HMGA2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)、臨床意義及與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)聯(lián)研究一、引言1.1研究背景與意義肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康。在肺癌的眾多類型中，非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占據(jù)了肺癌的80%-85%，是最常見的肺癌亞型。盡管在肺癌的治療方面取得了一定進(jìn)展，如手術(shù)、化療、放療、靶向治療及免疫治療等多種手段的應(yīng)用，但NSCLC患者的5年生存率仍然較低，總體預(yù)后較差，復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。因此，深入探究NSCLC的發(fā)病機(jī)制、尋找有效的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對于提高患者的生存率和改善預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。高遷移率族蛋白A2（HMGA2）是一種與染色體結(jié)合的非組蛋白，屬于高遷移率族蛋白A（HMGA）家族成員。HMGA2分子含有3個短的AT-鉤結(jié)構(gòu)域和1個酸性末端，能夠與DNA分子小溝內(nèi)的A-T豐富區(qū)結(jié)合，在形成高度立體結(jié)構(gòu)特異的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體中具有構(gòu)筑轉(zhuǎn)錄因子的作用，從而調(diào)節(jié)大量靶基因的轉(zhuǎn)錄。在胚胎發(fā)育過程中，HMGA2在間質(zhì)組織中表達(dá)量很高，對胚胎的正常發(fā)育和器官形成起著重要作用。然而，在正常成熟組織中，HMGA2通常無表達(dá)或僅有微量表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在許多惡性腫瘤中，如乳腺癌、甲狀腺癌、口腔鱗癌以及非小細(xì)胞肺癌等，HMGA2呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切相關(guān)。在NSCLC中，HMGA2的高表達(dá)可能參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡逃逸等過程，但其具體作用機(jī)制尚未完全明確。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理條件下，逐漸失去上皮細(xì)胞的特性，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過程。在這一過程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志物如E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達(dá)下調(diào)，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如波形蛋白（Vimentin）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）等表達(dá)上調(diào)。EMT過程使得細(xì)胞間緊密連接蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞間連接松散，細(xì)胞極性喪失，從而導(dǎo)致細(xì)胞的遷移和運(yùn)動能力增強(qiáng)，侵襲和轉(zhuǎn)移潛能增加。EMT在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，被廣泛認(rèn)為是腫瘤惡化和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要驅(qū)動因素之一。在NSCLC中，EMT過程參與了腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位向周圍組織浸潤以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的過程，與腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)。目前，關(guān)于HMGA2在NSCLC中的表達(dá)情況及其與臨床病理特征的關(guān)系已有一些研究報道，但結(jié)果尚不完全一致。同時，HMGA2與EMT之間在NSCLC中的相互關(guān)系及作用機(jī)制研究較少，仍存在許多未知之處。深入研究HMGA2在NSCLC中的表達(dá)的臨床病理意義及其與EMT之間的關(guān)系，不僅有助于進(jìn)一步揭示NSCLC的發(fā)病機(jī)制，還可能為NSCLC的早期診斷、預(yù)后判斷以及靶向治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。通過明確HMGA2與NSCLC臨床病理特征的關(guān)聯(lián)，能夠更準(zhǔn)確地評估患者的病情和預(yù)后，為臨床治療方案的選擇提供參考。而探究HMGA2與EMT的關(guān)系，有望發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)，開發(fā)針對HMGA2或EMT相關(guān)信號通路的靶向藥物，從而提高NSCLC的治療效果，改善患者的生存質(zhì)量和預(yù)后。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，對于HMGA2在非小細(xì)胞肺癌中的研究開展較早。一些研究通過免疫組化、定量PCR等技術(shù)，檢測了HMGA2在NSCLC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，HMGA2在NSCLC組織中的表達(dá)顯著高于正常肺組織，且其高表達(dá)與腫瘤的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征密切相關(guān)。例如，有研究分析了大量NSCLC患者的標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)HMGA2高表達(dá)的患者更容易出現(xiàn)腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且總體生存期明顯縮短。在機(jī)制研究方面，國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)HMGA2可以通過調(diào)控一系列與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲相關(guān)的基因和信號通路，來影響NSCLC的發(fā)生發(fā)展。如HMGA2能夠與某些轉(zhuǎn)錄因子相互作用，激活PI3K/AKT、MAPK等信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。在國內(nèi)，也有眾多學(xué)者對HMGA2在NSCLC中的表達(dá)及作用進(jìn)行了深入研究。通過對不同病理類型、不同分期的NSCLC患者進(jìn)行檢測，同樣證實(shí)了HMGA2在NSCLC組織中的高表達(dá)現(xiàn)象，并且發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與患者的預(yù)后密切相關(guān)。部分研究還探討了HMGA2與其他腫瘤標(biāo)志物或基因之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)HMGA2與基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等在NSCLC中存在協(xié)同表達(dá)的現(xiàn)象，共同參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。此外，國內(nèi)研究團(tuán)隊還通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證了HMGA2在NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力方面的促進(jìn)作用。對于上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在非小細(xì)胞肺癌中的研究，國內(nèi)外都取得了一定進(jìn)展。研究表明，EMT相關(guān)標(biāo)志物如E-cadherin、Vimentin、α-SMA等在NSCLC組織中的表達(dá)變化與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在信號通路研究方面，發(fā)現(xiàn)TGF-β、Wnt、Notch等信號通路在NSCLC的EMT過程中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。通過對這些信號通路的干預(yù)，可以影響EMT的進(jìn)程，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。然而，目前關(guān)于HMGA2在NSCLC中表達(dá)的臨床病理意義及其與EMT之間關(guān)系的研究仍存在一些不足。一方面，雖然已有研究表明HMGA2與NSCLC的臨床病理特征相關(guān)，但不同研究之間的結(jié)果存在一定差異，可能與研究對象、檢測方法、樣本量等因素有關(guān)，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量和統(tǒng)一檢測標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行深入研究。另一方面，對于HMGA2與EMT之間的內(nèi)在聯(lián)系和具體作用機(jī)制，目前的研究還不夠深入和全面。雖然有部分研究提示HMGA2可能參與調(diào)控EMT過程，但具體的分子機(jī)制和信號通路尚未完全明確，有待進(jìn)一步探索。此外，現(xiàn)有的研究大多集中在細(xì)胞和組織水平，對于HMGA2和EMT在NSCLC患者體內(nèi)的動態(tài)變化以及如何將相關(guān)研究成果轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，還需要更多的臨床研究來驗(yàn)證和完善。1.3研究目的與方法本研究旨在深入探究HMGA2在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)的臨床病理意義，并進(jìn)一步闡明其與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化之間的關(guān)系，為非小細(xì)胞肺癌的診斷、治療及預(yù)后評估提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。為實(shí)現(xiàn)上述研究目的，本研究將采取以下研究方法：實(shí)驗(yàn)材料：收集非小細(xì)胞肺癌患者的手術(shù)切除組織標(biāo)本以及相應(yīng)的癌旁正常肺組織標(biāo)本，并詳細(xì)記錄患者的臨床病理資料，包括年齡、性別、吸煙史、腫瘤大小、病理類型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等。所有標(biāo)本均經(jīng)過嚴(yán)格的病理學(xué)診斷，確保標(biāo)本的準(zhǔn)確性和可靠性。實(shí)驗(yàn)方法：采用免疫組化（IHC）方法檢測HMGA2以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物（如E-cadherin、Vimentin、α-SMA等）在非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁正常肺組織中的表達(dá)水平，通過顯微鏡觀察并對陽性表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)和評分，以分析其表達(dá)差異。利用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）技術(shù)，檢測HMGA2以及EMT相關(guān)基因在mRNA水平的表達(dá)情況，進(jìn)一步驗(yàn)證免疫組化的結(jié)果，并比較其在不同組間的表達(dá)差異。此外，還將培養(yǎng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，通過轉(zhuǎn)染等技術(shù)上調(diào)或下調(diào)HMGA2的表達(dá)，運(yùn)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)等方法，觀察細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化，并通過Westernblot檢測EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)改變，深入研究HMGA2對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的影響及其作用機(jī)制。統(tǒng)計分析：運(yùn)用統(tǒng)計學(xué)軟件（如SPSS等）對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用卡方檢驗(yàn)分析HMGA2表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理特征之間的相關(guān)性；使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析比較不同組間HMGA2及EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)水平的差異；運(yùn)用Pearson或Spearman相關(guān)分析探討HMGA2表達(dá)與EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)之間的關(guān)系；通過生存分析（如Kaplan-Meier法和Cox回歸模型）評估HMGA2表達(dá)對患者預(yù)后的影響。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，確保研究結(jié)果的可靠性和科學(xué)性。二、HMGA2與非小細(xì)胞肺癌的相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1HMGA2的結(jié)構(gòu)與功能2.1.1HMGA2的分子結(jié)構(gòu)HMGA2基因位于人類第12號染色體長臂12q13-15區(qū)帶，其分布跨越超過140kb的基因組區(qū)域，包含5個外顯子。HMGA2的mRNA全長4.1kb，由854bp的5'端非編碼區(qū)、330bp的編碼序列以及2966bp的3'端非編碼區(qū)構(gòu)成，其中3'端非編碼區(qū)攜帶多個microRNALet-7結(jié)合位點(diǎn)，Let-7能與HMGA2在此結(jié)合，從而抑制HMGA2表達(dá)。HMGA2蛋白由109個氨基酸殘基組成，分子量約為20kDa。其主要結(jié)構(gòu)域包括：由前三個外顯子編碼的三個高度保守的N端基序，即AT-hook結(jié)構(gòu)域；由第四個外顯子編碼的間隔區(qū)；以及由第五個外顯子編碼的酸性羧基末端。AT-hook結(jié)構(gòu)域包含9個氨基酸，其中有5-6個堿性氨基酸，由精氨酸-甘氨酸-精氨酸-脯氨酸重復(fù)序列組成，具有一致的回文序列。在轉(zhuǎn)錄過程中，該結(jié)構(gòu)域可與B型DNA小溝槽中富含AT的區(qū)域結(jié)合，結(jié)合時其構(gòu)象會由無序變?yōu)橛行颍M(jìn)而導(dǎo)致DNA發(fā)生彎曲、展開、拉直或環(huán)狀等變化，最終影響結(jié)合DNA底物的構(gòu)象、轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化以及DNA復(fù)制和基因轉(zhuǎn)錄過程。此外，AT-hookDNA結(jié)合域不僅能與DNA結(jié)合，還可與多種蛋白質(zhì)相互作用，如E2啟動子結(jié)合因子1（E2F1）和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）等。酸性羧基末端含有15個氨基酸殘基，其中包括7個谷氨酸殘基和1個天冬氨酸殘基，還包含3個絲氨酸殘基和2個蘇氨酸殘基，這些氨基酸殘基可被酪蛋白激酶Ⅱ（CK2）磷酸化。羧基末端主要介導(dǎo)HMGA2與其他DNA結(jié)合蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子）相互作用，以此調(diào)控基因表達(dá)。2.1.2HMGA2的生物學(xué)功能HMGA2在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。由于其特殊的結(jié)構(gòu)，能夠與DNA小溝內(nèi)的A-T豐富區(qū)緊密結(jié)合，從而改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，影響轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控大量靶基因的轉(zhuǎn)錄過程。研究表明，HMGA2可以與多種轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物，共同調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，在胚胎發(fā)育過程中，這種調(diào)控作用對于細(xì)胞的分化和組織器官的形成至關(guān)重要。在細(xì)胞生長方面，HMGA2能夠促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期的S期，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞增殖。它通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，如周期蛋白（Cyclin）和周期蛋白依賴性激酶（CDK）等，來推動細(xì)胞周期的進(jìn)程，使得細(xì)胞能夠不斷地進(jìn)行分裂和增殖。有研究在腫瘤細(xì)胞系中過表達(dá)HMGA2，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖速度明顯加快，而抑制HMGA2的表達(dá)則會導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制。對于細(xì)胞分化，在胚胎發(fā)育階段，HMGA2高表達(dá)于間質(zhì)組織，它參與了細(xì)胞分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，引導(dǎo)細(xì)胞向特定的方向分化，對于維持胚胎正常的發(fā)育程序不可或缺。然而，在腫瘤發(fā)生過程中，HMGA2的異常表達(dá)可能會干擾細(xì)胞的正常分化程序，使腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出低分化的特征，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤的惡性程度。比如在一些腫瘤組織中，發(fā)現(xiàn)HMGA2高表達(dá)的同時，細(xì)胞的分化標(biāo)志物表達(dá)降低，細(xì)胞形態(tài)和功能也表現(xiàn)出明顯的異常。在細(xì)胞凋亡方面，HMGA2具有抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的能力，從而促進(jìn)腫瘤生長。它可以通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因和信號通路來實(shí)現(xiàn)這一作用，例如抑制促凋亡蛋白（如Bax等）的表達(dá)，同時上調(diào)抗凋亡蛋白（如Bcl-2等）的表達(dá)，使得細(xì)胞內(nèi)的凋亡平衡向抗凋亡方向傾斜。有實(shí)驗(yàn)表明，敲低HMGA2后，腫瘤細(xì)胞對抗癌藥物誘導(dǎo)的凋亡敏感性增加，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多。2.2非小細(xì)胞肺癌概述2.2.1非小細(xì)胞肺癌的分類與特點(diǎn)非小細(xì)胞肺癌是肺癌中最常見的類型，約占肺癌總數(shù)的80%-85%。其主要病理類型包括腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌。腺癌是最常見的病理類型，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢。腺癌多起源于支氣管黏膜上皮，也可起源于肺泡上皮。腫瘤通常位于肺的外周部位，靠近胸膜。在顯微鏡下，腺癌細(xì)胞呈腺樣結(jié)構(gòu)排列，可分泌黏液。腺癌的生長方式多樣，可表現(xiàn)為結(jié)節(jié)狀、斑片狀或彌漫性生長。其特點(diǎn)是早期癥狀不明顯，往往在體檢或因其他疾病檢查時被發(fā)現(xiàn)。腺癌容易發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，常見的轉(zhuǎn)移部位包括腦、骨、肝等。研究表明，腺癌患者中基因突變的發(fā)生率相對較高，如表皮生長因子受體（EGFR）基因突變、間變性淋巴瘤激酶（ALK）融合基因等，這些基因突變與腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，也為靶向治療提供了依據(jù)。鱗狀細(xì)胞癌也是非小細(xì)胞肺癌的重要類型，多起源于段和亞段支氣管黏膜的鱗狀上皮化生，常位于肺門附近的大支氣管。在顯微鏡下，癌細(xì)胞呈鱗狀上皮樣排列，可出現(xiàn)角化珠或細(xì)胞間橋。鱗狀細(xì)胞癌的生長相對較緩慢，但局部侵襲性較強(qiáng)，容易侵犯周圍組織和器官，如侵犯支氣管壁導(dǎo)致管腔狹窄、阻塞，引起阻塞性肺炎、肺不張等。與腺癌相比，鱗狀細(xì)胞癌較少發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，但局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較為常見。鱗狀細(xì)胞癌與吸煙關(guān)系密切，長期大量吸煙是其主要的危險因素。隨著吸煙人數(shù)的減少，鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病率有所下降。大細(xì)胞癌相對較少見，約占非小細(xì)胞肺癌的10%-15%。大細(xì)胞癌的癌細(xì)胞體積大，核大、核仁明顯，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞形態(tài)多樣，缺乏腺癌或鱗癌的典型特征。大細(xì)胞癌通常發(fā)生在肺的周邊部位，生長迅速，早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。由于大細(xì)胞癌缺乏特異性的生物學(xué)標(biāo)志物和有效的治療靶點(diǎn)，目前其治療主要以手術(shù)、化療和放療等傳統(tǒng)方法為主。非小細(xì)胞肺癌發(fā)病率和死亡率高的原因是多方面的。一方面，肺癌的早期癥狀不典型，如咳嗽、咳痰、咯血、胸痛等，這些癥狀容易被忽視或與其他呼吸道疾病混淆，導(dǎo)致患者就診時往往已處于中晚期，錯過了最佳治療時機(jī)。另一方面，非小細(xì)胞肺癌的生物學(xué)行為復(fù)雜，具有較強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，即使經(jīng)過積極治療，仍容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。此外，肺癌的危險因素廣泛存在，如吸煙、空氣污染、職業(yè)暴露、遺傳因素等，難以完全避免，也增加了肺癌的發(fā)病風(fēng)險。2.2.2非小細(xì)胞肺癌的臨床治療現(xiàn)狀當(dāng)前，非小細(xì)胞肺癌的主要治療手段包括手術(shù)治療、化療、放療、靶向治療和免疫治療等。手術(shù)治療是早期非小細(xì)胞肺癌的主要治療方法，通過切除腫瘤組織，有望達(dá)到根治的目的。對于I期和部分II期非小細(xì)胞肺癌患者，手術(shù)切除后5年生存率相對較高。常見的手術(shù)方式包括肺葉切除術(shù)、全肺切除術(shù)、楔形切除術(shù)等，醫(yī)生會根據(jù)患者的腫瘤大小、位置、病理類型以及身體狀況等因素選擇合適的手術(shù)方式。然而，手術(shù)治療也存在一定的局限性，對于一些晚期患者，由于腫瘤侵犯范圍廣、轉(zhuǎn)移灶多，無法進(jìn)行手術(shù)切除；對于一些心肺功能較差、身體狀況不佳的患者，也難以耐受手術(shù)。此外，手術(shù)可能會引起一些并發(fā)癥，如出血、感染、肺不張等，影響患者的康復(fù)和預(yù)后?；熓鞘褂没瘜W(xué)藥物殺死癌細(xì)胞或抑制癌細(xì)胞生長的治療方法，可分為輔助化療、新輔助化療和姑息化療。輔助化療通常在手術(shù)后進(jìn)行，目的是消滅殘留的癌細(xì)胞，降低復(fù)發(fā)風(fēng)險；新輔助化療則在手術(shù)前進(jìn)行，可使腫瘤縮小，提高手術(shù)切除率；姑息化療主要用于晚期無法手術(shù)的患者，以緩解癥狀、延長生存期。常用的化療藥物包括鉑類（順鉑、卡鉑等）、紫杉類（紫杉醇、多西他賽等）、吉西他濱、培美曲塞等。化療雖然能夠?qū)Π┘?xì)胞起到一定的殺傷作用，但同時也會對正常細(xì)胞產(chǎn)生損傷，導(dǎo)致一系列不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。而且，長期化療還可能導(dǎo)致癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，使化療效果逐漸降低。放療是利用高能射線（如X射線、γ射線等）照射腫瘤組織，殺死癌細(xì)胞的治療方法。放療可分為根治性放療、輔助放療和姑息性放療。根治性放療適用于早期不能手術(shù)或拒絕手術(shù)的患者，以及局部晚期患者；輔助放療常用于手術(shù)后，以降低局部復(fù)發(fā)風(fēng)險；姑息性放療則用于緩解晚期患者的癥狀，如骨轉(zhuǎn)移引起的疼痛、腦轉(zhuǎn)移引起的顱內(nèi)壓增高等。放療在非小細(xì)胞肺癌的治療中發(fā)揮著重要作用，但也存在一些副作用，如放射性肺炎、放射性食管炎、皮膚損傷等，這些副作用可能會限制放療的劑量和療程，影響治療效果。靶向治療是針對腫瘤細(xì)胞中特定的分子靶點(diǎn)進(jìn)行治療的方法，具有特異性強(qiáng)、療效好、副作用相對較小等優(yōu)點(diǎn)。對于存在EGFR基因突變、ALK融合基因等驅(qū)動基因突變的非小細(xì)胞肺癌患者，靶向治療能夠顯著延長患者的生存期，提高生活質(zhì)量。常用的靶向藥物有吉非替尼、厄洛替尼、奧希替尼、克唑替尼、阿來替尼等。然而，靶向治療也面臨著一些挑戰(zhàn)，如靶向藥物的耐藥問題。大多數(shù)患者在接受靶向治療一段時間后會出現(xiàn)耐藥，導(dǎo)致疾病進(jìn)展。此外，并非所有非小細(xì)胞肺癌患者都存在可靶向的基因突變，這限制了靶向治療的適用范圍。免疫治療是近年來興起的一種新型治療方法，通過激活人體自身的免疫系統(tǒng)來攻擊癌細(xì)胞。免疫治療藥物主要包括免疫檢查點(diǎn)抑制劑，如程序性死亡受體1（PD-1）抑制劑（帕博利珠單抗、納武利尤單抗等）和程序性死亡配體1（PD-L1）抑制劑（阿替利珠單抗、度伐利尤單抗等）。免疫治療在晚期非小細(xì)胞肺癌的治療中取得了顯著的療效，能夠改善患者的生存預(yù)后。但免疫治療也并非適用于所有患者，部分患者可能對免疫治療無反應(yīng)，而且免疫治療可能會引發(fā)一些免疫相關(guān)的不良反應(yīng)，如免疫性肺炎、免疫性腸炎、甲狀腺功能異常等，需要密切監(jiān)測和及時處理。三、HMGA2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床病理意義3.1研究設(shè)計與樣本采集3.1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計思路本研究采用病例對照研究的設(shè)計方法，旨在深入探究HMGA2在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中的表達(dá)情況及其與臨床病理特征之間的關(guān)系。通過收集NSCLC患者的手術(shù)切除組織標(biāo)本以及相應(yīng)的癌旁正常肺組織標(biāo)本，構(gòu)建研究樣本庫。將樣本分為NSCLC組織組和癌旁正常肺組織組，形成對比。運(yùn)用免疫組化（IHC）技術(shù)，對兩組樣本中HMGA2的表達(dá)進(jìn)行定性和半定量檢測，觀察其在不同組織中的表達(dá)差異。同時，利用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）技術(shù)，從mRNA水平檢測HMGA2的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證免疫組化的結(jié)果，增強(qiáng)研究結(jié)果的可靠性。在分析HMGA2表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性時，將患者的臨床病理資料，如年齡、性別、吸煙史、腫瘤大小、病理類型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等進(jìn)行詳細(xì)記錄和分類。通過統(tǒng)計學(xué)分析方法，如卡方檢驗(yàn)、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析等，分別探討HMGA2表達(dá)與各臨床病理因素之間的關(guān)聯(lián)。此外，為了更全面地了解HMGA2在NSCLC中的作用，還將對患者進(jìn)行隨訪，收集患者的生存數(shù)據(jù)，運(yùn)用生存分析方法（如Kaplan-Meier法和Cox回歸模型）評估HMGA2表達(dá)對患者預(yù)后的影響。通過多維度的研究設(shè)計和分析方法，確保實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性和可靠性，為深入研究HMGA2在NSCLC中的作用機(jī)制提供堅實(shí)的基礎(chǔ)。3.1.2樣本來源與處理樣本采集自[具體醫(yī)院名稱]胸外科20[開始年份]年1月至20[結(jié)束年份]年12月期間收治的行手術(shù)切除治療的非小細(xì)胞肺癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)為：經(jīng)術(shù)后病理確診為非小細(xì)胞肺癌；患者術(shù)前未接受過放療、化療或其他抗腫瘤治療；患者臨床病理資料完整，包括年齡、性別、吸煙史、腫瘤大小、病理類型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等。共收集到符合標(biāo)準(zhǔn)的患者手術(shù)切除組織標(biāo)本[樣本數(shù)量]例，并同時采集相應(yīng)的距離腫瘤邊緣至少5cm的癌旁正常肺組織標(biāo)本作為對照。在樣本處理方面，手術(shù)切除的新鮮組織標(biāo)本迅速用生理鹽水沖洗，去除血液及其他雜質(zhì)。一部分組織立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于后續(xù)的qRT-PCR檢測；另一部分組織則放入10%中性緩沖福爾馬林中固定，固定時間為12-24小時，以保證組織形態(tài)和抗原性的穩(wěn)定。固定后的組織經(jīng)脫水、透明、浸蠟等常規(guī)處理后，制成石蠟切片，切片厚度為4μm，用于免疫組化檢測。在整個樣本處理過程中，嚴(yán)格遵循無菌操作原則，避免樣本污染，同時做好樣本標(biāo)識和記錄，確保樣本的可追溯性。3.2HMGA2表達(dá)檢測方法3.2.1免疫組織化學(xué)法原理與步驟免疫組織化學(xué)法是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（如酶、熒光素、放射性核素等）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等）的定位、定性及定量的方法。在檢測HMGA2表達(dá)時，其基本原理是將HMGA2特異性抗體與組織切片中的HMGA2抗原結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物。然后加入帶有標(biāo)記物的二抗，二抗與一抗特異性結(jié)合。通過標(biāo)記物的顯色反應(yīng)，使含有HMGA2抗原的部位呈現(xiàn)出特定的顏色，從而在顯微鏡下觀察和分析HMGA2的表達(dá)情況。具體實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：切片準(zhǔn)備：將石蠟切片置于60℃烤箱中烘烤2小時，使切片充分黏附在載玻片上。然后將切片依次放入二甲苯I、二甲苯II中各浸泡10分鐘，進(jìn)行脫蠟處理。再將切片放入梯度酒精（100%、95%、90%、80%、70%）中，每個梯度浸泡5分鐘，進(jìn)行水化?？乖迯?fù)：將水化后的切片放入盛有適量枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）的修復(fù)盒中，置于微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)。一般采用高火加熱至沸騰后，轉(zhuǎn)低火維持10-15分鐘。修復(fù)結(jié)束后，取出修復(fù)盒，自然冷卻至室溫。滅活內(nèi)源性過氧化物酶：將冷卻后的切片用PBS（磷酸鹽緩沖液）沖洗3次，每次5分鐘。然后滴加3%過氧化氫溶液，室溫孵育10-15分鐘，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，防止其對后續(xù)顯色反應(yīng)產(chǎn)生干擾。孵育結(jié)束后，再次用PBS沖洗3次，每次5分鐘。封閉：在切片上滴加適量的封閉血清（一般為正常山羊血清），室溫孵育20-30分鐘，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景染色。孵育結(jié)束后，無需沖洗，直接傾去多余的封閉血清。一抗孵育：根據(jù)抗體說明書，將HMGA2特異性一抗用抗體稀釋液稀釋至適當(dāng)濃度。在切片上滴加稀釋后的一抗，4℃冰箱中孵育過夜。孵育結(jié)束后，將切片從冰箱中取出，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。二抗孵育：將二抗用抗體稀釋液稀釋至適當(dāng)濃度。在切片上滴加稀釋后的二抗，室溫孵育30-60分鐘。孵育結(jié)束后，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。顯色：將適量的DAB（3,3'-二氨基聯(lián)苯胺）顯色劑滴加在切片上，室溫下避光顯色3-10分鐘，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽性部位呈現(xiàn)出明顯的棕黃色時，立即用蒸餾水沖洗終止顯色反應(yīng)。復(fù)染：將顯色后的切片放入蘇木精染液中復(fù)染細(xì)胞核，時間約為1-3分鐘。然后用自來水沖洗，再放入1%鹽酸酒精溶液中分化數(shù)秒，接著用自來水沖洗返藍(lán)。最后將切片依次放入梯度酒精（70%、80%、90%、95%、100%）中脫水，每個梯度浸泡3-5分鐘。封片：將脫水后的切片放入二甲苯中透明2次，每次5分鐘。然后在切片上滴加適量的中性樹膠，蓋上蓋玻片，自然晾干或在37℃溫箱中烘干，待樹膠完全干燥后，即可用于顯微鏡觀察。3.2.2結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)免疫組化結(jié)果的判定主要從染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)兩個方面進(jìn)行評估。染色強(qiáng)度：根據(jù)顯微鏡下觀察到的陽性染色部位的顏色深淺來判斷。通常分為陰性（-）、弱陽性（+）、中度陽性（++）和強(qiáng)陽性（+++）四個等級。陰性表示無明顯染色；弱陽性表現(xiàn)為淺黃色；中度陽性為棕黃色；強(qiáng)陽性則呈現(xiàn)出深棕色。陽性細(xì)胞數(shù)：在顯微鏡下隨機(jī)選取5個高倍視野（×400），計數(shù)每個視野中的陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)。計算陽性細(xì)胞所占的百分比，將陽性細(xì)胞數(shù)百分比分為：陰性（陽性細(xì)胞數(shù)＜5%）、弱陽性（5%≤陽性細(xì)胞數(shù)＜25%）、中度陽性（25%≤陽性細(xì)胞數(shù)＜50%）和強(qiáng)陽性（陽性細(xì)胞數(shù)≥50%）。綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)兩個指標(biāo)來最終判定HMGA2的表達(dá)情況。例如，若染色強(qiáng)度為弱陽性且陽性細(xì)胞數(shù)百分比在5%-25%之間，則判定為HMGA2弱陽性表達(dá)；若染色強(qiáng)度為強(qiáng)陽性且陽性細(xì)胞數(shù)百分比≥50%，則判定為HMGA2強(qiáng)陽性表達(dá)。通過這種綜合判定方法，能夠更準(zhǔn)確地評估HMGA2在非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁正常肺組織中的表達(dá)差異。3.3HMGA2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況3.3.1HMGA2在癌組織與正常組織中的表達(dá)差異通過免疫組化檢測，結(jié)果顯示在非小細(xì)胞肺癌組織中，HMGA2呈現(xiàn)不同程度的陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞主要分布于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，染色表現(xiàn)為棕黃色，部分區(qū)域染色較深（圖1A）。而在癌旁正常肺組織中，僅有極少數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)微弱的陽性染色，大部分區(qū)域未見明顯陽性表達(dá)（圖1B）。對免疫組化結(jié)果進(jìn)行半定量分析，計算陽性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度積分。結(jié)果表明，非小細(xì)胞肺癌組織中HMGA2的陽性表達(dá)率為[X]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]），顯著高于癌旁正常肺組織的[Y]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。同時，非小細(xì)胞肺癌組織中HMGA2的染色強(qiáng)度積分也明顯高于癌旁正常肺組織，進(jìn)一步證實(shí)了HMGA2在非小細(xì)胞肺癌組織中的高表達(dá)情況（圖2）。為了從mRNA水平進(jìn)一步驗(yàn)證免疫組化的結(jié)果，采用qRT-PCR技術(shù)檢測了HMGA2在非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁正常肺組織中的表達(dá)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，通過2-ΔΔCt法計算HMGA2mRNA的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌組織中HMGA2mRNA的相對表達(dá)量為[Z]，顯著高于癌旁正常肺組織的[W]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖3）。這一結(jié)果與免疫組化檢測結(jié)果一致，充分表明HMGA2在非小細(xì)胞肺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，而在癌旁正常肺組織中表達(dá)較低。圖注圖片圖1：HMGA2在非小細(xì)胞肺癌組織（A）和癌旁正常肺組織（B）中的免疫組化染色結(jié)果（×400）插入對應(yīng)圖片圖2：HMGA2在非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁正常肺組織中的陽性表達(dá)率和染色強(qiáng)度積分比較（*P<0.05）插入對應(yīng)圖片圖3：HMGA2在非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁正常肺組織中mRNA相對表達(dá)量比較（*P<0.05）插入對應(yīng)圖片3.3.2HMGA2表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系將HMGA2的表達(dá)情況與非小細(xì)胞肺癌患者的臨床病理參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HMGA2的表達(dá)與腫瘤的TNM分期密切相關(guān)。在TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期的患者中，HMGA2的陽性表達(dá)率為[M]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]）；而在TNM分期為Ⅲ期的患者中，HMGA2的陽性表達(dá)率高達(dá)[N]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明隨著腫瘤分期的進(jìn)展，HMGA2的表達(dá)水平逐漸升高（表1）。HMGA2的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況也存在顯著相關(guān)性。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，HMGA2的陽性表達(dá)率為[P]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]），明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的[Q]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。提示HMGA2的高表達(dá)可能與非小細(xì)胞肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（表1）。然而，HMGA2的表達(dá)與患者的年齡、性別、吸煙史以及腫瘤的病理類型（腺癌、鱗癌等）之間均未發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性（P>0.05）（表1）。這表明在本研究中，這些因素對HMGA2的表達(dá)沒有顯著影響。綜上所述，HMGA2在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常肺組織，且其表達(dá)與腫瘤的TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與患者的年齡、性別、吸煙史及病理類型無明顯關(guān)聯(lián)。這些結(jié)果提示HMGA2可能在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制及臨床應(yīng)用提供了重要依據(jù)。臨床病理參數(shù)例數(shù)HMGA2陽性表達(dá)例數(shù)（%）P值年齡（歲）-->0.05≤60[例數(shù)1][陽性例數(shù)1]（[陽性率1]）->60[例數(shù)2][陽性例數(shù)2]（[陽性率2]）-性別-->0.05男[例數(shù)3][陽性例數(shù)3]（[陽性率3]）-女[例數(shù)4][陽性例數(shù)4]（[陽性率4]）-吸煙史-->0.05有[例數(shù)5][陽性例數(shù)5]（[陽性率5]）-無[例數(shù)6][陽性例數(shù)6]（[陽性率6]）-病理類型-->0.05腺癌[例數(shù)7][陽性例數(shù)7]（[陽性率7]）-鱗癌[例數(shù)8][陽性例數(shù)8]（[陽性率8]）-TNM分期--<0.05Ⅰ+Ⅱ期[例數(shù)9][陽性例數(shù)9]（[陽性率9]）-Ⅲ期[例數(shù)10][陽性例數(shù)10]（[陽性率10]）-淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移--<0.05有[例數(shù)11][陽性例數(shù)11]（[陽性率11]）-無[例數(shù)12][陽性例數(shù)12]（[陽性率12]）-3.4HMGA2表達(dá)對非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的影響3.4.1生存分析方法與結(jié)果采用Kaplan-Meier法對非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行生存分析，以評估HMGA2表達(dá)對患者總生存期（OS）和無進(jìn)展生存期（PFS）的影響。根據(jù)HMGA2免疫組化檢測結(jié)果，將患者分為HMGA2高表達(dá)組和低表達(dá)組。隨訪時間從手術(shù)日期開始計算，直至患者死亡、失訪或隨訪截止日期。生存分析結(jié)果顯示，HMGA2高表達(dá)組患者的總生存期明顯短于HMGA2低表達(dá)組患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，圖4A）。HMGA2高表達(dá)組患者的中位總生存期為[X1]個月，而低表達(dá)組患者的中位總生存期為[X2]個月。在無進(jìn)展生存期方面，HMGA2高表達(dá)組患者同樣顯著短于低表達(dá)組患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，圖4B）。HMGA2高表達(dá)組患者的中位無進(jìn)展生存期為[Y1]個月，低表達(dá)組患者的中位無進(jìn)展生存期為[Y2]個月。這表明HMGA2高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，提示HMGA2可能作為評估患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。圖注圖片圖4：HMGA2高表達(dá)組和低表達(dá)組非小細(xì)胞肺癌患者的總生存期（A）和無進(jìn)展生存期（B）Kaplan-Meier曲線分析（*P<0.05）插入對應(yīng)圖片3.4.2多因素分析確定獨(dú)立預(yù)后因素為了進(jìn)一步確定影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素，采用多因素分析方法，將患者的年齡、性別、吸煙史、腫瘤大小、病理類型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及HMGA2表達(dá)等因素納入Cox回歸模型進(jìn)行分析。多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，TNM分期（HR=[HR1]，95%CI：[CI1]-[CI2]，P<0.05）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（HR=[HR2]，95%CI：[CI3]-[CI4]，P<0.05）和HMGA2表達(dá)（HR=[HR3]，95%CI：[CI5]-[CI6]，P<0.05）是影響非小細(xì)胞肺癌患者總生存期的獨(dú)立預(yù)后因素。其中，TNM分期越晚、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及HMGA2高表達(dá)，患者的死亡風(fēng)險越高。而年齡、性別、吸煙史和病理類型等因素在多因素分析中未顯示出對總生存期的獨(dú)立影響（P>0.05）。在無進(jìn)展生存期方面，TNM分期（HR=[HR4]，95%CI：[CI7]-[CI8]，P<0.05）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（HR=[HR5]，95%CI：[CI9]-[CI10]，P<0.05）和HMGA2表達(dá)（HR=[HR6]，95%CI：[CI11]-[CI12]，P<0.05）同樣是獨(dú)立預(yù)后因素。這表明在評估非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后時，除了考慮傳統(tǒng)的臨床病理因素如TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移外，HMGA2表達(dá)也是一個重要的獨(dú)立指標(biāo)，可為臨床醫(yī)生制定治療方案和預(yù)測患者預(yù)后提供更全面的信息。四、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在非小細(xì)胞肺癌中的作用機(jī)制4.1上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的概念與過程4.1.1上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的定義與特征上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理條件下，通過一系列復(fù)雜的分子和細(xì)胞生物學(xué)變化，逐漸失去上皮細(xì)胞的特性，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過程。這一過程在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)以及腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等生理病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在形態(tài)學(xué)方面，上皮細(xì)胞通常呈現(xiàn)為規(guī)則的多邊形，細(xì)胞之間緊密排列，形成緊密的細(xì)胞連接，具有明顯的極性，即細(xì)胞的頂面和底面具有不同的結(jié)構(gòu)和功能。而在EMT過程中，上皮細(xì)胞逐漸失去這種極性，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，從規(guī)則的多邊形逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮位蚶w維狀，類似于間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)。細(xì)胞之間的緊密連接減少，細(xì)胞間的黏附力下降，使得細(xì)胞更容易從上皮層脫離，獲得更強(qiáng)的遷移和運(yùn)動能力。從分子水平來看，上皮細(xì)胞具有一些特異性的標(biāo)志物，其中E-鈣黏蛋白（E-cadherin）是上皮細(xì)胞間黏附連接的關(guān)鍵分子，它通過與相鄰細(xì)胞表面的E-cadherin分子相互作用，維持上皮細(xì)胞之間的緊密連接和細(xì)胞極性。在EMT過程中，E-cadherin的表達(dá)顯著下調(diào)。研究表明，許多轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug、Twist等能夠與E-cadherin基因啟動子區(qū)域的特定序列結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致E-cadherin蛋白表達(dá)減少。此外，細(xì)胞角蛋白（Cytokeratin）也是上皮細(xì)胞的重要標(biāo)志物之一，在EMT過程中，其表達(dá)也會發(fā)生改變。間質(zhì)細(xì)胞同樣具有一些特征性的標(biāo)志物。波形蛋白（Vimentin）是間質(zhì)細(xì)胞中廣泛表達(dá)的一種中間絲蛋白，在EMT過程中，其表達(dá)顯著上調(diào)。Vimentin能夠形成細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)，增強(qiáng)細(xì)胞的機(jī)械穩(wěn)定性和遷移能力。α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）在正常上皮細(xì)胞中通常不表達(dá)或低表達(dá)，但在EMT過程中，其表達(dá)明顯增加。α-SMA主要參與細(xì)胞的收縮和運(yùn)動，其表達(dá)上調(diào)使得細(xì)胞獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。此外，N-鈣黏蛋白（N-cadherin）也屬于鈣黏蛋白家族成員，在間質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)。在EMT過程中，上皮細(xì)胞原本低表達(dá)的N-cadherin表達(dá)上調(diào)，這種現(xiàn)象被稱為“鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換”。N-cadherin能夠促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，以及細(xì)胞之間的相互作用，從而有利于腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。4.1.2上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在非小細(xì)胞肺癌中的發(fā)生過程在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的發(fā)生是一個受到多種因素調(diào)控的復(fù)雜過程。腫瘤微環(huán)境中的各種信號分子在NSCLC的EMT過程中起著重要的誘導(dǎo)作用。轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）是一種重要的細(xì)胞因子，在腫瘤微環(huán)境中廣泛存在。TGF-β與其受體結(jié)合后，激活下游的Smad信號通路?；罨腟mad蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β能夠誘導(dǎo)Snail、Slug等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，這些轉(zhuǎn)錄因子通過抑制E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)EMT的發(fā)生。此外，TGF-β還可以調(diào)節(jié)其他EMT相關(guān)基因的表達(dá)，如上調(diào)Vimentin、α-SMA等間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)。Wnt信號通路在NSCLC的EMT過程中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)Wnt配體與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合后，激活下游的β-catenin信號。β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（TCF/LEF）家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控靶基因的表達(dá)。在NSCLC中，異常激活的Wnt信號通路可以促進(jìn)EMT相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。研究表明，Wnt信號通路的激活可以上調(diào)Twist、Zeb1等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的EMT過程。除了TGF-β和Wnt信號通路外，Notch信號通路也參與了NSCLC的EMT調(diào)控。Notch受體與配體結(jié)合后，經(jīng)過一系列的蛋白水解過程，釋放出Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD）。NICD進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子RBP-Jκ結(jié)合，調(diào)控下游基因的表達(dá)。在NSCLC中，Notch信號通路的激活可以誘導(dǎo)EMT相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路可以通過上調(diào)Snail、Slug等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，從而推動EMT的發(fā)生。腫瘤細(xì)胞自身的基因突變也可能影響EMT的發(fā)生。例如，表皮生長因子受體（EGFR）基因突變在NSCLC中較為常見。EGFR基因突變后，其下游的信號通路如PI3K/AKT、MAPK/ERK等被持續(xù)激活。這些信號通路的激活可以促進(jìn)EMT相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。有研究表明，EGFR突變型NSCLC細(xì)胞中，E-cadherin的表達(dá)明顯下調(diào)，而Vimentin等間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)上調(diào)，提示EGFR基因突變可能通過誘導(dǎo)EMT促進(jìn)NSCLC的進(jìn)展。在NSCLC中，EMT的發(fā)生過程還涉及到細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的重塑。腫瘤細(xì)胞在EMT過程中，會分泌多種基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），如MMP-2、MMP-9等。這些MMPs能夠降解ECM中的各種成分，如膠原蛋白、纖連蛋白等，破壞細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件。同時，ECM的降解產(chǎn)物還可以作為信號分子，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的EMT過程。例如，纖連蛋白的降解片段可以激活腫瘤細(xì)胞表面的整合素受體，進(jìn)而激活下游的信號通路，促進(jìn)EMT相關(guān)基因的表達(dá)。4.2上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子標(biāo)志物4.2.1E-鈣黏蛋白等上皮標(biāo)志物的變化E-鈣黏蛋白作為上皮細(xì)胞間連接的關(guān)鍵分子，在維持上皮細(xì)胞的極性和組織結(jié)構(gòu)完整性方面起著不可或缺的作用。在正常的非小細(xì)胞肺癌組織周邊的正常肺上皮組織中，E-鈣黏蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，其在細(xì)胞膜上均勻分布，通過同型相互作用，即相鄰細(xì)胞表面的E-鈣黏蛋白分子相互結(jié)合，形成穩(wěn)定的細(xì)胞間黏附連接，使得上皮細(xì)胞緊密排列，保持上皮組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。研究表明，E-鈣黏蛋白的表達(dá)水平與上皮細(xì)胞的分化程度密切相關(guān)，高表達(dá)的E-鈣黏蛋白有助于維持上皮細(xì)胞的分化狀態(tài)和正常生理功能。然而，在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的過程中，E-鈣黏蛋白的表達(dá)出現(xiàn)顯著下調(diào)。這一變化主要是由于多種轉(zhuǎn)錄抑制因子的作用，其中Snail、Slug和Twist等轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮了關(guān)鍵作用。Snail是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，它能夠與E-鈣黏蛋白基因啟動子區(qū)域的E-box序列特異性結(jié)合，從而抑制E-鈣黏蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致其mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平降低。研究發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中，過表達(dá)Snail會使E-鈣黏蛋白的表達(dá)明顯下降，同時細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)；而抑制Snail的表達(dá)，則可上調(diào)E-鈣黏蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞的EMT進(jìn)程和侵襲轉(zhuǎn)移能力。Slug與Snail結(jié)構(gòu)相似，也能通過結(jié)合E-鈣黏蛋白基因啟動子區(qū)域來抑制其表達(dá)。此外，Twist作為另一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，同樣可以通過與E-鈣黏蛋白基因啟動子結(jié)合，以及調(diào)控其他相關(guān)信號通路，來降低E-鈣黏蛋白的表達(dá)。E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)在非小細(xì)胞肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中具有重要意義。由于E-鈣黏蛋白表達(dá)減少，上皮細(xì)胞間的黏附力顯著下降，細(xì)胞之間的連接變得松散，使得腫瘤細(xì)胞更容易從原發(fā)腫瘤部位脫離。這些脫離的腫瘤細(xì)胞獲得了更強(qiáng)的遷移能力，能夠穿過基底膜，進(jìn)入周圍組織和血管、淋巴管，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌患者中，腫瘤組織中E-鈣黏蛋白表達(dá)越低，患者的腫瘤分期往往越晚，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率越高，預(yù)后也越差。例如，一項對大量非小細(xì)胞肺癌患者的隨訪研究表明，E-鈣黏蛋白低表達(dá)組患者的5年生存率明顯低于高表達(dá)組患者。除了E-鈣黏蛋白外，其他上皮標(biāo)志物如細(xì)胞角蛋白在EMT過程中也會發(fā)生變化。細(xì)胞角蛋白是上皮細(xì)胞中間絲的主要成分，不同類型的細(xì)胞角蛋白在不同上皮組織中特異性表達(dá)。在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生EMT時，細(xì)胞角蛋白的表達(dá)水平和種類會發(fā)生改變，通常表現(xiàn)為表達(dá)量降低，且某些特定類型的細(xì)胞角蛋白表達(dá)減少或消失。這種變化與細(xì)胞的形態(tài)和功能改變密切相關(guān)，進(jìn)一步促進(jìn)了上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。4.2.2波形蛋白等間質(zhì)標(biāo)志物的變化波形蛋白作為間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，在正常的非小細(xì)胞肺癌組織周邊的正常肺上皮組織中，表達(dá)水平極低甚至幾乎不表達(dá)。這是因?yàn)檎５姆紊掀ぜ?xì)胞具有典型的上皮細(xì)胞特征，細(xì)胞之間緊密連接，極性明顯，不需要波形蛋白來維持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。然而，當(dāng)非小細(xì)胞肺癌發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）時，波形蛋白的表達(dá)會顯著上調(diào)。這一變化受到多種信號通路的調(diào)控。在TGF-β信號通路中，TGF-β與其受體結(jié)合后，激活下游的Smad信號分子?；罨腟mad蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，共同調(diào)節(jié)波形蛋白基因的表達(dá)。研究表明，在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中，加入外源性的TGF-β可以誘導(dǎo)波形蛋白表達(dá)上調(diào)，同時細(xì)胞呈現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)特征，遷移和侵襲能力增強(qiáng)；而阻斷TGF-β信號通路，則可抑制波形蛋白的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的EMT進(jìn)程。Wnt/β-catenin信號通路也參與了波形蛋白表達(dá)的調(diào)控。當(dāng)Wnt信號激活時，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（TCF/LEF）結(jié)合，促進(jìn)波形蛋白等EMT相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。此外，Notch信號通路、PI3K/AKT信號通路等也在波形蛋白表達(dá)上調(diào)過程中發(fā)揮作用。波形蛋白表達(dá)上調(diào)對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的功能產(chǎn)生了多方面的重要影響。從細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面來看，波形蛋白屬于中間絲蛋白家族，它可以在細(xì)胞內(nèi)形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)細(xì)胞的機(jī)械穩(wěn)定性。在EMT過程中，上皮細(xì)胞逐漸失去極性，形態(tài)發(fā)生改變，此時上調(diào)的波形蛋白能夠?yàn)榧?xì)胞提供必要的結(jié)構(gòu)支撐，使細(xì)胞能夠適應(yīng)形態(tài)的變化，更好地進(jìn)行遷移和侵襲。在細(xì)胞遷移和侵襲能力方面，波形蛋白通過與細(xì)胞內(nèi)的其他骨架蛋白（如肌動蛋白等）相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的運(yùn)動。研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)波形蛋白的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，能夠更容易地穿過細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，實(shí)現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。而且，波形蛋白還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)和功能，影響細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)以及周圍細(xì)胞的相互作用，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。除了波形蛋白，α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和N-鈣黏蛋白等間質(zhì)標(biāo)志物在EMT過程中也會出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)的情況。α-SMA主要表達(dá)于平滑肌細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞中，在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生EMT時，腫瘤細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)增加。α-SMA具有收縮功能，其表達(dá)上調(diào)使得腫瘤細(xì)胞能夠產(chǎn)生更強(qiáng)的收縮力，有助于細(xì)胞突破周圍組織的限制，實(shí)現(xiàn)侵襲和轉(zhuǎn)移。N-鈣黏蛋白在正常上皮細(xì)胞中低表達(dá)，但在EMT過程中表達(dá)顯著上調(diào)。N-鈣黏蛋白可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)以及其他細(xì)胞之間的黏附，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲提供有利條件。同時，N-鈣黏蛋白的上調(diào)還與腫瘤細(xì)胞的耐藥性相關(guān)，可能導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌患者對化療藥物的敏感性降低。4.3上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)信號通路4.3.1TGF-β信號通路的作用轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號通路在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程中發(fā)揮著核心作用。TGF-β家族是一類具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3等。在NSCLC中，腫瘤細(xì)胞自身以及腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞，如腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，都可以分泌TGF-β。TGF-β信號通路的激活起始于TGF-β與細(xì)胞膜表面的受體結(jié)合。TGF-β受體主要包括I型受體（TβRI）和II型受體（TβRII），它們都是跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體。當(dāng)TGF-β與TβRII結(jié)合后，TβRII的激酶活性被激活，進(jìn)而磷酸化并招募TβRI，形成TGF-β/TβRII/TβRI異源三聚體復(fù)合物。TβRI被TβRII磷酸化后，激活下游的Smad蛋白。Smad蛋白家族主要包括受體調(diào)節(jié)型Smads（R-Smads）、共同介導(dǎo)型Smad（Co-Smad）和抑制型Smads（I-Smads）。在TGF-β信號通路中，R-Smads主要包括Smad2和Smad3，它們被TβRI磷酸化后，與Co-Smad（Smad4）形成復(fù)合物。該復(fù)合物隨后進(jìn)入細(xì)胞核，與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達(dá)。研究表明，TGF-β/Smad信號通路可以通過多種機(jī)制誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞發(fā)生EMT。一方面，TGF-β/Smad信號通路能夠上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，如Snail、Slug、Twist等。這些轉(zhuǎn)錄因子可以與E-cadherin基因啟動子區(qū)域的E-box序列結(jié)合，抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)下調(diào)。例如，在NSCLC細(xì)胞系中，用TGF-β處理細(xì)胞后，Snail和Slug的表達(dá)明顯上調(diào)，同時E-cadherin的表達(dá)顯著下降，細(xì)胞呈現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和特征，遷移和侵襲能力增強(qiáng)。另一方面，TGF-β/Smad信號通路還可以直接調(diào)控其他EMT相關(guān)基因的表達(dá)，如上調(diào)Vimentin、α-SMA、N-cadherin等間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β能夠誘導(dǎo)Vimentin基因啟動子區(qū)域的特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生變化，促進(jìn)Vimentin的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。除了經(jīng)典的TGF-β/Smad信號通路外，TGF-β還可以通過非Smad信號通路來調(diào)節(jié)EMT。例如，TGF-β可以激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等。TGF-β與受體結(jié)合后，通過一系列的蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng)，激活MAPK信號通路。激活的MAPK可以磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，如c-Jun、Elk-1等，從而調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達(dá)。研究表明，在NSCLC細(xì)胞中，抑制MAPK信號通路可以阻斷TGF-β誘導(dǎo)的EMT過程，抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力。此外，TGF-β還可以激活PI3K/AKT信號通路，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存、增殖和遷移等過程，間接影響EMT的發(fā)生。在NSCLC中，PI3K/AKT信號通路的激活可以促進(jìn)細(xì)胞的存活和增殖，同時增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，與TGF-β誘導(dǎo)的EMT過程相互協(xié)同。4.3.2Wnt信號通路的影響Wnt信號通路是一條在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化和腫瘤發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用的信號傳導(dǎo)通路，在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程中也具有重要的調(diào)節(jié)作用。Wnt信號通路主要包括經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路和非經(jīng)典Wnt信號通路。在經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路中，當(dāng)Wnt配體（如Wnt1、Wnt3a等）與細(xì)胞膜上的受體卷曲蛋白（Frizzled，F(xiàn)z）和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP5/6）結(jié)合形成復(fù)合物后，會激活下游的散亂蛋白（Dishevelled，Dvl）。Dvl的激活抑制了由腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白（APC）、軸蛋白（Axin）和糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）組成的β-catenin降解復(fù)合物的活性。在沒有Wnt信號時，β-catenin在降解復(fù)合物的作用下，被GSK-3β磷酸化，然后被泛素化修飾，進(jìn)而被蛋白酶體降解。而當(dāng)Wnt信號激活后，β-catenin的磷酸化受到抑制，使其在細(xì)胞質(zhì)中積累。積累的β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（TCF/LEF）家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，形成β-catenin/TCF/LEF轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。該復(fù)合物可以調(diào)控一系列靶基因的表達(dá)，包括許多與EMT相關(guān)的基因。在NSCLC中，經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路的異常激活與EMT密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC組織中，Wnt配體的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號通路過度激活。激活的Wnt/β-catenin信號通路可以上調(diào)Twist、Zeb1等EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。Twist和Zeb1等轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到E-cadherin基因啟動子區(qū)域，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而使E-cadherin表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)EMT的發(fā)生。例如，在NSCLC細(xì)胞系中，過表達(dá)Wnt3a可以激活Wnt/β-catenin信號通路，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)積累，進(jìn)而上調(diào)Twist和Zeb1的表達(dá)，使E-cadherin表達(dá)下降，細(xì)胞發(fā)生EMT，遷移和侵襲能力增強(qiáng)。此外，Wnt/β-catenin信號通路還可以直接調(diào)控其他EMT相關(guān)基因的表達(dá)，如上調(diào)Vimentin、N-cadherin等間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的EMT過程。非經(jīng)典Wnt信號通路包括Wnt/PCP（平面細(xì)胞極性）信號通路和Wnt/Ca2+信號通路。在Wnt/PCP信號通路中，Wnt配體與Fz受體結(jié)合后，激活Dvl，Dvl通過激活Rho家族小GTP酶（如RhoA、Rac1和Cdc42等），調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組，從而影響細(xì)胞的極性和遷移能力。在NSCLC中，Wnt/PCP信號通路的激活可以促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲，可能與EMT過程相關(guān)。研究表明，在NSCLC細(xì)胞中，激活Wnt/PCP信號通路可以增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而抑制該信號通路則可以降低細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在Wnt/Ca2+信號通路中，Wnt配體與Fz受體結(jié)合后，通過激活磷脂酶C（PLC），使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高。升高的Ca2+可以激活鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II（CaMKII）和蛋白激酶C（PKC）等，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和遷移等過程。雖然Wnt/Ca2+信號通路在NSCLC的EMT過程中的具體作用機(jī)制尚不完全清楚，但有研究表明，該信號通路的激活可能參與了NSCLC細(xì)胞的遷移和侵襲過程。五、HMGA2與非小細(xì)胞肺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系研究5.1HMGA2對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子的調(diào)控5.1.1HMGA2與E-鈣黏蛋白的關(guān)系為了探究HMGA2對E-鈣黏蛋白表達(dá)的調(diào)控作用及機(jī)制，進(jìn)行了一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。首先，選取人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將針對HMGA2的小干擾RNA（si-HMGA2）轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，以降低細(xì)胞內(nèi)HMGA2的表達(dá)水平。同時設(shè)置陰性對照組，轉(zhuǎn)染無義小干擾RNA（si-NC）。轉(zhuǎn)染48小時后，采用qRT-PCR和Westernblot技術(shù)分別檢測兩組細(xì)胞中HMGA2和E-鈣黏蛋白在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)變化。qRT-PCR結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-HMGA2組細(xì)胞中HMGA2mRNA的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），而E-鈣黏蛋白mRNA的表達(dá)水平明顯升高（P<0.05）（圖5A）。Westernblot結(jié)果也表明，si-HMGA2組細(xì)胞中HMGA2蛋白表達(dá)量顯著減少，同時E-鈣黏蛋白蛋白表達(dá)量顯著增加（圖5B）。這初步說明抑制HMGA2的表達(dá)可以上調(diào)E-鈣黏蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)探究HMGA2調(diào)控E-鈣黏蛋白表達(dá)的分子機(jī)制。利用針對HMGA2的抗體進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)，富集與HMGA2結(jié)合的DNA片段。然后通過PCR擴(kuò)增E-鈣黏蛋白基因啟動子區(qū)域含有E-box序列的片段，該序列是已知的與EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的區(qū)域。結(jié)果顯示，在A549和H1299細(xì)胞中，HMGA2能夠與E-鈣黏蛋白基因啟動子區(qū)域的E-box序列結(jié)合（圖5C）。這表明HMGA2可能通過直接結(jié)合E-鈣黏蛋白基因啟動子區(qū)域，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而降低E-鈣黏蛋白的表達(dá)。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，構(gòu)建了含有E-鈣黏蛋白基因啟動子區(qū)域（包含HMGA2結(jié)合位點(diǎn)）的熒光素酶報告基因載體（pGL3-E-cad-promoter）。將該載體與過表達(dá)HMGA2的質(zhì)粒（pcDNA3.1-HMGA2）或空載體（pcDNA3.1）共轉(zhuǎn)染到A549和H1299細(xì)胞中。同時設(shè)置對照組，只轉(zhuǎn)染pGL3-E-cad-promoter載體。轉(zhuǎn)染48小時后，檢測熒光素酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，過表達(dá)HMGA2組細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低（P<0.05）（圖5D）。這進(jìn)一步證實(shí)了HMGA2能夠抑制E-鈣黏蛋白基因啟動子的活性，從而下調(diào)E-鈣黏蛋白的表達(dá)。圖注圖片圖5：A.qRT-PCR檢測si-HMGA2轉(zhuǎn)染后A549和H1299細(xì)胞中HMGA2和E-鈣黏蛋白mRNA表達(dá)水平變化（*P<0.05）；B.Westernblot檢測si-HMGA2轉(zhuǎn)染后A549和H1299細(xì)胞中HMGA2和E-鈣黏蛋白蛋白表達(dá)水平變化；C.ChIP實(shí)驗(yàn)檢測HMGA2與E-鈣黏蛋白基因啟動子區(qū)域E-box序列的結(jié)合；D.熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)檢測HMGA2對E-鈣黏蛋白基因啟動子活性的影響（*P<0.05）插入對應(yīng)圖片5.1.2HMGA2對波形蛋白等間質(zhì)標(biāo)志物的影響在探究HMGA2對波形蛋白等間質(zhì)標(biāo)志物的影響時，同樣以人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299為研究對象。通過轉(zhuǎn)染技術(shù)，將過表達(dá)HMGA2的質(zhì)粒（pcDNA3.1-HMGA2）轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，使其高表達(dá)HMGA2。同時設(shè)置對照組，轉(zhuǎn)染空載體（pcDNA3.1）。轉(zhuǎn)染48小時后，采用qRT-PCR和Westernblot技術(shù)檢測兩組細(xì)胞中波形蛋白（Vimentin）和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）等間質(zhì)標(biāo)志物在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)變化。qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達(dá)HMGA2組細(xì)胞中Vimentin和α-SMAmRNA的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）（圖6A）。Westernblot結(jié)果也表明，過表達(dá)HMGA2組細(xì)胞中Vimentin和α-SMA蛋白表達(dá)量明顯增加（圖6B）。這表明過表達(dá)HMGA2可以上調(diào)Vimentin和α-SMA等間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，在細(xì)胞中敲低HMGA2的表達(dá)。通過轉(zhuǎn)染針對HMGA2的小干擾RNA（si-HMGA2），抑制細(xì)胞內(nèi)HMGA2的表達(dá)。同樣設(shè)置陰性對照組，轉(zhuǎn)染無義小干擾RNA（si-NC）。轉(zhuǎn)染48小時后，檢測Vimentin和α-SMA的表達(dá)。結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-HMGA2組細(xì)胞中Vimentin和α-SMAmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）（圖6C、D）。這進(jìn)一步證實(shí)了HMGA2能夠正向調(diào)控Vimentin和α-SMA等間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)。為了探究HMGA2調(diào)控Vimentin和α-SMA表達(dá)的信號通路，采用信號通路抑制劑進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。在過表達(dá)HMGA2的A549細(xì)胞中，分別加入TGF-β信號通路抑制劑SB431542、Wnt信號通路抑制劑XAV939和PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002。同時設(shè)置對照組，加入等量的DMSO。處理24小時后，檢測Vimentin和α-SMA的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入SB431542后，過表達(dá)HMGA2誘導(dǎo)的Vimentin和α-SMA表達(dá)上調(diào)受到明顯抑制（P<0.05）（圖6E）。而加入XAV939和LY294002后，對過表達(dá)HMGA2誘導(dǎo)的Vimentin和α-SMA表達(dá)上調(diào)影響不明顯（P>0.05）。這表明HMGA2可能主要通過TGF-β信號通路來調(diào)控Vimentin和α-SMA等間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)。圖注圖片圖6：A.qRT-PCR檢測過表達(dá)HMGA2后A549和H1299細(xì)胞中Vimentin和α-SMAmRNA表達(dá)水平變化（*P<0.05）；B.Westernblot檢測過表達(dá)HMGA2后A549和H1299細(xì)胞中Vimentin和α-SMA蛋白表達(dá)水平變化；C.qRT-PCR檢測敲低HMGA2后A549和H1299細(xì)胞中Vimentin和α-SMAmRNA表達(dá)水平變化（*P<0.05）；D.Westernblot檢測敲低HMGA2后A549和H1299細(xì)胞中Vimentin和α-SMA蛋白表達(dá)水平變化；E.信號通路抑制劑對過表達(dá)HMGA2誘導(dǎo)的Vimentin和α-SMA表達(dá)上調(diào)的影響（*P<0.05）插入對應(yīng)圖片五、HMGA2與非小細(xì)胞肺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系研究5.2HMGA2對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)信號通路的影響5.2.1HMGA2與TGF-β信號通路的交互作用為深入探究HMGA2與TGF-β信號通路在非小細(xì)胞肺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程中的交互作用，以人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299為研究對象，開展了一系列實(shí)驗(yàn)。首先，通過轉(zhuǎn)染過表達(dá)HMGA2的質(zhì)粒（pcDNA3.1-HMGA2）使細(xì)胞高表達(dá)HMGA2，同時設(shè)置對照組轉(zhuǎn)染空載體（pcDNA3.1）。轉(zhuǎn)染48小時后，用外源性TGF-β1（10ng/mL）刺激細(xì)胞24小時。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測TGF-β信號通路關(guān)鍵分子Smad2/3的磷酸化水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達(dá)HMGA2組細(xì)胞在TGF-β1刺激后，p-Smad2/3的蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）（圖7A）。這表明HMGA2過表達(dá)增強(qiáng)了TGF-β信號通路中Smad2/3的磷酸化激活。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，在細(xì)胞中敲低HMGA2的表達(dá)，通過轉(zhuǎn)染針對HMGA2的小干擾RNA（si-HMGA2）實(shí)現(xiàn)。轉(zhuǎn)染48小時后，同樣用TGF-β1刺激細(xì)胞24小時，檢測p-Smad2/3的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低HMGA2組細(xì)胞中p-Smad2/3的蛋白表達(dá)水平明顯低于陰性對照組（si-NC）（P<0.05）（圖7B）。這進(jìn)一步證實(shí)了HMGA2能夠正向調(diào)控TGF-β信號通路中Smad2/3的激活。為了探究HMGA2影響TGF-β/Smad信號通路的分子機(jī)制，進(jìn)行了染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)。利用針對HMGA2的抗體進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)，富集與HMGA2結(jié)合的DNA片段。然后通過PCR擴(kuò)增TGF-β受體I（TβRI）基因啟動子區(qū)域含有特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的片段。結(jié)果顯示，在A549和H1299細(xì)胞中，HMGA2能夠與TβRI基因啟動子區(qū)域結(jié)合（圖7C）。這表明HMGA2可能通過直接結(jié)合TβRI基因啟動子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，從而增加TβRI的表達(dá)，增強(qiáng)TGF-β信號通路的激活。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，構(gòu)建了含有TβRI基因啟動子區(qū)域（包含HMGA2結(jié)合位點(diǎn)）的熒光素酶報告基因載體（pGL3-TβRI-promoter）。將該載體與過表達(dá)HMGA2的質(zhì)粒（pcDNA3.1-HMGA2）或空載體（pcDNA3.1）共轉(zhuǎn)染到A549和H1299細(xì)胞中。同時設(shè)置對照組，只轉(zhuǎn)染pGL3-TβRI-promoter載體。轉(zhuǎn)染48小時后，檢測熒光素酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，過表達(dá)HMGA2組細(xì)胞的熒光素酶活性顯著升高（P<0.05）（圖7D）。這進(jìn)一步證實(shí)了HMGA2能夠促進(jìn)TβRI基因啟動子的活性，上調(diào)TβRI的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)TGF-β信號通路的激活。圖注圖片圖7：A.Westernblot檢測過表達(dá)HMGA2后TGF-β1刺激下A549和H1299細(xì)胞中p-Smad2/3蛋白表達(dá)水平變化（*P<0.05）；B.Westernblot檢測敲低HMGA2后TGF-β1刺激下A549和H1299細(xì)胞中p-Smad2/3蛋白表達(dá)水平變化（*P<0.05）；C.ChIP實(shí)驗(yàn)檢測HMGA2與TβRI基因啟動子區(qū)域的結(jié)合；D.熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)檢測HMGA2對TβRI基因啟動子活性的影響（*P<0.05）插入對應(yīng)圖片5.2.2HMGA2對其他相關(guān)信號通路的作用除了TGF-β信號通路，HMGA2對其他與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)的信號通路也具有重要影響。以Wnt信號通路為例，在人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299中，通過轉(zhuǎn)染過表達(dá)HMGA2的質(zhì)粒（pcDNA3.1-HMGA2）使細(xì)胞高表達(dá)HMGA2。轉(zhuǎn)染48小時后，采用qRT-PCR和Westernblot技術(shù)檢測Wnt信號通路關(guān)鍵分子β-catenin以及下游靶基因c-Myc、CyclinD1的表達(dá)變化。qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達(dá)HMGA2組細(xì)胞中β-catenin、c-Myc和CyclinD1mRNA的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）（圖8A）。Westernblot結(jié)果也表明，過表達(dá)HMGA2組細(xì)胞中β-catenin、c-Myc和CyclinD1蛋白表達(dá)量明顯增加（圖8B）。這表明HMGA2過表達(dá)能夠激活Wnt/β-catenin信號通路，促進(jìn)其下游靶基因的表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，在細(xì)胞中敲低HMGA2的表達(dá)，通過轉(zhuǎn)染針對HMGA2的小干擾RNA（si-HMGA2）實(shí)現(xiàn)。轉(zhuǎn)染48小時后，檢測β-catenin、c-Myc和CyclinD1的表達(dá)。結(jié)果顯示，與陰性對照組（si-NC）相比，si-HMGA2組細(xì)胞中β-catenin、c-Myc和CyclinD1mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）（圖8C、D）。這進(jìn)一步證實(shí)了HMGA2能夠正向調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路。為了探究HMGA2激活Wnt/β-catenin信號通路的機(jī)制，采用免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)檢測HMGA2與β-catenin之間是否存在相互作用。結(jié)果顯示，在A549和H1299細(xì)胞中，HMGA2能夠