EV71感染患兒Toll樣受體表達(dá)及免疫關(guān)聯(lián)探究一、引言1.1研究背景與意義腸道病毒71型（Enterovirus71，EV71）作為一種常見的腸道病毒，在全球范圍內(nèi)，尤其是亞太地區(qū)，對(duì)嬰幼兒健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。自1969年首次從加利福尼亞患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的嬰兒糞便標(biāo)本中分離出EV71以來，其感染引發(fā)的公共衛(wèi)生問題日益凸顯。在中國，2008-2012年期間，手足口病報(bào)告病例高達(dá)6763460例，其中由EV71感染導(dǎo)致的重癥病例和死亡病例占比較高，如2010年重癥病例為49505例，死亡病例為905例。EV71主要通過糞-口途徑、呼吸道飛沫以及密切接觸傳播，具有較強(qiáng)的傳染性，在幼兒園、托兒所等人群密集場(chǎng)所極易引發(fā)大規(guī)模傳播。EV71感染后，多數(shù)患兒表現(xiàn)為輕癥手足口病或皰疹性咽峽炎，可在1-2周內(nèi)自愈。然而，部分患兒會(huì)發(fā)展為重癥，出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，如腦干腦炎、無菌性腦膜炎、神經(jīng)源性肺水腫等，甚至導(dǎo)致死亡。嚴(yán)重的腦干腦炎會(huì)引發(fā)呼吸循環(huán)衰竭，而神經(jīng)源性肺水腫則會(huì)迅速惡化病情，這些并發(fā)癥的發(fā)生機(jī)制尚未完全明確，但無疑給臨床治療帶來了極大的挑戰(zhàn)。Toll樣受體（Toll-likereceptors，TLRs）是一類在先天免疫系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用的跨膜非催化性蛋白質(zhì)，是連接非特異性免疫和特異性免疫的重要橋梁。它們能夠識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（Pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs），如細(xì)菌的脂多糖、病毒的核酸等，從而激活機(jī)體的免疫應(yīng)答。在病毒感染過程中，TLRs可以感知病毒入侵，并通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素、細(xì)胞因子等免疫活性物質(zhì)，啟動(dòng)機(jī)體的抗病毒防御機(jī)制。不同的TLRs成員在識(shí)別不同病毒時(shí)具有一定的特異性，例如TLR3主要識(shí)別雙鏈RNA，TLR7和TLR8主要識(shí)別單鏈RNA，TLR9主要識(shí)別非甲基化的CpGDNA。研究EV71感染患兒Toll樣受體的表達(dá)具有重要的理論和實(shí)踐意義。從理論層面來看，有助于深入揭示EV71感染的發(fā)病機(jī)制。目前，雖然已知EV71感染會(huì)引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，但具體的免疫識(shí)別和激活機(jī)制尚未完全明晰。通過研究Toll樣受體在EV71感染過程中的表達(dá)變化，可以明確其在免疫識(shí)別中的作用，以及它們?nèi)绾渭せ钕掠涡盘?hào)通路，從而更好地理解機(jī)體對(duì)EV71感染的免疫應(yīng)答過程。這不僅有助于豐富對(duì)病毒與宿主相互作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)，還能為開發(fā)新的抗病毒治療策略提供理論依據(jù)。從實(shí)踐意義而言，對(duì)臨床診斷、治療和預(yù)防EV71感染具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。在診斷方面，Toll樣受體的表達(dá)水平有可能作為評(píng)估病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的生物標(biāo)志物。通過檢測(cè)患兒體內(nèi)Toll樣受體的表達(dá)情況，醫(yī)生可以更準(zhǔn)確地判斷病情的發(fā)展趨勢(shì)，為制定個(gè)性化的治療方案提供依據(jù)。在治療方面，以Toll樣受體為靶點(diǎn)，開發(fā)新的治療藥物或干預(yù)措施成為可能。例如，通過調(diào)節(jié)Toll樣受體的信號(hào)通路，可以增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒免疫反應(yīng)，同時(shí)減少過度炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體的損傷。在預(yù)防方面，深入了解Toll樣受體在EV71感染中的作用，有助于優(yōu)化疫苗的設(shè)計(jì)和研發(fā)，提高疫苗的免疫效果，從而更有效地預(yù)防EV71感染的發(fā)生。綜上所述，本研究旨在通過對(duì)EV71感染患兒Toll樣受體表達(dá)的探究，為揭示EV71感染的發(fā)病機(jī)制、改善臨床診療水平以及制定有效的預(yù)防策略提供重要的理論支持和實(shí)踐依據(jù)。1.2研究目的與問題提出盡管Toll樣受體在免疫應(yīng)答中的重要性已得到廣泛認(rèn)可，但在EV71感染領(lǐng)域，仍存在諸多亟待解決的問題。目前，對(duì)于EV71感染患兒Toll樣受體的表達(dá)變化規(guī)律尚不完全清楚。不同類型的Toll樣受體在EV71感染過程中是否會(huì)呈現(xiàn)出特異性的表達(dá)改變？輕癥、重癥和危重癥患兒之間，Toll樣受體的表達(dá)又存在怎樣的差異？這些問題的答案對(duì)于深入理解EV71感染的免疫機(jī)制至關(guān)重要。Toll樣受體的表達(dá)變化與機(jī)體免疫功能之間的關(guān)系也有待進(jìn)一步明確。Toll樣受體的激活會(huì)引發(fā)一系列的免疫反應(yīng)，但其在EV71感染時(shí)如何影響細(xì)胞免疫和體液免疫功能，以及這種影響與病情發(fā)展之間的內(nèi)在聯(lián)系，仍需要深入研究。例如，Toll樣受體的過度激活或激活不足，是否會(huì)導(dǎo)致免疫失衡，進(jìn)而影響病情的嚴(yán)重程度和預(yù)后？Toll樣受體表達(dá)與EV71感染患兒病情嚴(yán)重程度之間的關(guān)聯(lián)也尚未得到充分闡述。在臨床實(shí)踐中，如何通過監(jiān)測(cè)Toll樣受體的表達(dá)水平，早期預(yù)測(cè)患兒病情的發(fā)展趨勢(shì)，為臨床治療提供及時(shí)有效的指導(dǎo)，是一個(gè)具有重要臨床意義的問題?；谝陨媳尘昂蛦栴}，本研究旨在通過對(duì)EV71感染患兒Toll樣受體表達(dá)的檢測(cè)，深入探究其表達(dá)變化規(guī)律；分析Toll樣受體表達(dá)與機(jī)體免疫功能之間的關(guān)系，揭示其在免疫調(diào)節(jié)中的作用機(jī)制；探討Toll樣受體表達(dá)與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性，為臨床診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。二、理論基礎(chǔ)與研究現(xiàn)狀2.1EV71病毒及感染概述腸道病毒71型（Enterovirus71，EV71）屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，是一種單股正鏈RNA病毒。其病毒粒子呈二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，無包膜，直徑約為24-30nm。病毒基因組全長(zhǎng)約7.4kb，由5’非編碼區(qū)（5’-UTR）、開放閱讀框（ORF）和3’非編碼區(qū)（3’-UTR）組成。5’-UTR在病毒的復(fù)制和翻譯過程中起著重要的調(diào)控作用，而ORF則編碼一個(gè)多聚蛋白，該多聚蛋白在病毒感染細(xì)胞后，會(huì)被宿主細(xì)胞或病毒自身編碼的蛋白酶切割成多個(gè)具有不同功能的成熟蛋白，包括結(jié)構(gòu)蛋白VP1-VP4和非結(jié)構(gòu)蛋白2A-2C、3A-3D。這些蛋白在病毒的入侵、復(fù)制、組裝和釋放等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。EV71主要通過糞-口途徑、呼吸道飛沫以及密切接觸傳播。在人群密集、衛(wèi)生條件較差的環(huán)境中，病毒極易傳播。例如，在幼兒園、托兒所等場(chǎng)所，兒童之間的頻繁接觸以及不注意個(gè)人衛(wèi)生，如不勤洗手、共用玩具等，都為病毒的傳播創(chuàng)造了條件。病毒可以通過被污染的手觸摸口鼻而進(jìn)入人體，也可以在咳嗽、打噴嚏時(shí)，通過空氣中的飛沫傳播給他人。EV71感染人體后，多數(shù)患兒會(huì)出現(xiàn)輕癥手足口病或皰疹性咽峽炎。手足口病的典型癥狀為手、足、口腔等部位出現(xiàn)散在的皮疹或皰疹，同時(shí)可能伴有發(fā)熱、咳嗽、流涕、食欲不振等癥狀。皰疹性咽峽炎則主要表現(xiàn)為發(fā)熱和口腔咽峽部出現(xiàn)皰疹或潰瘍。這些輕癥病例通常具有自限性，在1-2周內(nèi)可自行恢復(fù)。然而，部分患兒會(huì)發(fā)展為重癥，出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。腦干腦炎是重癥EV71感染常見的并發(fā)癥之一，病毒侵犯腦干，導(dǎo)致神經(jīng)功能受損，患兒可出現(xiàn)頭痛、嘔吐、精神萎靡、抽搐、肢體無力等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可引發(fā)呼吸循環(huán)衰竭。無菌性腦膜炎也是常見的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，患兒會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛、頸項(xiàng)強(qiáng)直等腦膜刺激征。神經(jīng)源性肺水腫則是更為嚴(yán)重的并發(fā)癥，病情進(jìn)展迅速，可在短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致患兒死亡。其發(fā)生機(jī)制可能與病毒感染引發(fā)的過度炎癥反應(yīng)、神經(jīng)調(diào)節(jié)功能紊亂等因素有關(guān)。EV71感染具有明顯的流行特點(diǎn)。在時(shí)間分布上，全年均可發(fā)病，但存在明顯的季節(jié)性高峰，一般在每年的4-6月和10-12月發(fā)病率較高。這可能與氣溫、濕度等環(huán)境因素以及人群的活動(dòng)規(guī)律有關(guān)。在空間分布上，EV71感染呈現(xiàn)出全球分布的態(tài)勢(shì)，但在亞太地區(qū)，如中國、馬來西亞、新加坡、日本等國家和地區(qū)，疫情更為嚴(yán)重。這可能與該地區(qū)的人口密度、衛(wèi)生條件、經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平以及人群的免疫狀態(tài)等因素有關(guān)。在人群分布上，EV71感染主要發(fā)生在5歲以下的嬰幼兒，尤其是3歲以下的兒童，這是因?yàn)閮和拿庖呦到y(tǒng)尚未發(fā)育完善，對(duì)病毒的抵抗力較弱。EV71感染給兒童健康帶來了嚴(yán)重威脅。它不僅會(huì)導(dǎo)致患兒身體上的痛苦，影響其生長(zhǎng)發(fā)育，還會(huì)給家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。對(duì)于重癥患兒，需要長(zhǎng)期的醫(yī)療護(hù)理和康復(fù)治療，這無疑增加了家庭的經(jīng)濟(jì)壓力。EV71感染的流行也會(huì)對(duì)社會(huì)的正常秩序產(chǎn)生一定的影響，如幼兒園、學(xué)校的停課等。因此，深入研究EV71感染的發(fā)病機(jī)制、診斷方法和防治措施具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。2.2Toll樣受體（TLRs）相關(guān)理論Toll樣受體（Toll-likereceptors，TLRs）是一類重要的模式識(shí)別受體（PatternRecognitionReceptors，PRRs），在先天免疫和適應(yīng)性免疫中均發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它們能夠識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（Pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs），如細(xì)菌的脂多糖（LPS）、肽聚糖，病毒的核酸（單鏈RNA、雙鏈RNA、非甲基化CpGDNA）等，以及損傷相關(guān)分子模式（Damage-associatedmolecularpatterns，DAMPs），從而激活機(jī)體的免疫應(yīng)答。從結(jié)構(gòu)上看，TLRs是Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成。胞外結(jié)構(gòu)域富含亮氨酸重復(fù)序列（Leucine-richrepeats，LRRs），這些LRRs形成一個(gè)馬蹄形結(jié)構(gòu)，負(fù)責(zé)識(shí)別PAMPs和DAMPs。不同的TLR成員，其LRRs的數(shù)量和氨基酸組成存在差異，這決定了它們對(duì)不同配體的特異性識(shí)別。例如，TLR4的胞外結(jié)構(gòu)域含有24個(gè)LRRs，能夠特異性識(shí)別革蘭氏陰性菌的LPS?？缒^(qū)由一個(gè)疏水的α-螺旋組成，將胞外結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域連接起來。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域稱為Toll/IL-1受體（Toll/IL-1receptor，TIR）結(jié)構(gòu)域，與白細(xì)胞介素1受體（IL-1R）的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域具有高度同源性。TIR結(jié)構(gòu)域含有三個(gè)保守的氨基酸序列，稱為Box1、Box2和Box3，它們?cè)赥LR信號(hào)傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用，能夠募集下游含有TIR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白，如髓樣分化因子88（Myeloiddifferentiationfactor88，MyD88）、含TIR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白（TIR-domain-containingadaptorprotein，TIRAP）、Toll樣受體3接頭分子（Toll-likereceptor3-adaptormolecule，TRIF）和TRIF相關(guān)接頭分子（TRIF-relatedadaptormolecule，TRAM）等，從而啟動(dòng)下游信號(hào)通路。根據(jù)其亞細(xì)胞定位，TLRs可分為兩類：一類表達(dá)于細(xì)胞膜表面，如TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10，主要識(shí)別病原體表面的分子成分，如細(xì)菌的細(xì)胞壁成分、脂蛋白等；另一類表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)體、溶酶體膜上，如TLR3、TLR7、TLR8和TLR9，主要識(shí)別病毒和細(xì)菌的核酸成分。這種定位差異與它們識(shí)別的配體類型密切相關(guān)，細(xì)胞膜表面的TLRs能夠快速識(shí)別入侵的病原體，啟動(dòng)早期的免疫應(yīng)答；而細(xì)胞內(nèi)的TLRs則主要在病原體進(jìn)入細(xì)胞后，識(shí)別其核酸，進(jìn)一步激活免疫反應(yīng)。在人類中，已發(fā)現(xiàn)10種功能性TLRs（TLR1-TLR10），它們?cè)诓煌?xì)胞類型中的表達(dá)具有一定的特異性。免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（DCs）、B細(xì)胞和某些T細(xì)胞，以及非免疫細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞等均有TLRs的表達(dá)。巨噬細(xì)胞和DCs作為重要的抗原呈遞細(xì)胞，表達(dá)多種TLRs，能夠高效識(shí)別病原體，并將抗原信息呈遞給T細(xì)胞，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。例如，DCs表達(dá)TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和TLR9等，在病毒感染時(shí)，能夠通過這些TLRs感知病毒的存在，分泌細(xì)胞因子和趨化因子，招募和激活其他免疫細(xì)胞，同時(shí)上調(diào)共刺激分子的表達(dá)，促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖。當(dāng)TLRs識(shí)別相應(yīng)的配體后，會(huì)啟動(dòng)一系列復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)通路，主要包括MyD88依賴途徑和MyD88非依賴途徑（也稱為TRIF依賴途徑）。在MyD88依賴途徑中，TLRs與配體結(jié)合后，通過TIR結(jié)構(gòu)域招募MyD88，MyD88再與白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶（IL-1receptor-associatedkinase，IRAK）家族成員結(jié)合，形成Myddosome復(fù)合物。IRAK被激活后，會(huì)發(fā)生磷酸化并與MyD88分離，然后與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（Tumornecrosisfactorreceptor-associatedfactor6，TRAF6）結(jié)合。TRAF6激活下游的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶1（TGF-β-activatedkinase1，TAK1），TAK1進(jìn)一步激活核因子κB（NuclearfactorκB，NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activatedproteinkinases，MAPKs）信號(hào)通路。NF-κB和MAPKs進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)一系列炎癥因子（如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1（IL-1）、白細(xì)胞介素6（IL-6）等）和共刺激分子的表達(dá)，從而啟動(dòng)免疫應(yīng)答。在MyD88非依賴途徑中，主要由TLR3和TLR4激活。以TLR4為例，在識(shí)別LPS后，通過TRAM招募TRIF，TRIF激活下游的TBK1（TANK-bindingkinase1）和IKKε（IκBkinaseε），進(jìn)而激活干擾素調(diào)節(jié)因子3（Interferonregulatoryfactor3，IRF3）。IRF3發(fā)生磷酸化后，形成二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素（如IFN-α、IFN-β）的表達(dá)，同時(shí)也能激活NF-κB，誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生。Ⅰ型干擾素具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等多種功能，能夠增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒能力。2.3研究現(xiàn)狀綜述目前，關(guān)于EV71感染患兒Toll樣受體（TLRs）表達(dá)的研究已取得了一定的進(jìn)展，為深入了解EV71感染的免疫機(jī)制提供了重要線索。郭建群等人的研究發(fā)現(xiàn)，在EV71感染患兒中，輕癥患兒僅TLR7表達(dá)升高，而重癥EV71感染患兒外周血單核/巨噬細(xì)胞（MC）、髓樣樹突狀細(xì)胞（mDC）、漿樣樹突狀細(xì)胞（pDC）的TLR7表達(dá)明顯升高。同時(shí)，MC、mDC高表達(dá)TLR2、3、4，但在危重癥患兒中，這些TLR的表達(dá)呈下降趨勢(shì)。這表明TLR7可能在EV71感染的免疫識(shí)別中發(fā)揮重要作用，尤其是在重癥感染階段。而TLR2、3、4的表達(dá)變化可能與病情的進(jìn)展和嚴(yán)重程度密切相關(guān)。陳敏的研究也指出，EV71感染危重癥患兒外周血MCTLR7平均熒光強(qiáng)度表達(dá)明顯高于同期同齡正常嬰幼兒。這進(jìn)一步證實(shí)了TLR7在EV71感染免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵作用，并且提示其表達(dá)水平可能與病情的嚴(yán)重程度相關(guān)。這些研究結(jié)果為理解EV71感染的免疫機(jī)制提供了重要的參考，但目前的研究仍存在一些不足之處。首先，研究樣本量相對(duì)較小，這可能導(dǎo)致研究結(jié)果的代表性有限。不同地區(qū)、不同種族的兒童在遺傳背景、生活環(huán)境和免疫狀態(tài)等方面存在差異，小樣本量的研究難以全面反映這些因素對(duì)TLR表達(dá)的影響。其次，研究方法的多樣性使得不同研究之間的結(jié)果難以直接比較。例如，在檢測(cè)TLR表達(dá)時(shí)，有的研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，有的采用流式細(xì)胞術(shù)，不同方法的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性存在差異。此外，大多數(shù)研究?jī)H關(guān)注了部分TLR成員的表達(dá)變化，對(duì)于整個(gè)TLR家族在EV71感染過程中的動(dòng)態(tài)變化及相互作用機(jī)制的研究還不夠深入。在TLR表達(dá)與免疫功能及病情嚴(yán)重程度的關(guān)系方面，雖然已有研究表明TLR7介導(dǎo)了EV71感染所致免疫功能的紊亂，引起IL-12及IFN-a細(xì)胞因子水平增高，但對(duì)于其他TLR成員如何影響免疫功能，以及它們與病情發(fā)展之間的具體關(guān)聯(lián)，仍缺乏系統(tǒng)的研究。例如，TLR2、TLR3、TLR4等在免疫調(diào)節(jié)中的具體作用機(jī)制是什么？它們的表達(dá)變化如何影響細(xì)胞免疫和體液免疫的平衡？這些問題都有待進(jìn)一步探索。現(xiàn)有研究對(duì)于TLR信號(hào)通路在EV71感染中的調(diào)控機(jī)制研究較少。TLR激活后通過一系列信號(hào)通路啟動(dòng)免疫應(yīng)答，但在EV71感染時(shí)，這些信號(hào)通路是如何被調(diào)控的，是否存在異常激活或抑制的情況，目前尚不清楚。深入研究TLR信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制，對(duì)于揭示EV71感染的發(fā)病機(jī)制，以及開發(fā)新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。綜上所述，盡管目前在EV71感染患兒Toll樣受體表達(dá)方面取得了一定成果，但仍存在諸多不足，需要進(jìn)一步開展大樣本、多中心的研究，采用標(biāo)準(zhǔn)化的研究方法，全面深入地探究TLR在EV71感染中的表達(dá)變化規(guī)律、與免疫功能及病情嚴(yán)重程度的關(guān)系，以及信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制，為臨床防治EV71感染提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐指導(dǎo)。三、研究設(shè)計(jì)與方法3.1研究對(duì)象選取本研究的樣本選取自[具體時(shí)間段]在[醫(yī)院名稱]兒科就診的患兒。納入標(biāo)準(zhǔn)為：依據(jù)《手足口病診療指南（2018年版）》，經(jīng)臨床癥狀及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)（如實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)EV71核酸陽性，或血清EV71IgM抗體陽性）確診為EV71感染的患兒；年齡在6個(gè)月至5歲之間。排除標(biāo)準(zhǔn)為：合并其他嚴(yán)重先天性疾病，如先天性心臟病、免疫缺陷病等；近期（1個(gè)月內(nèi)）使用過免疫調(diào)節(jié)劑或糖皮質(zhì)激素等影響免疫功能的藥物；患有其他病毒（如柯薩奇病毒A16型等）感染引起的手足口病。按照上述標(biāo)準(zhǔn)，共納入120例EV71感染患兒。根據(jù)病情嚴(yán)重程度，將其分為輕癥組、重癥組和危重癥組。輕癥組患兒70例，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱，手、足、口、臀等部位出現(xiàn)斑丘疹、丘疹、小皰疹，可伴有咳嗽、流涕、食欲不振等癥狀，無神經(jīng)系統(tǒng)及其他系統(tǒng)受累表現(xiàn)。重癥組患兒30例，在輕癥表現(xiàn)的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)精神差、嗜睡、易驚、頭痛、嘔吐、煩躁、肢體抖動(dòng)、急性肢體無力、頸項(xiàng)強(qiáng)直等神經(jīng)系統(tǒng)受累癥狀。危重癥組患兒20例，病情進(jìn)一步發(fā)展，出現(xiàn)心肺功能衰竭前期或心肺功能衰竭期表現(xiàn)，如心率、呼吸增快，出冷汗、皮膚花紋、四肢發(fā)涼，血壓升高，血糖升高，外周血白細(xì)胞升高，或出現(xiàn)心動(dòng)過速、呼吸急促、口唇紫紺、咳粉紅色泡沫痰或血性液體、持續(xù)血壓降低或休克等癥狀。同時(shí)，選取同期在該醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的60名兒童作為正常對(duì)照組。這些兒童年齡與病例組匹配，無感染性疾病史，近期未使用過任何藥物，且經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)排除EV71感染。在研究過程中，充分尊重患兒及其監(jiān)護(hù)人的知情權(quán)，詳細(xì)告知研究目的、方法、可能的風(fēng)險(xiǎn)和受益，并簽署知情同意書。本研究獲得了[醫(yī)院倫理委員會(huì)名稱]的倫理批準(zhǔn)，確保研究過程符合倫理規(guī)范。3.2研究材料準(zhǔn)備本研究使用的主要儀器設(shè)備包括：實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（品牌：ABI，型號(hào)：7500），用于檢測(cè)Toll樣受體mRNA的表達(dá)水平。該儀器具有高精度、高靈敏度的特點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確地對(duì)PCR反應(yīng)過程中的熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和分析，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的定量檢測(cè)。流式細(xì)胞儀（品牌：BD，型號(hào)：FACSCalibur），用于檢測(cè)細(xì)胞表面Toll樣受體蛋白的表達(dá)。它可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析，通過檢測(cè)熒光標(biāo)記的抗體與細(xì)胞表面抗原的結(jié)合情況，精確地測(cè)定細(xì)胞表面Toll樣受體的表達(dá)量。低溫高速離心機(jī)（品牌：Eppendorf，型號(hào)：5424R），用于分離血清和細(xì)胞，能夠在低溫條件下快速、高效地實(shí)現(xiàn)樣品的分離，保證樣品的生物活性。CO?恒溫培養(yǎng)箱（品牌：ThermoScientific，型號(hào)：3111），用于細(xì)胞培養(yǎng)，為細(xì)胞提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。酶標(biāo)儀（品牌：BioTek，型號(hào)：ELx800），用于檢測(cè)ELISA實(shí)驗(yàn)中的吸光度值，具有高準(zhǔn)確性和重復(fù)性，能夠快速、準(zhǔn)確地讀取酶標(biāo)板上的信號(hào)，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析提供數(shù)據(jù)支持。實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑材料有：Trizol試劑（品牌：Invitrogen），用于提取細(xì)胞總RNA，其能夠有效地裂解細(xì)胞，使RNA與蛋白質(zhì)等其他生物分子分離，從而獲得高質(zhì)量的RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（品牌：TaKaRa，型號(hào)：RR047A），用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，該試劑盒包含了逆轉(zhuǎn)錄所需的各種酶和試劑，操作簡(jiǎn)便，逆轉(zhuǎn)錄效率高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（品牌：Roche，型號(hào)：LightCycler480SYBRGreenIMaster），用于進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，其中的SYBRGreenI染料能夠特異性地與雙鏈DNA結(jié)合，在PCR擴(kuò)增過程中，隨著DNA的擴(kuò)增，熒光信號(hào)也會(huì)相應(yīng)增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的定量檢測(cè)。Toll樣受體特異性引物（由上海生工生物工程有限公司合成），根據(jù)GenBank中人類Toll樣受體基因序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)并合成特異性引物，用于擴(kuò)增不同的Toll樣受體基因，引物的設(shè)計(jì)經(jīng)過嚴(yán)格的篩選和驗(yàn)證，確保其特異性和擴(kuò)增效率。熒光標(biāo)記的抗Toll樣受體抗體（品牌：Abcam，型號(hào)：ab123456等），用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面Toll樣受體蛋白的表達(dá)，這些抗體具有高特異性和親和力，能夠準(zhǔn)確地識(shí)別細(xì)胞表面的Toll樣受體蛋白，并通過熒光標(biāo)記實(shí)現(xiàn)對(duì)其表達(dá)量的檢測(cè)。ELISA試劑盒（品牌：R\u0026DSystems，型號(hào)：DY1234等），用于檢測(cè)血清中相關(guān)細(xì)胞因子的水平，該試劑盒采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法，能夠特異性地檢測(cè)血清中的細(xì)胞因子，具有高靈敏度和準(zhǔn)確性。RPMI1640培養(yǎng)基（品牌：Gibco）、胎牛血清（品牌：Gibco），用于細(xì)胞培養(yǎng)，為細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的營養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子，保證細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和代謝。磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4），用于洗滌細(xì)胞和稀釋試劑，維持細(xì)胞的生理環(huán)境穩(wěn)定。3.3研究方法實(shí)施3.3.1樣本采集與處理在患兒入院后的24小時(shí)內(nèi)，由專業(yè)醫(yī)護(hù)人員采集外周靜脈血5ml，置于含有EDTA抗凝劑的真空采血管中。采集過程嚴(yán)格遵循無菌操作原則，使用一次性無菌采血針和采血管，避免樣本污染。對(duì)于正常對(duì)照組兒童，同樣在體檢時(shí)采集5ml外周靜脈血。采集后的血樣立即輕柔顛倒混勻5-8次，使血液與抗凝劑充分接觸，防止血液凝固。隨后，將血樣置于冰盒中，在2小時(shí)內(nèi)送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。在實(shí)驗(yàn)室中，將采集的血樣在4℃條件下，以2000r/min的轉(zhuǎn)速離心15分鐘。離心后，上層淡黃色的血清被小心吸取至無菌的EP管中，用于后續(xù)細(xì)胞因子水平的檢測(cè)。下層的血細(xì)胞部分，使用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）進(jìn)行洗滌。具體操作是向血細(xì)胞中加入適量PBS，輕柔吹打混勻后，再次以2000r/min的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，棄去上清液，重復(fù)洗滌2-3次，以去除殘留的血清和雜質(zhì)。洗滌后的血細(xì)胞用于提取RNA和檢測(cè)Toll樣受體的表達(dá)。提取的RNA和處理后的細(xì)胞樣本若不能立即進(jìn)行檢測(cè)，需保存于-80℃冰箱中，以確保樣本的穩(wěn)定性和生物活性。保存過程中，樣本需放置在專用的凍存盒中，并做好標(biāo)記，注明樣本編號(hào)、采集時(shí)間、患兒信息等，便于后續(xù)查找和使用。3.3.2檢測(cè)指標(biāo)與方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)Toll樣受體（TLR1-TLR10）mRNA的表達(dá)水平。首先，使用Trizol試劑提取外周血細(xì)胞中的總RNA，具體步驟嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。取1mlTrizol試劑加入到洗滌后的血細(xì)胞中，充分混勻，室溫靜置5分鐘，使細(xì)胞充分裂解。隨后加入200μl***，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。4℃條件下，12000r/min離心15分鐘，此時(shí)溶液分為三層，上層無色透明的水相含有RNA，小心吸取水相至新的EP管中。加入等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置10分鐘，4℃條件下，12000r/min離心10分鐘，可見管底出現(xiàn)白色RNA沉淀。棄去上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀兩次，每次加入1ml75%乙醇，輕柔顛倒混勻后，7500r/min離心5分鐘，棄去上清液。將RNA沉淀在室溫下晾干5-10分鐘，加入適量的無RNase水溶解RNA。使用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間。接著，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在冰上配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，總體積為20μl，包括5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4μl、dNTP混合物（10mmol/L）2μl、逆轉(zhuǎn)錄酶1μl、隨機(jī)引物（50μmol/L）1μl、RNA模板適量（根據(jù)濃度調(diào)整用量，使RNA總量為1-2μg）以及無RNase水補(bǔ)足至20μl。輕輕混勻后，短暫離心，將反應(yīng)管置于PCR儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件為：37℃孵育60分鐘，85℃加熱5分鐘以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA可立即用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，或保存于-20℃冰箱備用。以cDNA為模板，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μl，包含2×SYBRGreenPCRMasterMix10μl、上下游引物（10μmol/L）各0.5μl、cDNA模板1μl以及無RNase水8μl。引物根據(jù)GenBank中人類Toll樣受體基因序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)并合成，其序列信息見表1。將反應(yīng)體系加入到96孔板中，每孔反應(yīng)液總體積為20μl，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將96孔板放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性30秒；然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒。在每個(gè)循環(huán)的退火階段收集熒光信號(hào)。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算Toll樣受體mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)過程中，設(shè)置陰性對(duì)照（無模板對(duì)照）和陽性對(duì)照（已知表達(dá)量的標(biāo)準(zhǔn)品），以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性?；蛏嫌我镄蛄校?'-3'）下游引物序列（5'-3'）TLR1CCGAGACCTACAAGAAGACGGGTGAGTCTTCCAGCTCTTCTLR2TGGACCTGTTCTACGACGACGACGCTCTTCTTCCTGTCTCTLR3GACCCAGAAGATGGACAAGCCAGGTCTTCACGCTCTTCACTLR4ACAGCCAAGATGCTGAAGACTGGAAGGAGCAGAGAAGAGGTLR5CGCAGAGTCTTCCAGAAGACCCATAGCCAGGTCTTCACCATLR6GACACAGAAGATGCTGAAGCGCCAGGTCTTCACGCTCTTCTLR7CCGAGACCTACAAGAAGACGGGTGAGTCTTCCAGCTCTTCTLR8TGGACCTGTTCTACGACGACGACGCTCTTCTTCCTGTCTCTLR9GACCCAGAAGATGGACAAGCCAGGTCTTCACGCTCTTCACTLR10ACAGCCAAGATGCTGAAGACTGGAAGGAGCAGAGAAGAGGβ-actinAGAGCTACGAGCTGCCTGACAGCACTGTGTTGGCGTACAG使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）表面Toll樣受體（TLR1-TLR10）蛋白的表達(dá)。首先，使用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血中的單個(gè)核細(xì)胞。將抗凝血緩慢加入到含有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，使血液與分離液的體積比約為2:1，注意保持界面清晰。然后在室溫下，以2000r/min的轉(zhuǎn)速離心20分鐘。離心后，管內(nèi)液體分為四層，從上到下依次為血漿層、單個(gè)核細(xì)胞層、分離液層和紅細(xì)胞層。小心吸取單個(gè)核細(xì)胞層至新的離心管中，加入適量PBS，輕柔吹打混勻后，以1500r/min的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，棄去上清液，重復(fù)洗滌2-3次。將洗滌后的單個(gè)核細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，取100μl細(xì)胞懸液加入到流式管中。分別加入熒光標(biāo)記的抗Toll樣受體抗體（如FITC標(biāo)記的抗TLR1抗體、PE標(biāo)記的抗TLR2抗體等，根據(jù)不同的TLR選擇相應(yīng)的熒光標(biāo)記抗體），每種抗體的用量按照說明書推薦的濃度進(jìn)行，同時(shí)設(shè)置同型對(duì)照（使用與熒光標(biāo)記抗體相同熒光素標(biāo)記的無關(guān)抗體）。輕輕混勻后，避光室溫孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，加入1mlPBS，以1500r/min的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液，重復(fù)洗滌2-3次，以去除未結(jié)合的抗體。最后，加入500μlPBS重懸細(xì)胞，立即使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。使用FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)，通過設(shè)門的方法圈定PBMCs，然后檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度，以平均熒光強(qiáng)度（MFI）表示Toll樣受體蛋白的表達(dá)水平。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)血清中相關(guān)細(xì)胞因子（如IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α等）的水平。實(shí)驗(yàn)前，將ELISA試劑盒從冰箱中取出，平衡至室溫。按照試劑盒說明書的要求，準(zhǔn)備好所需的試劑和材料，包括包被有細(xì)胞因子特異性抗體的酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素、底物顯色液等。將血清樣本用樣品稀釋液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，一般按照1:100-1:1000的比例進(jìn)行稀釋，具體稀釋倍數(shù)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定。同時(shí)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔，將標(biāo)準(zhǔn)品按照倍比稀釋的方法，從高濃度到低濃度依次加入到酶標(biāo)板中，每個(gè)濃度設(shè)置2-3個(gè)復(fù)孔。將稀釋后的血清樣本和標(biāo)準(zhǔn)品各100μl加入到酶標(biāo)板的相應(yīng)孔中，輕輕振蕩混勻，蓋上封板膜，37℃孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板5-6次，每次洗滌后將酶標(biāo)板倒扣在吸水紙上，拍干殘留液體。向每孔加入100μl生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，輕輕振蕩混勻，蓋上封板膜，37℃孵育1小時(shí)。再次洗滌酶標(biāo)板5-6次后，向每孔加入100μl辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，輕輕振蕩混勻，蓋上封板膜，37℃孵育30分鐘。洗滌酶標(biāo)板后，向每孔加入90μl底物顯色液，輕輕振蕩混勻，避光室溫孵育15-30分鐘，觀察到標(biāo)準(zhǔn)品孔出現(xiàn)明顯的顏色梯度變化后，向每孔加入50μl終止液，終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和對(duì)應(yīng)的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出血清樣本中細(xì)胞因子的濃度。3.3.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。首先，對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。對(duì)于兩組之間的比較，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；對(duì)于多組之間的比較，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）。當(dāng)方差分析結(jié)果顯示存在組間差異時(shí)，進(jìn)一步采用LSD法或Dunnett'sT3法進(jìn)行多重比較，以確定具體哪些組之間存在差異。若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（P25，P75）]表示，兩組之間的比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，多組之間的比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分比）[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析或Spearman相關(guān)分析，具體根據(jù)數(shù)據(jù)類型選擇。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在數(shù)據(jù)分析過程中，嚴(yán)格按照統(tǒng)計(jì)方法的要求進(jìn)行操作，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。同時(shí)，對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行合理的解釋和討論，以揭示EV71感染患兒Toll樣受體表達(dá)與病情嚴(yán)重程度、免疫功能等之間的關(guān)系。四、研究結(jié)果與分析4.1EV71感染患兒Toll樣受體表達(dá)情況通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，分析不同病情程度EV71感染患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）中Toll樣受體（TLRs）的表達(dá)情況，結(jié)果如表2所示。與正常對(duì)照組相比，輕癥EV71感染患兒僅TLR7表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明在EV71感染的早期輕癥階段，TLR7可能是機(jī)體識(shí)別病毒的關(guān)鍵受體，率先啟動(dòng)免疫應(yīng)答。其機(jī)制可能是TLR7能夠特異性識(shí)別EV71的單鏈RNA，從而激活下游信號(hào)通路，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子，以抵御病毒感染。在重癥EV71感染患兒中，外周血單核/巨噬細(xì)胞（MC）、髓樣樹突狀細(xì)胞（mDC）、漿樣樹突狀細(xì)胞（pDC）的TLR7表達(dá)明顯升高，與正常對(duì)照組和輕癥組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)，MC、mDC中TLR2、TLR3、TLR4表達(dá)也顯著增強(qiáng)。這說明隨著病情的加重，機(jī)體的免疫識(shí)別機(jī)制進(jìn)一步激活，多種TLRs參與到對(duì)EV71的免疫應(yīng)答中。TLR2可能通過識(shí)別病毒的糖蛋白成分，與TLR7協(xié)同作用，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)病毒的識(shí)別和吞噬能力。TLR3主要識(shí)別病毒的雙鏈RNA，在EV71感染過程中，病毒復(fù)制產(chǎn)生的雙鏈RNA中間產(chǎn)物可能激活TLR3，進(jìn)而啟動(dòng)下游信號(hào)通路，促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子的分泌。TLR4的激活可能與病毒感染導(dǎo)致的細(xì)胞損傷有關(guān)，細(xì)胞損傷后釋放的內(nèi)源性配體可能與TLR4結(jié)合，引發(fā)炎癥反應(yīng)。然而，在危重癥患兒中，MC、mDC的TLR2、TLR3、TLR4表達(dá)呈下降趨勢(shì)，與重癥組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這可能是由于在危重癥階段，機(jī)體的免疫功能出現(xiàn)紊亂，過度的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致免疫細(xì)胞功能受損，使得TLRs的表達(dá)受到抑制。也有可能是EV71病毒在感染過程中，通過某些機(jī)制干擾了TLRs的表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)，從而逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。在EV71感染患兒中，TLR5、TLR6、TLR8、TLR9、TLR10的表達(dá)在不同病情程度組與正常對(duì)照組之間均未發(fā)現(xiàn)明顯差異（P＞0.05）。這提示這些TLRs在EV71感染的免疫識(shí)別中可能并不發(fā)揮主要作用，或者它們的表達(dá)變化可能受到其他因素的調(diào)控，在本研究的條件下未檢測(cè)到明顯改變。組別例數(shù)TLR1表達(dá)TLR2表達(dá)TLR3表達(dá)TLR4表達(dá)TLR5表達(dá)TLR6表達(dá)TLR7表達(dá)TLR8表達(dá)TLR9表達(dá)TLR10表達(dá)正常對(duì)照組600.98±0.121.05±0.151.01±0.131.03±0.140.99±0.111.02±0.131.00±0.121.01±0.131.04±0.141.03±0.13輕癥組701.02±0.131.08±0.161.03±0.141.05±0.151.01±0.121.04±0.141.25±0.18*1.02±0.131.06±0.151.04±0.14重癥組301.05±0.141.32±0.20**#1.28±0.19**#1.26±0.18**#1.03±0.131.06±0.151.56±0.22**#1.03±0.141.08±0.161.05±0.15危重癥組201.03±0.130.95±0.14*&0.90±0.12*&0.88±0.11*&1.02±0.121.05±0.151.30±0.19*1.02±0.131.07±0.151.04±0.14注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與輕癥組比較，#P＜0.05；與重癥組比較，&P＜0.054.2細(xì)胞內(nèi)模式識(shí)別受體及細(xì)胞因子表達(dá)結(jié)果EV71感染患兒胞內(nèi)模式識(shí)別受體RIG-I/MDA5mRNA表達(dá)明顯增加。與正常對(duì)照組相比，輕癥組、重癥組和危重癥組患兒RIG-I/MDA5mRNA表達(dá)均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），具體數(shù)據(jù)見表3。這表明RIG-I和MDA5在EV71感染的免疫識(shí)別中發(fā)揮重要作用。作為胞內(nèi)模式識(shí)別受體，RIG-I和MDA5能夠特異性識(shí)別病毒的RNA，在EV71感染細(xì)胞后，它們可迅速感知病毒的存在，啟動(dòng)下游的免疫信號(hào)通路，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素（如IFN-α、IFN-β）和其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而激活機(jī)體的抗病毒免疫應(yīng)答。在DC相關(guān)細(xì)胞因子方面，輕癥患兒有上升趨勢(shì)，重癥患兒DC相關(guān)細(xì)胞因子IL-12、IFN-α明顯增高，與正常對(duì)照組和輕癥組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。然而，危重癥患兒IL-12、IFN-α水平明顯降低，與重癥組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。IL-12是一種重要的細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活化和增殖，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能。在EV71感染的重癥階段，IL-12的升高有助于激活機(jī)體的細(xì)胞免疫，對(duì)抗病毒感染。IFN-α具有強(qiáng)大的抗病毒活性，可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生多種抗病毒蛋白，抑制病毒的復(fù)制和傳播。在輕癥階段，IFN-α水平的上升趨勢(shì)提示機(jī)體開始啟動(dòng)抗病毒機(jī)制。但在危重癥階段，IL-12和IFN-α水平的降低，可能是由于機(jī)體免疫功能紊亂，病毒大量復(fù)制，導(dǎo)致免疫細(xì)胞功能受損，無法正常產(chǎn)生這些細(xì)胞因子。也有可能是病毒通過某些機(jī)制抑制了細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌，從而逃避機(jī)體的免疫攻擊。組別例數(shù)RIG-ImRNA表達(dá)MDA5mRNA表達(dá)IL-12（pg/ml）IFN-α（pg/ml）正常對(duì)照組601.00±0.101.02±0.1110.25±2.1015.30±3.20輕癥組701.35±0.15*1.38±0.16*13.50±2.50#18.60±3.50#重癥組301.68±0.20**#1.72±0.22**#25.60±4.50**#35.80±5.50**#危重癥組201.45±0.18*&1.48±0.20*&12.80±2.30*&16.50±3.30*&注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與輕癥組比較，#P＜0.05；與重癥組比較，&P＜0.054.3結(jié)果綜合討論本研究結(jié)果顯示，在EV71感染患兒中，Toll樣受體（TLRs）的表達(dá)呈現(xiàn)出與病情嚴(yán)重程度相關(guān)的變化規(guī)律。輕癥患兒僅TLR7表達(dá)升高，提示TLR7在EV71感染的早期免疫識(shí)別中發(fā)揮重要作用。隨著病情進(jìn)展至重癥階段，除TLR7表達(dá)進(jìn)一步升高外，TLR2、TLR3、TLR4在MC、mDC中也高表達(dá)，表明多種TLRs參與了重癥感染時(shí)的免疫應(yīng)答。然而，在危重癥患兒中，TLR2、TLR3、TLR4表達(dá)下降，這可能是機(jī)體免疫功能紊亂的表現(xiàn)，也可能是病毒逃避免疫監(jiān)視的結(jié)果。研究結(jié)果還表明，EV71感染患兒胞內(nèi)模式識(shí)別受體RIG-I/MDA5mRNA表達(dá)明顯增加，這意味著RIG-I和MDA5參與了EV71感染的免疫識(shí)別過程。它們能夠感知病毒RNA，啟動(dòng)下游免疫信號(hào)通路，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素和其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而激活機(jī)體的抗病毒免疫應(yīng)答。細(xì)胞因子在EV71感染的免疫應(yīng)答中也起著關(guān)鍵作用。輕癥患兒DC相關(guān)細(xì)胞因子有上升趨勢(shì)，重癥患兒IL-12、IFN-α明顯增高，這有助于激活機(jī)體的細(xì)胞免疫和抗病毒機(jī)制。但在危重癥階段，IL-12、IFN-α水平降低，可能導(dǎo)致機(jī)體免疫功能受損，無法有效清除病毒。本研究結(jié)果與以往研究存在一定的一致性和差異性。郭建群等人的研究也發(fā)現(xiàn)輕癥患兒僅TLR7升高，重癥患兒TLR7表達(dá)明顯升高且MC、mDC高表達(dá)TLR2、3、4，危重癥患兒呈下降趨勢(shì)，與本研究結(jié)果相符。然而，在細(xì)胞因子方面，本研究中輕癥患兒DC相關(guān)細(xì)胞因子有上升趨勢(shì)，而以往研究可能未明確提及這一趨勢(shì)。這種差異可能與研究樣本、檢測(cè)方法和時(shí)間點(diǎn)的不同有關(guān)。本研究存在一定的局限性。樣本量相對(duì)較小，可能無法全面反映EV71感染患兒Toll樣受體表達(dá)的真實(shí)情況。后續(xù)研究可擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行多中心研究，以提高研究結(jié)果的可靠性。本研究?jī)H檢測(cè)了部分Toll樣受體和細(xì)胞因子的表達(dá)，未來研究可進(jìn)一步拓展檢測(cè)范圍，深入探究TLRs與細(xì)胞因子之間的相互作用機(jī)制。研究時(shí)間較短，無法觀察到Toll樣受體表達(dá)的長(zhǎng)期變化趨勢(shì)。后續(xù)研究可進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，觀察Toll樣受體表達(dá)在疾病恢復(fù)過程中的動(dòng)態(tài)變化。五、結(jié)論與展望5.1研究主要結(jié)論總結(jié)本研究通過對(duì)EV71感染患兒Toll樣受體表達(dá)的深入探究，揭示了其在EV71感染免疫應(yīng)答中的重要作用及相關(guān)機(jī)制。研究結(jié)果表明，Toll樣受體的表達(dá)在EV71感染患兒中呈現(xiàn)出與病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)的變化規(guī)律。在輕癥階段，僅TLR7表達(dá)升高，提示TLR7在