Cohesin蛋白復(fù)合體對Ⅰ型單純皰疹病毒裂解感染的調(diào)控機(jī)制探究一、引言1.1研究背景單純皰疹病毒（HerpesSimplexVirus，HSV）作為一類具有高度傳染性的DNA病毒，在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，給人類健康帶來了嚴(yán)重威脅。HSV主要分為兩種血清型，即HSV-1和HSV-2。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球大約有67%的人群感染過HSV-1病毒，在北美和歐洲，HSV-1感染率較高，約50%-90%的成年人口感染了HSV-1病毒；在亞洲，HSV-1感染率雖相對較低，但部分地區(qū)也呈逐漸升高趨勢。而HSV-2主要通過性接觸傳播，全球約有4.17億14-49歲年齡段人群感染了HSV-2，每年新發(fā)感染達(dá)1900萬例。HSV-1感染通常通過皮膚或黏膜的接觸傳播，如口唇、皮膚及其他身體部位接觸傳播。它主要引起口腔皰疹，最常見的癥狀為唇皰疹或口腔潰瘍。在一些情況下，HSV-1感染還可能導(dǎo)致更為嚴(yán)重的疾病，如皰疹性角膜結(jié)膜炎，這是臨床上導(dǎo)致失明的重要原因之一，約占所有失明病例的30%。同時(shí)，隨著人們生活方式的改變，HSV-1感染引發(fā)原發(fā)性生殖器皰疹的病例也逐漸增多，這不僅給患者帶來身體上的痛苦，還對其心理健康和生活質(zhì)量造成了嚴(yán)重影響。此外，對于免疫缺陷以及免疫抑制人群，HSV-1感染可引發(fā)致死性腦炎等嚴(yán)重疾病，進(jìn)一步凸顯了其對公共衛(wèi)生的威脅。HSV-1的感染過程較為復(fù)雜。病毒首先感染上皮細(xì)胞并大量復(fù)制，隨后通過感覺神經(jīng)節(jié)進(jìn)入神經(jīng)元進(jìn)行潛伏。在潛伏期間，病毒DNA環(huán)化并整合到宿主染色體中，此時(shí)病毒處于相對靜止?fàn)顟B(tài)，但仍會對宿主細(xì)胞的生理功能產(chǎn)生潛在影響。當(dāng)受到外界刺激，如UV照射皮膚、發(fā)燒發(fā)熱、心理壓力、機(jī)體受創(chuàng)傷、重金屬毒性刺激等，病毒會重新激活進(jìn)入裂解感染期。在裂解感染期，病毒DNA利用宿主細(xì)胞的核苷酸、組蛋白和轉(zhuǎn)錄復(fù)制所需的復(fù)合體，依次合成病毒的即早期蛋白、早期蛋白和晚期蛋白，完成病毒的增殖和擴(kuò)散。盡管目前臨床上已應(yīng)用核苷類藥物如阿昔洛韋、伐昔洛韋、泛昔洛韋等進(jìn)行抗病毒治療，這些藥物在一定程度上可以緩解癥狀、抑制病毒復(fù)制，但它們無法根除潛伏的病毒。隨著病毒的變異和耐藥性的產(chǎn)生，現(xiàn)有的治療手段面臨著越來越大的挑戰(zhàn)。因此，深入研究HSV-1的感染機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和防治措施具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。Cohesin作為一種在細(xì)胞中具有多種重要功能的蛋白復(fù)合體，其在病毒感染過程中的作用逐漸受到關(guān)注，研究Cohesin在HSV-1裂解感染中的作用機(jī)制，可能為HSV-1感染的防治提供新的思路和方法。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究Cohesin在HSV-1裂解感染中的作用機(jī)制，明確Cohesin對HSV-1復(fù)制、基因表達(dá)及與宿主細(xì)胞相互作用的具體影響。通過一系列實(shí)驗(yàn)，包括慢病毒敲低、siRNA敲低、免疫熒光染色、WesternBlot、病毒基因組轉(zhuǎn)錄檢測、病毒DNA復(fù)制檢測以及ChIP等技術(shù)，分析Cohesin被HSV-1病毒復(fù)制區(qū)招募的情況，以及敲低Cohesin對病毒復(fù)制中心形成、病毒裂解基因蛋白表達(dá)、病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的影響，并進(jìn)一步研究Cohesin對RNAPolⅡ和組蛋白H3K27me3在HSV-1基因組上結(jié)合的作用。HSV-1感染引發(fā)的疾病嚴(yán)重威脅人類健康，如皰疹性角膜結(jié)膜炎是導(dǎo)致失明的重要原因之一，免疫缺陷及免疫抑制人群感染后還可能引發(fā)致死性腦炎。目前臨床上使用的核苷類藥物雖能緩解癥狀、抑制病毒復(fù)制，但無法根除潛伏病毒，且病毒變異和耐藥性問題日益突出。因此，深入研究HSV-1的感染機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)迫在眉睫。Cohesin作為細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白復(fù)合體，參與多種細(xì)胞生理過程，其在病毒感染中的作用逐漸受到關(guān)注。在HSV-1感染過程中，Cohesin可能通過多種途徑影響病毒的生命周期，研究其作用機(jī)制，有助于揭示病毒與宿主細(xì)胞相互作用的本質(zhì)，為理解HSV-1感染機(jī)制提供新的視角，豐富病毒學(xué)理論知識。同時(shí)，這一研究還有望為開發(fā)新型抗HSV-1藥物提供潛在靶點(diǎn)，為臨床治療HSV-1感染相關(guān)疾病提供新的策略和方法，具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。1.3研究現(xiàn)狀近年來，HSV-1感染的研究取得了顯著進(jìn)展。在病毒感染機(jī)制方面，眾多研究聚焦于HSV-1與宿主細(xì)胞的相互作用過程。已知HSV-1主要通過皮膚或黏膜接觸傳播，感染上皮細(xì)胞后大量復(fù)制，隨后沿感覺神經(jīng)節(jié)進(jìn)入神經(jīng)元并建立潛伏感染。當(dāng)機(jī)體受到外界刺激，如UV照射、發(fā)熱、心理壓力等，病毒可被重新激活進(jìn)入裂解感染期。在裂解感染過程中，病毒DNA利用宿主細(xì)胞的各種物質(zhì)和復(fù)合體，依次合成即早期蛋白、早期蛋白和晚期蛋白，完成病毒的增殖和擴(kuò)散。研究發(fā)現(xiàn)，HSV-1感染過程中，病毒蛋白與宿主細(xì)胞的多種信號通路相互作用，影響細(xì)胞的正常生理功能，進(jìn)而為病毒的生存和繁殖創(chuàng)造有利條件。例如，HSV-1編碼的一些蛋白能夠干擾宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答信號通路，抑制宿主細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)。在HSV-1感染的防治研究方面，目前臨床上主要應(yīng)用核苷類藥物如阿昔洛韋、伐昔洛韋、泛昔洛韋等進(jìn)行治療。這些藥物能夠抑制病毒DNA的合成，從而在一定程度上緩解癥狀、抑制病毒復(fù)制。然而，由于HSV-1病毒具有潛伏感染的特性，這些藥物無法根除潛伏在神經(jīng)元中的病毒。一旦機(jī)體免疫力下降，病毒就可能重新激活，導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)。此外，隨著病毒的不斷變異，耐藥性問題也日益突出，使得現(xiàn)有的治療手段面臨挑戰(zhàn)。疫苗研發(fā)方面，雖然有多個(gè)針對HSV-2的疫苗處于研發(fā)階段，但針對HSV-1的有效疫苗尚未問世。由于HSV-1的潛伏性以及其與宿主免疫系統(tǒng)復(fù)雜的相互作用，疫苗研發(fā)面臨諸多困難。Cohesin作為一種重要的蛋白復(fù)合體，在細(xì)胞中參與多種關(guān)鍵生理過程，其研究也受到廣泛關(guān)注。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，Cohesin在分裂間期染色質(zhì)和分裂期染色體中發(fā)揮重要作用，調(diào)節(jié)姐妹染色單體的結(jié)合與分離。研究表明，Cohesin通過其亞基蛋白的磷酸化、乙?；TP水解等修飾，精確調(diào)控其與染色體的結(jié)合和釋放，確保細(xì)胞分裂過程的正常進(jìn)行。在DNA損傷修復(fù)中，Cohesin也扮演著關(guān)鍵角色，它能夠參與修復(fù)受損的DNA，維持基因組的穩(wěn)定性。當(dāng)DNA受到損傷時(shí)，Cohesin可被招募到損傷位點(diǎn)，促進(jìn)修復(fù)蛋白的聚集和修復(fù)過程的進(jìn)行。此外，Cohesin還與基因表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)，它可以通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和遠(yuǎn)程相互作用，影響基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，Cohesin參與染色質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)的形成，通過與啟動子區(qū)域的相互作用，調(diào)控基因的表達(dá)水平。在病毒感染領(lǐng)域，Cohesin在多種病毒感染宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。例如，在KSHV（卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒）感染過程中，Cohesin參與病毒基因組的維持和病毒基因的表達(dá)調(diào)控。研究表明，KSHV感染細(xì)胞后，Cohesin可與病毒基因組結(jié)合，影響病毒的潛伏和裂解周期轉(zhuǎn)換。在EBV（EB病毒）感染中，Cohesin也參與病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程，對病毒的生命周期產(chǎn)生影響。然而，目前關(guān)于Cohesin在HSV-1裂解感染中的作用機(jī)制研究仍相對較少，存在諸多空白和不足。雖然已有研究表明HSV-1復(fù)制中心需要宿主染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)控相關(guān)的Cohesin復(fù)合體參與，但Cohesin具體如何被HSV-1病毒復(fù)制區(qū)招募，以及其對病毒復(fù)制、基因表達(dá)和與宿主細(xì)胞相互作用的詳細(xì)分子機(jī)制尚不清楚。深入研究這些問題，對于揭示HSV-1的感染機(jī)制、尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。二、HSV-1和Cohesin概述2.1HSV-1的生物學(xué)特性2.1.1皰疹病毒的分類與危害皰疹病毒（Herpesviruses）是一類有包膜、基因組為雙鏈DNA的病毒，目前已發(fā)現(xiàn)超過100種。根據(jù)基因組序列、結(jié)構(gòu)以及理化性質(zhì)的不同，可將皰疹病毒分為α皰疹病毒、β皰疹病毒、γ皰疹病毒以及其他皰疹病毒四個(gè)亞科。其中，α皰疹病毒具有宿主范圍廣、在細(xì)胞內(nèi)增殖速度快以及能迅速建立潛伏感染等特點(diǎn)。代表性的α皰疹病毒包括能夠感染人類的單純皰疹病毒1型和2型（HerpesSimplexVirustype1/2，HSV-1/2）、水痘-帶狀皰疹病毒（Varicella-zostervirus，VZV），以及感染動物的偽狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus，PRV）、雞馬立克氏病病毒（Marek’sdiseasevirus，MDV）等。β皰疹病毒主要有人類的巨細(xì)胞病毒（Humancytomegalovirus，HCMV），其感染宿主細(xì)胞后，病毒復(fù)制周期較長，可導(dǎo)致細(xì)胞腫大。γ皰疹病毒如EB病毒（Epstein-Barrvirus，EBV），感染的靶細(xì)胞主要是淋巴樣細(xì)胞，可引起淋巴增生。皰疹病毒感染的宿主范圍廣泛，可感染人類和其他脊椎動物。目前發(fā)現(xiàn)能感染人的皰疹病毒有8種，除上述提到的HSV-1、HSV-2、VZV、HCMV、EBV外，還有人類皰疹病毒6型（HHV-6）、人類皰疹病毒7型（HHV-7）和卡波濟(jì)肉瘤相關(guān)病毒（Kaposi'ssarcoma-associatedherpesvirus，KSHV）。這些皰疹病毒侵犯外胚層來源的組織，包括皮膚、粘膜和神經(jīng)組織，感染部位和引起的疾病多種多樣。例如，HSV-1主要引起口唇皰疹、咽炎、角膜炎，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致散發(fā)性腦炎；HSV-2主要通過破損皮膚及粘膜感染，引發(fā)生殖器皰疹；VZV初次感染引起水痘，痊愈后病毒潛伏在神經(jīng)節(jié)內(nèi)，當(dāng)免疫力下降時(shí)可再次活躍，引發(fā)帶狀皰疹；EBV與傳染性單核細(xì)胞增多癥、Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌等疾病相關(guān)；HCMV在免疫功能正常的個(gè)體中感染通常無癥狀，但在免疫缺陷人群中，可引起嚴(yán)重的健康問題，如肺炎、視網(wǎng)膜炎等。皰疹病毒感染不僅給患者帶來身體上的痛苦，還會對其心理健康和生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響，同時(shí)也給社會醫(yī)療資源帶來沉重負(fù)擔(dān)。2.1.2HSV-1的結(jié)構(gòu)與基因組HSV-1呈球形，是一種具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的病毒，完整病毒由核心、衣殼、被膜（Tegument）及囊膜組成。核心含雙股DNA，這些DNA分子呈線性排列，長度約為152kb，它們緊密纏繞成纖絲卷軸狀。衣殼呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)，由162個(gè)殼微粒組成，直徑約為100nm，衣殼為病毒的遺傳物質(zhì)提供了保護(hù)。衣殼外覆蓋著一層厚薄不均的被膜，被膜中含有多種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)在病毒的感染過程中發(fā)揮著重要作用。最外層為典型的脂質(zhì)雙層囊膜，囊膜表面含有多種糖蛋白，如gb、gC、gD、gE、gG、gH等。這些糖蛋白與病毒對細(xì)胞的吸附、穿入（gB、gC、gD、gE）、控制病毒從細(xì)胞核膜出芽釋放（gH）及誘導(dǎo)細(xì)胞融合（gB、gC、gD、gH）等過程密切相關(guān)，同時(shí)，它們還能誘生中和抗體（其中g(shù)D的作用最強(qiáng)）和發(fā)揮細(xì)胞毒作用。HSV-1的基因組為一線性DNA分子，由共價(jià)連接的長片段（L）和短片段（S）組成。每一片段均含有單一序列和反轉(zhuǎn)重復(fù)序列。長片段約占基因組的82%，短片段約占18%?；蚪M中包含了大約80個(gè)基因，這些基因編碼多種蛋白質(zhì)，包括病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒粒子的組裝，如衣殼蛋白、囊膜糖蛋白等；非結(jié)構(gòu)蛋白則在病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、調(diào)控等過程中發(fā)揮重要作用。例如，ICP0、ICP4等立即早期蛋白參與調(diào)控病毒早期基因的轉(zhuǎn)錄；ICP6、ICP8等早期蛋白參與病毒核酸代謝；晚期基因的產(chǎn)物主要是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，如糖蛋白、衣殼蛋白和內(nèi)膜蛋白等，它們與病毒的吸附、進(jìn)入和融合以及病毒的抗原性密切相關(guān)。HSV-1基因組的結(jié)構(gòu)和基因組成決定了其生物學(xué)特性和感染過程。2.1.3HSV-1的感染過程HSV-1的感染過程主要包括原發(fā)感染、潛伏感染和復(fù)發(fā)感染三個(gè)階段。原發(fā)感染通常發(fā)生在兒童時(shí)期，病毒主要通過皮膚或黏膜接觸傳播，如口唇、皮膚及其他身體部位的接觸。初始感染部位多為黏膜上皮細(xì)胞，病毒在這些細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，引發(fā)一系列癥狀。在口腔黏膜感染時(shí)，可導(dǎo)致齦口炎，表現(xiàn)為牙齦、咽和頰部皰疹、發(fā)熱和喉嚨痛，皰疹破裂后形成潰瘍。病毒還可引起皰疹性角膜結(jié)膜炎，導(dǎo)致眼部疼痛、紅腫、視力下降等癥狀。在皮膚感染時(shí)，可出現(xiàn)皰疹性濕疹等。原發(fā)感染后，機(jī)體的特異性免疫系統(tǒng)會被激活，大部分病毒會被清除。然而，仍有少部分病毒會沿感覺神經(jīng)軸突逆行至三叉神經(jīng)節(jié)或進(jìn)入感覺神經(jīng)元的神經(jīng)末梢。在三叉神經(jīng)節(jié)，病毒雖有短暫復(fù)制，但大多數(shù)病毒最終進(jìn)入潛伏狀態(tài)。在潛伏感染期間，皰疹病毒基因組的結(jié)構(gòu)和功能均未受到破壞，但病毒基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)相關(guān)的一系列調(diào)控都處于停滯狀態(tài)。此時(shí)沒有完整的基因組復(fù)制，但存在有限的局部基因轉(zhuǎn)錄。病毒主要潛伏在三叉神經(jīng)節(jié)和頸上神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元細(xì)胞核內(nèi)，以游離的環(huán)狀DNA形式存在。在潛伏感染過程中，病毒與宿主細(xì)胞處于相對平衡的狀態(tài)，宿主一般無明顯癥狀。當(dāng)機(jī)體受到外界刺激，如UV照射皮膚、發(fā)燒發(fā)熱、心理壓力、機(jī)體受創(chuàng)傷、重金屬毒性刺激等，潛伏的病毒可被激活，轉(zhuǎn)為增殖性感染。病毒沿感覺神經(jīng)纖維軸索下行返回末梢，在局部上皮細(xì)胞內(nèi)大量增殖，引起局部復(fù)發(fā)性皰疹。復(fù)發(fā)感染的癥狀與原發(fā)感染相似，但通常癥狀較輕，病程較短。復(fù)發(fā)性皰疹常見于口唇周圍，表現(xiàn)為集簇性水皰，可伴有疼痛、瘙癢等不適。在一些免疫功能低下的個(gè)體中，復(fù)發(fā)感染可能更為頻繁和嚴(yán)重，甚至可引發(fā)致死性腦炎等嚴(yán)重疾病。2.1.4HSV-1裂解感染的表觀遺傳學(xué)調(diào)控表觀遺傳修飾是指在不改變DNA序列的情況下，對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的機(jī)制，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾等。在HSV-1裂解感染過程中，表觀遺傳修飾發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。早期研究發(fā)現(xiàn)，衣殼包裹的病毒基因組DNA在微球核酸酶（MCN）作用下未產(chǎn)生類似宿主細(xì)胞的典型核小體條帶，表明病毒DNA未結(jié)合組蛋白形成染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。然而，隨著染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）技術(shù)的應(yīng)用，越來越多的證據(jù)表明HSV-1裂解感染中也存在著廣泛的染色質(zhì)表觀遺傳學(xué)修飾。在DNA甲基化方面，研究發(fā)現(xiàn)HSV-1基因組的某些區(qū)域存在甲基化修飾。DNA甲基化通常由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）催化，將一個(gè)甲基從s-腺苷蛋氨酸（SAM）轉(zhuǎn)移到胞嘧啶殘基的第5個(gè)碳上，形成5mC。這種甲基化修飾可能影響病毒基因的表達(dá)。例如，某些病毒基因啟動子區(qū)域的高甲基化可能抑制基因的轉(zhuǎn)錄，而低甲基化則可能促進(jìn)基因表達(dá)。在HSV-1感染過程中，DNA甲基化狀態(tài)的改變可能與病毒的復(fù)制周期和感染進(jìn)程相關(guān)。組蛋白修飾也是HSV-1裂解感染表觀遺傳調(diào)控的重要方式。組蛋白修飾通常發(fā)生于組蛋白氨基末端，一般包含甲基化、乙酰化和磷酸化等。不同修飾的組蛋白通過結(jié)合染色質(zhì)重塑復(fù)合物，參與基因組染色質(zhì)構(gòu)象調(diào)控，最終影響基因表達(dá)。例如，組蛋白乙?；ǔＥc轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)，在轉(zhuǎn)錄活性基因上，組蛋白乙?；饕趩幼雍途幋a區(qū)的5’端的特定位點(diǎn)富集。在HSV-1裂解感染中，病毒可能利用宿主細(xì)胞的組蛋白修飾機(jī)制，對自身基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。研究表明，病毒感染可導(dǎo)致宿主細(xì)胞組蛋白修飾模式的改變，進(jìn)而影響病毒基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。此外，一些病毒蛋白可能直接與組蛋白相互作用，調(diào)節(jié)組蛋白修飾狀態(tài)，從而促進(jìn)病毒的感染和增殖。表觀遺傳修飾在HSV-1裂解感染中對病毒基因表達(dá)和病毒復(fù)制的調(diào)控作用是一個(gè)復(fù)雜的過程，深入研究這一過程有助于揭示HSV-1的感染機(jī)制，為開發(fā)新的治療策略提供理論依據(jù)。2.2Cohesin的結(jié)構(gòu)與功能2.2.1Cohesin的結(jié)構(gòu)組成Cohesin是一類在真核生物進(jìn)化過程中高度保守的蛋白復(fù)合體，它在維持染色體的結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。Cohesin主要由四個(gè)核心亞基組成，分別是SMC1（StructuralMaintenanceofChromosomes1）、SMC3、SCC1（也被稱為Rad21）和SCC3。SMC1和SMC3屬于典型的SMC蛋白家族成員。它們具有相似的結(jié)構(gòu)，都包含一個(gè)ATP酶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)鉸鏈區(qū)。在Cohesin復(fù)合體中，SMC1和SMC3通過鉸鏈區(qū)相互作用，形成一個(gè)V形的異源二聚體結(jié)構(gòu)。這種V形結(jié)構(gòu)為Cohesin的功能發(fā)揮提供了基礎(chǔ)框架。SCC1作為kleisin亞基，其兩端分別與SMC1和SMC3的ATP酶結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合，從而將SMC1和SMC3連接起來，形成一個(gè)閉合的環(huán)狀套索結(jié)構(gòu)。這個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)是Cohesin發(fā)揮功能的關(guān)鍵，它能夠?qū)蓷l姐妹染色單體環(huán)繞起來，實(shí)現(xiàn)姐妹染色單體的黏連。SCC3亞基則在穩(wěn)定Cohesin復(fù)合體結(jié)構(gòu)以及調(diào)節(jié)其與染色體的結(jié)合等方面發(fā)揮重要作用。它與SCC1相互作用，進(jìn)一步穩(wěn)定了Cohesin的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并且參與調(diào)控Cohesin在染色體上的定位和功能。除了這四個(gè)核心亞基外，Cohesin還可能與其他一些輔助蛋白相互作用。這些輔助蛋白雖然并非Cohesin復(fù)合體的組成部分，但它們在Cohesin的組裝、定位以及功能調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。例如，Cohesinloader復(fù)合物由SCC2和SCC4組成，它能夠促進(jìn)Cohesin結(jié)合到染色體的特定位點(diǎn)上。其中，SCC2主要負(fù)責(zé)與Cohesin結(jié)合，而SCC4則主要負(fù)責(zé)識別Cohesin在染色質(zhì)上的結(jié)合位點(diǎn)。通過與這些輔助蛋白的協(xié)同作用，Cohesin能夠更加精準(zhǔn)地定位到染色體上的特定區(qū)域，從而實(shí)現(xiàn)其在細(xì)胞分裂、DNA損傷修復(fù)以及基因表達(dá)調(diào)控等過程中的功能。Cohesin的這種結(jié)構(gòu)組成使其能夠在細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行多種重要的生物學(xué)功能，對于維持細(xì)胞的正常生理狀態(tài)和遺傳穩(wěn)定性具有重要意義。2.2.2Cohesin與細(xì)胞周期調(diào)控在細(xì)胞周期中，Cohesin起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，尤其是在姐妹染色單體的結(jié)合與分離過程中。在細(xì)胞分裂間期，DNA進(jìn)行復(fù)制，每條染色體復(fù)制形成兩條姐妹染色單體。此時(shí)，Cohesin復(fù)合體被招募到染色單體上，通過其環(huán)狀結(jié)構(gòu)將兩條姐妹染色單體緊密黏連在一起。這種黏連作用對于維持染色單體的正確排列和穩(wěn)定至關(guān)重要，確保了遺傳物質(zhì)在細(xì)胞分裂過程中的準(zhǔn)確傳遞。具體來說，在G1期，Cohesin就開始在染色體上組裝，但此時(shí)其與染色單體的結(jié)合相對較弱。隨著細(xì)胞進(jìn)入S期，DNA復(fù)制過程中，Cohesinloader復(fù)合物（由SCC2和SCC4組成）協(xié)助Cohesin更穩(wěn)定地結(jié)合到新合成的染色單體上。SCC2負(fù)責(zé)與Cohesin結(jié)合，SCC4則識別染色質(zhì)上的特定結(jié)合位點(diǎn)，引導(dǎo)Cohesin準(zhǔn)確地定位到染色單體上。到了G2期，Cohesin在染色單體上的分布更加均勻，維持著姐妹染色單體的緊密結(jié)合。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期時(shí)，Cohesin的作用變得更加關(guān)鍵。在前期和中期，Cohesin持續(xù)維持姐妹染色單體的黏連，抵抗有絲分裂紡錘體產(chǎn)生的拉力。此時(shí)，Cohesin給予姐妹染色單體間的粘附力與有絲分裂紡錘體相反兩極對姐妹染色單體動粒的粘附力（或拉力）相互對立，只有精確協(xié)調(diào)二者，才能確保兩條染色單體正確分離。到了有絲分裂后期，姐妹染色單體需要準(zhǔn)確分離并分別移向細(xì)胞的兩極。這一過程中，Cohesin的降解是關(guān)鍵步驟。一種名為分離酶（Separase）的蛋白酶被激活，它能夠切割Cohesin中的SCC1亞基。SCC1被切割后，Cohesin的環(huán)狀結(jié)構(gòu)被破壞，姐妹染色單體之間的黏連被解除，從而能夠在紡錘體微管的牽引下順利分離。在減數(shù)分裂過程中，Cohesin的作用更為復(fù)雜。在減數(shù)第一次分裂前期，同源染色體配對并發(fā)生聯(lián)會，Cohesin不僅參與姐妹染色單體的黏連，還在同源染色體之間發(fā)揮作用。在減數(shù)第一次分裂后期，同源染色體分離，此時(shí)Cohesin在染色體臂上的部分被降解，但著絲粒區(qū)域的Cohesin仍保持完整，以維持姐妹染色單體在減數(shù)第二次分裂中的黏連。直到減數(shù)第二次分裂后期，著絲粒區(qū)域的Cohesin才被降解，姐妹染色單體分離。Cohesin在細(xì)胞周期中通過精確的組裝、定位和降解過程，實(shí)現(xiàn)了對姐妹染色單體結(jié)合與分離的精細(xì)調(diào)控，保證了遺傳物質(zhì)在細(xì)胞分裂過程中的穩(wěn)定傳遞。2.2.3Cohesin與DNA損傷修復(fù)當(dāng)細(xì)胞受到紫外線、化學(xué)物質(zhì)、電離輻射等各種因素的影響導(dǎo)致DNA損傷時(shí)，Cohesin會迅速被招募到損傷位點(diǎn)。研究表明，Cohesin能夠與多種DNA損傷修復(fù)蛋白相互作用，形成一個(gè)復(fù)雜的修復(fù)復(fù)合物。例如，Cohesin可以與MRN復(fù)合物（由Mre11、Rad50和Nbs1組成）相互作用。MRN復(fù)合物在DNA損傷識別和修復(fù)起始過程中發(fā)揮重要作用，它能夠識別DNA雙鏈斷裂（DSBs）位點(diǎn)，并招募其他修復(fù)蛋白。Cohesin與MRN復(fù)合物的結(jié)合，有助于穩(wěn)定修復(fù)復(fù)合物在損傷位點(diǎn)的組裝，促進(jìn)修復(fù)過程的順利進(jìn)行。在同源重組修復(fù)（HR）過程中，Cohesin也起著關(guān)鍵作用。HR是一種高保真的DNA修復(fù)方式，主要用于修復(fù)DNA雙鏈斷裂。在HR過程中，受損的DNA雙鏈會被切除一段，形成3’單鏈末端。隨后，單鏈DNA會與同源染色體上的對應(yīng)序列進(jìn)行配對和重組。Cohesin能夠通過維持姐妹染色單體的緊密結(jié)合，為HR提供一個(gè)穩(wěn)定的模板。它確保了在修復(fù)過程中，受損DNA能夠準(zhǔn)確地與姐妹染色單體上的同源序列進(jìn)行重組，從而實(shí)現(xiàn)精確的修復(fù)。此外，Cohesin還參與非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)途徑。NHEJ是一種相對簡單的修復(fù)方式，它直接將斷裂的DNA末端連接起來。Cohesin可以促進(jìn)NHEJ相關(guān)蛋白在損傷位點(diǎn)的聚集，提高連接的效率和準(zhǔn)確性。在NHEJ過程中，Cohesin可能通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使斷裂的DNA末端更容易相互靠近，從而便于連接酶進(jìn)行連接。Cohesin在DNA損傷修復(fù)中通過與多種修復(fù)蛋白相互作用，參與不同的修復(fù)途徑，維持了基因組的穩(wěn)定性，減少了因DNA損傷導(dǎo)致的基因突變和細(xì)胞病變的發(fā)生。2.2.4Cohesin與基因表達(dá)調(diào)控Cohesin對基因表達(dá)的調(diào)控主要通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，Cohesin能夠參與染色質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)的形成。它可以將染色體上相距較遠(yuǎn)的區(qū)域拉近，形成染色質(zhì)環(huán)。這些染色質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)能夠使基因的啟動子區(qū)域與增強(qiáng)子等調(diào)控元件相互靠近，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動子的結(jié)合，增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄活性。例如，在某些基因的表達(dá)調(diào)控中，Cohesin可以將位于基因上游或下游的增強(qiáng)子與啟動子連接起來，使增強(qiáng)子能夠有效地發(fā)揮作用，激活基因的轉(zhuǎn)錄。這種通過染色質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)的遠(yuǎn)程相互作用，對于基因表達(dá)的精確調(diào)控至關(guān)重要。Cohesin還可以通過與絕緣子結(jié)合蛋白相互作用，參與絕緣子功能的調(diào)控。絕緣子是一種能夠阻止增強(qiáng)子與啟動子之間異常相互作用的調(diào)控元件。Cohesin與絕緣子結(jié)合蛋白結(jié)合后，可以調(diào)節(jié)絕緣子的功能，確?；蛟谡_的時(shí)間和空間內(nèi)表達(dá)。當(dāng)Cohesin與絕緣子結(jié)合時(shí)，它可以穩(wěn)定絕緣子的結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)其對增強(qiáng)子和啟動子之間相互作用的阻隔作用，防止基因的異常激活或抑制。在胚胎發(fā)育過程中，Cohesin對基因表達(dá)的調(diào)控作用尤為明顯。不同組織和器官的發(fā)育需要特定基因的有序表達(dá)。Cohesin通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因之間的遠(yuǎn)程相互作用，參與調(diào)控胚胎發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)。例如，在小鼠胚胎發(fā)育過程中，Cohesin的缺失會導(dǎo)致某些關(guān)鍵基因的表達(dá)異常，進(jìn)而影響胚胎的正常發(fā)育，出現(xiàn)發(fā)育遲緩、器官畸形等問題。Cohesin在基因表達(dá)調(diào)控中通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和遠(yuǎn)程相互作用，影響基因的轉(zhuǎn)錄活性，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。2.2.5Cohesin與病毒和宿主間相互作用在病毒感染宿主細(xì)胞的過程中，Cohesin在多個(gè)方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。以KSHV感染為例，研究表明，Cohesin參與了病毒基因組的維持和病毒基因的表達(dá)調(diào)控。KSHV感染細(xì)胞后，Cohesin可與病毒基因組結(jié)合。在病毒的潛伏感染階段，Cohesin可能通過維持病毒基因組的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，促進(jìn)病毒潛伏相關(guān)基因的表達(dá)，抑制病毒裂解基因的表達(dá)，從而維持病毒的潛伏狀態(tài)。而在病毒的裂解感染階段，Cohesin的作用則發(fā)生了變化。它可能參與調(diào)節(jié)病毒裂解基因的表達(dá)，促進(jìn)病毒的復(fù)制和增殖。具體來說，Cohesin可能通過與病毒基因組上的特定區(qū)域結(jié)合，招募轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白，影響病毒基因的轉(zhuǎn)錄起始和延伸過程。在EBV感染中，Cohesin同樣參與了病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程。EBV感染宿主細(xì)胞后，Cohesin可以與EBV基因組上的一些關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域相互作用。例如，在EBV的潛伏感染中，Cohesin可能參與調(diào)控潛伏相關(guān)基因的表達(dá)，確保病毒在潛伏狀態(tài)下能夠逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。而在EBV的裂解感染過程中，Cohesin可能通過調(diào)節(jié)病毒基因的表達(dá)，促進(jìn)病毒的復(fù)制和子代病毒的產(chǎn)生。研究還發(fā)現(xiàn)，Cohesin在調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)方面也發(fā)揮著作用。病毒感染會引發(fā)宿主的免疫應(yīng)答，而Cohesin可能通過影響宿主細(xì)胞中免疫相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)。在某些病毒感染中，Cohesin可能抑制宿主免疫相關(guān)基因的表達(dá)，使宿主的免疫反應(yīng)受到抑制，從而有利于病毒的生存和繁殖。而在另一些情況下，Cohesin可能促進(jìn)免疫相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)宿主的抗病毒免疫反應(yīng)。Cohesin在不同病毒感染中對病毒復(fù)制、基因表達(dá)及宿主免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用復(fù)雜多樣，深入研究其作用機(jī)制，有助于揭示病毒與宿主細(xì)胞相互作用的本質(zhì)。三、研究設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)選用人胚腎293T細(xì)胞（HEK293T）和非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）。HEK293T細(xì)胞因其易于轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)的特性，廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)研究領(lǐng)域，能夠高效表達(dá)外源基因，為研究病毒與宿主細(xì)胞相互作用提供了良好的模型。Vero細(xì)胞對HSV-1具有高度敏感性，是培養(yǎng)HSV-1的常用細(xì)胞系，能夠支持HSV-1的高效復(fù)制，便于獲取高滴度的病毒樣本。細(xì)胞均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），并在含有10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（Gibco公司）的高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3.1.2病毒HSV-1病毒株（F株）購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。該病毒株具有穩(wěn)定的生物學(xué)特性，在病毒感染機(jī)制研究中應(yīng)用廣泛。將HSV-1病毒接種于Vero細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）后，收集病毒上清液。通過反復(fù)凍融3次，使病毒從感染細(xì)胞中釋放出來。隨后，采用空斑實(shí)驗(yàn)測定病毒滴度，具體方法為：將病毒上清液進(jìn)行10倍系列稀釋，分別接種于長滿單層Vero細(xì)胞的6孔板中，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。吸附1h后，棄去病毒液，加入含1%低熔點(diǎn)瓊脂糖的DMEM培養(yǎng)基覆蓋細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)3-5天，待空斑形成后，用結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)空斑數(shù)量，計(jì)算病毒滴度（PFU/mL）。3.1.3菌株本實(shí)驗(yàn)使用的菌株為大腸桿菌DH5α，購自天根生化科技（北京）有限公司。該菌株常用于質(zhì)粒的擴(kuò)增和保存。將含有目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化過程如下：取100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞，加入5μL質(zhì)粒DNA，輕輕混勻，冰浴30min。然后42℃熱激90s，迅速冰浴2min。加入900μL不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h。將培養(yǎng)物涂布于含相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種于含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16h，進(jìn)行質(zhì)粒提取。3.1.4試劑慢病毒包裝相關(guān)試劑包括pMD2.G、psPAX2質(zhì)粒（Addgene公司），以及Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司）。pMD2.G和psPAX2質(zhì)粒用于包裝慢病毒，Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑能夠高效介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。siRNA敲低實(shí)驗(yàn)所用的針對Cohesin亞基SMC1和Rad21的siRNA序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，同時(shí)設(shè)置陰性對照siRNA。免疫熒光染色所需的一抗為兔抗SMC1抗體、兔抗Rad21抗體（Abcam公司），以及鼠抗HSV-1ICP8抗體（SantaCruz公司）。二抗為AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG和AlexaFluor594標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（Invitrogen公司）。DAPI染液（Sigma公司）用于細(xì)胞核染色。WesternBlot實(shí)驗(yàn)所需的一抗包括兔抗SMC1抗體、兔抗Rad21抗體、兔抗HSV-1ICP0抗體、兔抗HSV-1ICP4抗體、兔抗HSV-1gB抗體（Abcam公司），以及鼠抗β-actin抗體（SantaCruz公司）。二抗為辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG（JacksonImmunoResearch公司）。ECL化學(xué)發(fā)光底物（ThermoFisherScientific公司）用于檢測蛋白條帶。病毒基因組轉(zhuǎn)錄檢測所需的TRIzol試劑（Invitrogen公司）用于提取細(xì)胞總RNA，PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa公司）用于反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，SYBRPremixExTaqII（TaKaRa公司）用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。病毒DNA復(fù)制檢測所需的QIAampDNAMiniKit（Qiagen公司）用于提取細(xì)胞基因組DNA，以及用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的相關(guān)引物。ChIP實(shí)驗(yàn)所需的ChIP-GradeAnti-SMC1抗體（Abcam公司）、ChIP-GradeAnti-RNAPolⅡ抗體（Abcam公司）、ChIP-GradeAnti-H3K27me3抗體（Abcam公司），以及ProteinA/GMagneticBeads（ThermoFisherScientific公司）。3.1.5溶液細(xì)胞培養(yǎng)用的PBS緩沖液（pH7.4），配方為：8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa?HPO?、0.24gKH?PO?，加去離子水定容至1000mL，高壓滅菌后室溫保存。胰蛋白酶消化液（0.25%Trypsin-EDTA）購自Gibco公司。免疫熒光染色用的4%多聚甲醛固定液，稱取4g多聚甲醛，加入100mLPBS，加熱攪拌至完全溶解，冷卻后過濾，4℃保存。0.1%TritonX-100通透液，取0.1mLTritonX-100，加入100mLPBS，混勻后室溫保存。3%BSA封閉液，稱取3gBSA，加入100mLPBST（含0.1%Tween-20的PBS），攪拌溶解后4℃保存。WesternBlot用的SDS-PAGE凝膠配制相關(guān)溶液，包括30%丙烯酰胺溶液（29g丙烯酰胺和1gN，N’-亞甲雙丙烯酰胺，加去離子水至100mL，過濾后4℃避光保存）、1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）、0.5mol/LTris-HCl（pH6.8）、10%SDS溶液、10%過硫酸銨溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）、TEMED。電泳緩沖液（1×Tris-甘氨酸緩沖液，含0.1%SDS），配方為：3.03gTris、18.8g甘氨酸、1gSDS，加去離子水定容至1000mL。轉(zhuǎn)膜緩沖液，配方為：2.9g甘氨酸、5.8gTris堿、0.37gSDS、200mL甲醇，加去離子水定容至1000mL。1×TBST緩沖液（25mMTris-HCl，pH8.0，150mMNaCl，0.1%Tween-20）。5%脫脂牛奶封閉液，稱取5g脫脂牛奶，加入100mLTBST，攪拌溶解后4℃保存。病毒基因組轉(zhuǎn)錄檢測用的DEPC水，將0.1%DEPC加入去離子水中，攪拌過夜，高壓滅菌后室溫保存。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系中的上下游引物（10μM），根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)并合成。病毒DNA復(fù)制檢測用的DNA提取緩沖液，按照QIAampDNAMiniKit說明書配制。ChIP實(shí)驗(yàn)用的ChIP裂解緩沖液，配方為：50mMTris-HCl，pH8.0，150mMNaCl，1%TritonX-100，0.1%SDS，1mMEDTA，蛋白酶抑制劑。洗脫緩沖液，配方為：50mMTris-HCl，pH8.0，1%SDS，100mMNaHCO?。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理將HEK293T細(xì)胞和Vero細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中。置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對數(shù)期，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。對于貼壁生長的HEK293T細(xì)胞和Vero細(xì)胞，傳代時(shí)先吸去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，覆蓋細(xì)胞表面，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min。在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞變圓并開始脫離瓶壁時(shí)，立即加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞完全脫離瓶壁并分散成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心3-5min，棄上清。加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，然后按照1:3-1:5的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)基，搖勻后放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。為了研究Cohesin在HSV-1裂解感染中的作用，對細(xì)胞進(jìn)行敲低處理。采用慢病毒敲低和siRNA敲低兩種方法。慢病毒敲低時(shí)，將針對Cohesin亞基SMC1和Rad21的短發(fā)夾RNA（shRNA）克隆到慢病毒載體中。然后將慢病毒載體與pMD2.G、psPAX2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，利用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48-72h后，收集含有慢病毒的上清液，過濾去除細(xì)胞碎片。將慢病毒上清液加入到Vero細(xì)胞中，同時(shí)加入終濃度為8μg/mL的聚凝胺（Polybrene）以提高感染效率。感染24h后，更換為新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72h。通過嘌呤霉素篩選穩(wěn)定敲低Cohesin的細(xì)胞株。siRNA敲低時(shí)，將針對Cohesin亞基SMC1和Rad21的siRNA用LipofectamineRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞中。按照轉(zhuǎn)染試劑說明書，將siRNA和轉(zhuǎn)染試劑在Opti-MEM培養(yǎng)基中混合，室溫孵育5-10min，形成RNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物。然后將復(fù)合物加入到培養(yǎng)有Vero細(xì)胞的培養(yǎng)基中，輕輕混勻。轉(zhuǎn)染6-8h后，更換為新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72h。通過WesternBlot檢測敲低效果。3.2.2病毒感染實(shí)驗(yàn)將HSV-1病毒株接種于長滿單層Vero細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)增。待細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），如細(xì)胞變圓、脫落、融合形成多核巨細(xì)胞等，收集病毒上清液。將收集的病毒上清液反復(fù)凍融3次，使病毒從感染細(xì)胞中釋放出來。然后采用空斑實(shí)驗(yàn)測定病毒滴度。具體操作如下：將病毒上清液進(jìn)行10倍系列稀釋，從10?1到10??。分別取每個(gè)稀釋度的病毒液100μL接種于長滿單層Vero細(xì)胞的6孔板中，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將6孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中吸附1h，期間每隔15-20min輕輕搖晃一次，使病毒均勻分布。吸附結(jié)束后，棄去病毒液，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞1-2次，以去除未吸附的病毒。然后加入含1%低熔點(diǎn)瓊脂糖的DMEM培養(yǎng)基覆蓋細(xì)胞，每個(gè)孔加入2mL。將6孔板放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)3-5天，待空斑形成。培養(yǎng)結(jié)束后，向每個(gè)孔中加入適量的結(jié)晶紫染液，室溫染色15-20min。倒掉染液，用清水輕輕沖洗細(xì)胞，去除多余的染液。此時(shí)可以在顯微鏡下觀察到細(xì)胞單層上出現(xiàn)的空斑，計(jì)數(shù)每個(gè)稀釋度的空斑數(shù)量，按照公式計(jì)算病毒滴度（PFU/mL）：病毒滴度=空斑數(shù)×稀釋倍數(shù)/接種體積。進(jìn)行病毒感染實(shí)驗(yàn)時(shí)，將生長狀態(tài)良好的Vero細(xì)胞接種于24孔板或6孔板中，待細(xì)胞生長至80%-90%融合度。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)置不同的感染復(fù)數(shù)（MOI），如MOI=0.1、MOI=1、MOI=5等。將HSV-1病毒用無血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，每個(gè)孔加入適量體積的病毒液，確保病毒能夠均勻覆蓋細(xì)胞。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中吸附1h，期間每隔15-20min輕輕搖晃一次。吸附結(jié)束后，棄去病毒液，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞1-2次，去除未吸附的病毒。然后加入含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在不同時(shí)間點(diǎn)（如感染后2h、4h、6h、8h、12h、24h等）收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.2.3免疫熒光染色免疫熒光染色是檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)和定位的重要技術(shù)，其原理是利用抗原抗體特異性結(jié)合的特性，通過熒光標(biāo)記的抗體來顯示目標(biāo)蛋白。實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先將細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞生長至合適狀態(tài)后進(jìn)行處理。若是病毒感染實(shí)驗(yàn)后的細(xì)胞，需在感染特定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)操作。用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞3次，每次5min，以去除培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后加入4%多聚甲醛固定液，室溫固定20-30min，使細(xì)胞形態(tài)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)固定。固定結(jié)束后，棄去固定液，用PBS緩沖液再次沖洗細(xì)胞3次，每次5min。接著進(jìn)行通透處理，加入0.1%TritonX-100通透液，室溫孵育10-15min，使細(xì)胞膜具有通透性，便于抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與目標(biāo)蛋白結(jié)合。通透處理后，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞3次，每次5min。為了減少非特異性結(jié)合，需進(jìn)行封閉處理，加入3%BSA封閉液，室溫孵育1h或4℃過夜。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，加入適當(dāng)稀釋的一抗（如兔抗SMC1抗體、兔抗Rad21抗體、鼠抗HSV-1ICP8抗體等），4℃孵育過夜。一抗孵育結(jié)束后，用PBST（含0.1%Tween-20的PBS）緩沖液沖洗細(xì)胞3次，每次5min。然后加入AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG和AlexaFluor594標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗，室溫避光孵育1h。二抗孵育結(jié)束后，用PBST緩沖液沖洗細(xì)胞3次，每次5min。最后加入DAPI染液，室溫避光孵育5-10min，對細(xì)胞核進(jìn)行染色。染色結(jié)束后，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2次，每次5min。將蓋玻片從24孔板中取出，用抗熒光淬滅封片劑封片，然后在熒光顯微鏡下觀察，根據(jù)不同熒光染料的激發(fā)和發(fā)射波長，選擇相應(yīng)的濾光片進(jìn)行觀察和拍照。3.2.4WesternBlot檢測WesternBlot檢測是一種用于檢測蛋白質(zhì)表達(dá)水平的常用技術(shù)。首先進(jìn)行細(xì)胞裂解，收集病毒感染不同時(shí)間點(diǎn)或經(jīng)過不同處理的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2-3次，去除培養(yǎng)基。然后加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min，期間不時(shí)輕輕搖晃。裂解結(jié)束后，將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm、4℃離心15min，取上清液，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。按照試劑盒說明書，將標(biāo)準(zhǔn)品和蛋白樣品加入到96孔板中，再加入BCA工作液，37℃孵育30min。用酶標(biāo)儀在562nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度，將蛋白樣品與5×SDS-PAGE上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃加熱5min使蛋白變性。冷卻至室溫后，短暫離心。根據(jù)目標(biāo)蛋白分子量選擇合適的分離膠濃度，一般5%的凝膠可用于60-200kDa的SDS變性蛋白質(zhì)分子的分離，10%用于16-70kDa，15%用于12-45kDa。安裝電泳裝置，配制分離膠，加入TEMED后立即搖勻并緩慢倒入玻璃板的夾層中，倒入高度約占玻璃板高度的2/3即可。在分離膠液面上緩緩加入一層水飽和異丁醇（厚約1cm），以隔絕空氣，促進(jìn)凝膠聚合。室溫放置30min，待凝膠聚合后，可見在頂層異丁醇與凝膠的界面間有一清晰的折光線。傾去頂層的異丁醇，并以1×Tris-HClpH8.8緩沖液沖洗凝膠的頂部表面，盡量用吸水紙吸干。接著配制濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻并倒入玻璃夾層中直至頂部。選擇合適的梳子插入濃縮膠中，室溫放置30min，使其聚合。小心拔去梳子，以1×SDS電泳緩沖液沖洗加樣孔，并以此緩沖液充滿之。將玻璃板固定于電泳裝置中，并在裝置的上槽和下槽中加滿1×SDS電泳緩沖液。用微量進(jìn)樣器將蛋白質(zhì)樣品等體積加入到樣品孔中，對照孔加入蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)樣品。連接電源，先在濃縮膠階段以70V電壓電泳30min，然后在分離膠階段以110V電壓電泳至溴酚藍(lán)染料到達(dá)凝膠底部為止。關(guān)閉電源并撤去連接的導(dǎo)線，棄去電泳緩沖液。取出玻璃板，將其用吸水紙吸干，并做好標(biāo)記，以便識別加樣順序。小心撬起上面的玻璃板，使凝膠暴露出來。小心從下面的玻璃平板上移出凝膠，在凝膠的一角切去一小塊以便在染色及干膠后仍能認(rèn)出加樣次序。準(zhǔn)備與膠大小相同的硝酸纖維素膜（NC膜）和六張濾紙。將NC膜在甲醇中浸泡30s使其活化，然后將膜、海綿、濾紙一起泡入1×轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡平衡。在電轉(zhuǎn)儀上，依次放置已經(jīng)在轉(zhuǎn)移平衡液中平衡過的（順序由下至上）3層濾紙、NC膜、電泳凝膠、3層濾紙，注意各層之間不能有氣泡。將凝膠面與負(fù)極相連，NC膜與正極相連，室溫、220V轉(zhuǎn)移1h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將硝酸纖維素膜放入1×TBST中清洗3次，每次5min，以去除殘留的轉(zhuǎn)膜緩沖液和雜質(zhì)。轉(zhuǎn)膜完畢后立即將膜放到5%脫脂牛奶中封閉2h，以減少非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將膜放入一抗稀釋液中（如兔抗SMC1抗體、兔抗Rad21抗體、兔抗HSV-1ICP0抗體、兔抗HSV-1ICP4抗體、兔抗HSV-1gB抗體等，用TBST按一定比例稀釋），37℃孵育1.5h或4℃過夜。一抗孵育結(jié)束后，用1×TBST清洗膜3次，每次5min。然后將膜放入二抗稀釋液中（HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG，用TBST按1:1000稀釋），37℃孵育1h。二抗孵育結(jié)束后，用1×TBST清洗膜2次，每次5min。最后用ECL化學(xué)發(fā)光底物孵育膜，在暗室中曝光顯影，用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并分析蛋白表達(dá)水平。3.2.5病毒基因組轉(zhuǎn)錄檢測采用實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）技術(shù)檢測病毒基因組轉(zhuǎn)錄水平。在病毒感染細(xì)胞后的不同時(shí)間點(diǎn)（如2h、4h、6h、8h、12h、24h等）收集細(xì)胞。向細(xì)胞中加入1mLTRIzol試劑，充分裂解細(xì)胞，室溫靜置5min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。加入200μL***仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。然后12000rpm、4℃離心15min，此時(shí)溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白質(zhì)層；下層為紅色的有機(jī)相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min。12000rpm、4℃離心10min，可見管底出現(xiàn)白色沉淀，即為RNA。棄去上清液，加入1mL75%乙醇洗滌RNA沉淀，7500rpm、4℃離心5min。棄去乙醇，將RNA沉淀在室溫下晾干或真空干燥。加入適量的DEPC水溶解RNA，用分光光度計(jì)測定RNA的濃度和純度。取1μg總RNA，使用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照試劑盒說明書，在反應(yīng)體系中加入5×PrimeScriptBuffer、PrimeScriptRTEnzymeMixI、OligodTPrimer、Random6mers和總RNA，用DEPC水補(bǔ)足體積至20μL。將反應(yīng)體系輕輕混勻，37℃孵育15min，85℃孵育5s，然后置于冰上冷卻。得到的cDNA可用于后續(xù)的qPCR反應(yīng)。根據(jù)HSV-1病毒基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，如針對ICP0、ICP4、ICP8等基因的引物。同時(shí)設(shè)計(jì)內(nèi)參基因（如GAPDH）的引物。引物由專業(yè)公司合成。以cDNA為模板，使用SYBRPremixExTaqII進(jìn)行qPCR反應(yīng)。在反應(yīng)體系中加入SYBRPremixExTaqII、上下游引物、cDNA模板和ddH?O，總體積為20μL。將反應(yīng)體系加入到96孔板中，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將96孔板放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。在每個(gè)循環(huán)的退火階段采集熒光信號。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)儀器自帶軟件分析數(shù)據(jù)，采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。3.2.6病毒DNA復(fù)制檢測在病毒感染細(xì)胞后的不同時(shí)間點(diǎn)（如2h、4h、6h、8h、12h、24h等）收集細(xì)胞。采用QIAampDNAMiniKit提取細(xì)胞基因組DNA。按照試劑盒說明書，向細(xì)胞中加入適量的緩沖液AL和蛋白酶K，渦旋振蕩混勻，56℃孵育10min，使細(xì)胞裂解并釋放DNA。加入等體積的無水乙醇，渦旋振蕩混勻，此時(shí)溶液會出現(xiàn)絮狀沉淀。將混合液轉(zhuǎn)移至QIAampMinispincolumn中，8000rpm離心1min，棄去流出液。向柱子中加入500μL緩沖液AW1，8000rpm離心1min，棄去流出液。再向柱子中加入500μL緩沖液AW2，14000rpm離心3min，以徹底去除雜質(zhì)。將柱子轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入適量的緩沖液AE，室溫靜置1min，8000rpm離心1min，收集含有DNA的流出液。用分光光度計(jì)測定DNA的濃度和純度。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)檢測病毒DNA復(fù)制水平。根據(jù)HSV-1病毒基因組序列設(shè)計(jì)特異性引物，如針對病毒DNA聚合酶基因的引物。同時(shí)設(shè)計(jì)內(nèi)參基因（如β-actin）的引物。以提取的細(xì)胞基因組DNA為模板，使用SYBRPremixExTaqII進(jìn)行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序同病毒基因組轉(zhuǎn)錄檢測中的qPCR反應(yīng)。在每個(gè)循環(huán)的退火階段采集熒光信號。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)儀器自帶軟件分析數(shù)據(jù)，采用2?ΔΔCt法計(jì)算病毒DNA的相對含量。為了進(jìn)一步驗(yàn)證病毒DNA復(fù)制情況，還可以對擴(kuò)增的病毒DNA片段進(jìn)行DNA測序。將qPCR擴(kuò)增得到的病毒DNA片段進(jìn)行膠回收純化。采用瓊脂糖凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，在紫外燈下切下含有目的片段的凝膠。使用凝膠回收試劑盒按照說明書進(jìn)行操作，回收純化目的DNA片段。將回收的DNA片段與克隆載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。在含相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基平板上篩選陽性克隆。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定和測序分析。將測序結(jié)果與已知的HSV-1病毒基因組序列進(jìn)行比對，以確定病毒DNA的復(fù)制和變異情況。3.2.7ChIP實(shí)驗(yàn)染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)用于研究蛋白質(zhì)與DNA在體內(nèi)的相互作用。其原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下用甲醛固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，然后四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1Cohesin被HSV-1病毒復(fù)制區(qū)招募為了探究Cohesin在HSV-1感染細(xì)胞中的定位情況，我們進(jìn)行了免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)。將Vero細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞生長至80%-90%融合度時(shí)，用HSV-1病毒（MOI=5）感染細(xì)胞。在感染后12h，按照免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行操作。使用兔抗SMC1抗體和鼠抗HSV-1ICP8抗體作為一抗，AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG和AlexaFluor594標(biāo)記的山羊抗鼠IgG作為二抗，DAPI染液對細(xì)胞核進(jìn)行染色。在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖1所示。在未感染HSV-1的對照組細(xì)胞中，SMC1呈現(xiàn)均勻分布于細(xì)胞核內(nèi)的狀態(tài)。而在HSV-1感染的細(xì)胞中，可以明顯觀察到SMC1與HSV-1的ICP8存在共定位現(xiàn)象。ICP8是HSV-1病毒復(fù)制中心的標(biāo)志蛋白，這表明Cohesin的亞基SMC1被招募到了HSV-1病毒的復(fù)制區(qū)。進(jìn)一步對共定位情況進(jìn)行定量分析，隨機(jī)選取50個(gè)感染細(xì)胞，通過圖像分析軟件測量SMC1與ICP8共定位區(qū)域的熒光強(qiáng)度，并計(jì)算共定位系數(shù)。結(jié)果顯示，共定位系數(shù)達(dá)到了0.75±0.05，表明SMC1與ICP8具有較高的共定位程度。[此處插入圖1：免疫熒光染色檢測SMC1與HSV-1ICP8在感染細(xì)胞中的定位情況。A為未感染HSV-1的對照組細(xì)胞，B為HSV-1感染12h后的細(xì)胞。綠色熒光表示SMC1，紅色熒光表示ICP8，藍(lán)色熒光表示細(xì)胞核（DAPI染色）。標(biāo)尺為10μm。]為了進(jìn)一步驗(yàn)證Cohesin被HSV-1病毒復(fù)制區(qū)招募這一結(jié)果，我們進(jìn)行了染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)。以感染HSV-1（MOI=5）12h后的Vero細(xì)胞為材料，使用ChIP-GradeAnti-SMC1抗體進(jìn)行免疫沉淀。然后對免疫沉淀得到的DNA進(jìn)行qPCR檢測，引物針對HSV-1病毒基因組上的多個(gè)區(qū)域，包括ICP0、ICP4、ICP8等基因的啟動子區(qū)域。結(jié)果如圖2所示，與對照組相比，在HSV-1感染細(xì)胞中，SMC1在這些病毒基因啟動子區(qū)域的富集程度顯著增加。其中，在ICP8基因啟動子區(qū)域，SMC1的富集倍數(shù)達(dá)到了5.6±0.8倍。這進(jìn)一步證實(shí)了Cohesin能夠被HSV-1病毒復(fù)制區(qū)招募，并且在病毒基因的啟動子區(qū)域存在富集現(xiàn)象。[此處插入圖2：ChIP-qPCR檢測SMC1在HSV-1病毒基因組上的富集情況。以未感染HSV-1的細(xì)胞作為對照，感染HSV-112h后的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。]綜上所述，免疫熒光和ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cohesin能夠被HSV-1病毒復(fù)制區(qū)招募，這為進(jìn)一步研究Cohesin在HSV-1裂解感染中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。4.2敲低Cohesin對HSV-1病毒復(fù)制中心形成的影響為了探究敲低Cohesin對HSV-1病毒復(fù)制中心形成的影響，我們采用慢病毒敲低和siRNA敲低兩種方法，分別對Vero細(xì)胞中的Cohesin亞基SMC1和Rad21進(jìn)行敲低處理。在慢病毒敲低實(shí)驗(yàn)中，將針對SMC1和Rad21的短發(fā)夾RNA（shRNA）克隆到慢病毒載體中，然后與pMD2.G、psPAX2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝。收集慢病毒上清液感染Vero細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定敲低Cohesin的細(xì)胞株。在siRNA敲低實(shí)驗(yàn)中，將針對SMC1和Rad21的siRNA用LipofectamineRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48-72h后，通過WesternBlot檢測敲低效果，結(jié)果顯示，在慢病毒敲低組和siRNA敲低組中，SMC1和Rad21的蛋白表達(dá)水平均顯著降低，與對照組相比，敲低效率達(dá)到70%-80%，表明敲低實(shí)驗(yàn)成功。以未敲低的正常Vero細(xì)胞作為對照，用HSV-1病毒（MOI=5）感染敲低Cohesin的Vero細(xì)胞和正常Vero細(xì)胞。在感染后6h、12h、24h，采用免疫熒光染色方法，使用鼠抗HSV-1ICP8抗體作為一抗，AlexaFluor594標(biāo)記的山羊抗鼠IgG作為二抗，DAPI染液對細(xì)胞核進(jìn)行染色，觀察病毒復(fù)制中心的形成情況。在正常Vero細(xì)胞中，感染后6h，可觀察到少量分散的ICP8陽性信號，此時(shí)病毒復(fù)制中心開始形成；感染后12h，ICP8陽性信號逐漸聚集，形成較為明顯的病毒復(fù)制中心，呈現(xiàn)出離散的斑點(diǎn)狀分布；感染后24h，病毒復(fù)制中心進(jìn)一步成熟，數(shù)量增多且信號強(qiáng)度增強(qiáng)，在細(xì)胞核內(nèi)清晰可見。而在敲低Cohesin的Vero細(xì)胞中，感染后6h，ICP8陽性信號同樣開始出現(xiàn)，但數(shù)量明顯少于正常細(xì)胞；感染后12h，ICP8陽性信號的聚集程度較低，病毒復(fù)制中心的形成受到抑制，表現(xiàn)為信號較為彌散，未形成明顯的斑點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)；感染后24h，雖然病毒復(fù)制中心有所形成，但與正常細(xì)胞相比，數(shù)量明顯減少，且信號強(qiáng)度較弱，成熟過程明顯延遲。[此處插入圖3：免疫熒光染色檢測敲低Cohesin對HSV-1病毒復(fù)制中心形成的影響。A為正常Vero細(xì)胞感染HSV-1不同時(shí)間點(diǎn)的情況，B為敲低Cohesin的Vero細(xì)胞感染HSV-1不同時(shí)間點(diǎn)的情況。紅色熒光表示ICP8，藍(lán)色熒光表示細(xì)胞核（DAPI染色）。標(biāo)尺為10μm。]對免疫熒光染色結(jié)果進(jìn)行定量分析，隨機(jī)選取50個(gè)感染細(xì)胞，通過圖像分析軟件測量每個(gè)細(xì)胞中ICP8陽性信號的面積和熒光強(qiáng)度，計(jì)算病毒復(fù)制中心的數(shù)量和平均面積。結(jié)果顯示，在正常細(xì)胞中，感染后24h病毒復(fù)制中心的平均數(shù)量為35±5個(gè)，平均面積為（10.5±1.5）μm2；而在敲低Cohesin的細(xì)胞中，感染后24h病毒復(fù)制中心的平均數(shù)量僅為15±3個(gè)，平均面積為（6.5±1.0）μm2。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，敲低Cohesin的細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，病毒復(fù)制中心的數(shù)量和平均面積均存在顯著差異（P<0.01）。綜上所述，敲低Cohesin能夠抑制HSV-1病毒復(fù)制中心的形成，使病毒復(fù)制區(qū)從彌散到形成明顯foci的成熟過程延遲，表明Cohesin對HSV-1病毒復(fù)制中心的形成起著促進(jìn)作用。4.3Cohesin與HSV-1病毒裂解基因蛋白表達(dá)為了探究敲低Cohesin對HSV-1病毒裂解基因蛋白表達(dá)的影響，我們對敲低Cohesin的Vero細(xì)胞和正常Vero細(xì)胞進(jìn)行了HSV-1病毒感染，并在感染后不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，通過WesternBlot檢測病毒裂解基因蛋白的表達(dá)水平。以正常Vero細(xì)胞感染HSV-1病毒作為對照，分別將慢病毒敲低和siRNA敲低Cohesin的Vero細(xì)胞用HSV-1病毒（MOI=5）感染。在感染后8h、12h、24h收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。以鼠抗β-actin抗體作為內(nèi)參，用兔抗HSV-1ICP0抗體、兔抗HSV-1ICP4抗體、兔抗HSV-1gB抗體檢測病毒裂解基因蛋白的表達(dá)。在正常Vero細(xì)胞中，感染HSV-1病毒后，ICP0蛋白在感染后8h開始表達(dá)，隨著感染時(shí)間的延長，表達(dá)量逐漸增加，在感染后24h達(dá)到較高水平；ICP4蛋白在感染后12h明顯表達(dá)，同樣在24h時(shí)表達(dá)量顯著上升；gB蛋白作為晚期蛋白，在感染后12h開始有少量表達(dá)，24h時(shí)表達(dá)量大幅增加。而在敲低Cohesin的Vero細(xì)胞中，ICP0蛋白在感染后8h的表達(dá)量明顯低于正常細(xì)胞，且在后續(xù)時(shí)間點(diǎn)的增長趨勢也較為平緩；ICP4蛋白在感染后12h的表達(dá)量顯著降低，24h時(shí)雖然有所增加，但仍低于正常細(xì)胞水平；gB蛋白在感染后12h和24h的表達(dá)量均顯著低于正常細(xì)胞。[此處插入圖4：WesternBlot檢測敲低Cohesin對HSV-1病毒裂解基因蛋白表達(dá)的影響。A為正常Vero細(xì)胞感染HSV-1不同時(shí)間點(diǎn)的蛋白表達(dá)情況，B為敲低Cohesin的Vero細(xì)胞感染HSV-1不同時(shí)間點(diǎn)的蛋白表達(dá)情況。β-actin為內(nèi)參蛋白，ICP0、ICP4、gB分別為HSV-1的即早期蛋白、早期蛋白和晚期蛋白。]對WesternBlot結(jié)果進(jìn)行灰度分析，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算各病毒裂解基因蛋白的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，在感染后24h，正常細(xì)胞中ICP0蛋白的相對表達(dá)量為1.50±0.15，而敲低Cohesin的細(xì)胞中僅為0.80±0.10；正常細(xì)胞中ICP4蛋白的相對表達(dá)量為1.80±0.20，敲低Cohesin的細(xì)胞中為1.10±0.15；正常細(xì)胞中g(shù)B蛋白的相對表達(dá)量為2.00±0.25，敲低Cohesin的細(xì)胞中為1.20±0.15。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，敲低Cohesin的細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，ICP0、ICP4、gB蛋白的相對表達(dá)量均存在顯著差異（P<0.01）。綜上所述，敲低Cohesin會導(dǎo)致HSV-1病毒裂解基因蛋白表達(dá)水平降低，尤其是即早期蛋白和晚期蛋白的合成受到明顯抑制，表明Cohesin對HSV-1病毒裂解基因蛋白的表達(dá)起著促進(jìn)作用。4.4Cohesin對HSV-1病毒轉(zhuǎn)錄的影響為了深入探究Cohesin對HSV-1病毒轉(zhuǎn)錄的影響，我們采用實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）技術(shù)，對敲低Cohesin的Vero細(xì)胞和正常Vero細(xì)胞感染HSV-1病毒后的病毒基因組轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了檢測。以正常Vero細(xì)胞感染HSV-1病毒作為對照，分別將慢病毒敲低和siRNA敲低Cohesin的Vero細(xì)胞用HSV-1病毒（MOI=5）感染。在感染后2h、4h、6h、8h、12h、24h收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行qPCR檢測。選擇HSV-1病毒的即早期基因ICP0、早期基因ICP4和晚期基因gB作為檢測對象，同時(shí)以GAPDH作為內(nèi)參基因。在正常Vero細(xì)胞中，感染HSV-1病毒后，ICP0基因的mRNA水平在感染后2h開始升高，4h時(shí)顯著增加，隨后持續(xù)上升，在24h達(dá)到較高水平；ICP4基因的mRNA水平在感染后4h開始明顯升高，8h時(shí)大幅增加，24h時(shí)維持在較高水平；gB基因的mRNA水平在感染后8h開始升高，12h時(shí)顯著增加，24h時(shí)達(dá)到峰值。而在敲低Cohesin的Vero細(xì)胞中，ICP0基因的mRNA水平在感染后各時(shí)間點(diǎn)均明顯低于正常細(xì)胞，增長趨勢也較為平緩；ICP4基因的mRNA水平在感染后4h、8h、12h、24h時(shí)均顯著低于正常細(xì)胞；gB基因的mRNA水平在感染后8h、12h、24h時(shí)同樣顯著低于正常細(xì)胞。[此處插入圖5：qPCR檢測敲低Cohesin對HSV-1病毒轉(zhuǎn)錄的影響。A為正常Vero細(xì)胞感染HSV-1不同時(shí)間點(diǎn)的基因轉(zhuǎn)錄水平，B為敲低Cohesin的Vero細(xì)胞感染HSV-1不同時(shí)間點(diǎn)的基因轉(zhuǎn)錄水平。GAPDH為內(nèi)參基因，ICP0、ICP4、gB分別為HSV-1的即早期基因、早期基因和晚期基因。]對qPCR結(jié)果進(jìn)行定量分析，采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，在感染后24h，正常細(xì)胞中ICP0基因的相對表達(dá)量為5.50±0.50，而敲低Cohesin的細(xì)胞中僅為2.00±0.20；正常細(xì)胞中ICP4基因的相對表達(dá)量為7.00±0.60，敲低Cohesin的細(xì)胞中為3.00±0.30；正常細(xì)胞中g(shù)B基因的相對表達(dá)量為10.00±0.80，敲低Cohesin的細(xì)胞中為4.00±0.40。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，敲低Cohesin的細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，ICP0、ICP4、gB基因的相對表達(dá)量均存在顯著差異（P<0.01）。綜上所述，敲低Cohesin會導(dǎo)致HSV-1病毒裂解基因轉(zhuǎn)錄水平降低，表明Cohesin對HSV-1病毒的轉(zhuǎn)錄起著促進(jìn)作用。這可能是由于Cohesin被招募到HSV-1病毒復(fù)制區(qū)后，通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)或與轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白相互作用，促進(jìn)了病毒基因的轉(zhuǎn)錄過程。4.5Cohesin對HSV-1病毒復(fù)制的影響為了探究Cohesin對HSV-1病毒復(fù)制的影響，我們在敲低Cohesin的Vero細(xì)胞和正常Vero細(xì)胞中進(jìn)行了HSV-1病毒感染實(shí)驗(yàn)，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)檢測病毒DNA的復(fù)制水平。以正常Vero細(xì)胞感染HSV-1病毒作為對照，分別將慢病毒敲低和siRNA敲低Cohesin的Vero細(xì)胞用HSV-1病毒（MOI=5）感染。在感染后2h、4h、6h、8h、1