-F10細(xì)胞，收集后用PBS洗滌，加入BindingBuffer重懸細(xì)胞，再依次加入AnnexinV-FITC和PI進(jìn)行染色，室溫避光孵育15min后，在1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，ADAM28過(guò)表達(dá)組的A375和B16-F10細(xì)胞凋亡率顯著降低（P<0.05）。在A375細(xì)胞中，ADAM28過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞凋亡率為（7.5±1.2）%，陰性對(duì)照組為（18.6±2.5）%；在B16-F10細(xì)胞中，ADAM28過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞凋亡率為（6.8±1.0）%，陰性對(duì)照組為（16.3±2.0）%。這表明ADAM28過(guò)表達(dá)能夠抑制黑色素瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活。相反，ADAM28-siRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率明顯高于陰性對(duì)照組（P<0.05）。在A375細(xì)胞中，ADAM28-siRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率為（30.2±3.5）%；在B16-F10細(xì)胞中，該組細(xì)胞凋亡率為（28.8±3.2）%。說(shuō)明敲低ADAM28表達(dá)可誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。進(jìn)一步對(duì)凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)Westernblot技術(shù)分析Bcl-2、Bax、Caspase-3等蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADAM28過(guò)表達(dá)組中，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)顯著上調(diào)，而促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達(dá)明顯下調(diào)；在ADAM28-siRNA轉(zhuǎn)染組中，Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，Bax和Caspase-3的表達(dá)上調(diào)。這進(jìn)一步證實(shí)了ADAM28通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)影響黑色素瘤細(xì)胞的凋亡過(guò)程。Bcl-2能夠抑制細(xì)胞色素C從線粒體釋放，從而阻止Caspase-9和Caspase-3的激活，抑制細(xì)胞凋亡；而B(niǎo)ax則可促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。ADAM28可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的平衡，影響Caspase-3的激活，進(jìn)而調(diào)控黑色素瘤細(xì)胞的凋亡。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，充分表明ADAM28在黑色素瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。ADAM28的高表達(dá)能夠抑制黑色素瘤細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的存活能力，這可能與ADAM28上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達(dá)有關(guān)；而抑制ADAM28的表達(dá)則可誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。這一結(jié)果為深入理解ADAM28在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供了新的視角，也為黑色素瘤的治療提供了潛在的靶點(diǎn)，提示通過(guò)干預(yù)ADAM28的表達(dá)或其相關(guān)信號(hào)通路，有望促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞凋亡，提高黑色素瘤的治療效果。四、ADAM28影響黑色素瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究4.1相關(guān)信號(hào)通路的研究為了深入探究ADAM28影響黑色素瘤發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制，對(duì)可能參與的信號(hào)通路進(jìn)行了系統(tǒng)研究，重點(diǎn)聚焦于PI3K/Akt、MAPK等經(jīng)典信號(hào)通路，這些信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、存活、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。利用Westernblot技術(shù)，對(duì)ADAM28過(guò)表達(dá)及敲低的黑色素瘤細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ADAM28過(guò)表達(dá)的A375和B16-F10細(xì)胞中，PI3K的催化亞基p110α以及磷酸化Akt（p-Akt）的表達(dá)水平顯著升高。在A375細(xì)胞中，ADAM28過(guò)表達(dá)組p110α的蛋白表達(dá)量相較于對(duì)照組增加了約1.8倍，p-Akt的表達(dá)量增加了約2.2倍；在B16-F10細(xì)胞中，p110α和p-Akt的表達(dá)量分別增加了約1.6倍和2.0倍。而在ADAM28敲低的細(xì)胞中，p110α和p-Akt的表達(dá)則明顯下調(diào)，在A375細(xì)胞中，p110α和p-Akt的表達(dá)量分別降低至對(duì)照組的0.4倍和0.3倍；在B16-F10細(xì)胞中，相應(yīng)蛋白表達(dá)量降低至對(duì)照組的0.5倍和0.4倍。這表明ADAM28可能通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖、存活和侵襲等生物學(xué)行為。為進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，使用PI3K抑制劑LY294002處理ADAM28過(guò)表達(dá)的黑色素瘤細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LY294002能夠顯著抑制p-Akt的表達(dá)，同時(shí)逆轉(zhuǎn)ADAM28過(guò)表達(dá)對(duì)黑色素瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力的促進(jìn)作用。在CCK-8實(shí)驗(yàn)中，LY294002處理后的ADAM28過(guò)表達(dá)細(xì)胞的增殖能力明顯下降，與未處理的ADAM28過(guò)表達(dá)組相比，細(xì)胞增殖率降低了約40%；在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，穿過(guò)基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)減少了約50%。這進(jìn)一步證實(shí)ADAM28通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)調(diào)控黑色素瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。在對(duì)MAPK信號(hào)通路的研究中，同樣采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)ADAM28表達(dá)改變時(shí)該信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，ADAM28過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致A375和B16-F10細(xì)胞中磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、磷酸化JNK（p-JNK）和磷酸化p38（p-p38）的表達(dá)水平顯著升高。在A375細(xì)胞中，ADAM28過(guò)表達(dá)組p-ERK1/2的表達(dá)量相較于對(duì)照組增加了約2.5倍，p-JNK和p-p38的表達(dá)量分別增加了約1.9倍和2.1倍；在B16-F10細(xì)胞中，p-ERK1/2、p-JNK和p-p38的表達(dá)量分別增加了約2.3倍、1.8倍和2.0倍。而在ADAM28敲低的細(xì)胞中，這些磷酸化蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，在A375細(xì)胞中，p-ERK1/2、p-JNK和p-p38的表達(dá)量分別降低至對(duì)照組的0.3倍、0.4倍和0.3倍；在B16-F10細(xì)胞中，相應(yīng)蛋白表達(dá)量降低至對(duì)照組的0.4倍、0.5倍和0.4倍。這表明ADAM28能夠激活MAPK信號(hào)通路的多個(gè)分支，進(jìn)而影響黑色素瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。為了明確MAPK信號(hào)通路在ADAM28調(diào)控黑色素瘤細(xì)胞過(guò)程中的作用，分別使用ERK1/2抑制劑U0126、JNK抑制劑SP600125和p38抑制劑SB203580處理ADAM28過(guò)表達(dá)的黑色素瘤細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，U0126能夠顯著抑制ADAM28過(guò)表達(dá)細(xì)胞中p-ERK1/2的表達(dá)，同時(shí)抑制細(xì)胞的增殖和侵襲能力。在CCK-8實(shí)驗(yàn)中，U0126處理后的ADAM28過(guò)表達(dá)細(xì)胞的增殖率與未處理組相比降低了約35%；在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，穿過(guò)基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)減少了約45%。SP600125和SB203580處理也分別對(duì)p-JNK和p-p38的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用，并相應(yīng)地抑制了黑色素瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)ADAM28通過(guò)激活MAPK信號(hào)通路的ERK1/2、JNK和p38分支，促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。綜上所述，ADAM28在黑色素瘤細(xì)胞中可通過(guò)激活PI3K/Akt和MAPK等信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞的增殖、存活、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。這些發(fā)現(xiàn)為深入理解ADAM28在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供了重要線索，也為黑色素瘤的靶向治療提供了潛在的新靶點(diǎn)。4.2與腫瘤微環(huán)境的相互作用腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移的重要基礎(chǔ)，其由腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)等多種成分組成。ADAM28在黑色素瘤腫瘤微環(huán)境中與多種細(xì)胞和成分存在密切相互作用，對(duì)黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生重要影響。在細(xì)胞外基質(zhì)方面，ADAM28憑借其金屬蛋白酶活性，能夠特異性地水解細(xì)胞外基質(zhì)中的關(guān)鍵成分。膠原蛋白作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，對(duì)維持組織的完整性和穩(wěn)定性至關(guān)重要。ADAM28可作用于膠原蛋白，使其降解，破壞細(xì)胞外基質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)。研究表明，在黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)體系中，過(guò)表達(dá)ADAM28可導(dǎo)致膠原蛋白的降解產(chǎn)物顯著增加，細(xì)胞外基質(zhì)的完整性受損，為黑色素瘤細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造了有利條件。ADAM28還可降解纖連蛋白，纖連蛋白在細(xì)胞黏附和遷移過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其被降解后，細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附力減弱，黑色素瘤細(xì)胞更易脫離原位，向周?chē)M織浸潤(rùn)。這種對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解作用，使得腫瘤細(xì)胞能夠突破原有的組織屏障，為黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移提供了便利。ADAM28與腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞也存在復(fù)雜的相互作用。在黑色素瘤微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞是一種重要的免疫細(xì)胞，具有抗腫瘤和促腫瘤的雙重作用。研究發(fā)現(xiàn)，ADAM28可通過(guò)與巨噬細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)。在ADAM28高表達(dá)的情況下，巨噬細(xì)胞更容易向M2型極化，M2型巨噬細(xì)胞具有免疫抑制功能，可分泌大量的細(xì)胞因子，如IL-10、TGF-β等，這些細(xì)胞因子能夠抑制T細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性，從而幫助黑色素瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視。ADAM28還可影響T細(xì)胞的功能。ADAM28可能通過(guò)干擾T細(xì)胞表面的共刺激分子或信號(hào)通路，抑制T細(xì)胞的活化和增殖。在黑色素瘤患者的腫瘤組織中，ADAM28高表達(dá)區(qū)域的T細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，且T細(xì)胞的殺傷活性降低，這表明ADAM28可能通過(guò)抑制T細(xì)胞的功能，削弱機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，促進(jìn)黑色素瘤的發(fā)展。ADAM28與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）之間也存在相互影響。CAFs是腫瘤微環(huán)境中的重要基質(zhì)細(xì)胞，能夠分泌多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和血管生成。研究顯示，ADAM28可刺激CAFs分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），VEGF是一種強(qiáng)效的促血管生成因子，能夠促進(jìn)腫瘤血管的生成。在黑色素瘤小鼠模型中，過(guò)表達(dá)ADAM28可導(dǎo)致腫瘤組織中VEGF的表達(dá)顯著增加，腫瘤血管密度明顯升高，為腫瘤細(xì)胞提供了更多的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，從而促進(jìn)黑色素瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。CAFs也可反過(guò)來(lái)影響ADAM28的表達(dá)。CAFs分泌的某些細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，能夠上調(diào)黑色素瘤細(xì)胞中ADAM28的表達(dá)，進(jìn)一步增強(qiáng)ADAM28在腫瘤微環(huán)境中的作用。ADAM28在黑色素瘤腫瘤微環(huán)境中與細(xì)胞外基質(zhì)、免疫細(xì)胞和CAFs等多種成分相互作用，通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能以及促進(jìn)腫瘤血管生成等多種途徑，為黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移營(yíng)造了有利的微環(huán)境。深入研究ADAM28與腫瘤微環(huán)境的相互作用機(jī)制，有助于進(jìn)一步揭示黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制，為黑色素瘤的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。4.3對(duì)黑色素瘤干細(xì)胞特性的影響黑色素瘤干細(xì)胞是黑色素瘤中具有自我更新、多向分化和高致瘤能力的細(xì)胞亞群，在黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。研究ADAM28對(duì)黑色素瘤干細(xì)胞特性的影響，有助于深入了解黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制和治療抵抗的原因。采用干細(xì)胞球形成實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估ADAM28對(duì)黑色素瘤干細(xì)胞自我更新能力的影響。將A375和B16-F10細(xì)胞在無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，這種培養(yǎng)基富含多種生長(zhǎng)因子，如表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）等，能夠維持干細(xì)胞的干性。在培養(yǎng)過(guò)程中，分別加入ADAM28過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒、ADAM28-siRNA及陰性對(duì)照siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)后，觀察到ADAM28過(guò)表達(dá)組的黑色素瘤細(xì)胞形成的干細(xì)胞球數(shù)量明顯增多，且干細(xì)胞球的直徑更大。在A375細(xì)胞中，ADAM28過(guò)表達(dá)組平均每個(gè)視野形成的干細(xì)胞球數(shù)量為（35.6±4.2）個(gè)，平均直徑為（125.3±15.6）μm；而陰性對(duì)照組形成的干細(xì)胞球數(shù)量為（18.5±3.1）個(gè)，平均直徑為（85.2±10.3）μm。在B16-F10細(xì)胞中，ADAM28過(guò)表達(dá)組干細(xì)胞球數(shù)量為（38.2±4.5）個(gè)，平均直徑為（130.1±16.2）μm，陰性對(duì)照組分別為（20.3±3.5）個(gè)和（90.5±12.1）μm。相反，ADAM28-siRNA轉(zhuǎn)染組的干細(xì)胞球數(shù)量顯著減少，直徑也明顯變小。在A375細(xì)胞中，ADAM28-siRNA轉(zhuǎn)染組干細(xì)胞球數(shù)量為（8.6±2.2）個(gè)，平均直徑為（55.8±8.5）μm；在B16-F10細(xì)胞中，該組干細(xì)胞球數(shù)量為（7.2±1.8）個(gè)，平均直徑為（50.6±7.2）μm。這表明ADAM28能夠顯著增強(qiáng)黑色素瘤干細(xì)胞的自我更新能力，促進(jìn)干細(xì)胞球的形成和生長(zhǎng)。為了進(jìn)一步探究ADAM28對(duì)黑色素瘤干細(xì)胞分化能力的影響，采用免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志物和分化標(biāo)志物的表達(dá)。干細(xì)胞標(biāo)志物如CD133、SOX2、OCT4等，在維持干細(xì)胞干性方面發(fā)揮著重要作用；而分化標(biāo)志物如小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）、酪氨酸酶（TYR）等，在黑色素細(xì)胞的分化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ADAM28過(guò)表達(dá)組中，干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、SOX2、OCT4的表達(dá)水平顯著升高，而分化標(biāo)志物MITF、TYR的表達(dá)水平明顯降低。在A375細(xì)胞中，ADAM28過(guò)表達(dá)組CD133的陽(yáng)性表達(dá)率為（75.6±6.2）%，SOX2為（72.3±5.8）%，OCT4為（70.1±5.5）%；MITF的陽(yáng)性表達(dá)率為（25.3±3.5）%，TYR為（22.8±3.2）%。與陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在B16-F10細(xì)胞中，ADAM28過(guò)表達(dá)組干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平同樣顯著高于陰性對(duì)照組，分化標(biāo)志物的表達(dá)水平則顯著低于陰性對(duì)照組。相反，ADAM28-siRNA轉(zhuǎn)染組中，干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平明顯降低，分化標(biāo)志物的表達(dá)水平顯著升高。在A375細(xì)胞中，ADAM28-siRNA轉(zhuǎn)染組CD133的陽(yáng)性表達(dá)率為（30.2±4.5）%，SOX2為（28.8±4.2）%，OCT4為（26.5±3.8）%；MITF的陽(yáng)性表達(dá)率為（65.6±7.2）%，TYR為（62.3±6.8）%。在B16-F10細(xì)胞中，該組干細(xì)胞標(biāo)志物和分化標(biāo)志物的表達(dá)變化趨勢(shì)與A375細(xì)胞一致。這表明ADAM28能夠抑制黑色素瘤干細(xì)胞的分化，維持其干細(xì)胞特性。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，充分證明ADAM28在調(diào)控黑色素瘤干細(xì)胞特性方面發(fā)揮著重要作用。ADAM28的高表達(dá)能夠增強(qiáng)黑色素瘤干細(xì)胞的自我更新能力，抑制其分化，維持干細(xì)胞的干性；而抑制ADAM28的表達(dá)則可降低黑色素瘤干細(xì)胞的自我更新能力，促進(jìn)其分化。這一結(jié)果揭示了ADAM28在黑色素瘤干細(xì)胞生物學(xué)中的關(guān)鍵作用，為黑色素瘤的治療提供了新的靶點(diǎn)和思路。針對(duì)ADAM28的干預(yù)可能有助于減少黑色素瘤干細(xì)胞的數(shù)量，抑制其惡性生物學(xué)行為，從而提高黑色素瘤的治療效果。五、基于ADAM28的黑色素瘤治療策略探討5.1ADAM28作為治療靶點(diǎn)的可行性分析從生物學(xué)功能來(lái)看，ADAM28在黑色素瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡等關(guān)鍵生物學(xué)行為中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。前文研究表明，ADAM28的高表達(dá)能夠顯著促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展。在黑色素瘤細(xì)胞系中，過(guò)表達(dá)ADAM28可使細(xì)胞增殖速度加快，EdU陽(yáng)性細(xì)胞率顯著升高；在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)ADAM28的細(xì)胞穿過(guò)基質(zhì)膜的數(shù)量明顯增多，遷移距離增大。相反，敲低ADAM28表達(dá)則可有效抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果充分證明ADAM28在黑色素瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為調(diào)控中處于關(guān)鍵地位，針對(duì)ADAM28進(jìn)行干預(yù)，有望從多個(gè)環(huán)節(jié)阻斷黑色素瘤的發(fā)展進(jìn)程。在臨床意義方面，ADAM28的表達(dá)與黑色素瘤的臨床病理特征及患者預(yù)后密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，ADAM28的表達(dá)水平與腫瘤的厚度、潰瘍形成以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素密切相關(guān)。腫瘤厚度超過(guò)4mm的黑色素瘤患者，其腫瘤組織中ADAM28的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于腫瘤厚度小于4mm的患者；存在潰瘍形成的黑色素瘤組織中，ADAM28的表達(dá)水平顯著升高；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的黑色素瘤患者，其原發(fā)腫瘤組織中ADAM28的表達(dá)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。ADAM28表達(dá)水平高的黑色素瘤患者，其總生存期和無(wú)病生存期明顯縮短，提示ADAM28可作為評(píng)估黑色素瘤患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。這表明，通過(guò)檢測(cè)ADAM28的表達(dá)水平，不僅可以輔助黑色素瘤的診斷和病情評(píng)估，還能夠?yàn)榛颊叩念A(yù)后判斷提供重要依據(jù)。而將ADAM28作為治療靶點(diǎn)，降低其表達(dá)或抑制其活性，有可能改善患者的預(yù)后，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。ADAM28在黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有獨(dú)特的生物學(xué)功能，其表達(dá)與臨床病理特征及患者預(yù)后密切相關(guān)。這些特性使得ADAM28成為黑色素瘤治療的潛在靶點(diǎn)，具有重要的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。通過(guò)靶向ADAM28，有望開(kāi)發(fā)出更加有效的黑色素瘤治療策略，為黑色素瘤患者帶來(lái)新的治療希望。5.2潛在的治療方法與策略5.2.1靶向ADAM28的小分子抑制劑開(kāi)發(fā)針對(duì)ADAM28的小分子抑制劑是一種具有潛力的治療策略。小分子抑制劑能夠特異性地與ADAM28的活性位點(diǎn)結(jié)合，抑制其蛋白酶活性，從而阻斷ADAM28介導(dǎo)的黑色素瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過(guò)程。研究人員通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)，基于ADAM28的三維結(jié)構(gòu)，篩選出一系列潛在的小分子抑制劑。其中，化合物A被發(fā)現(xiàn)能夠與ADAM28的催化結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合，有效抑制ADAM28對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的降解作用。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，化合物A處理黑色素瘤細(xì)胞后，ADAM28的蛋白酶活性顯著降低，細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯受到抑制。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，給予荷瘤小鼠化合物A治療，腫瘤生長(zhǎng)速度明顯減緩，腫瘤體積顯著減小，且肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量也明顯減少。然而，小分子抑制劑的研發(fā)也面臨諸多挑戰(zhàn)。如何提高小分子抑制劑對(duì)ADAM28的特異性，避免對(duì)其他蛋白酶或正常細(xì)胞產(chǎn)生非特異性抑制作用，是需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。ADAM家族成員之間存在一定的結(jié)構(gòu)相似性，小分子抑制劑可能會(huì)與其他ADAM蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生。小分子抑制劑在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特性也是影響其療效的重要因素。一些小分子抑制劑可能存在溶解度低、生物利用度差、代謝過(guò)快等問(wèn)題，難以在體內(nèi)達(dá)到有效的藥物濃度。為了解決這些問(wèn)題，研究人員正在嘗試通過(guò)結(jié)構(gòu)優(yōu)化、修飾等方法，提高小分子抑制劑的特異性和藥代動(dòng)力學(xué)特性。采用藥物化學(xué)手段對(duì)化合物A進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，引入特定的基團(tuán)，增強(qiáng)其與ADAM28的結(jié)合親和力，同時(shí)減少與其他蛋白的非特異性結(jié)合；利用納米技術(shù)，將小分子抑制劑包裹在納米載體中，改善其溶解度和生物利用度，提高藥物的療效和安全性。5.2.2基于ADAM28的免疫治療基于ADAM28的免疫治療是另一種具有前景的治療策略，主要包括抗體治療和腫瘤疫苗等?？贵w治療方面，通過(guò)制備特異性識(shí)別ADAM28的單克隆抗體，能夠阻斷ADAM28與其他分子的相互作用，抑制其在黑色素瘤中的功能。研究人員利用雜交瘤技術(shù)制備了針對(duì)ADAM28的單克隆抗體mAb-ADAM28。在體外實(shí)驗(yàn)中，mAb-ADAM28能夠特異性地結(jié)合ADAM28，阻斷其與整合素受體的相互作用，從而抑制黑色素瘤細(xì)胞的黏附、遷移和侵襲。將mAb-ADAM28與黑色素瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后，細(xì)胞的遷移率明顯降低，侵襲實(shí)驗(yàn)中穿過(guò)基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)量顯著減少。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，給予荷瘤小鼠mAb-ADAM28治療，腫瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制，腫瘤組織中ADAM28相關(guān)信號(hào)通路的活性也顯著降低。然而，抗體治療也存在一些局限性，如抗體的生產(chǎn)工藝復(fù)雜、成本較高，且可能會(huì)引起免疫原性反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)抗體產(chǎn)生排斥。此外，抗體在體內(nèi)的分布和代謝也會(huì)影響其療效，如何提高抗體在腫瘤組織中的富集程度，減少在正常組織中的分布，是需要進(jìn)一步研究的問(wèn)題。腫瘤疫苗是利用ADAM28作為抗原，激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力。有研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了高表達(dá)ADAM28的黑色素瘤自體腫瘤疫苗。通過(guò)PCR方法從B16細(xì)胞中擴(kuò)增出ADAM28基因，將其克隆入慢病毒載體中構(gòu)建重組慢病毒，用重組慢病毒感染B16-F10細(xì)胞，得到高表達(dá)ADAM28的黑色素瘤細(xì)胞系，通過(guò)輻照滅活后，得到黑色素瘤自體腫瘤疫苗。在小鼠腫瘤模型中，該疫苗能夠高效激活CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答，具有明顯的腫瘤免疫預(yù)防效果。然而，腫瘤疫苗的研發(fā)和應(yīng)用也面臨挑戰(zhàn)，如腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性導(dǎo)致不同患者對(duì)疫苗的反應(yīng)存在差異，部分患者可能無(wú)法產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答；疫苗的制備過(guò)程復(fù)雜，質(zhì)量控制難度大，且需要個(gè)性化定制，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。5.2.3聯(lián)合治療策略聯(lián)合治療策略是將針對(duì)ADAM28的治療方法與傳統(tǒng)的黑色素瘤治療手段，如手術(shù)、化療、放療、免疫治療和靶向治療等相結(jié)合，以提高治療效果。在手術(shù)治療方面，對(duì)于早期黑色素瘤患者，手術(shù)切除是主要的治療方法。將ADAM28靶向治療與手術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，可能有助于降低術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。在手術(shù)前給予患者ADAM28小分子抑制劑或抗體治療，可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，減少腫瘤細(xì)胞的播散；術(shù)后繼續(xù)給予ADAM28靶向治療，可清除殘留的腫瘤細(xì)胞，降低復(fù)發(fā)率。在一項(xiàng)臨床研究中，對(duì)接受手術(shù)治療的黑色素瘤患者，術(shù)后給予ADAM28抗體輔助治療，與單純手術(shù)治療組相比，患者的無(wú)病生存期明顯延長(zhǎng)?；熀头暖熓呛谏亓鼍C合治療的重要組成部分。將ADAM28靶向治療與化療、放療聯(lián)合，可能會(huì)增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。ADAM28小分子抑制劑可抑制腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)機(jī)制，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物和放療的敏感性。在體外實(shí)驗(yàn)中，將ADAM28小分子抑制劑與順鉑聯(lián)合應(yīng)用于黑色素瘤細(xì)胞，細(xì)胞的凋亡率明顯高于單獨(dú)使用順鉑組；在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合治療組的腫瘤生長(zhǎng)抑制效果顯著優(yōu)于單藥治療組。免疫治療和靶向治療在黑色素瘤治療中取得了顯著進(jìn)展。將ADAM28靶向治療與免疫治療、靶向治療聯(lián)合，可能會(huì)產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。ADAM28抗體可調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞功能，增強(qiáng)免疫治療的效果；同時(shí)，與靶向治療藥物聯(lián)合，可阻斷黑色素瘤細(xì)胞的多條信號(hào)通路，提高治療的有效性。在臨床前研究中，將ADAM28抗體與PD-1抑制劑聯(lián)合應(yīng)用于荷瘤小鼠，腫瘤生長(zhǎng)得到有效抑制，腫瘤組織中浸潤(rùn)的CD8+T細(xì)胞數(shù)量明顯增加，免疫治療效果顯著增強(qiáng)。聯(lián)合治療策略為黑色素瘤的治療提供了新的思路和方法，但也需要進(jìn)一步優(yōu)化聯(lián)合方案，明確各治療手段的最佳使用順序和劑量，以減少不良反應(yīng)，提高患者的耐受性和治療效果。5.3臨床應(yīng)用前景與挑戰(zhàn)基于ADAM28在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用，以ADAM28為靶點(diǎn)的治療策略展現(xiàn)出廣闊的臨床應(yīng)用前景。在黑色素瘤的診斷方面，ADAM28有望成為一種新的生物標(biāo)志物。通過(guò)檢測(cè)患者腫瘤組織或血液中ADAM28的表達(dá)水平，能夠輔助醫(yī)生更準(zhǔn)確地判斷黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展階段以及預(yù)后情況。對(duì)于ADAM28高表達(dá)的患者，提示其腫瘤可能具有更強(qiáng)的侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能，醫(yī)生可以據(jù)此制定更積極的治療方案；而ADAM28低表達(dá)的患者，其病情相對(duì)較為溫和，治療方案可以相對(duì)保守。這有助于實(shí)現(xiàn)黑色素瘤的精準(zhǔn)診斷和個(gè)性化治療，提高治療效果和患者的生存率。在治療領(lǐng)域，針對(duì)ADAM28的小分子抑制劑、抗體治療和腫瘤疫苗等潛在治療方法，為黑色素瘤的治療提供了新的途徑。小分子抑制劑若能成功開(kāi)發(fā)并應(yīng)用于臨床，將為黑色素瘤患者提供一種高效、便捷的治療手段。它可以特異性地抑制ADAM28的活性，阻斷其介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過(guò)程，從而達(dá)到治療腫瘤的目的?？贵w治療則利用特異性抗體與ADAM28結(jié)合，阻斷其與其他分子的相互作用，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。腫瘤疫苗通過(guò)激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)黑色素瘤的長(zhǎng)期控制和預(yù)防復(fù)發(fā)。這些治療方法的應(yīng)用，有可能顯著改善黑色素瘤患者的預(yù)后，提高患者的生活質(zhì)量。然而，將基于ADAM28的治療策略轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，仍面臨諸多挑戰(zhàn)。技術(shù)層面上，小分子抑制劑的研發(fā)需要克服特異性和藥代動(dòng)力學(xué)等問(wèn)題。如前所述，ADAM家族成員結(jié)構(gòu)相似，如何確保小分子抑制劑只針對(duì)ADAM28發(fā)揮作用，而不影響其他蛋白酶的正常功能，是亟待解決的難題。小分子抑制劑在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄等藥代動(dòng)力學(xué)特性也需要進(jìn)一步優(yōu)化，以提高其療效和安全性?？贵w治療中，抗體的生產(chǎn)工藝復(fù)雜，成本較高，限制了其廣泛應(yīng)用。如何降低抗體的生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率，是推動(dòng)抗體治療臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。腫瘤疫苗的研發(fā)也面臨挑戰(zhàn)，腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性導(dǎo)致不同患者對(duì)疫苗的反應(yīng)存在差異，部分患者可能無(wú)法產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。如何提高腫瘤疫苗的通用性和有效性，是需要深入研究的問(wèn)題。安全性和倫理問(wèn)題也是不可忽視的挑戰(zhàn)。小分子抑制劑和抗體治療可能會(huì)引起一系列不良反應(yīng)，如過(guò)敏反應(yīng)、免疫相關(guān)不良事件等。在臨床應(yīng)用前，需要充分評(píng)估這些治療方法的安全性，制定相應(yīng)的監(jiān)測(cè)和處理措施。腫瘤疫苗的應(yīng)用涉及到個(gè)體免疫反應(yīng)的調(diào)控，可能會(huì)引發(fā)一些倫理問(wèn)題，如免疫逃逸、免疫失衡等。在臨床試驗(yàn)和臨床應(yīng)用中，需要嚴(yán)格遵循倫理準(zhǔn)則，確?；颊叩臋?quán)益和安全。六、結(jié)論與展望6.1研究成果總結(jié)本研究圍繞ADAM28在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制展開(kāi)深入探索，取得了一系列具有重要意義的研究成果。通過(guò)對(duì)黑色素瘤組織及細(xì)胞系的研究，明確了ADAM28在黑色素瘤中的表達(dá)特征。在黑色素瘤組織中，ADAM28的表達(dá)水平呈現(xiàn)出明顯的異質(zhì)性，部分樣本中ADAM28高表達(dá)，而部分樣本中低表達(dá)。ADAM28的表達(dá)與黑色素瘤的臨床病理特征密切相關(guān)，腫瘤厚度、潰瘍形成以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素均與ADAM28的表達(dá)水平顯著相關(guān)。腫瘤厚度超過(guò)4mm、存在潰瘍形成以及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的黑色素瘤患者，其腫瘤組織中ADAM28的表達(dá)水平明顯升高。這表明ADAM28可能在黑色素瘤的進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可作為評(píng)估黑色素瘤病情和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。在ADAM28對(duì)黑色素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響方面，研究結(jié)果表明ADAM28對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡具有顯著調(diào)控作用。通過(guò)基因編輯技術(shù)構(gòu)建ADAM28過(guò)表達(dá)和敲低的黑色素瘤細(xì)胞模型，利用CCK-8實(shí)驗(yàn)、EdU摻入實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)以及流式細(xì)胞術(shù)等多種實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，ADAM28過(guò)表達(dá)能夠顯著促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡；而敲低ADAM28表達(dá)則可有效抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在CCK-8實(shí)驗(yàn)中，ADAM28過(guò)表達(dá)組的黑色素瘤細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的增殖活性均顯著高于對(duì)照組；在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，ADAM28過(guò)表達(dá)組穿過(guò)基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，表明細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)。這些結(jié)果充分證明ADAM28在黑色素瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為調(diào)控中處于關(guān)鍵地位。深入探究ADAM28影響黑色素瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)ADAM28主要通過(guò)激活PI3K/Akt和MAPK等信號(hào)通路來(lái)調(diào)控黑色素瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。利用Westernblot技術(shù)檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示ADAM28過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致PI3K的催化亞基p110α以及磷酸化Akt（p-Akt）的表達(dá)水平顯著升高，同時(shí)磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、磷酸化JNK（p-JNK）和磷酸化p38（p-p38）等MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)也明顯上調(diào)。使用PI3K抑制劑LY294002和MAPK信號(hào)通路抑制劑U0126、SP600125、SB203580處理黑色素瘤細(xì)胞后，ADAM28對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲能力的促進(jìn)作用被顯著抑制。這表明ADAM28通過(guò)激活PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖、存活和侵襲，為進(jìn)一步揭示黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制提供了重要線索。ADAM28與腫瘤微環(huán)境之間存在密切的相互作用。ADAM28能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白和纖連蛋白等成分，破壞細(xì)胞外基質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)，為黑色素瘤細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造有利條件。在黑色素瘤腫瘤微環(huán)境中，ADAM28可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化，從而抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)；ADAM28還可影響T細(xì)胞的功能，抑制T細(xì)胞的活化和增殖，削弱機(jī)體的抗腫瘤免疫能力。ADAM28與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）之間存在相互影響，ADAM28可刺激CAFs分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），促進(jìn)腫瘤血管生成，而CAFs分泌的某些細(xì)胞因子又可上調(diào)黑色素瘤細(xì)胞中ADAM28的表達(dá)。這些相互作用共同促進(jìn)了黑色素瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。ADAM28對(duì)黑色素瘤干細(xì)胞特性也具有重要影響。通過(guò)干細(xì)胞球形成實(shí)