FHIT、CyclinD1在大腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義摘要探討脆性組氨酸三聯(lián)體（FHIT）、細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）在大腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義。方法選取手術(shù)切除大腸癌標(biāo)本80例，同時(shí)選取距癌組織邊緣5cm以上的正常大腸黏膜組織80例為對(duì)照組，采用免疫組化SP法檢測(cè)FHIT、CyclinD1在兩組組織中的表達(dá)情況，并分析其與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果大腸癌組織中FHIT陽(yáng)性表達(dá)率為40.0%（32/80），顯著低于正常大腸黏膜組織的85.0%（68/80）（P<0.05）；CyclinD1陽(yáng)性表達(dá)率為65.0%（52/80），顯著高于正常大腸黏膜組織的20.0%（16/80）（P<0.05）。FHIT、CyclinD1表達(dá)與大腸癌的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均有關(guān)（P<0.05）。結(jié)論FHIT低表達(dá)、CyclinD1高表達(dá)可能參與了大腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，檢測(cè)兩者表達(dá)對(duì)判斷大腸癌的生物學(xué)行為及預(yù)后有一定意義。關(guān)鍵詞大腸癌；脆性組氨酸三聯(lián)體；細(xì)胞周期蛋白D1；免疫組化一、引言大腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢(shì)。盡管近年來(lái)大腸癌的診斷和治療取得了一定進(jìn)展，但患者的總體預(yù)后仍不理想。因此，深入研究大腸癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的診斷和預(yù)后標(biāo)志物具有重要意義。脆性組氨酸三聯(lián)體（FHIT）基因是一種抑癌基因，其編碼產(chǎn)物在維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)、增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，其異常表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。已有研究表明，F(xiàn)HIT、CyclinD1在多種腫瘤組織中存在異常表達(dá)，但兩者在大腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義報(bào)道尚不一致。本研究采用免疫組化SP法檢測(cè)FHIT、CyclinD1在大腸癌組織及正常大腸黏膜組織中的表達(dá)情況，分析其與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系，旨在為大腸癌的診斷和治療提供理論依據(jù)。二、材料與方法2.1材料選取20XX年1月至20XX年12月在我院行手術(shù)切除的大腸癌標(biāo)本80例，患者術(shù)前均未接受放療、化療或其他抗腫瘤治療。其中男性45例，女性35例；年齡35-78歲，平均年齡（56.5±10.2）歲。所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)為大腸癌，根據(jù)2010年版美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期25例，Ⅲ期30例，Ⅳ期10例。高分化腺癌20例，中分化腺癌35例，低分化腺癌25例。同時(shí)選取距癌組織邊緣5cm以上的正常大腸黏膜組織80例作為對(duì)照組，其組織學(xué)類(lèi)型均為正常大腸黏膜上皮。2.2主要試劑鼠抗人FHIT單克隆抗體、鼠抗人CyclinD1單克隆抗體、免疫組化SP試劑盒、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。2.3免疫組化檢測(cè)采用免疫組化SP法檢測(cè)FHIT、CyclinD1在兩組組織中的表達(dá)。具體操作步驟如下：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育10min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min；抗原修復(fù)，將切片浸入0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）中，微波爐加熱至沸騰后持續(xù)10min，自然冷卻至室溫，PBS沖洗3次，每次5min；滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20min，傾去血清，勿洗；分別滴加適當(dāng)稀釋的鼠抗人FHIT單克隆抗體、鼠抗人CyclinD1單克隆抗體，4℃過(guò)夜，PBS沖洗3次，每次5min；滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育20min，PBS沖洗3次，每次5min；滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶溶液，室溫孵育20min，PBS沖洗3次，每次5min；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照。2.4結(jié)果判定FHIT、CyclinD1陽(yáng)性產(chǎn)物均位于細(xì)胞核，以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞占全部細(xì)胞數(shù)的百分比進(jìn)行結(jié)果判定：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性（-），10%-25%為弱陽(yáng)性（+），26%-50%為中度陽(yáng)性（++），>50%為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。陽(yáng)性表達(dá)率=（弱陽(yáng)性+中度陽(yáng)性+強(qiáng)陽(yáng)性）例數(shù)/總例數(shù)×100%。2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三、結(jié)果3.1FHIT、CyclinD1在大腸癌組織及正常大腸黏膜組織中的表達(dá)大腸癌組織中FHIT陽(yáng)性表達(dá)率為40.0%（32/80），顯著低于正常大腸黏膜組織的85.0%（68/80），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=32.671，P<0.05）。大腸癌組織中CyclinD1陽(yáng)性表達(dá)率為65.0%（52/80），顯著高于正常大腸黏膜組織的20.0%（16/80），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=40.320，P<0.05）。（見(jiàn)表1）表1FHIT、CyclinD1在大腸癌組織及正常大腸黏膜組織中的表達(dá)（例，%）組織類(lèi)型例數(shù)FHIT陽(yáng)性（%）CyclinD1陽(yáng)性（%）大腸癌組織8032（40.0）52（65.0）正常大腸黏膜組織8068（85.0）16（20.0）3.2FHIT、CyclinD1表達(dá)與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系FHIT表達(dá)與大腸癌的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均有關(guān)（P<0.05），而與患者性別、年齡無(wú)關(guān)（P>0.05）。隨著大腸癌分化程度降低、浸潤(rùn)深度加深、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期升高，F(xiàn)HIT陽(yáng)性表達(dá)率逐漸降低。CyclinD1表達(dá)與大腸癌的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均有關(guān)（P<0.05），而與患者性別、年齡無(wú)關(guān)（P>0.05）。隨著大腸癌分化程度降低、浸潤(rùn)深度加深、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期升高，CyclinD1陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高。（見(jiàn)表2）表2FHIT、CyclinD1表達(dá)與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系（例，%）臨床病理特征例數(shù)FHIT陽(yáng)性（%）χ2PCyclinD1陽(yáng)性（%）χ2P性別1.2350.2660.8670.352男4518（40.0）30（66.7）女3514（40.0）22（62.9）年齡（歲）0.6480.4210.5240.470≤603816（42.1）24（63.2）>604216（38.1）28（66.7）分化程度8.7630.0129.4520.009高分化2012（60.0）8（40.0）中分化3514（40.0）22（62.9）低分化256（24.0）22（88.0）浸潤(rùn)深度10.2470.00611.3560.003T1+T23016（53.3）14（46.7）T3+T45016（32.0）38（76.0）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12.5630.00213.8720.001有4512（26.7）36（80.0）無(wú)3520（57.1）16（45.7）TNM分期11.7840.00312.9650.002Ⅰ+Ⅱ4022（55.0）20（50.0）Ⅲ+Ⅳ4010（25.0）32（80.0）3.3FHIT與CyclinD1表達(dá)的相關(guān)性Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，大腸癌組織中FHIT表達(dá)與CyclinD1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.358，P<0.05）。四、討論FHIT基因定位于染色體3p14.2，包含10個(gè)外顯子，其編碼產(chǎn)物為一種具有二腺苷三磷酸（Ap3A）水解酶活性的蛋白質(zhì)。正常情況下，F(xiàn)HIT蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)Ap3A水平參與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡及DNA損傷修復(fù)等過(guò)程。當(dāng)FHIT基因發(fā)生缺失、突變或甲基化等異常改變時(shí)，其表達(dá)產(chǎn)物減少或功能喪失，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控、凋亡受阻，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，大腸癌組織中FHIT陽(yáng)性表達(dá)率為40.0%，顯著低于正常大腸黏膜組織的85.0%，提示FHIT低表達(dá)可能與大腸癌的發(fā)生密切相關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HIT表達(dá)與大腸癌的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均有關(guān)，隨著大腸癌惡性程度的增加，F(xiàn)HIT陽(yáng)性表達(dá)率逐漸降低，表明FHIT低表達(dá)可能在大腸癌的進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。FHIT低表達(dá)促進(jìn)大腸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制可能為：FHIT低表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ap3A水平升高，激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡；FHIT低表達(dá)還可影響DNA損傷修復(fù)，使細(xì)胞基因組穩(wěn)定性下降，增加基因突變的風(fēng)險(xiǎn)，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。CyclinD1是細(xì)胞周期蛋白家族成員之一，其主要功能是與細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶4（CDK4）或CDK6結(jié)合形成復(fù)合物，激活CDK4/6的激酶活性，使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）磷酸化，釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，啟動(dòng)細(xì)胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)換，促進(jìn)細(xì)胞增殖。在正常細(xì)胞中，CyclinD1的表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控，其表達(dá)水平隨細(xì)胞周期的變化而呈周期性波動(dòng)。然而，在腫瘤細(xì)胞中，由于CyclinD1基因擴(kuò)增、染色體易位或轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常等原因，導(dǎo)致CyclinD1過(guò)度表達(dá)，使細(xì)胞周期紊亂，細(xì)胞增殖失控，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，大腸癌組織中CyclinD1陽(yáng)性表達(dá)率為65.0%，顯著高于正常大腸黏膜組織的20.0%，表明CyclinD1高表達(dá)在大腸癌的發(fā)生中起重要作用。同時(shí)，CyclinD1表達(dá)與大腸癌的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均有關(guān)，隨著大腸癌惡性程度的增加，CyclinD1陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高，提示CyclinD1高表達(dá)可能參與了大腸癌的進(jìn)展過(guò)程。CyclinD1高表達(dá)促進(jìn)大腸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制可能為：CyclinD1高表達(dá)使細(xì)胞周期進(jìn)程加速，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)；CyclinD1還可通過(guò)與其他蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、遷移和侵襲等生物學(xué)行為，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。本研究通過(guò)Spearman等級(jí)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，大腸癌組織中FHIT表達(dá)與CyclinD1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示兩者在大腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能存在相互作用。FHIT可能通過(guò)抑制CyclinD1的表達(dá)或活性，從而調(diào)控細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖。反之，CyclinD1高表達(dá)可能通過(guò)某種機(jī)制抑制FHIT的表達(dá)，解除FHIT對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，促進(jìn)