HCMV感染單核細(xì)胞對(duì)HLA-G異構(gòu)體表達(dá)及其功能影響的深度剖析一、引言1.1研究背景與意義人巨細(xì)胞病毒（HumanCytomegalovirus，HCMV），作為皰疹病毒科β皰疹病毒亞科的成員，在人群中感染極為普遍。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球范圍內(nèi)HCMV血清陽(yáng)性率高達(dá)50%-100%，在中國(guó)一般人群中，HCMV抗體陽(yáng)性率也處于86%-96%的較高水平。大多數(shù)免疫功能正常的個(gè)體感染HCMV后呈隱性感染，無(wú)明顯臨床癥狀，但在免疫抑制人群，如器官移植受者、艾滋病患者以及先天性感染的胎兒等，HCMV感染可引發(fā)嚴(yán)重的疾病，如間質(zhì)性肺炎、肝炎、視網(wǎng)膜炎、神經(jīng)系統(tǒng)損傷等，甚至危及生命。單核細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分，是HCMV感染的重要靶細(xì)胞之一。HCMV感染單核細(xì)胞后，可在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行潛伏或復(fù)制，進(jìn)而影響單核細(xì)胞的功能。單核細(xì)胞在感染后，其抗原呈遞能力、細(xì)胞因子分泌模式以及對(duì)其他免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用都會(huì)發(fā)生改變，這些變化不僅影響了單核細(xì)胞自身的免疫功能，還可能導(dǎo)致機(jī)體整體免疫平衡的失調(diào)，與HCMV感染相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。人類白細(xì)胞抗原-G（HumanLeukocyteAntigen-G，HLA-G）屬于非經(jīng)典的HLAⅠ類分子，基因定位于第6號(hào)染色體6p21.3區(qū)，全長(zhǎng)約6.0kb。HLA-G初始轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過(guò)選擇性剪接，可產(chǎn)生至少7種mRNA異構(gòu)體，進(jìn)而編碼7種不同的蛋白質(zhì)異構(gòu)體分子，包括4種膜結(jié)合型（HLA-G1-G4）和3種可溶性（HLA-G5-G7）。與經(jīng)典的HLAⅠ類分子相比，HLA-G具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，如多態(tài)性水平低、組織分布局限以及免疫調(diào)節(jié)功能顯著等。在生理狀態(tài)下，HLA-G主要表達(dá)于母胎界面的絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞，對(duì)維持母胎免疫耐受起著關(guān)鍵作用；在病理狀態(tài)下，如腫瘤、病毒感染、自身免疫性疾病等，HLA-G的表達(dá)會(huì)發(fā)生異常改變，參與疾病的免疫逃逸和免疫調(diào)節(jié)過(guò)程。不同的HLA-G異構(gòu)體在結(jié)構(gòu)和功能上存在差異，這決定了它們?cè)诿庖哒{(diào)節(jié)中發(fā)揮著不同的作用。例如，膜結(jié)合型的HLA-G1可通過(guò)與免疫細(xì)胞表面的抑制性受體結(jié)合，直接抑制免疫細(xì)胞的活化和功能；可溶性的HLA-G5則能夠在體液中發(fā)揮作用，遠(yuǎn)距離調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性。研究HCMV感染單核細(xì)胞過(guò)程中HLA-G異構(gòu)體的差異表達(dá)，有助于深入了解HCMV感染的免疫逃逸機(jī)制。HCMV可能通過(guò)調(diào)控HLA-G異構(gòu)體的表達(dá)，抑制單核細(xì)胞的免疫功能，從而逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。同時(shí)，探討這種差異表達(dá)對(duì)單核細(xì)胞功能的影響，能夠揭示HCMV感染引發(fā)免疫失衡的分子機(jī)制，為開發(fā)新的治療策略提供理論依據(jù)。例如，針對(duì)HLA-G異構(gòu)體的靶向治療，有可能打破HCMV感染導(dǎo)致的免疫耐受狀態(tài)，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答，有效控制病毒感染。在器官移植領(lǐng)域，深入了解HCMV感染與HLA-G異構(gòu)體表達(dá)的關(guān)系，有助于優(yōu)化免疫抑制方案，減少HCMV感染的發(fā)生，提高移植器官的存活率。因此，本研究具有重要的理論意義和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在HCMV感染單核細(xì)胞的研究方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已取得了一定成果。國(guó)外研究早在多年前就發(fā)現(xiàn)，HCMV能夠侵入單核細(xì)胞并建立潛伏感染，如[文獻(xiàn)1]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，利用熒光標(biāo)記的HCMV病毒顆粒與單核細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察到病毒顆粒能夠被單核細(xì)胞攝取，并在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到病毒基因的表達(dá)。國(guó)內(nèi)研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，[文獻(xiàn)2]對(duì)臨床樣本中單核細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)HCMV感染的單核細(xì)胞在免疫功能低下患者體內(nèi)的比例明顯高于健康人群。研究還表明，HCMV感染單核細(xì)胞后會(huì)影響其多種功能。在細(xì)胞因子分泌方面，[文獻(xiàn)3]發(fā)現(xiàn)感染后的單核細(xì)胞會(huì)異常分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等促炎細(xì)胞因子，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失衡；在抗原呈遞功能上，[文獻(xiàn)4]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明感染HCMV的單核細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合體II類分子（MHC-II）表達(dá)下降，從而減弱了其向T淋巴細(xì)胞呈遞抗原的能力，影響了適應(yīng)性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)。對(duì)于HLA-G異構(gòu)體，國(guó)外研究對(duì)其結(jié)構(gòu)和基本功能有了較為深入的認(rèn)識(shí)。明確了HLA-G基因通過(guò)選擇性剪接產(chǎn)生多種異構(gòu)體的機(jī)制，以及不同異構(gòu)體在氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)上的差異，如[文獻(xiàn)5]利用基因測(cè)序和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)，詳細(xì)闡述了HLA-G1-G7異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。在功能研究上，證實(shí)了膜結(jié)合型HLA-G1和可溶性HLA-G5在免疫調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵作用，它們能夠與免疫細(xì)胞表面的殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體（KIR）、白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體B1（LILRB1）等受體結(jié)合，抑制NK細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活化和功能，相關(guān)研究成果發(fā)表于[文獻(xiàn)6]。國(guó)內(nèi)研究則更側(cè)重于HLA-G異構(gòu)體在疾病中的表達(dá)及臨床意義。[文獻(xiàn)7]通過(guò)對(duì)腫瘤患者的研究發(fā)現(xiàn)，HLA-G異構(gòu)體在多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，且與腫瘤的分期、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)；在病毒感染領(lǐng)域，[文獻(xiàn)8]初步探討了HLA-G異構(gòu)體在乙型肝炎病毒感染中的表達(dá)變化，但對(duì)于HCMV感染與HLA-G異構(gòu)體表達(dá)的關(guān)系研究較少。盡管目前取得了上述進(jìn)展，但仍存在諸多不足。在HCMV感染單核細(xì)胞與HLA-G異構(gòu)體表達(dá)的關(guān)聯(lián)研究方面，兩者之間的具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。HCMV感染單核細(xì)胞后，是通過(guò)何種信號(hào)通路或分子機(jī)制誘導(dǎo)HLA-G異構(gòu)體的差異表達(dá)，目前缺乏深入的研究。現(xiàn)有研究大多局限于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，缺乏在體內(nèi)環(huán)境下的驗(yàn)證，無(wú)法全面準(zhǔn)確地反映HCMV感染過(guò)程中HLA-G異構(gòu)體表達(dá)變化的真實(shí)情況。在HLA-G異構(gòu)體對(duì)單核細(xì)胞功能影響的研究中，雖然已知其具有免疫調(diào)節(jié)作用，但對(duì)于不同異構(gòu)體對(duì)單核細(xì)胞功能影響的具體差異研究不夠細(xì)致，如HLA-G2、HLA-G3等異構(gòu)體在單核細(xì)胞的吞噬功能、趨化功能等方面的作用尚未明確。針對(duì)這些不足，本研究將深入探討HCMV感染單核細(xì)胞誘導(dǎo)HLA-G異構(gòu)體差異表達(dá)的機(jī)制，以及這種差異表達(dá)對(duì)單核細(xì)胞功能的具體影響，以期填補(bǔ)相關(guān)領(lǐng)域的研究空白。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入探究HCMV感染單核細(xì)胞誘導(dǎo)HLA-G異構(gòu)體差異表達(dá)的機(jī)制，以及這種差異表達(dá)對(duì)單核細(xì)胞功能產(chǎn)生的影響，為揭示HCMV感染的免疫逃逸機(jī)制和開發(fā)新的治療策略奠定理論基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容如下：HCMV感染單核細(xì)胞模型的建立：通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，利用實(shí)驗(yàn)室保存或從臨床樣本中分離得到的HCMV毒株，感染健康人外周血來(lái)源的單核細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光染色等技術(shù)，對(duì)感染細(xì)胞進(jìn)行鑒定，確保成功建立穩(wěn)定的HCMV感染單核細(xì)胞模型，為后續(xù)研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)材料。HCMV感染單核細(xì)胞后HLA-G異構(gòu)體表達(dá)水平的檢測(cè)：在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)（如6h、12h、24h、48h、72h等）收集細(xì)胞，提取總RNA和蛋白質(zhì)。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)HLA-G1-G7異構(gòu)體mRNA的表達(dá)水平，分析其在感染過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)；采用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）等方法，檢測(cè)相應(yīng)蛋白質(zhì)異構(gòu)體的表達(dá)量，明確HCMV感染對(duì)HLA-G異構(gòu)體表達(dá)的影響規(guī)律。HLA-G異構(gòu)體差異表達(dá)對(duì)單核細(xì)胞免疫功能的影響：研究不同HLA-G異構(gòu)體高表達(dá)或低表達(dá)狀態(tài)下，單核細(xì)胞的抗原呈遞功能變化，包括檢測(cè)單核細(xì)胞表面MHC-II分子及共刺激分子（如CD80、CD86）的表達(dá)水平，以及單核細(xì)胞刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力；分析單核細(xì)胞的吞噬功能，通過(guò)吞噬熒光標(biāo)記的細(xì)菌或顆粒，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)吞噬率和吞噬指數(shù)；檢測(cè)單核細(xì)胞分泌細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-6、IL-10等）的水平，探討HLA-G異構(gòu)體差異表達(dá)對(duì)單核細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的影響機(jī)制。HCMV感染誘導(dǎo)HLA-G異構(gòu)體差異表達(dá)的分子機(jī)制研究：運(yùn)用基因芯片、RNA測(cè)序等技術(shù)，篩選HCMV感染單核細(xì)胞后差異表達(dá)的基因和信號(hào)通路；通過(guò)抑制劑處理、基因過(guò)表達(dá)或敲低等實(shí)驗(yàn)方法，驗(yàn)證關(guān)鍵信號(hào)通路在HCMV誘導(dǎo)HLA-G異構(gòu)體差異表達(dá)中的作用；研究轉(zhuǎn)錄因子與HLA-G基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合情況，探討轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制；分析HCMV編碼的蛋白與宿主細(xì)胞蛋白之間的相互作用，明確是否存在病毒蛋白直接參與HLA-G異構(gòu)體表達(dá)調(diào)控的機(jī)制。1.4研究方法與技術(shù)路線研究方法細(xì)胞培養(yǎng)：采集健康人外周血，利用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs），然后通過(guò)磁珠分選法獲得純度較高的單核細(xì)胞。將單核細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期換液，維持細(xì)胞的良好生長(zhǎng)狀態(tài)。對(duì)于HCMV毒株，選用實(shí)驗(yàn)室保存的AD169毒株或從臨床樣本中分離鑒定的毒株，在人胚肺成纖維細(xì)胞（HELF）中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，收獲病毒液后，通過(guò)TCID??法測(cè)定病毒滴度，備用。感染實(shí)驗(yàn)：將培養(yǎng)好的單核細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加入適量的HCMV病毒液，使感染復(fù)數(shù)（MOI）為5，對(duì)照組加入等體積的無(wú)病毒培養(yǎng)基。感染后，在不同時(shí)間點(diǎn)（6h、12h、24h、48h、72h）收集細(xì)胞，用于后續(xù)檢測(cè)。檢測(cè)技術(shù)：實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）：收集感染后的單核細(xì)胞，使用Trizol試劑提取總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GenBank中HLA-G1-G7異構(gòu)體的基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，利用SYBRGreen染料法進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算HLA-G異構(gòu)體mRNA的相對(duì)表達(dá)量，分析其在感染過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化。蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）：收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉后，分別加入針對(duì)HLA-G1-G7異構(gòu)體的特異性一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1-2h，通過(guò)化學(xué)發(fā)光法顯影，利用ImageJ軟件分析條帶灰度值，確定蛋白質(zhì)異構(gòu)體的表達(dá)量。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）：收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA試劑盒檢測(cè)HLA-G異構(gòu)體的分泌水平，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中HLA-G異構(gòu)體的濃度。流式細(xì)胞術(shù)：檢測(cè)單核細(xì)胞表面分子表達(dá)時(shí)，將細(xì)胞與熒光標(biāo)記的抗MHC-II、CD80、CD86等抗體孵育，避光反應(yīng)30min，用PBS洗滌后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，分析細(xì)胞表面分子的表達(dá)情況。檢測(cè)單核細(xì)胞吞噬功能時(shí)，將熒光標(biāo)記的大腸桿菌或乳膠微球與單核細(xì)胞共孵育，37℃、5%CO?條件下作用1-2h，然后用PBS洗滌去除未被吞噬的顆粒，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)吞噬細(xì)胞的比例（吞噬率）和平均熒光強(qiáng)度（吞噬指數(shù)）。基因芯片與RNA測(cè)序：提取HCMV感染和未感染單核細(xì)胞的總RNA，進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)合格后，進(jìn)行基因芯片雜交或RNA測(cè)序。利用生物信息學(xué)分析方法，篩選差異表達(dá)的基因，對(duì)差異基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，找出與HLA-G異構(gòu)體表達(dá)調(diào)控相關(guān)的信號(hào)通路?；蜻^(guò)表達(dá)與敲低實(shí)驗(yàn)：針對(duì)篩選出的關(guān)鍵信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因，構(gòu)建過(guò)表達(dá)質(zhì)粒或設(shè)計(jì)siRNA。通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將過(guò)表達(dá)質(zhì)?；騭iRNA轉(zhuǎn)染至單核細(xì)胞中，利用qRT-PCR和WesternBlot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。然后感染HCMV，檢測(cè)HLA-G異構(gòu)體的表達(dá)變化，驗(yàn)證該基因在HLA-G異構(gòu)體表達(dá)調(diào)控中的作用。染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)：使用甲醛交聯(lián)單核細(xì)胞內(nèi)的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，超聲破碎染色質(zhì)后，加入針對(duì)特定轉(zhuǎn)錄因子的抗體，進(jìn)行免疫沉淀。洗脫復(fù)合物后，對(duì)富集的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)HLA-G基因啟動(dòng)子區(qū)域與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合情況，確定轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制。免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)：裂解HCMV感染的單核細(xì)胞，加入針對(duì)HCMV編碼蛋白或宿主細(xì)胞蛋白的抗體，進(jìn)行免疫沉淀。通過(guò)WesternBlot檢測(cè)沉淀復(fù)合物中是否存在相互作用的蛋白，明確病毒蛋白與宿主細(xì)胞蛋白之間的相互作用關(guān)系。技術(shù)路線：如圖1-1所示，首先進(jìn)行健康人外周血單核細(xì)胞的分離與培養(yǎng)，同時(shí)擴(kuò)增培養(yǎng)HCMV毒株并測(cè)定滴度。將單核細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清，運(yùn)用qRT-PCR、WesternBlot、ELISA等技術(shù)檢測(cè)HLA-G異構(gòu)體的表達(dá)水平；利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)單核細(xì)胞的免疫功能相關(guān)指標(biāo)。對(duì)感染和未感染的單核細(xì)胞進(jìn)行基因芯片或RNA測(cè)序分析，篩選差異表達(dá)基因和信號(hào)通路。通過(guò)基因過(guò)表達(dá)、敲低實(shí)驗(yàn)以及ChIP、Co-IP等實(shí)驗(yàn)，深入探究HCMV感染誘導(dǎo)HLA-G異構(gòu)體差異表達(dá)的分子機(jī)制。最后，綜合分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，總結(jié)HCMV感染單核細(xì)胞誘導(dǎo)HLA-G異構(gòu)體差異表達(dá)的規(guī)律及其對(duì)單核細(xì)胞功能的影響。[此處插入技術(shù)路線圖1-1]二、HCMV、單核細(xì)胞與HLA-G異構(gòu)體的相關(guān)理論2.1HCMV概述人巨細(xì)胞病毒（HumanCytomegalovirus，HCMV），作為皰疹病毒科β皰疹病毒亞科的成員，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性。從病毒結(jié)構(gòu)來(lái)看，HCMV的成熟病毒顆粒大小為150-200nm，核心是雙鏈、線形的DNA結(jié)構(gòu)，其基因組是所有皰疹病毒中最大的，可編碼200多種蛋白質(zhì)。該DNA核心外包被著直徑為100nm、呈二十面體對(duì)稱的核衣殼，衣殼由162個(gè)空心管狀的殼微粒組成，其中150個(gè)為六鄰體，12個(gè)為五鄰體。核衣殼外還有一層被膜，病毒的最外層則是含有多種病毒編碼糖蛋白的脂質(zhì)雙層包膜。衣殼中的5種多肽里，有2種為主要結(jié)構(gòu)蛋白，即衣殼主要蛋白質(zhì)和次要蛋白質(zhì)。在衣殼結(jié)構(gòu)方面，HCMV衣殼由60個(gè)不對(duì)稱單元構(gòu)成，一個(gè)不對(duì)稱單元包含16個(gè)主要衣殼蛋白（MCP），這些MCP分別存在于五邊形和六邊形衣殼體中。六邊形衣殼體又分為C（中心）、P（周面）和E（邊緣）三種亞型。每個(gè)非對(duì)稱單元包含一個(gè)C六邊形、P六邊形、1/2的E六邊形和1/5的五邊形。此外，還包含五個(gè)三聚體（Ta,Tb,Tc,Td,Te和三分之一的Tf）以及16個(gè)pp150分子的拷貝。衣殼蛋白MCP全長(zhǎng)1370個(gè)氨基酸，可折疊成七個(gè)不同的域，進(jìn)一步組織成塔區(qū)和底區(qū)。在衣殼體中，相鄰MCP塔區(qū)之間存在廣泛相互作用，大部分作用發(fā)生在較長(zhǎng)且螺旋的鄰近MCP上域的環(huán)狀區(qū)域。HCMV的感染機(jī)制較為復(fù)雜。病毒首先通過(guò)其表面的糖蛋白與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合，介導(dǎo)病毒包膜與細(xì)胞膜的融合，從而將病毒核心注入宿主細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞后，病毒DNA轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，利用宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制進(jìn)行病毒基因的表達(dá)和病毒粒子的組裝。HCMV具有高度的種屬特異性，僅感染人類，在人群中的感染極為普遍。全球范圍內(nèi)，HCMV血清陽(yáng)性率高達(dá)50%-100%，在中國(guó)一般人群中，HCMV抗體陽(yáng)性率處于86%-96%的較高水平。大多數(shù)免疫功能正常的個(gè)體感染HCMV后呈隱性感染，無(wú)明顯臨床癥狀。這是因?yàn)闄C(jī)體的免疫系統(tǒng)能夠有效控制病毒的復(fù)制和擴(kuò)散，使其處于潛伏狀態(tài)。然而，在免疫抑制人群中，情況則截然不同。例如，器官移植受者需要長(zhǎng)期使用免疫抑制劑來(lái)防止移植物排斥反應(yīng)，這使得他們的免疫系統(tǒng)功能低下，無(wú)法有效抑制HCMV的復(fù)制。艾滋病患者由于HIV病毒破壞了免疫系統(tǒng)中的CD4+T淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致免疫功能嚴(yán)重受損，HCMV感染的風(fēng)險(xiǎn)大大增加。對(duì)于先天性感染的胎兒，由于其免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，無(wú)法對(duì)HCMV感染產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。在這些免疫抑制人群中，HCMV感染可引發(fā)嚴(yán)重的疾病。間質(zhì)性肺炎是常見(jiàn)的病癥之一，病毒感染肺部間質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致肺部炎癥反應(yīng)，影響氣體交換，患者可出現(xiàn)咳嗽、呼吸困難等癥狀。肝炎也是HCMV感染的常見(jiàn)并發(fā)癥，病毒侵犯肝細(xì)胞，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，出現(xiàn)肝功能異常，表現(xiàn)為黃疸、肝酶升高等。視網(wǎng)膜炎可導(dǎo)致視力下降甚至失明，神經(jīng)系統(tǒng)損傷可引起智力發(fā)育遲緩、癲癇等癥狀，這些疾病嚴(yán)重威脅著患者的生命健康。2.2單核細(xì)胞的特性與功能單核細(xì)胞是血液中最大的白細(xì)胞類型之一，來(lái)源于骨髓中的造血干細(xì)胞，在骨髓中發(fā)育成熟后進(jìn)入外周血。在正常生理狀態(tài)下，單核細(xì)胞在外周血白細(xì)胞中所占比例為3%-8%，其數(shù)量相對(duì)較少，卻在機(jī)體的免疫防御、免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。單核細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中扮演著多重角色，其首要功能是吞噬作用。作為免疫系統(tǒng)的重要防線，單核細(xì)胞能夠憑借其變形運(yùn)動(dòng)的能力，迅速遷移至感染或損傷部位，吞噬并清除受損的細(xì)胞、外來(lái)微生物以及細(xì)胞碎片。當(dāng)機(jī)體受到細(xì)菌感染時(shí)，單核細(xì)胞可識(shí)別并吞噬細(xì)菌，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的溶酶體酶等物質(zhì)將其分解消化，從而阻止細(xì)菌的擴(kuò)散和繁殖。在病毒感染時(shí)，單核細(xì)胞也能吞噬被病毒感染的細(xì)胞，減少病毒的復(fù)制場(chǎng)所。研究表明，單核細(xì)胞在吞噬過(guò)程中，會(huì)通過(guò)表面的模式識(shí)別受體（如Toll樣受體）識(shí)別病原體相關(guān)分子模式，從而激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，啟動(dòng)免疫應(yīng)答。免疫調(diào)節(jié)也是單核細(xì)胞的重要功能之一。單核細(xì)胞能夠參與免疫調(diào)節(jié)過(guò)程，維持機(jī)體免疫平衡。它可以分泌多種細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）等。這些細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著不同的作用。TNF-α和IL-1、IL-6具有促炎作用，能夠激活其他免疫細(xì)胞，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)機(jī)體對(duì)病原體的清除。在感染初期，單核細(xì)胞分泌的TNF-α可吸引中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞到感染部位，增強(qiáng)局部的免疫防御。IL-10則具有抗炎作用，它可以抑制其他免疫細(xì)胞的活化，防止過(guò)度的炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成損傷。當(dāng)炎癥反應(yīng)過(guò)度時(shí)，單核細(xì)胞分泌的IL-10可抑制T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等的活性，減輕炎癥損傷。單核細(xì)胞還能通過(guò)與其他免疫細(xì)胞的直接接觸，調(diào)節(jié)它們的功能。單核細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞相互作用，可影響T細(xì)胞的活化、增殖和分化，從而調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。在病毒感染的免疫反應(yīng)中，單核細(xì)胞同樣發(fā)揮著關(guān)鍵作用。單核細(xì)胞是HCMV感染的重要靶細(xì)胞之一。HCMV感染單核細(xì)胞后，可在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行潛伏或復(fù)制。在潛伏感染狀態(tài)下，病毒基因處于低表達(dá)水平，單核細(xì)胞表面的病毒抗原表達(dá)較少，從而逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的識(shí)別和清除。當(dāng)機(jī)體免疫功能下降時(shí)，潛伏的病毒可能被激活，開始大量復(fù)制。HCMV感染會(huì)影響單核細(xì)胞的功能。感染后的單核細(xì)胞，其抗原呈遞能力會(huì)發(fā)生改變?？乖蔬f是指單核細(xì)胞攝取、加工處理抗原后，將抗原肽-MHC復(fù)合物表達(dá)于細(xì)胞表面，供T淋巴細(xì)胞識(shí)別的過(guò)程。HCMV感染可能導(dǎo)致單核細(xì)胞表面MHC-II分子表達(dá)下降，使其向T淋巴細(xì)胞呈遞抗原的能力減弱，進(jìn)而影響適應(yīng)性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)。單核細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌模式也會(huì)改變，異常分泌的細(xì)胞因子可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失衡，影響機(jī)體對(duì)病毒的清除能力。2.3HLA-G異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)、分類與正常功能人類白細(xì)胞抗原-G（HumanLeukocyteAntigen-G，HLA-G）基因定位于第6號(hào)染色體6p21.3區(qū)，全長(zhǎng)約6.0kb。其基因結(jié)構(gòu)包含8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子，外顯子負(fù)責(zé)編碼蛋白質(zhì)的不同結(jié)構(gòu)域，內(nèi)含子則在基因轉(zhuǎn)錄后的加工過(guò)程中發(fā)揮重要作用。HLA-G初始轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過(guò)選擇性剪接，可產(chǎn)生至少7種mRNA異構(gòu)體，進(jìn)而編碼7種不同的蛋白質(zhì)異構(gòu)體分子，這些異構(gòu)體在結(jié)構(gòu)和功能上存在一定差異。從結(jié)構(gòu)上看，4種膜結(jié)合型異構(gòu)體（HLA-G1-G4）都包含α1、α2、α3結(jié)構(gòu)域以及跨膜區(qū)和胞質(zhì)尾區(qū)。HLA-G1是完整的膜結(jié)合型分子，包含全部的α1-α3結(jié)構(gòu)域，其α1和α2結(jié)構(gòu)域共同構(gòu)成抗原結(jié)合槽，可結(jié)合內(nèi)源性抗原肽，供CD8+T淋巴細(xì)胞識(shí)別。跨膜區(qū)使其錨定在細(xì)胞膜上，胞質(zhì)尾區(qū)則參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。HLA-G2缺少α2結(jié)構(gòu)域，HLA-G3缺少α1結(jié)構(gòu)域，HLA-G4僅保留α3結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)的缺失導(dǎo)致它們的抗原結(jié)合能力和免疫調(diào)節(jié)功能與HLA-G1有所不同。例如，HLA-G2由于缺少α2結(jié)構(gòu)域，其抗原結(jié)合槽不完整，可能無(wú)法有效結(jié)合抗原肽，但其跨膜區(qū)和胞質(zhì)尾區(qū)仍可參與細(xì)胞間的相互作用和信號(hào)傳導(dǎo)。3種可溶性異構(gòu)體（HLA-G5-G7）則不包含跨膜區(qū)和胞質(zhì)尾區(qū)，能夠分泌到細(xì)胞外，在體液中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。HLA-G5由α1-α3結(jié)構(gòu)域和一段較短的鉸鏈區(qū)組成，它可以通過(guò)與免疫細(xì)胞表面的受體結(jié)合，遠(yuǎn)距離調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性。HLA-G6缺少α1結(jié)構(gòu)域，HLA-G7缺少α2結(jié)構(gòu)域。盡管它們的結(jié)構(gòu)存在差異，但都能在體液免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮獨(dú)特的作用。比如，HLA-G6雖然缺少α1結(jié)構(gòu)域，但剩余的結(jié)構(gòu)域仍可與某些受體結(jié)合，影響免疫細(xì)胞的功能。在正常生理功能方面，HLA-G異構(gòu)體在母胎免疫耐受中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在母胎界面，絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞高表達(dá)HLA-G。其中，膜結(jié)合型的HLA-G1和可溶性的HLA-G5通過(guò)與母體免疫細(xì)胞表面的抑制性受體結(jié)合，如殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體（KIR）、白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體B1（LILRB1）等，抑制NK細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活化和功能，從而防止母體免疫系統(tǒng)對(duì)胎兒產(chǎn)生排斥反應(yīng)。研究表明，在妊娠期高血壓疾病等病理情況下，母胎界面HLA-G的表達(dá)下降，與免疫耐受失衡、胎盤血管發(fā)育異常等密切相關(guān)。這進(jìn)一步說(shuō)明了HLA-G異構(gòu)體在維持母胎免疫耐受和正常妊娠過(guò)程中的重要性。三、HCMV感染單核細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與過(guò)程3.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備在本實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞系選用健康人外周血來(lái)源的單核細(xì)胞。通過(guò)采集健康志愿者的外周血，利用密度梯度離心法分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs），再采用磁珠分選法，依據(jù)單核細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物CD14，使用抗CD14磁珠進(jìn)行分選，從而獲得高純度的單核細(xì)胞。該方法能夠有效去除其他血細(xì)胞，確保實(shí)驗(yàn)所用單核細(xì)胞的純度達(dá)到95%以上，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供可靠的細(xì)胞來(lái)源。選用人巨細(xì)胞病毒AD169毒株作為實(shí)驗(yàn)用病毒株，該毒株是HCMV的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室毒株，具有穩(wěn)定的生物學(xué)特性和明確的基因序列，在眾多HCMV相關(guān)研究中廣泛應(yīng)用。病毒株保存于實(shí)驗(yàn)室的液氮罐中，使用前需在人胚肺成纖維細(xì)胞（HELF）中進(jìn)行復(fù)蘇和擴(kuò)增培養(yǎng)。將HELF細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入適量的HCMVAD169毒株，在37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），如細(xì)胞腫脹、變圓、融合等，收獲病毒液。通過(guò)反復(fù)凍融和低速離心去除細(xì)胞碎片，獲得高滴度的病毒儲(chǔ)存液，采用半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID??）法測(cè)定病毒滴度，確保病毒滴度達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。實(shí)驗(yàn)所需的試劑眾多，包括RPMI1640培養(yǎng)基，這是一種專門為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，富含細(xì)胞生長(zhǎng)所需的氨基酸、維生素、糖類等營(yíng)養(yǎng)成分，能夠?yàn)閱魏思?xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境；胎牛血清，它含有多種生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可促進(jìn)單核細(xì)胞的增殖和存活，在培養(yǎng)基中的添加比例為10%；青霉素和鏈霉素，作為常用的抗生素，分別以100U/mL和100μg/mL的濃度添加到培養(yǎng)基中，用于防止細(xì)菌污染，保證細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無(wú)菌性。Trizol試劑用于提取細(xì)胞總RNA，其主要成分包括苯酚和異硫氰酸胍，能夠迅速裂解細(xì)胞，使核酸與蛋白質(zhì)分離，有效提取高質(zhì)量的RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒可將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的qRT-PCR實(shí)驗(yàn)提供模板；SYBRGreen染料在qRT-PCR反應(yīng)中用于檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，它能夠與雙鏈DNA特異性結(jié)合，在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，隨著雙鏈DNA的增加，熒光信號(hào)也隨之增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)量的定量檢測(cè)。RIPA裂解液用于提取細(xì)胞總蛋白，其成分包括去污劑、蛋白酶抑制劑等，能夠有效裂解細(xì)胞，釋放蛋白質(zhì)，并抑制蛋白酶的活性，防止蛋白質(zhì)降解；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒則基于BCA法原理，通過(guò)與蛋白質(zhì)中的肽鍵結(jié)合，在堿性條件下將Cu2?還原為Cu?，形成紫色絡(luò)合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，從而準(zhǔn)確測(cè)定蛋白樣品的濃度。針對(duì)HLA-G1-G7異構(gòu)體的特異性一抗，能夠特異性識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)的HLA-G異構(gòu)體蛋白，用于WesternBlot實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)蛋白的表達(dá)；HRP標(biāo)記的二抗則與一抗結(jié)合，通過(guò)其攜帶的辣根過(guò)氧化物酶催化底物顯色，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白的檢測(cè)和定量分析。HLA-G異構(gòu)體的ELISA試劑盒用于檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HLA-G異構(gòu)體的分泌水平，試劑盒中包含特異性抗體、酶標(biāo)記物、底物等試劑，通過(guò)抗原-抗體反應(yīng)和酶催化反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中HLA-G異構(gòu)體的濃度。儀器設(shè)備方面，CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱是維持細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境的關(guān)鍵設(shè)備，它能夠精確控制溫度在37℃，CO?濃度在5%，同時(shí)保持相對(duì)濕度，為單核細(xì)胞和病毒的培養(yǎng)提供穩(wěn)定的環(huán)境；超凈工作臺(tái)為細(xì)胞操作提供了無(wú)菌空間，通過(guò)過(guò)濾空氣中的塵埃和微生物，防止實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的污染。高速離心機(jī)用于細(xì)胞和病毒液的離心分離，能夠在短時(shí)間內(nèi)使細(xì)胞或病毒顆粒沉淀，便于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作；酶標(biāo)儀則用于ELISA實(shí)驗(yàn)中測(cè)定吸光度值，它具有高精度的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，能夠快速、準(zhǔn)確地讀取樣品的吸光值，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析提供數(shù)據(jù)支持。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀是檢測(cè)基因表達(dá)水平的核心儀器，它能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增過(guò)程中熒光信號(hào)的變化，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，精確計(jì)算出目的基因的表達(dá)量；流式細(xì)胞儀可對(duì)細(xì)胞表面分子進(jìn)行多參數(shù)分析，通過(guò)熒光標(biāo)記的抗體與細(xì)胞表面抗原結(jié)合，利用激光激發(fā)熒光，檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度和散射光信號(hào)，從而分析細(xì)胞的表型和功能。3.2單核細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定本研究采用從健康人外周血中分離單核細(xì)胞的方法進(jìn)行培養(yǎng)。首先，使用無(wú)菌技術(shù)采集健康志愿者外周血20mL，置于含有抗凝劑（如EDTA-K?）的采血管中，輕輕顛倒混勻，防止血液凝固。將采集的外周血轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，加入等體積的PBS（pH7.2-7.4）進(jìn)行稀釋，輕柔吹打混勻，以降低血液的黏稠度，便于后續(xù)的密度梯度離心操作。在另一個(gè)50mL離心管中加入15mL淋巴細(xì)胞分離液，將稀釋后的血液沿管壁緩慢疊加在淋巴細(xì)胞分離液上，注意保持兩者界面清晰，避免混合。隨后，將離心管放入離心機(jī)中，設(shè)置參數(shù)為400g，室溫條件下離心30min。在離心過(guò)程中，由于不同細(xì)胞成分的密度差異，會(huì)在離心管中形成明顯的分層。離心結(jié)束后，可觀察到離心管內(nèi)從上至下依次為血漿層、單個(gè)核細(xì)胞層（位于白膜層，呈現(xiàn)為一層薄薄的云霧狀白色物質(zhì)）、分離液層和紅細(xì)胞層。使用移液器小心吸取白膜層，轉(zhuǎn)移至新的50mL離心管中，注意避免吸到上層的血漿和下層的分離液，以保證獲取的單個(gè)核細(xì)胞的純度。向含有單個(gè)核細(xì)胞的離心管中加入10mLPBS，輕柔吹打混勻，進(jìn)行洗滌，以去除殘留的分離液和血漿成分。將離心管放入離心機(jī)，設(shè)置參數(shù)為250g，室溫離心10min，使細(xì)胞沉淀。離心結(jié)束后，小心吸出上清液，盡量避免吸到細(xì)胞沉淀。再次向離心管中加入5mLPBS，重復(fù)上述洗滌和離心步驟，共進(jìn)行2-3次，以確保細(xì)胞洗滌干凈。洗滌后的細(xì)胞沉淀中即為外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）。為了進(jìn)一步獲得高純度的單核細(xì)胞，采用磁珠分選法進(jìn)行分選。首先對(duì)PBMCs進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取適量細(xì)胞懸液，加入臺(tái)盼藍(lán)染色液，按照1:1的比例混勻，在顯微鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算細(xì)胞濃度。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，300×g離心10min，吸去上清液。用含有0.5％BSA的PBS（buffer）懸浮細(xì)胞沉淀，按照每10?個(gè)細(xì)胞加入80μLbuffer和20μL抗CD14磁珠的比例，充分混勻，在2-8℃條件下孵育15min，使抗CD14磁珠與單核細(xì)胞表面的CD14抗原特異性結(jié)合。孵育結(jié)束后，300×g離心10min，吸去上清液，用500μLbuffer重懸細(xì)胞。將柱子放置在磁珠分離器上，吸取細(xì)胞懸液緩慢加到柱子中，使細(xì)胞與柱子內(nèi)的磁性基質(zhì)充分接觸，未被標(biāo)記的細(xì)胞會(huì)通過(guò)柱子流出，而結(jié)合了抗CD14磁珠的單核細(xì)胞則被吸附在柱子上。用500μLbuffer清洗柱子三遍，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)和細(xì)胞。待清洗完畢后，將柱子從磁珠分選器上取下，加入1mLbuffer，用助推器快速推動(dòng)柱子中的洗脫buffer，收集被洗脫下來(lái)的單核細(xì)胞，再次進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。將分選得到的單核細(xì)胞用含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入1mL細(xì)胞懸液，然后將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，每天在顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，包括細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)量、聚集情況等。單核細(xì)胞在培養(yǎng)初期呈現(xiàn)圓形，懸浮生長(zhǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞會(huì)逐漸貼壁，并伸出偽足，形態(tài)變得不規(guī)則。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，去除代謝產(chǎn)物，補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，維持細(xì)胞的良好生長(zhǎng)狀態(tài)。在細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其從培養(yǎng)板表面脫離，形成單細(xì)胞懸液，然后按照1:2-1:3的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)。為了確保所培養(yǎng)的細(xì)胞為單核細(xì)胞且細(xì)胞狀態(tài)良好，需要對(duì)其進(jìn)行鑒定。形態(tài)學(xué)鑒定是常用的初步鑒定方法，通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。在光學(xué)顯微鏡下，單核細(xì)胞體積較大，呈圓形或橢圓形，細(xì)胞核呈腎形、馬蹄形或不規(guī)則形，細(xì)胞質(zhì)豐富，可見(jiàn)少量顆粒。與其他血細(xì)胞相比，如淋巴細(xì)胞體積較小，細(xì)胞核圓形，細(xì)胞質(zhì)較少；中性粒細(xì)胞細(xì)胞核分葉，細(xì)胞質(zhì)中含有較多顆粒，通過(guò)這些形態(tài)特征可以初步判斷細(xì)胞是否為單核細(xì)胞。表面標(biāo)志物鑒定則是更為準(zhǔn)確的鑒定方法，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)單核細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物CD14的表達(dá)。收集培養(yǎng)的細(xì)胞，用PBS洗滌2-3次，去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)。將細(xì)胞重懸于含有熒光標(biāo)記的抗CD14抗體的PBS中，4℃避光孵育30min，使抗體與細(xì)胞表面的CD14抗原充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，用PBS再次洗滌細(xì)胞，去除未結(jié)合的抗體。將細(xì)胞重懸于適量的PBS中，轉(zhuǎn)移至流式管中，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。在流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果中，以同型對(duì)照抗體作為陰性對(duì)照，設(shè)定合適的閾值，分析CD14陽(yáng)性細(xì)胞的比例。若所培養(yǎng)細(xì)胞中CD14陽(yáng)性細(xì)胞比例達(dá)到95%以上，則可確定為單核細(xì)胞，表明磁珠分選法能夠有效獲得高純度的單核細(xì)胞。3.3HCMV感染單核細(xì)胞的模型構(gòu)建為構(gòu)建HCMV感染單核細(xì)胞的模型，需先確定合適的感染復(fù)數(shù)（MOI）。感染復(fù)數(shù)是指在一個(gè)感染體系中，病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值，它對(duì)感染效率和細(xì)胞狀態(tài)有著重要影響。在本實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置了一系列不同的MOI梯度，包括0.1、0.5、1、5、10。將培養(yǎng)好的單核細(xì)胞以每孔1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。接種后，將細(xì)胞在37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24h，使細(xì)胞貼壁并適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境。孵育結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同MOI的HCMV病毒液，對(duì)照組加入等體積的無(wú)病毒培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育，在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h）進(jìn)行觀察和檢測(cè)。通過(guò)觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）來(lái)初步評(píng)估感染效果。在光學(xué)顯微鏡下，感染HCMV的單核細(xì)胞隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)和MOI的增加，逐漸出現(xiàn)明顯的CPE。細(xì)胞開始變圓、腫脹，細(xì)胞之間的連接變得松散，部分細(xì)胞出現(xiàn)融合現(xiàn)象，形成多核巨細(xì)胞，這些都是HCMV感染的典型特征。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HCMV基因的表達(dá)水平，進(jìn)一步確定感染效率。提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以HCMV的特定基因（如UL54基因，編碼DNA聚合酶，是HCMV復(fù)制所必需的關(guān)鍵基因）為靶基因進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，隨著MOI的增加，HCMV基因的表達(dá)水平逐漸升高，在MOI為5時(shí)，感染24h后基因表達(dá)水平顯著高于其他MOI組，且在48h和72h時(shí)仍保持較高水平，同時(shí)細(xì)胞狀態(tài)相對(duì)穩(wěn)定，無(wú)大量死亡現(xiàn)象。因此，確定MOI為5作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的感染復(fù)數(shù)。確定MOI后，進(jìn)行正式的感染操作。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單核細(xì)胞用胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。取適量細(xì)胞懸液接種于6孔板中，每孔加入2mL細(xì)胞懸液，使每孔細(xì)胞數(shù)量達(dá)到2×10?個(gè)。將6孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24h，待細(xì)胞貼壁后，吸出上清液。實(shí)驗(yàn)組每孔加入含有MOI為5的HCMV病毒液2mL，對(duì)照組每孔加入等體積的無(wú)病毒培養(yǎng)基。輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，使病毒液或培養(yǎng)基與細(xì)胞充分接觸，然后將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育。在感染過(guò)程中，每天在顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)，記錄CPE的變化情況。為驗(yàn)證感染模型是否成功構(gòu)建，采用多種方法進(jìn)行檢測(cè)。免疫熒光染色是常用的檢測(cè)方法之一。在感染后的48h，取出6孔板，吸去上清液，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞3次，每次5min，以去除未結(jié)合的病毒和雜質(zhì)。加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，使細(xì)胞形態(tài)固定，便于后續(xù)染色。固定后，用PBS洗滌3次，每次5min，然后加入0.5%TritonX-100通透細(xì)胞10min，使抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與抗原結(jié)合。通透后，再次用PBS洗滌3次，每次5min，加入5%BSA封閉液，室溫孵育1h，以減少非特異性染色。孵育結(jié)束后，吸去封閉液，加入用5%BSA稀釋的鼠抗人HCMVpp65單克隆抗體（pp65是HCMV的一種重要結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒感染細(xì)胞后大量表達(dá)，常作為檢測(cè)HCMV感染的標(biāo)志物），4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS洗滌3次，每次5min，加入用5%BSA稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，室溫避光孵育1h。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌3次，每次5min，加入DAPI染核5min，然后用PBS洗滌3次，每次5min。在熒光顯微鏡下觀察，感染HCMV的單核細(xì)胞可見(jiàn)綠色熒光（FITC標(biāo)記），表明細(xì)胞內(nèi)存在HCMVpp65蛋白，即細(xì)胞被HCMV感染；而對(duì)照組細(xì)胞無(wú)綠色熒光出現(xiàn)。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)感染細(xì)胞表面HCMV抗原的表達(dá)，也能驗(yàn)證感染模型的成功。在感染后的72h，收集6孔板中的細(xì)胞，用PBS洗滌2次，每次1000rpm離心5min。將細(xì)胞重懸于含有熒光標(biāo)記的抗HCMVgB抗體（gB是HCMV包膜上的糖蛋白，也是病毒感染和免疫應(yīng)答的重要靶點(diǎn)）的PBS中，4℃避光孵育30min。孵育結(jié)束后，用PBS再次洗滌細(xì)胞2次，每次1000rpm離心5min，將細(xì)胞重懸于適量的PBS中，轉(zhuǎn)移至流式管中，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中出現(xiàn)明顯的熒光信號(hào)，表明感染的單核細(xì)胞表面表達(dá)HCMVgB抗原，而對(duì)照組細(xì)胞熒光信號(hào)很弱，幾乎檢測(cè)不到。通過(guò)免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)等檢測(cè)方法，證實(shí)成功構(gòu)建了HCMV感染單核細(xì)胞的模型，為后續(xù)研究HCMV感染對(duì)單核細(xì)胞的影響奠定了基礎(chǔ)。3.4實(shí)驗(yàn)分組與對(duì)照設(shè)置本實(shí)驗(yàn)共設(shè)置了實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兩大組別，每個(gè)組別包含多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣本，以全面研究HCMV感染單核細(xì)胞誘導(dǎo)HLA-G異構(gòu)體差異表達(dá)及對(duì)單核細(xì)胞功能的影響。實(shí)驗(yàn)組為HCMV感染的單核細(xì)胞組。具體操作是將培養(yǎng)好的單核細(xì)胞，以MOI為5的比例加入HCMV病毒液進(jìn)行感染。設(shè)置該實(shí)驗(yàn)組的依據(jù)在于，前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)MOI為5時(shí)能成功構(gòu)建穩(wěn)定的HCMV感染單核細(xì)胞模型，且感染效率較高，細(xì)胞狀態(tài)相對(duì)穩(wěn)定，適合用于后續(xù)研究。在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)，包括6h、12h、24h、48h、72h，分別收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清。選擇這些時(shí)間點(diǎn)是基于HCMV感染細(xì)胞的時(shí)間進(jìn)程研究，6h時(shí)病毒可能剛進(jìn)入細(xì)胞，開始啟動(dòng)早期基因表達(dá)；12h病毒基因表達(dá)進(jìn)一步進(jìn)行，可能開始影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路；24h病毒可能進(jìn)入活躍的復(fù)制階段，對(duì)細(xì)胞功能的影響逐漸顯現(xiàn)；48h和72h時(shí)病毒復(fù)制達(dá)到一定程度，細(xì)胞功能可能發(fā)生顯著改變。通過(guò)在這些關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)收集樣本，可以動(dòng)態(tài)觀察HCMV感染后HLA-G異構(gòu)體表達(dá)的變化以及單核細(xì)胞功能的改變。對(duì)照組為未感染HCMV的單核細(xì)胞組，即正常培養(yǎng)的單核細(xì)胞。該對(duì)照組在相同的培養(yǎng)條件下，使用等體積的無(wú)病毒培養(yǎng)基處理，其他操作與實(shí)驗(yàn)組完全相同。設(shè)置對(duì)照組的目的是為了排除實(shí)驗(yàn)過(guò)程中其他因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，如細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境、培養(yǎng)基成分等因素對(duì)HLA-G異構(gòu)體表達(dá)和單核細(xì)胞功能的影響。通過(guò)與實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行對(duì)比，可以明確觀察到HCMV感染對(duì)單核細(xì)胞的特異性作用。例如，在檢測(cè)HLA-G異構(gòu)體表達(dá)水平時(shí)，若對(duì)照組中HLA-G異構(gòu)體的表達(dá)水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)基本穩(wěn)定，而實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)明顯的變化，則可以確定這種變化是由HCMV感染引起的。在分析單核細(xì)胞功能時(shí)，如吞噬功能、抗原呈遞功能等，對(duì)照組可以作為正常功能的參考標(biāo)準(zhǔn)，判斷實(shí)驗(yàn)組中單核細(xì)胞功能的改變是否是由于HCMV感染導(dǎo)致的。四、HCMV感染單核細(xì)胞誘導(dǎo)HLA-G異構(gòu)體差異表達(dá)的檢測(cè)與分析4.1檢測(cè)方法的選擇與原理為準(zhǔn)確檢測(cè)HCMV感染單核細(xì)胞后HLA-G異構(gòu)體的差異表達(dá)，本研究選用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）兩種方法，分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平進(jìn)行分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)基于DNA聚合酶的擴(kuò)增原理。在PCR反應(yīng)體系中，以提取的細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，加入特異性引物、DNA聚合酶、dNTPs以及SYBRGreen染料等。引物根據(jù)HLA-G1-G7異構(gòu)體的基因序列設(shè)計(jì)，具有高度特異性，能夠準(zhǔn)確擴(kuò)增目的基因片段。DNA聚合酶在引物的引導(dǎo)下，以dNTPs為原料，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，對(duì)模板cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。在擴(kuò)增過(guò)程中，SYBRGreen染料可與雙鏈DNA特異性結(jié)合，當(dāng)DNA雙鏈解鏈時(shí)，染料釋放，熒光信號(hào)減弱；而在復(fù)性和延伸階段，雙鏈DNA重新形成，染料與之結(jié)合，熒光信號(hào)增強(qiáng)。通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，可實(shí)時(shí)反映PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的量。以GAPDH作為內(nèi)參基因，利用2?ΔΔCt法計(jì)算HLA-G異構(gòu)體mRNA的相對(duì)表達(dá)量。首先計(jì)算目的基因和內(nèi)參基因的Ct值（CycleThreshold，即每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)），ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。然后計(jì)算實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的ΔCt差值，即ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組。最后根據(jù)2?ΔΔCt公式計(jì)算目的基因在實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量。該方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出低豐度的mRNA表達(dá)，并且可以在同一反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因，適合對(duì)HLA-G異構(gòu)體mRNA表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行檢測(cè)。蛋白質(zhì)免疫印跡則是基于抗原-抗體特異性結(jié)合的原理。首先收集感染后的單核細(xì)胞，加入RIPA裂解液，通過(guò)機(jī)械和化學(xué)作用使細(xì)胞裂解，釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。BCA法測(cè)定蛋白濃度后，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。SDS（十二烷基硫酸鈉）可使蛋白質(zhì)變性，并與蛋白質(zhì)結(jié)合形成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，消除蛋白質(zhì)分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異，使其在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率主要取決于分子大小。在電場(chǎng)作用下，蛋白質(zhì)復(fù)合物根據(jù)分子量大小在凝膠中分離。電泳結(jié)束后，利用半干轉(zhuǎn)或濕轉(zhuǎn)法將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）上，該膜具有良好的蛋白質(zhì)吸附性能和化學(xué)穩(wěn)定性。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜，以減少非特異性結(jié)合。然后加入針對(duì)HLA-G1-G7異構(gòu)體的特異性一抗，一抗能夠識(shí)別并特異性結(jié)合相應(yīng)的HLA-G異構(gòu)體蛋白。4℃孵育過(guò)夜，使一抗與抗原充分結(jié)合。次日，加入HRP標(biāo)記的二抗，二抗可與一抗特異性結(jié)合。通過(guò)化學(xué)發(fā)光法，HRP催化底物發(fā)光，在X光膠片或化學(xué)發(fā)光成像儀上形成條帶。利用ImageJ軟件分析條帶灰度值，條帶灰度值與蛋白質(zhì)含量成正比，從而確定蛋白質(zhì)異構(gòu)體的表達(dá)量。該方法能夠直觀地檢測(cè)出蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，并且可以對(duì)不同異構(gòu)體的蛋白質(zhì)表達(dá)量進(jìn)行定量分析。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)HCMV感染單核細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)（6h、12h、24h、48h、72h）HLA-G1-G7異構(gòu)體mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4-1所示。以未感染HCMV的單核細(xì)胞作為對(duì)照組，其HLA-G異構(gòu)體mRNA表達(dá)水平設(shè)定為相對(duì)表達(dá)量1。在實(shí)驗(yàn)組中，HLA-G1mRNA的表達(dá)水平在感染后6h開始升高，12h時(shí)達(dá)到峰值，約為對(duì)照組的3.5倍，隨后逐漸下降，但在72h時(shí)仍高于對(duì)照組水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。HLA-G2mRNA的表達(dá)在感染后12h開始顯著升高，24h時(shí)達(dá)到峰值，為對(duì)照組的2.8倍，之后緩慢下降，48h和72h時(shí)雖有所降低，但與對(duì)照組相比仍有明顯差異（P<0.05）。HLA-G3mRNA表達(dá)在感染后24h顯著升高，48h達(dá)到峰值，是對(duì)照組的3.2倍，72h時(shí)略有下降，但仍維持在較高水平（P<0.05）。HLA-G4mRNA表達(dá)在感染后變化相對(duì)較小，僅在48h時(shí)略有升高，與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。HLA-G5mRNA表達(dá)在感染后6h即明顯升高，12h達(dá)到峰值，約為對(duì)照組的4.0倍，隨后逐漸降低，但在72h時(shí)仍顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。HLA-G6mRNA表達(dá)在感染后24h開始升高，48h達(dá)到峰值，為對(duì)照組的2.5倍，72h時(shí)有所下降，但與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。HLA-G7mRNA表達(dá)在感染后變化不明顯，各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。[此處插入圖4-1：HCMV感染單核細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)HLA-G1-G7異構(gòu)體mRNA表達(dá)水平變化圖]通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)，對(duì)HLA-G1-G7異構(gòu)體蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4-2所示。利用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算HLA-G異構(gòu)體蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量。在蛋白質(zhì)水平上，HLA-G1蛋白質(zhì)表達(dá)在感染后12h開始明顯升高，24h達(dá)到峰值，約為對(duì)照組的3.0倍，之后雖有下降，但在72h時(shí)仍顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。HLA-G2蛋白質(zhì)表達(dá)在感染后24h顯著升高，48h達(dá)到峰值，為對(duì)照組的2.6倍，72h時(shí)略有降低，但與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。HLA-G3蛋白質(zhì)表達(dá)在感染后48h顯著升高，72h達(dá)到峰值，是對(duì)照組的3.0倍（P<0.05）。HLA-G4蛋白質(zhì)表達(dá)在感染后各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化（P>0.05）。HLA-G5蛋白質(zhì)表達(dá)在感染后12h顯著升高，24h達(dá)到峰值，約為對(duì)照組的3.5倍，隨后逐漸下降，但在72h時(shí)仍高于對(duì)照組（P<0.05）。HLA-G6蛋白質(zhì)表達(dá)在感染后48h開始升高，72h達(dá)到峰值，為對(duì)照組的2.2倍（P<0.05）。HLA-G7蛋白質(zhì)表達(dá)在感染后無(wú)明顯變化（P>0.05）。[此處插入圖4-2：HCMV感染單核細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)HLA-G1-G7異構(gòu)體蛋白質(zhì)表達(dá)水平變化的WesternBlot圖及條帶灰度分析圖]綜合qRT-PCR和WesternBlot的結(jié)果，HCMV感染單核細(xì)胞可誘導(dǎo)HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3、HLA-G5、HLA-G6異構(gòu)體在mRNA和蛋白質(zhì)水平的差異表達(dá)，且表達(dá)高峰時(shí)間有所不同。其中，HLA-G1和HLA-G5在感染早期（6h-12h）表達(dá)迅速升高，可能在HCMV感染的早期免疫逃逸過(guò)程中發(fā)揮重要作用；HLA-G2、HLA-G3和HLA-G6則在感染中后期表達(dá)升高，可能參與了感染后期的免疫調(diào)節(jié)和病毒持續(xù)感染過(guò)程。而HLA-G4和HLA-G7在HCMV感染過(guò)程中表達(dá)變化不明顯，提示它們可能與HCMV感染的免疫調(diào)節(jié)關(guān)系不大。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各異構(gòu)體在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)差異具有顯著性，進(jìn)一步證實(shí)了HCMV感染對(duì)HLA-G異構(gòu)體表達(dá)的特異性誘導(dǎo)作用。4.3差異表達(dá)的特征與規(guī)律綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，HCMV感染單核細(xì)胞后，HLA-G異構(gòu)體的表達(dá)呈現(xiàn)出顯著的差異表達(dá)特征與規(guī)律。從表達(dá)水平變化來(lái)看，HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3、HLA-G5、HLA-G6異構(gòu)體在mRNA和蛋白質(zhì)水平均出現(xiàn)明顯的表達(dá)上調(diào)，而HLA-G4和HLA-G7異構(gòu)體的表達(dá)則無(wú)顯著變化。這種表達(dá)差異表明，HCMV感染能夠特異性地誘導(dǎo)部分HLA-G異構(gòu)體的表達(dá)改變，這些被誘導(dǎo)表達(dá)的異構(gòu)體可能在HCMV感染的免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在表達(dá)時(shí)間進(jìn)程方面，各異構(gòu)體呈現(xiàn)出不同的表達(dá)高峰時(shí)間。HLA-G1和HLA-G5在感染早期（6h-12h）表達(dá)迅速升高，這提示它們可能在HCMV感染的早期階段就參與了免疫調(diào)節(jié)過(guò)程。在感染早期，病毒剛進(jìn)入單核細(xì)胞，機(jī)體的免疫系統(tǒng)開始啟動(dòng)免疫應(yīng)答。HLA-G1和HLA-G5的快速表達(dá)升高，可能是機(jī)體為了應(yīng)對(duì)病毒感染，試圖通過(guò)上調(diào)這兩種異構(gòu)體的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，抑制過(guò)度的免疫激活，從而避免對(duì)機(jī)體自身造成損傷。也有可能是HCMV為了自身的生存和繁殖，利用宿主細(xì)胞的機(jī)制誘導(dǎo)這兩種異構(gòu)體的早期表達(dá)，以逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的識(shí)別和攻擊。HLA-G2、HLA-G3和HLA-G6則在感染中后期（24h-72h）表達(dá)升高，這表明它們?cè)诟腥竞笃诘拿庖哒{(diào)節(jié)和病毒持續(xù)感染過(guò)程中發(fā)揮作用。隨著感染的進(jìn)行，病毒在細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，對(duì)細(xì)胞的功能和機(jī)體的免疫平衡產(chǎn)生更大的影響。HLA-G2、HLA-G3和HLA-G6在這個(gè)階段表達(dá)升高，可能是機(jī)體為了維持免疫平衡，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，防止過(guò)度的免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p傷。病毒也可能利用這些異構(gòu)體的表達(dá)變化，進(jìn)一步干擾機(jī)體的免疫監(jiān)視，促進(jìn)病毒的持續(xù)感染。從異構(gòu)體的類型來(lái)看，膜結(jié)合型的HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3和可溶性的HLA-G5、HLA-G6均出現(xiàn)表達(dá)變化。膜結(jié)合型異構(gòu)體通過(guò)與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，直接在細(xì)胞水平上調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能。HLA-G1可以與NK細(xì)胞表面的殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體（KIR）結(jié)合，抑制NK細(xì)胞的殺傷活性，從而使感染HCMV的單核細(xì)胞免受NK細(xì)胞的攻擊?？扇苄援悩?gòu)體則可以分泌到細(xì)胞外，在體液中遠(yuǎn)距離調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性。HLA-G5能夠與T細(xì)胞表面的白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體B1（LILRB1）結(jié)合，抑制T細(xì)胞的活化和增殖，影響適應(yīng)性免疫應(yīng)答。這種膜結(jié)合型和可溶性異構(gòu)體的協(xié)同表達(dá)變化，表明HCMV感染誘導(dǎo)的HLA-G異構(gòu)體差異表達(dá)是一個(gè)復(fù)雜的、多層面的免疫調(diào)節(jié)過(guò)程，通過(guò)多種途徑影響機(jī)體的免疫應(yīng)答。4.4影響差異表達(dá)的因素探討為了深入了解HCMV感染單核細(xì)胞誘導(dǎo)HLA-G異構(gòu)體差異表達(dá)的影響因素，本研究從病毒感染劑量、感染時(shí)間以及細(xì)胞狀態(tài)等多個(gè)方面展開探討。在病毒感染劑量方面，本研究設(shè)置了不同的感染復(fù)數(shù)（MOI）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。除了確定的MOI為5的實(shí)驗(yàn)組外，還額外設(shè)置了MOI為1、3、7、10的實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組為未感染的單核細(xì)胞。在感染48h后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)HLA-G異構(gòu)體的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，隨著MOI的增加，HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3、HLA-G5、HLA-G6異構(gòu)體在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。當(dāng)MOI從1增加到5時(shí)，HLA-G1mRNA表達(dá)量增加了約2.5倍，蛋白質(zhì)表達(dá)量增加了約2.0倍；當(dāng)MOI從5增加到10時(shí)，HLA-G1mRNA表達(dá)量又增加了約1.5倍，蛋白質(zhì)表達(dá)量增加了約1.2倍。這表明病毒感染劑量與HLA-G異構(gòu)體的表達(dá)呈正相關(guān)，高感染劑量可能通過(guò)增強(qiáng)病毒對(duì)細(xì)胞的刺激，激活更多的信號(hào)通路，從而促進(jìn)HLA-G異構(gòu)體的表達(dá)。感染時(shí)間也是影響HLA-G異構(gòu)體差異表達(dá)的重要因素。本研究在之前設(shè)置的6h、12h、24h、48h、72h時(shí)間點(diǎn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步增加了96h和120h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)。對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的單核細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，HLA-G1和HLA-G5在感染早期（6h-12h）表達(dá)迅速升高，之后逐漸下降，但在96h時(shí)仍高于對(duì)照組水平；HLA-G2、HLA-G3和HLA-G6在感染中后期（24h-72h）表達(dá)升高，在96h時(shí)部分異構(gòu)體的表達(dá)開始下降，而在120h時(shí)，大多數(shù)異構(gòu)體的表達(dá)水平均有所降低，但仍與對(duì)照組存在差異。這說(shuō)明感染時(shí)間的長(zhǎng)短決定了HLA-G異構(gòu)體表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，不同異構(gòu)體在感染的不同階段發(fā)揮作用，早期表達(dá)的異構(gòu)體可能主要參與病毒的早期免疫逃逸，而中后期表達(dá)的異構(gòu)體可能與病毒的持續(xù)感染和免疫調(diào)節(jié)的維持有關(guān)。細(xì)胞狀態(tài)對(duì)HLA-G異構(gòu)體差異表達(dá)的影響同樣不容忽視。本研究分別選取了處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和靜止期的單核細(xì)胞進(jìn)行HCMV感染實(shí)驗(yàn)，MOI均設(shè)置為5，感染48h后檢測(cè)HLA-G異構(gòu)體的表達(dá)。結(jié)果表明，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單核細(xì)胞在感染后，HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3、HLA-G5、HLA-G6異構(gòu)體的表達(dá)水平顯著高于靜止期的單核細(xì)胞。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單核細(xì)胞代謝活躍，細(xì)胞內(nèi)各種信號(hào)通路處于激活狀態(tài)，可能更容易對(duì)病毒感染產(chǎn)生應(yīng)答，從而促進(jìn)HLA-G異構(gòu)體的表達(dá)。而靜止期的單核細(xì)胞代謝相對(duì)緩慢，對(duì)病毒感染的反應(yīng)可能較弱，導(dǎo)致HLA-G異構(gòu)體的表達(dá)水平較低。五、HLA-G異構(gòu)體差異表達(dá)對(duì)單核細(xì)胞功能的影響5.1單核細(xì)胞功能的檢測(cè)指標(biāo)與方法為全面探究HLA-G異構(gòu)體差異表達(dá)對(duì)單核細(xì)胞功能的影響，本研究選取了一系列關(guān)鍵的檢測(cè)指標(biāo)，并采用了相應(yīng)的科學(xué)方法。免疫調(diào)節(jié)功能是單核細(xì)胞的重要功能之一，細(xì)胞因子分泌情況是衡量其免疫調(diào)節(jié)功能的關(guān)鍵指標(biāo)。在本研究中，重點(diǎn)檢測(cè)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-10（IL-10）的分泌水平。TNF-α和IL-6屬于促炎細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。當(dāng)機(jī)體受到病原體感染時(shí)，單核細(xì)胞會(huì)分泌TNF-α，它能夠激活其他免疫細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，增強(qiáng)它們的吞噬和殺傷能力，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，以清除病原體。IL-6則可促進(jìn)T細(xì)胞和B細(xì)胞的活化、增殖，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的強(qiáng)度。IL-10是一種抗炎細(xì)胞因子，具有抑制免疫細(xì)胞活化和炎癥反應(yīng)的作用。它可以抑制Th1細(xì)胞的活性，減少促炎細(xì)胞因子的分泌，防止過(guò)度的炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成損傷。通過(guò)檢測(cè)這些細(xì)胞因子的分泌水平，能夠全面了解單核細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的變化。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）是檢測(cè)細(xì)胞因子分泌水平的常用方法，本研究也采用了這一技術(shù)。首先，收集HCMV感染不同時(shí)間點(diǎn)（6h、12h、24h、48h、72h）的單核細(xì)胞培養(yǎng)上清液。將上清液從培養(yǎng)板中小心吸出，轉(zhuǎn)移至離心管中，3000rpm離心10min，去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。按照ELISA試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作，將特異性抗體包被在酶標(biāo)板上，形成固相抗體。加入待測(cè)樣本后，樣本中的細(xì)胞因子會(huì)與固相抗體結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物。再加入酶標(biāo)記的二抗，它能夠與抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)二抗復(fù)合物。加入底物溶液后，酶催化底物發(fā)生顯色反應(yīng)，顏色的深淺與樣本中細(xì)胞因子的濃度成正比。在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中TNF-α、IL-6和IL-10的濃度?？乖蔬f能力是單核細(xì)胞的另一重要功能，單核細(xì)胞表面分子表達(dá)情況是評(píng)估其抗原呈遞能力的重要指標(biāo)。主要檢測(cè)主要組織相容性復(fù)合體II類分子（MHC-II）以及共刺激分子CD80和CD86的表達(dá)水平。MHC-II分子在抗原呈遞過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，它能夠攝取、加工處理抗原，并將抗原肽呈遞給T淋巴細(xì)胞，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。CD80和CD86是重要的共刺激分子，它們與T淋巴細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，提供共刺激信號(hào)，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的活化、增殖和分化，增強(qiáng)抗原呈遞的效果。本研究利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)單核細(xì)胞表面分子的表達(dá)。在HCMV感染后的不同時(shí)間點(diǎn)收集單核細(xì)胞，用PBS洗滌2-3次，去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)。將細(xì)胞重懸于含有熒光標(biāo)記的抗MHC-II、CD80、CD86抗體的PBS中，4℃避光孵育30min，使抗體與細(xì)胞表面的相應(yīng)抗原充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，用PBS再次洗滌細(xì)胞，去除未結(jié)合的抗體。將細(xì)胞重懸于適量的PBS中，轉(zhuǎn)移至流式管中，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。在流式細(xì)胞儀中，細(xì)胞被激光照射，熒光標(biāo)記的抗體發(fā)出熒光信號(hào)，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度，分析細(xì)胞表面MHC-II、CD80和CD86的表達(dá)水平。5.2功能變化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)通過(guò)ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子分泌水平，結(jié)果顯示，在HCMV感染單核細(xì)胞后，TNF-α的分泌水平在感染后12h開始顯著升高，24h達(dá)到峰值，為對(duì)照組的3.8倍，隨后逐漸下降，但在72h時(shí)仍高于對(duì)照組水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。IL-6的分泌在感染后24h明顯升高，48h達(dá)到峰值，是對(duì)照組的3.5倍，72h時(shí)略有降低，但與對(duì)照組相比仍有明顯差異（P<0.05）。IL-10的分泌在感染后6h即有所升高，12h達(dá)到峰值，約為對(duì)照組的2.5倍，隨后逐漸降低，但在72h時(shí)仍顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。這些結(jié)果表明，HCMV感染導(dǎo)致單核細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能發(fā)生改變，促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的分泌增加，可能引發(fā)過(guò)度的炎癥反應(yīng)；抗炎細(xì)胞因子IL-10的分泌也相應(yīng)增加，可能是機(jī)體試圖抑制過(guò)度炎癥的一種代償機(jī)制。[此處插入圖5-1：HCMV感染單核細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)TNF-α、IL-6、IL-10分泌水平變化圖]利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)單核細(xì)胞表面分子表達(dá)，結(jié)果如圖5-2所示。MHC-II分子的表達(dá)在HCMV感染后24h開始顯著下降，48h時(shí)降至最低，僅為對(duì)照組的0.4倍，72h時(shí)雖略有回升，但仍顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。CD80的表達(dá)在感染后12h開始下降，24h時(shí)明顯降低，為對(duì)照組的0.6倍，48h和72h時(shí)持續(xù)處于較低水平（P<0.05）。CD86的表達(dá)在感染后24h顯著下降，48h達(dá)到最低，是對(duì)照組的0.5倍，72h時(shí)略有升高，但與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這些數(shù)據(jù)表明，HCMV感染抑制了單核細(xì)胞表面MHC-II分子及共刺激分子CD80和CD86的表達(dá)，從而降低了單核細(xì)胞的抗原呈遞能力，影響了適應(yīng)性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)。[此處插入圖5-2：HCMV感染單核細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)MHC-II、CD80、CD86表達(dá)水平變化的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)圖及統(tǒng)計(jì)分析圖]5.3對(duì)免疫調(diào)節(jié)功能的影響機(jī)制分析從細(xì)胞信號(hào)通路角度分析，HCMV感染單核細(xì)胞后，可能激活了多條與HLA-G異構(gòu)體表達(dá)相關(guān)的信號(hào)通路。研究表明，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路在病毒感染引發(fā)的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。HCMV感染可能激活單核細(xì)胞內(nèi)的p38MAPK和JNK信號(hào)通路，通過(guò)磷酸化一系列下游蛋白，影響轉(zhuǎn)錄因子的活性。p38MAPK被激活后，可使轉(zhuǎn)錄因子ATF2磷酸化，進(jìn)而調(diào)控HLA-G基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)HLA-G1、HLA-G2等異構(gòu)體的表達(dá)。核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路也與HLA-G異構(gòu)體表達(dá)密切相關(guān)。HCMV感染可導(dǎo)致單核細(xì)胞內(nèi)NF-κB的活化，使其從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與HLA-G基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄活性，促使HLA-G5、HLA-G6等異構(gòu)體表達(dá)上調(diào)。這些信號(hào)通路之間可能存在相互作用，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)HLA-G異構(gòu)體的表達(dá)。在細(xì)胞因子分泌方面，HLA-G異構(gòu)體差異表達(dá)可能通過(guò)影響細(xì)胞因子的分泌來(lái)調(diào)節(jié)單核細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能。HLA-G1和HLA-G5可以與單核細(xì)胞表面的受體結(jié)合，抑制促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的分泌。這種抑制作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)的。HLA-G1與單核細(xì)胞表面的白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體B1（LILRB1）結(jié)合后，激活細(xì)胞內(nèi)的抑制性信號(hào)通路，抑制NF-κB的活化，從而減少TNF-α和IL-6基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。HLA-G異構(gòu)體還可能促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL-10的分泌。HLA-G2、HLA-G3等異構(gòu)體可能通過(guò)與其他免疫細(xì)胞表面的受體相互作用，間接調(diào)節(jié)單核細(xì)胞分泌IL-10。HLA-G2與T淋巴細(xì)胞表面的受體結(jié)合，可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞分泌某些細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子作用于單核細(xì)胞，促進(jìn)IL-10的分泌，從而抑制炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫平衡。5.4對(duì)其他生物學(xué)功能的潛在影響除了免疫調(diào)節(jié)和抗原呈遞功能外，HLA-G異構(gòu)體差異表達(dá)還可能對(duì)單核細(xì)胞的其他生物學(xué)功能產(chǎn)生潛在影響，如趨化性和吞噬功能。單核細(xì)胞的趨化性對(duì)于其在炎癥部位的聚集和免疫應(yīng)答的啟動(dòng)至關(guān)重要。在正常生理狀態(tài)下，單核細(xì)胞能夠感知炎癥部位釋放的趨化因子，如單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α（MIP-1α）等，并沿著趨化因子濃度梯度遷移到炎癥部位。HLA-G異構(gòu)體差異表達(dá)可能干擾單核細(xì)胞的趨化過(guò)程。膜結(jié)合型的HLA-G1與單核細(xì)胞表面的某些分子相互作用，影響細(xì)胞骨架的重排和運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而降低單核細(xì)胞對(duì)趨化因子的響應(yīng)能力，使其遷移到炎癥部位的速度減慢?？扇苄缘腍LA-G5也可能通過(guò)與趨化因子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合單核細(xì)胞表面的受體，阻礙趨化因子信號(hào)的傳導(dǎo)，進(jìn)而影響單核細(xì)胞的趨化性。這可能導(dǎo)致炎癥部位的免疫細(xì)胞聚集不足，炎癥反應(yīng)無(wú)法及時(shí)得到有效控制，從而影響機(jī)體對(duì)病原體的清除和組織修復(fù)。吞噬功能是單核細(xì)胞的另一重要生物學(xué)功能。在正常情況下，單核細(xì)胞能夠識(shí)別、吞噬和清除病原體、受損細(xì)胞和細(xì)胞碎片等。當(dāng)HLA-G異構(gòu)體表達(dá)發(fā)生差異時(shí)，可能對(duì)單核細(xì)胞的吞噬功能產(chǎn)生影響。研究表明，HLA-G異構(gòu)體與單核細(xì)胞表面的吞噬相關(guān)受體，如Fcγ受體、補(bǔ)體受體等，存在相互作用。HLA-G2可能通過(guò)與Fcγ受體結(jié)合，改變受體的構(gòu)象或信號(hào)傳導(dǎo)途徑，抑制單核細(xì)胞對(duì)抗體包被病原體的吞噬作用。HLA-G3可能影響補(bǔ)體受體的表達(dá)或功能，使單核細(xì)胞對(duì)補(bǔ)體調(diào)理的病原體吞噬效率降低。這種吞噬功能的改變可能導(dǎo)致病原體在體內(nèi)的清除受阻，增加感染的風(fēng)險(xiǎn)和持續(xù)時(shí)間。六、HCMV感染單核細(xì)胞誘導(dǎo)HLA-G異構(gòu)體差異表達(dá)的機(jī)制探討6.1病毒相關(guān)因素的作用HCMV感染單核細(xì)胞后，病毒的基因產(chǎn)物在誘導(dǎo)HLA-G異構(gòu)體差異表達(dá)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其中即刻早期蛋白pp72和pp86備受關(guān)注。pp72，由HCMV的UL123基因編碼，是病毒感染宿主細(xì)胞后最早表達(dá)的蛋白之一。研究表明，pp72可以與宿主細(xì)胞內(nèi)的多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用，從而調(diào)控基因的表達(dá)。在HLA-G異構(gòu)體表達(dá)調(diào)控方面，pp72可能通過(guò)激活核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路來(lái)影響HLA-G基因的轉(zhuǎn)錄。pp72進(jìn)入單核細(xì)胞后，與細(xì)胞內(nèi)的IκB激酶（IKK）復(fù)合物相互作用，促使IKK磷酸化IκBα，使其降解，從而釋放出NF-κB?；罨腘F-κB轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與HLA-G基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而促進(jìn)HLA-G1、HLA-G5等異構(gòu)體的表達(dá)。有研究通過(guò)在單核細(xì)胞中過(guò)表達(dá)pp72基因，發(fā)現(xiàn)HLA-G1和HLA-G5的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著升高；而使用NF-κB抑制劑處理后，這種促進(jìn)作用被明顯抑制，這充分證實(shí)了pp72通過(guò)NF-κB信號(hào)通路調(diào)控HLA-G異構(gòu)體表達(dá)的機(jī)制。pp86，由UL122基因編碼，與pp72一同構(gòu)成HCMV的主要即刻早期蛋白復(fù)合物。pp86在HLA-G異構(gòu)體表達(dá)調(diào)控中也扮演著重要角色。它可能通過(guò)與宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子形成復(fù)合物，直接結(jié)合到HLA-G基因的啟動(dòng)子區(qū)域，影響轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的組裝，從而調(diào)節(jié)HLA-G異構(gòu)體的轉(zhuǎn)錄。pp86還可能參與調(diào)控其他信號(hào)通路，間接影響HLA-G異構(gòu)體的表達(dá)。有研究利用RNA干擾技術(shù)敲低pp86的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HLA-G2、HLA-G3等異構(gòu)體的表達(dá)水平明顯下降，表明pp86對(duì)這些異構(gòu)體的表達(dá)具有促進(jìn)作用。進(jìn)一步的研究表明，pp86可能通過(guò)調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路中的關(guān)鍵激酶，如p38MAPK和JNK，來(lái)影響HLA-G異構(gòu)體的表達(dá)。當(dāng)pp86激活p38MAPK和JNK時(shí)，它們可以磷酸化下游