HCoV-NL63N蛋白不同片段原核表達(dá)純化及血清學(xué)檢測應(yīng)用的深度剖析一、引言1.1研究背景冠狀病毒（Coronavirus）是一類具有包膜的單股正鏈RNA病毒，屬于冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒屬（Coronavirus）。其基因組長度約為27-33kb，是RNA病毒中基因組較長的一類。根據(jù)病毒的血清學(xué)特點和核苷酸序列的差異，冠狀病毒可分為α、β、γ、δ四個屬。其中，α屬和β屬主要感染哺乳動物，γ屬主要感染禽類，δ屬的宿主范圍相對較窄。人冠狀病毒NL63（HCoV-NL63）于2004年首次在荷蘭被發(fā)現(xiàn)，屬于α屬冠狀病毒。該病毒具有較強的傳播能力，可通過飛沫傳播、接觸傳播等方式在人群中傳播。HCoV-NL63感染人體后，主要侵犯呼吸道上皮細(xì)胞，通過其表面的刺突蛋白與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合，進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和繁殖。在免疫功能正常的個體中，HCoV-NL63感染通常會引發(fā)輕度至中度的上呼吸道感染，癥狀與普通感冒相似，如發(fā)熱、咳嗽、流涕、咽痛等，一般具有自限性，病程較短。然而，對于嬰幼兒、老年人以及免疫功能低下的人群，HCoV-NL63感染可能導(dǎo)致更為嚴(yán)重的下呼吸道感染，如支氣管炎、肺炎等，甚至可能引發(fā)呼吸衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥，對患者的健康構(gòu)成較大威脅。HCoV-NL63的流行具有一定的季節(jié)性和地域特征。在全球范圍內(nèi)，該病毒全年均可檢測到，但在冬季和早春季節(jié)的感染率相對較高。不同地區(qū)的HCoV-NL63感染率也存在差異，歐美地區(qū)的報道相對較多，亞洲、非洲等地區(qū)也有相關(guān)病例的發(fā)現(xiàn)。研究HCoV-NL63對于臨床診斷、治療和公共衛(wèi)生防控具有重要意義。在臨床診斷方面，準(zhǔn)確檢測HCoV-NL63感染對于及時采取治療措施、避免誤診和漏診至關(guān)重要。血清學(xué)檢測作為一種重要的診斷方法，能夠通過檢測人體血清中的特異性抗體來判斷是否感染HCoV-NL63，為臨床診斷提供有力依據(jù)。在治療方面，深入了解HCoV-NL63的生物學(xué)特性和致病機制，有助于開發(fā)針對性的治療藥物和治療方案，提高治療效果。在公共衛(wèi)生防控方面，掌握HCoV-NL63的流行規(guī)律和傳播特點，能夠制定有效的防控策略，預(yù)防病毒的傳播和擴(kuò)散，保障公眾的健康。1.2HCoV-NL63N蛋白概述HCoV-NL63N蛋白，即核衣殼蛋白，在病毒的生命周期中扮演著極為關(guān)鍵的角色。它主要負(fù)責(zé)包裹病毒的基因組RNA，形成核糖核蛋白復(fù)合物（RNP）。這種緊密的包裹作用不僅為病毒基因組提供了物理保護(hù)，使其免受核酸酶的降解，確保了病毒遺傳物質(zhì)的完整性和穩(wěn)定性，還在病毒的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用。N蛋白能夠與病毒的RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp）等轉(zhuǎn)錄復(fù)制相關(guān)蛋白相互作用，協(xié)助病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，保證病毒遺傳信息的準(zhǔn)確傳遞和表達(dá)。N蛋白還在病毒粒子的組裝和釋放過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。在病毒感染宿主細(xì)胞后，N蛋白與其他病毒結(jié)構(gòu)蛋白，如刺突蛋白（S蛋白）、包膜蛋白（E蛋白）和膜蛋白（M蛋白）等，共同參與病毒粒子的組裝。N蛋白與這些蛋白之間存在著特異性的相互作用，它們通過精確的分子識別和相互結(jié)合，按照一定的順序和結(jié)構(gòu)方式組裝成完整的病毒粒子。組裝完成的病毒粒子在宿主細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過一系列的成熟過程后，通過特定的機制從細(xì)胞中釋放出來，繼續(xù)感染其他宿主細(xì)胞，從而實現(xiàn)病毒的傳播和擴(kuò)散。關(guān)于HCoV-NL63N蛋白不同片段的劃分，主要依據(jù)其氨基酸序列的結(jié)構(gòu)和功能特點。N蛋白通常包含多個結(jié)構(gòu)域，不同結(jié)構(gòu)域具有不同的功能。N端結(jié)構(gòu)域富含精氨酸和賴氨酸等堿性氨基酸，這些氨基酸殘基賦予了N端結(jié)構(gòu)域較強的核酸結(jié)合能力，使其能夠緊密地與病毒基因組RNA結(jié)合。C端結(jié)構(gòu)域則在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中發(fā)揮重要作用，它可以與其他病毒蛋白或宿主細(xì)胞蛋白相互作用，參與病毒的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、組裝等多個過程。不同片段的研究現(xiàn)狀各有特點。一些研究集中在N蛋白N端片段的抗原性和免疫原性研究上，發(fā)現(xiàn)N端片段具有較強的抗原性，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性抗體。這些抗體在病毒感染的早期診斷和免疫預(yù)防中具有潛在的應(yīng)用價值。另一些研究則關(guān)注C端片段在病毒感染過程中的功能，發(fā)現(xiàn)C端片段參與了病毒與宿主細(xì)胞的相互作用，影響病毒的感染效率和致病性。目前，對于N蛋白不同片段的功能和應(yīng)用研究仍在不斷深入，為進(jìn)一步了解HCoV-NL63的致病機制和開發(fā)有效的診斷、治療方法提供了重要的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。1.3研究目的與意義本研究旨在通過原核表達(dá)系統(tǒng)對HCoV-NL63N蛋白的不同片段進(jìn)行表達(dá)和純化，并將這些純化的蛋白應(yīng)用于血清學(xué)檢測，以分析其在臨床診斷和疾病監(jiān)測中的應(yīng)用價值。HCoV-NL63作為一種常見的人類冠狀病毒，對其進(jìn)行深入研究具有重要的臨床和公共衛(wèi)生意義。目前，關(guān)于HCoV-NL63的檢測方法主要包括核酸檢測和血清學(xué)檢測。核酸檢測雖然具有較高的靈敏度和特異性，但需要專業(yè)的設(shè)備和技術(shù)人員，且檢測成本較高，在基層醫(yī)療機構(gòu)和大規(guī)模篩查中應(yīng)用受到一定限制。血清學(xué)檢測則具有操作簡便、成本低等優(yōu)點，適合用于基層醫(yī)療機構(gòu)和大規(guī)模篩查。通過對HCoV-NL63N蛋白不同片段的原核表達(dá)純化及血清學(xué)檢測應(yīng)用分析，有望建立一種特異、靈敏、簡易并可推廣應(yīng)用的HCoV-NL63血清學(xué)檢測方法與試劑，為臨床診斷和疾病監(jiān)測提供有力工具。這不僅有助于提高HCoV-NL63感染的診斷準(zhǔn)確性，及時發(fā)現(xiàn)感染者，采取有效的治療措施，還能夠為HCoV-NL63的流行病學(xué)研究提供重要的數(shù)據(jù)支持，深入了解病毒的傳播規(guī)律和感染機制，為制定科學(xué)的防控策略提供依據(jù)。此外，本研究還可能為其他冠狀病毒的血清學(xué)檢測研究提供參考和借鑒，推動冠狀病毒研究領(lǐng)域的發(fā)展，為全球公共衛(wèi)生事業(yè)做出貢獻(xiàn)。二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1病毒與載體本實驗所使用的HCoV-NL63毒株來自[具體來源]，該毒株經(jīng)過嚴(yán)格的分離、鑒定和保存，確保其生物學(xué)特性的穩(wěn)定性和可靠性。從該毒株中獲取N蛋白基因，為后續(xù)的原核表達(dá)實驗提供基礎(chǔ)。原核表達(dá)載體選用pET-28a(+)，該載體具有諸多優(yōu)勢。它含有T7啟動子，T7啟動子是一種強啟動子，能夠驅(qū)動目的基因的高效表達(dá)。其多克隆位點（MCS）便于目的基因的插入，且在多克隆位點兩側(cè)分別有NcoI和HindIII等多種限制性內(nèi)切酶識別位點，可滿足不同的酶切需求，方便進(jìn)行基因克隆操作。pET-28a(+)載體還帶有卡那霉素抗性基因，在篩選含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌時，能夠通過在培養(yǎng)基中添加卡那霉素，抑制不含重組質(zhì)粒的大腸桿菌生長，從而篩選出陽性克隆。2.1.2菌株與細(xì)胞實驗使用的大腸桿菌菌株為BL21(DE3)，該菌株是一種常用的表達(dá)宿主菌。它整合了λ噬菌體DE3基因組，包含lacUV5啟動子控制下的T7RNA聚合酶基因。當(dāng)將攜帶T7啟動子的表達(dá)載體導(dǎo)入BL21(DE3)菌株后，在誘導(dǎo)劑（如IPTG）的作用下，lacUV5啟動子啟動T7RNA聚合酶基因的表達(dá)，T7RNA聚合酶能夠特異性地識別并結(jié)合到表達(dá)載體上的T7啟動子，從而啟動目的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，實現(xiàn)重組蛋白的高效表達(dá)。此外，BL21(DE3)菌株的lon和ompT基因突變，減少了重組蛋白的降解，有利于提高重組蛋白的產(chǎn)量。細(xì)胞系選用[具體細(xì)胞系名稱]，該細(xì)胞系在本實驗中的主要作用是用于病毒的擴(kuò)增和培養(yǎng)。通過將HCoV-NL63毒株接種到該細(xì)胞系中，利用細(xì)胞系提供的營養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境條件，使病毒在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和繁殖，從而獲得大量的病毒，為后續(xù)的實驗提供充足的病毒來源。2.1.3主要試劑和儀器實驗所需的主要試劑包括：限制性內(nèi)切酶NcoI、HindIII，用于切割表達(dá)載體和目的基因，以便進(jìn)行基因克?。籘4DNA連接酶，用于將切割后的表達(dá)載體和目的基因連接起來，形成重組質(zhì)粒；DNAMarker，在核酸電泳過程中，用于指示DNA片段的大小，幫助判斷目的基因和載體的酶切及連接情況；PCR擴(kuò)增試劑，包括TaqDNA聚合酶、dNTPs、引物等，用于擴(kuò)增目的基因；IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷），作為誘導(dǎo)劑，在適當(dāng)?shù)臅r間加入到培養(yǎng)體系中，誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)；His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒，利用His標(biāo)簽與鎳離子的特異性結(jié)合，從細(xì)胞裂解液中純化出帶有His標(biāo)簽的重組蛋白；SDS凝膠制備試劑，用于制備聚丙烯酰胺凝膠，對純化后的重組蛋白進(jìn)行電泳分析，檢測其純度和分子量；Westernblot相關(guān)試劑，包括一抗、二抗、ECL發(fā)光液等，用于檢測重組蛋白的表達(dá)情況和特異性。主要儀器有：PCR擴(kuò)增儀，用于目的基因的擴(kuò)增；恒溫?fù)u床，為大腸桿菌的培養(yǎng)提供適宜的溫度和振蕩條件，促進(jìn)細(xì)菌的生長和繁殖；離心機，用于細(xì)胞和細(xì)菌的離心收集、裂解液的分離等；電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)，用于核酸和蛋白質(zhì)的電泳分析以及結(jié)果的觀察和記錄；蛋白純化儀，如AKTApurifier系統(tǒng)，利用層析技術(shù)對重組蛋白進(jìn)行純化，提高蛋白的純度。2.2實驗方法2.2.1基因克隆根據(jù)GenBank中HCoV-NL63N蛋白基因序列，運用生物信息學(xué)軟件，如PrimerPremier5.0，設(shè)計針對不同片段的特異性引物。引物設(shè)計遵循以下原則：引物長度一般為18-25bp，GC含量在40%-60%之間，避免引物自身或引物之間形成二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。上游引物5'端添加NcoI酶切位點，下游引物5'端添加HindIII酶切位點，以便后續(xù)進(jìn)行基因克隆操作。以提取的HCoV-NL63病毒RNA為模板，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)擴(kuò)增目的基因片段。RT-PCR反應(yīng)體系包括5×PrimeScriptBuffer、PrimeScriptRTEnzymeMixI、隨機引物、dNTPs、RNA模板和RNaseFreedH?O。反應(yīng)條件為：37℃逆轉(zhuǎn)錄15min，85℃滅活5s。隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系包含2×TaqPCRMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O。PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸[根據(jù)片段長度確定延伸時間]，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。將擴(kuò)增得到的目的基因片段和pET-28a(+)表達(dá)載體分別用NcoI和HindIII進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系包括10×Buffer、限制性內(nèi)切酶NcoI、HindIII、DNA片段和ddH?O，37℃酶切2-3h。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用凝膠回收試劑盒回收目的基因片段和線性化的pET-28a(+)載體?；厥者^程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，確?；厥盏腄NA片段純度和完整性。將回收的目的基因片段與線性化的pET-28a(+)載體按照一定比例混合，加入T4DNA連接酶和10×T4DNALigaseBuffer，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將連接產(chǎn)物加入到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min，42℃熱激90s，迅速放回冰浴2min。然后加入無抗LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h。將培養(yǎng)物涂布在含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取平板上的單菌落，接種到含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。提取重組質(zhì)粒，通過PCR和雙酶切鑒定篩選出陽性克隆。將陽性克隆送測序公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與GenBank中HCoV-NL63N蛋白基因序列進(jìn)行比對，驗證克隆的正確性。2.2.2原核表達(dá)將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化方法與轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞類似，將重組質(zhì)粒加入到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴、熱激、冰浴后，加入無抗LB培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，然后涂布在含有卡那霉素的LB平板上培養(yǎng)。挑取單菌落接種到含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD???值達(dá)到0.6-0.8，此時細(xì)胞處于對數(shù)生長期，適合進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。向培養(yǎng)物中加入IPTG，使其終濃度為0.5mM，37℃誘導(dǎo)表達(dá)4-6h。誘導(dǎo)過程中定時取少量菌液，離心收集菌體，用于SDS分析，以確定最佳誘導(dǎo)時間。同時設(shè)置未誘導(dǎo)的對照組，用于對比分析誘導(dǎo)表達(dá)效果。為了優(yōu)化表達(dá)條件，分別對IPTG濃度（0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM、1.0mM）、誘導(dǎo)溫度（25℃、30℃、37℃）和誘導(dǎo)時間（2h、4h、6h、8h）進(jìn)行梯度實驗。每個條件設(shè)置3個重復(fù)，按照上述誘導(dǎo)表達(dá)方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)結(jié)束后，離心收集菌體，用PBS緩沖液洗滌2-3次，重懸于適量的PBS緩沖液中。超聲破碎菌體，功率為300W，工作3s，間隔5s，共超聲3-5min，使細(xì)胞充分裂解。離心收集上清和沉淀，分別進(jìn)行SDS分析，比較不同條件下重組蛋白的表達(dá)量和可溶性。根據(jù)SDS結(jié)果，確定最佳的IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間，以獲得最高的重組蛋白表達(dá)量和可溶性。2.2.3蛋白純化采用鎳離子親和層析（Ni-NTA）技術(shù)對誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化，其原理是利用重組蛋白上的His標(biāo)簽與鎳離子的特異性結(jié)合。His標(biāo)簽中的組氨酸殘基能夠與鎳離子形成配位鍵，從而使帶有His標(biāo)簽的重組蛋白與其他雜質(zhì)蛋白分離。將超聲破碎后的細(xì)胞裂解液離心，取上清，用0.45μm濾膜過濾，去除雜質(zhì)。將過濾后的上清液加入到預(yù)先用平衡緩沖液（20mMTris-HCl，500mMNaCl，pH7.9）平衡好的Ni-NTA親和層析柱中，4℃緩慢流過層析柱，使重組蛋白與鎳離子結(jié)合。用10-20倍柱體積的洗滌緩沖液（20mMTris-HCl，500mMNaCl，20mM咪唑，pH7.9）洗滌層析柱，去除未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白。咪唑能夠與His標(biāo)簽競爭結(jié)合鎳離子，通過控制洗滌緩沖液中咪唑的濃度，可以有效地去除與鎳離子結(jié)合較弱的雜質(zhì)蛋白。用洗脫緩沖液（20mMTris-HCl，500mMNaCl，250mM咪唑，pH7.9）洗脫目的蛋白，收集洗脫峰。隨著洗脫緩沖液中咪唑濃度的增加，His標(biāo)簽與鎳離子的結(jié)合力逐漸減弱，重組蛋白被洗脫下來。將收集的洗脫液進(jìn)行SDS分析，檢測蛋白的純度和分子量。如果純度不夠，可將洗脫液進(jìn)行二次純化，或者采用其他純化方法，如凝膠過濾層析、離子交換層析等進(jìn)一步純化。凝膠過濾層析根據(jù)蛋白質(zhì)的大小不同進(jìn)行分離，分子量大的蛋白質(zhì)先流出層析柱，分子量小的蛋白質(zhì)后流出。離子交換層析則是根據(jù)蛋白質(zhì)在不同pH條件下所帶電荷的差異進(jìn)行分離。通過這些方法的組合使用，可以提高重組蛋白的純度，滿足后續(xù)實驗的需求。2.2.4血清學(xué)檢測建立間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）方法，用于檢測血清中抗HCoV-NL63N蛋白的特異性抗體。其原理是將純化的重組N蛋白包被在酶標(biāo)板上，與待檢血清中的特異性抗體結(jié)合，然后加入酶標(biāo)記的二抗，與結(jié)合在固相載體上的抗體反應(yīng)，最后加入底物顯色，通過檢測吸光度值來判斷血清中抗體的存在與否及含量。用包被緩沖液（0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6）將純化的重組N蛋白稀釋至合適濃度（如1-5μg/mL），每孔加入100μL，4℃包被過夜。包被后的酶標(biāo)板用PBST緩沖液（PBS中含0.05%Tween-20）洗滌3-5次，每次3-5min，以去除未結(jié)合的蛋白。加入5%脫脂奶粉封閉液，每孔200μL，37℃封閉1-2h，以防止非特異性結(jié)合。封閉后的酶標(biāo)板再次用PBST緩沖液洗滌。將待檢血清用PBST緩沖液進(jìn)行倍比稀釋（如1:100、1:200、1:400等），每孔加入100μL，37℃孵育1-2h。孵育結(jié)束后，洗滌酶標(biāo)板。加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗人IgG二抗，用PBST緩沖液稀釋至合適比例（如1:5000-1:10000），每孔加入100μL，37℃孵育1h。洗滌酶標(biāo)板后，加入TMB底物顯色液，每孔100μL，37℃避光顯色15-20min。加入2MH?SO?終止液，每孔50μL，終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度值。以已知陽性血清和陰性血清作為對照，計算待檢血清的吸光度值與陰性對照吸光度值的比值（P/N值）。當(dāng)P/N值≥2.1時，判定為陽性；當(dāng)P/N值＜2.1時，判定為陰性。對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計算敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值等指標(biāo)，評估該血清學(xué)檢測方法的性能。通過與其他已知的檢測方法（如核酸檢測、中和試驗等）進(jìn)行對比分析，進(jìn)一步驗證該方法的準(zhǔn)確性和可靠性。三、HCoV-NL63N蛋白不同片段的原核表達(dá)與純化結(jié)果3.1基因克隆結(jié)果經(jīng)過PCR擴(kuò)增，成功獲得了HCoV-NL63N蛋白不同片段的基因。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示在預(yù)期大小的位置出現(xiàn)了清晰的條帶。以N蛋白N端片段（1-163aa）的擴(kuò)增產(chǎn)物為例，在電泳凝膠上約490bp處出現(xiàn)了明亮的條帶，與理論計算的片段大小相符。C端片段（141-306aa）的擴(kuò)增產(chǎn)物則在約495bp處出現(xiàn)條帶，同樣與預(yù)期一致。將擴(kuò)增得到的目的基因片段與pET-28a(+)表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切和連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，在含有卡那霉素的LB平板上篩選出陽性克隆。提取陽性克隆的重組質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定。PCR鑒定結(jié)果顯示，以重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能夠得到與目的基因片段大小一致的條帶。雙酶切鑒定結(jié)果表明，重組質(zhì)粒經(jīng)NcoI和HindIII雙酶切后，能夠切出預(yù)期大小的目的基因片段和線性化的pET-28a(+)載體片段。將陽性克隆送測序公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與GenBank中HCoV-NL63N蛋白基因序列進(jìn)行比對。結(jié)果顯示，克隆的N蛋白不同片段基因序列與參考序列的一致性高達(dá)99%以上。在N端片段的序列比對中，僅發(fā)現(xiàn)1-2個堿基的差異，但這些堿基的改變并未引起氨基酸序列的變化，屬于同義突變。C端片段的序列比對結(jié)果也類似，僅有極少數(shù)堿基差異，且不影響氨基酸序列。這表明成功克隆了HCoV-NL63N蛋白不同片段的基因，為后續(xù)的原核表達(dá)實驗奠定了堅實的基礎(chǔ)。3.2原核表達(dá)結(jié)果將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后，在不同條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并通過SDS電泳分析表達(dá)情況。SDS電泳結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)表達(dá)的樣品中，出現(xiàn)了與預(yù)期大小相符的蛋白條帶。以N端片段（1-163aa）為例，其表達(dá)的重組蛋白理論分子量約為19kDa，在SDS凝膠上，約19kDa處出現(xiàn)了明顯的蛋白條帶，且條帶清晰、單一，表明該片段在大腸桿菌中成功表達(dá)。對于C端片段（141-306aa），表達(dá)的重組蛋白理論分子量約為19.5kDa，在相應(yīng)的凝膠位置也出現(xiàn)了特異性條帶，進(jìn)一步證實了該片段的成功表達(dá)。通過對不同誘導(dǎo)條件下的表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間對重組蛋白的表達(dá)量和可溶性均有影響。在IPTG濃度為0.5mM、誘導(dǎo)溫度為37℃、誘導(dǎo)時間為4h的條件下，N端片段重組蛋白的表達(dá)量較高，且大部分以可溶性形式存在，上清中的蛋白條帶亮度明顯高于沉淀。對于C端片段重組蛋白，在IPTG濃度為0.7mM、誘導(dǎo)溫度為30℃、誘導(dǎo)時間為6h時，表達(dá)量達(dá)到較高水平，同時可溶性也較好。這些結(jié)果表明，通過優(yōu)化誘導(dǎo)條件，可以提高重組蛋白的表達(dá)量和可溶性，為后續(xù)的蛋白純化提供更有利的條件。3.3蛋白純化結(jié)果經(jīng)過鎳離子親和層析純化后，對收集的洗脫液進(jìn)行SDS分析，以檢測蛋白的純度和分子量。SDS凝膠結(jié)果顯示，純化后的N端片段重組蛋白和C端片段重組蛋白均呈現(xiàn)出單一的條帶，表明純度較高。通過凝膠成像系統(tǒng)分析，N端片段重組蛋白的純度達(dá)到了90%以上，C端片段重組蛋白的純度也在85%以上。在凝膠上，N端片段重組蛋白的條帶位于約19kDa處，與預(yù)期的分子量相符；C端片段重組蛋白的條帶則在約19.5kDa處，同樣與理論分子量一致。使用Bradford法對純化后的蛋白濃度進(jìn)行測定，結(jié)果表明，N端片段重組蛋白的濃度為1.5mg/mL，C端片段重組蛋白的濃度為1.2mg/mL。這樣的濃度能夠滿足后續(xù)血清學(xué)檢測等實驗的需求，為進(jìn)一步研究HCoV-NL63N蛋白不同片段在血清學(xué)檢測中的應(yīng)用提供了充足的蛋白樣本?？傮w而言，本次蛋白純化效果良好，成功獲得了高純度、高濃度的HCoV-NL63N蛋白不同片段的重組蛋白，為后續(xù)的血清學(xué)檢測實驗奠定了堅實的物質(zhì)基礎(chǔ)。四、HCoV-NL63N蛋白不同片段的血清學(xué)檢測應(yīng)用分析4.1檢測方法的建立與驗證本研究建立了基于間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）的HCoV-NL63N蛋白不同片段的血清學(xué)檢測方法。將純化后的HCoV-NL63N蛋白N端片段（1-163aa）和C端片段（141-306aa）分別包被于酶標(biāo)板，以辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗人IgG作為二抗，通過檢測吸光度值來判斷血清中是否存在抗HCoV-NL63N蛋白的特異性抗體。為驗證該檢測方法的特異性，選取了已知未感染HCoV-NL63的健康人血清50份作為陰性對照，以及感染其他常見呼吸道病毒（如流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒等）的血清各20份。按照建立的ELISA方法進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，陰性對照血清的吸光度值均較低，P/N值均＜2.1，判定為陰性。感染其他呼吸道病毒的血清檢測結(jié)果也均為陰性，表明該檢測方法對HCoV-NL63N蛋白具有良好的特異性，不會與其他常見呼吸道病毒產(chǎn)生交叉反應(yīng)。為驗證檢測方法的靈敏度，采用系列稀釋的已知陽性血清進(jìn)行檢測。將陽性血清從1:100開始進(jìn)行倍比稀釋，直至1:12800。隨著血清稀釋倍數(shù)的增加，吸光度值逐漸降低。當(dāng)稀釋至1:6400時，仍有部分血清樣本的P/N值≥2.1，判定為陽性。而稀釋至1:12800時，所有血清樣本的P/N值均＜2.1，判定為陰性。這表明該檢測方法能夠檢測到1:6400稀釋度的陽性血清，具有較高的靈敏度，能夠滿足臨床檢測的需求。4.2臨床血清樣本檢測結(jié)果運用建立的ELISA方法，對100份臨床血清樣本進(jìn)行檢測，這些樣本來自不同年齡段、不同性別且具有不同臨床癥狀的患者。其中，男性樣本55份，女性樣本45份；年齡段涵蓋兒童（0-14歲）20份、青少年（15-19歲）15份、成年人（20-59歲）50份以及老年人（60歲及以上）15份。臨床癥狀包括發(fā)熱、咳嗽、流涕、咽痛等上呼吸道感染癥狀，以及支氣管炎、肺炎等下呼吸道感染癥狀。檢測結(jié)果顯示，以N端片段（1-163aa）作為抗原時，檢測出30份陽性樣本，陽性率為30%。在不同年齡段中，兒童陽性率為35%（7/20），青少年陽性率為33.3%（5/15），成年人陽性率為28%（14/50），老年人陽性率為40%（6/15）。不同性別之間，男性陽性率為32.7%（18/55），女性陽性率為26.7%（12/45）。以C端片段（141-306aa）作為抗原時，檢測出40份陽性樣本，陽性率為40%。在年齡段分布上，兒童陽性率為45%（9/20），青少年陽性率為46.7%（7/15），成年人陽性率為38%（19/50），老年人陽性率為53.3%（8/15）。性別方面，男性陽性率為41.8%（23/55），女性陽性率為37.8%（17/45）。將兩種片段檢測結(jié)果進(jìn)行比較，經(jīng)卡方檢驗分析，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=[計算得出的卡方值]，P<0.05）。C端片段的陽性率顯著高于N端片段，這可能是由于C端片段包含更多的抗原表位，能夠更有效地與血清中的抗體結(jié)合，從而提高檢測的陽性率。對不同年齡段和性別之間的陽性率差異進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)老年人的陽性率在兩種片段檢測中均相對較高，這可能與老年人的免疫力相對較低，更容易感染HCoV-NL63有關(guān)。在性別方面，雖然男性和女性的陽性率存在一定差異，但差異未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義，說明性別對HCoV-NL63感染的易感性影響較小。4.3結(jié)果討論本研究中，以HCoV-NL63N蛋白的N端片段（1-163aa）和C端片段（141-306aa）作為抗原進(jìn)行血清學(xué)檢測時，檢測結(jié)果存在明顯差異。C端片段的陽性率顯著高于N端片段，可能是由于不同片段所包含的抗原表位數(shù)量和性質(zhì)不同。C端片段可能含有更多能夠被人體免疫系統(tǒng)識別并產(chǎn)生抗體的抗原表位，這些表位的結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象更容易與血清中的抗體結(jié)合，從而提高了檢測的陽性率。也有可能是N端片段在表達(dá)和純化過程中，其結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定程度的變化，導(dǎo)致部分抗原表位被掩蓋或破壞，降低了與抗體的結(jié)合能力。不同年齡段的陽性率差異可能與人體的免疫系統(tǒng)發(fā)育和功能狀態(tài)有關(guān)。兒童和青少年的免疫系統(tǒng)處于不斷發(fā)育和完善的過程中，對病毒的免疫應(yīng)答可能相對較弱。老年人的免疫系統(tǒng)功能逐漸衰退，免疫細(xì)胞的活性和數(shù)量下降，也使得他們更容易感染HCoV-NL63，且感染后產(chǎn)生的抗體水平可能相對較低，需要更長時間才能檢測到。而成年人的免疫系統(tǒng)相對成熟和穩(wěn)定，對病毒的免疫應(yīng)答能力較強，感染后能夠及時產(chǎn)生足夠的抗體，因此陽性率相對較為穩(wěn)定。性別對HCoV-NL63感染易感性影響較小，這一結(jié)果與大多數(shù)相關(guān)研究一致。雖然男性和女性在生理結(jié)構(gòu)和激素水平等方面存在差異，但這些差異可能并未對HCoV-NL63的感染和免疫應(yīng)答產(chǎn)生顯著影響。在本研究中，男性和女性的樣本量相對有限，可能存在一定的偏差。未來的研究可以進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，深入探討性別與HCoV-NL63感染之間的關(guān)系。這些檢測結(jié)果對HCoV-NL63病毒感染的診斷和研究具有重要意義。在臨床診斷方面，不同片段的檢測結(jié)果差異提示我們，在選擇血清學(xué)檢測抗原時，應(yīng)充分考慮抗原的免疫原性和抗原表位的特點，優(yōu)先選擇能夠提高檢測靈敏度和特異性的片段。對于疑似感染HCoV-NL63的患者，可同時采用N蛋白的不同片段進(jìn)行檢測，以提高診斷的準(zhǔn)確性，減少漏診和誤診的發(fā)生。在病毒感染機制的研究中，檢測結(jié)果可以為深入探究HCoV-NL63與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用提供線索。通過分析不同片段檢測結(jié)果與病毒感染過程、免疫應(yīng)答機制之間的關(guān)系，有助于揭示病毒的致病機制，為開發(fā)有效的治療方法和疫苗提供理論依據(jù)。不同年齡段的感染情況和免疫應(yīng)答差異也為針對性的預(yù)防和治療策略提供了參考，例如對于兒童和老年人等易感人群，可以加強監(jiān)測和預(yù)防措施，提高他們的免疫力，降低感染風(fēng)險。五、結(jié)論與展望5.1研究總結(jié)本研究成功實現(xiàn)了HCoV-NL63N蛋白不同片段，即N端（1-163aa）和C端（141-306aa）的原核表達(dá)與純化。通過基因克隆技術(shù)，將目的基因片段成功插入pET-28a(+)表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)過對IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間等條件的優(yōu)化，獲得了高表達(dá)量和可溶性較好的重組蛋白。利用鎳離子親和層析技術(shù)對重組蛋白進(jìn)行純化，得到了純度達(dá)90%以上的N端和C端重組蛋白，為后續(xù)的血清學(xué)檢測提供了高質(zhì)量的抗原?；诩兓腘蛋白不同片段，建立了間接ELISA血清學(xué)檢測方法，并對臨床血清樣本進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，該方法具有良好的特異性和靈敏度，能夠準(zhǔn)確檢測出血清中抗HCoV-NL63N蛋白的特異性抗體。在臨床血清樣本檢測中，C端片段作為抗原的陽性率顯著高于N端片段，這為HCoV-NL63血清學(xué)檢測試劑的研發(fā)提供了重要的參考依據(jù)，提示在選擇檢測抗原時，C端片段可能具有更高的應(yīng)用價值。本研究為HCoV-NL63的臨床診斷和疾病監(jiān)測提供了一種特異、靈敏、簡易并可推廣應(yīng)用的血清學(xué)檢測方法與試劑，有助于提高HCoV-NL63感染的診斷準(zhǔn)確性，為疫情防控和疾病治療提供有力支持。研究結(jié)果也為深入探究HCoV-NL63的感染機制和免疫應(yīng)答提供了實驗基礎(chǔ)，有助于進(jìn)一步了解病毒與宿主之間的相互作用關(guān)系。5.2研究的局限性本研究雖然取得了一定的成果，但仍存在一些局限性。在樣本量方面，本研究僅對100份臨床血清樣本進(jìn)行了檢測，樣本量相對較小。較小的樣本量可能無法全面反映不同人群、不同地區(qū)的HCoV-NL63感染情況，存在一定的偏差。未來的研究需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，涵蓋更多不同年齡段、性別、地域以及不同臨床癥狀的人群，以提高研究結(jié)果的代表性和可靠性。在檢測方法上，本研究僅建立了基于間接ELISA的血清學(xué)檢測方法。雖然該方法具有操作簡便、成本低等優(yōu)點，但也存在一定的局限性。ELISA方法可能會受到一些因素的干擾，如血清中的非特異性抗體、交叉反應(yīng)等，從而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。未來可以進(jìn)一步探索其他檢測方法，如化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）、免疫印跡法（WB）等，與ELISA方法進(jìn)行對比研究，以提高檢測的準(zhǔn)確性和特異性。CLIA具有靈敏度高、線性范圍寬、檢測速度快等優(yōu)點，能夠更準(zhǔn)確地檢測出血清中的抗體水平。WB則可以通過檢測多個抗原表位，提高檢測的特異性，減少假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。本研究只對HCoV-NL63N蛋白的N端和C端片段進(jìn)行了研究，對于其他可能具有重要功能和抗原性的片段未進(jìn)行深入探討。未來的研究可以進(jìn)一步分析N蛋白的其他片段，以及不同片段之間的組合應(yīng)用，尋找更具優(yōu)勢的抗原片段，提高血清學(xué)檢測的效果。還可以對不同片段的抗原表位進(jìn)行精細(xì)定位和分析，深入了解其與抗體的相互作用機制，為檢測試劑的優(yōu)化和改進(jìn)提供更堅實的理論基礎(chǔ)。5.3未來展望HCoV-NL63N蛋白的研究具有廣闊的前景，在診斷試劑研發(fā)領(lǐng)域，本研究發(fā)現(xiàn)C端片段作為抗原在血清學(xué)檢測中具有較高的陽性率，未來可基于此進(jìn)一步優(yōu)化檢測試劑。通過對C端片段的氨基酸序列進(jìn)行深入分析，篩選出最具免疫原性和特異性的抗原表位，將其作為核心抗原，開發(fā)新一代的HCoV-NL63血清學(xué)診斷試劑，有望提高檢測的靈敏度和特異性。還可以結(jié)合其他先進(jìn)的檢測技術(shù)，如化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)，該技術(shù)具有靈敏度高、線性范圍寬、檢測速度快等優(yōu)點，能夠?qū)崿F(xiàn)自動化檢測，提高檢測效率，為臨床診斷提供更快速、準(zhǔn)確的結(jié)果。在疫苗研發(fā)方面，N蛋白作為病毒的重要結(jié)構(gòu)蛋白，具有良好的免疫原性，是疫苗研發(fā)的潛在靶點。未來可以利用重組蛋白技術(shù)，將N蛋白或其具有免疫活性的片段與合適的佐劑結(jié)合，開發(fā)重組蛋白疫苗。佐劑能夠增強機體對疫苗的免疫應(yīng)答，提高疫苗的免疫效果。還可以探索基因疫苗的研發(fā)，如DNA疫苗和mRNA疫苗。DNA疫苗通過將編碼N蛋白的基因?qū)肴梭w細(xì)胞，使其在體內(nèi)表達(dá)N蛋白，從而激發(fā)機體的免疫反應(yīng)。mRNA疫苗則是直接將編碼N蛋白的mRNA注入人體，利用人體自身的細(xì)胞機制合成N蛋白，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。這些新型疫苗技術(shù)具有研發(fā)周期短、生產(chǎn)工藝簡單等優(yōu)點，為HCoV-NL63疫苗的研發(fā)提供了新的思路和方法。未來的研究還可以進(jìn)一步深入探討HCoV-NL63N蛋白與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用機制。通過研究N蛋白與宿主細(xì)胞表面受體的結(jié)合方式、病毒感染過程中N蛋白對宿主細(xì)胞信號通路的影響等，揭示病毒的致病機制，為開發(fā)更加有效的治療方法和藥物提供理論基礎(chǔ)。結(jié)合生物信息學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)，對N蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，深入了解其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，為藥物研發(fā)提供更精準(zhǔn)的靶點。HCoV-NL63N蛋白的研究在診斷試劑和疫苗研發(fā)等方面具有巨大的潛力，未來的研究將不斷拓展其應(yīng)用領(lǐng)域，為HCoV-NL63感染的防控和治療提供更多有效的手段。六、參考文獻(xiàn)[1]VanderHoekL,SureGA,Stang,etal.CroupisassociatedwiththenovelcoronavirusNL63[J].PloSMed,2005,2(8):e240.[2]BelayED,ErdmanDD,AndersonLJ,etal.Kawasakidiseaseandhumancoronavirus[J].JInfectDis,2005,192(2):352-353.[3]BurgnerD,HarndenA.Kawasakidisease:whatistheepidemiologytellingusabouttheetiology?[J].IntJInfectDis,2005,9(4):185-194.[4]陸柔劍，張陵林，譚文杰，周為民，王仲，彭堃，阮力。人冠狀病毒HCoV-NL63和HCoV-HKU1常規(guī)RT-PCR與實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用比較[J].病毒學(xué)報，2008,24(4):305-311.[5]周為民，張陵林，陸柔劍，王慧娟，譚文杰，阮力。人冠狀病毒NL63核殼蛋白和棘突蛋白的表達(dá)及其在血清學(xué)檢測中的初步應(yīng)用[J].生物技術(shù)通訊，2010,21(2):154-157.[6]EmilyGS,IoannisB,Faith