PCR技術PCR技術的應用

一滴殘留在裙子上的精液使得美國總統(tǒng)BillC1inton不得不坦承他與白宮實

習生有不合法的關系。由于他知道現(xiàn)在的生物科技就連一個精子也能被用來做

為證據(jù)。這種將極微量的生物標本化為可供鑒定的現(xiàn)代技術正是PCR(Polymer

asechainreaction)--聚合酶鏈式反映具有的特色之一。這也是分子生

物醫(yī)學令人震撼的一例。

何謂PCR

簡樸的說，PCR就是運用DNA聚合酶對特定基因做體外或試管內(InV

itro)的大量合成?；旧纤沁\用DNA聚合酶進行專一性的連鎖復制.目前常

用的技術，可以將一段基因復制為本來的一百億至一千億倍。

APCR的要素

基本的PCR須具有1.要被復制的DNA模板(Template)2.界定復制范

圍兩端的引物(Primers).3.DNA聚合酶(Taq.Polymearse)4.合成的原料

及水。PCR的反映涉及三個重要環(huán)節(jié)，分別是1).Denaturation2).A

nnea1ingofprimers,and3).Extensionofprimerso所謂

Denaturing乃是將DNA加熱變性，將雙股的DNA加熱后轉為單股DNA以

做為復制的模板.而Annealing則是令Primers于一定的溫度下附著于模板

DNA兩端。最后在DNA聚合酶(e.g.Taq-poIymerase)的作用下進行

引物的延長(Extensionofprimers)及另一股的合成。

PCR的問題，無疑是絕大多數(shù)學生物的人都關心的問題。今天我們把相關內容

整理出來，與大家共同討論，希望對大家能有所幫助C

④一、引物設計A所謂“工欲善其事泌先利其器”，這年頭手工設計引物的人似乎不

多，還是用軟件方便些，防止你一不小心看走眼，丟一個堿基，同時計算起來

也方便。設計軟件有很多，既可以在線設計(如Primer3http://frodo.wi.mi

t.edu/cgi-bin/primer3/primer3www.cgi),也可以用Primer5、0

Iigo6.65等等。

1.引物設計的原則

細心地進行引物設計是PCR中最重要的一步。抱負的引物對只同目的序列兩

側的單一序列而非其他序列退火。設計糟糕的引物也許會同時擴增其他的非目

的序列。下面的指導描述了一個可以增長特異性的引物所具有的令人滿意的特

點:S)典型的引物18到24個核昔長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并

減少序列存在于非目的序列位點的也許性。但是長度大于24核昔的引物并不

意味著更高的特異性。較長的序列也許會與錯誤配對序列雜交，減少了特異性,

并且比短序列雜交慢，從而減少了產量。42)選擇GC含量為40%到60%或G

C含量與模板GC含量接近的引物。分)設計5'端和中間區(qū)為G或C的

引物。這會增長引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。

4)避免引物對3'末端存在互補序列,這會形成引物二聚體，克制擴增。在用軟件

設計時大家經(jīng)常會疑惑,究竟？G不能低于多少?這里有個數(shù)據(jù)：？G為

0~-2時,PCR產率可達100%,?G=-6時，為40%.W)避免3末端富含

GCo設計引物時保證在最后5個核昔中具有3個A或T。A6）避免3'末端

的錯誤配對。3,端核昔需要同模板退火以供聚合醐催化延伸。3,最佳以G或C

結尾，防止AT的松散結合引起錯配。7A）避免存在也許會產生內部二級結

構如發(fā)夾結構的序列，這會破壞引物退火穩(wěn)定性。

8）引物的一個重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當50%的引物和互補序列表現(xiàn)為

雙鏈DNA分子時的溫度。兩引物的Tm值相差不應大于5C。計算Tm有

幾種公式。第一個公式（Wallace規(guī)則）:Tm=4℃（g+C）+2℃（a+T）,

這來源于高鹽溶液中的雜交，合用于小于15—20個堿基的引物，也合用于手工設

計時的簡樸計算.第二個公式（Ba1dino算法）合用于計算14-70個核昔酸

在WO.4moi\L的陽離子溶液中的Tm,也可用于擴增產物的Tm計算.Tm=

81.5+16.6*lg[K+]+0.41（%[G+C]）-（675/n）0以上兩種算法都是基于堿基

組成而不是堿基排列而計算的，事實上相同堿基組成的引物Tm也許差異不小:

GGGAA和GAGAG的Tm是不同樣的，所以擬定引物Tm最可信的方法

是近鄰分析法。這種方法從序列一級結構和相鄰堿基的特性預測引物的雜交穩(wěn)

定性。大部分計算機程序如Primer5等均使用近鄰分析法。

9）當在引物5,端添加酶切位點時要考慮：a）該目的序列內部不得具有相同的酶

切位點，在引物發(fā)出后才發(fā)現(xiàn)錯誤的事情本人就干過，在論壇上也能看到這樣的

粗心人。這樣的錯誤會給將來的克隆導致麻煩。b）假如打算PCR后直接酶處

不要忘了在酶切位點的外側再加上保護堿基，不同的酶對于保護堿基的規(guī)定是

不同的。假如不設計保護堿基，則多半要用TA克隆的方式連接到質粒上，這

時要注意Taq酶的選擇，這一點在后面再聊。若想在目的序列上附加上并入存

在的序列，如限制位點和啟動子序列，可以加入到引物5,端而不影響特異性。當

計算引物Tm值時并不涉及這些序列，但是應當對其進行互補性和內部二級結

構的檢測。A10）有時候，對于引物設計僅了解有限的序列信息。比如,假如僅

知道氨基酸序列，可以設計兼并引物。兼并引物是指代表編碼單個氨基酸所有

不同堿基也許性的不同序列的混合物。為了增長恃異性，可以參考密碼子使用

表，根據(jù)不同生物的堿基使用偏好,減少兼并性。次英噪吟可以同所有的堿基配

對，減少引物的退火溫度。特別要注意的是:不要在引物的3'端使用兼并堿基,

由于3,端最后3個堿基的退火足以在錯誤位點起始PCR。使用較高的引物

濃度（IpM到3pM）,由于許多兼并混合物中的引物不是特異性針對目的模板。

說了半天了,想起來還得提醒大家一句：千萬別搞錯了引物的位置!這句話似乎多

余。

看了上面的圖吧，假如要擴增目的序列為“ATG.............TGA”的片段，則引物分

別為“ATG……”和"TCA……”仔細琢磨一下，特別是5'端再接上酶切位點可

別搞錯了！合成錯了一條可就是50塊錢，屆時候挨老板批的時候別怪我沒提醒

你哦：）設計好『引物就要讓公司合成，這時候別忘「談價格:）現(xiàn)在競爭很歷害,

價格已經(jīng)挺便宜了，注意兩個參數(shù):一個是0D值，假如公司說1OD能比20D

優(yōu)惠,那通常1OD足夠了。第二是純度，是HPLC的還是0PC的，事先

要說好，建議看看這里（唉，不是我給他們做廣告，只是他們的說明書寫得真不

錯）：http：〃www.tak/product/cs/c3.htm#1弓I物設計

方面尚有很多話題可說，比如如何運用引物搭橋將兩個片段通過PCR而不是

酶連接起來、假如要設計引物表達蛋白時注意“N端規(guī)則”。

A二、PCR成分A引用《分子克隆3》提供的PCR標準反映條件：*模板1p

g-1的

引物1pmol/L

DNA聚合酶1-5單位

Mg2+1.5mmoI/L'dNTPs200pmol/LAKCI50mmol/LlA.模板A

模板可是PCR的關鍵，模板的質量是PCR成功的先決條件，巧婦難為無米之

炊嘛!如何得到模板，這可是一個大問題，僅僅一個提取基因組DNA就有很多

的名堂，這會是我們后面專輯的內容，這里不多說啦，有問題來論壇討論吧。P

不出東西的時候不妨先考慮:模板有沒有問題？（DNA樣品中發(fā)現(xiàn)有多種污染

物會克制PCR。一些在標準基因組DNA制備中使用的試劑，如SDS,在濃

度低至0.01%時就會克制擴增反映。）所需的最佳模板量取決于基因組的大小。

你的目的片段在基因組中占多少？至少要保證模板中具有一個單拷貝吧！100

ng至i」1pg的人類基因組DNA,相稱于3x104到3x105個分子。所以對

于單拷貝基因，這需要0.1用的人基因組DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大腸

桿菌DNA.擴增多拷貝序列時，用量更少.靈敏的PCR可從一個細胞，一根頭發(fā)，

一個抱子或一個精子提取的DNA中分析目的序列.模板量過多則也許增長非特

異性產物.DNA中的雜質也會影響PCR的效率。2A.引物A引物以干粉形式運

送。最佳用TE重溶引物，使其最終濃度為1OOpM。TE比去離子水好，由于

水的pH經(jīng)常偏酸，會引起寡核昔的水解。當然，假如緊張TE對于PCR的

影響,不妨用ddH2Oo引物的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應將干粉和溶解的引物儲

存在-20℃。以大于10uM濃度溶于TE的引物在-20°C可以穩(wěn)定保存6個月，

但在室溫（15C到30C）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20C保存至少

1年,在室溫（15°C到30℃）最多可以保存2個月。注意：溶解之前先離心

一下,防止一開蓋就飛了。引物的濃度會影響特異性。最佳的引物濃度一般在0.

1到0.5pM。較高的引物濃度會導致非特異性產物擴增。通常跟著引物來的說

明書會告訴你.關于寡核苗酸的計算可以看看這里：http：//www.takara.。。

/product/fl/i1.htm

3.聚合酶的選擇A這可是有講究，咱論壇里有個專題討論這個問題。重要考慮

兩個方面:用途一對保真度的規(guī)定高不高？成本一高保真的前總是會貴一

些的。綜合考慮一下找個平衡點吧，當然啦，該花錢的時候可不能省。TaqDN

A聚合酶被看做是低保真度的聚合酶，由于其缺少3'到5外切核酸酶（校正）

活性。使用帶有3'到5,外切核酸酶活性的熱穩(wěn)定聚合醐可以提高保真度。但

是這些聚合酶的產量比TaqDNA聚合酶低。在很多公司的手冊中有對各種酶

特性的描述，大家不妨比較一下。提醒一點:高保真醵除了我所知的Merck的E

asy-A以外，都不會在3,端加A尾巴（由于其3-5，外切酶活性），所以做TA

克隆的時候需要一點小訣竅一擴增完了再加普通Taq去加個Ao此外尚有個

方法:將TaqDNA聚合酶同帶有3'到S外切核酸酶活性第二種聚合酶混合

在一起可以獲得比單獨TaqDNA聚合酶高的保真度，并可以得到高產量及

擴增長模板。務.Mg2+濃度A鎂離子影響PCR的多個方面，如DNA聚合酶的

活性，這會影響產量；再如引物退火，這會影響特異性。dNTP和模板同鎂離子

結合,減少了酶活性所需要的游離鎂離子的量。最佳的鎂離子濃度對于不同的引

物對和模板都不同，但是包含200pMdNTP的典型PCR起始濃度是1.5mM

（注意:對實時定量PCR,使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液）。在多

數(shù)情況下，較高的游離鎂離子濃度可以增長產量,但也會增長非特異性擴增，減少

忠實性（當然，也有相反的報道）。為了擬定最佳濃度，可以用0.1-5mm。

1/L的遞增濃度的Mg2+進行預備實驗，選出最適的Mg2+濃度。在PCR反映

混合物中，應盡量減少有高濃度的帶負電荷的基團，例如磷酸基團或EDTA

等也許影響Mg2+離子濃度的物質，以保證最適Mg2+濃度。

5.dNTPs

高濃度的dNTPs會對擴增反映起克制作用。將每種dNTP的濃度從200口

M減少到25-5O|jM可以使擴增產物獲得滿意的產率。

6.KC1A標準濃度為50mmo1/L,對于較短片段可將其提高到70-100m

mol/L.

三，PCR反映參數(shù).變性:在第一輪循環(huán)前，在94c下變性5?10min非常

重要，它可使模板DNA完全解鏈，然后加入TaqDNA聚合酶(hotstart),

這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對的引物與模板復合

物所導致的錯誤。變性不完全,往往使PCR失敗，由于未變性完全的DNA雙

鏈會不久復性，減少DNA產量.一般變性溫度與時間為94℃imino在變性溫

度下，雙鏈DNA解鏈只需幾秒鐘即可完全,所耗時間重要是為使反映體系完全

達成適當?shù)臏囟?。對于富含GC的序列，可適當提高變性溫度.但變性溫度過

高或時間過長都會導致酶活性的損失。

2.退火:這是PCR的一個關鍵參數(shù)。在抱負狀態(tài)下，退火溫度足夠低,以保證

引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火

溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的Tm低5℃,當產物中包具有

影響實驗的非可異性擴增帶時，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退

火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成。假如兩個引物Tm不同，將退

火溫度設定為比最低的Tm低5℃?；蛘邽榱颂岣咛禺愋?，可以在根據(jù)較高Tm

設計的退火溫度先進行5個循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設計的退火溫度進行

剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。退火

溫度越高，所得產物的特異性越高。有些反映甚至可將退火與延伸兩步合并，只用

兩種溫度(例如用60c和94C)完畢整個擴增循環(huán)，既省時間又提高了特異

性。退火一般僅需數(shù)秒鐘即可完畢,反映中所需時間重要是為使整個反映體系這

成合適的溫度。分.延伸:延伸反映通常為72℃,接近于TaqDNA聚合酶的最

適反映溫度75c.事實上，引物延伸在退火時即已開始，由于TaqDNA聚合酶

的作用溫度范圍可從20℃-85c.延伸反映時間的長短取決于目的序列的長度和

濃度.在一般反映體系中,TaqDNA聚合酶每分鐘約可合成1kb長的DNA。

延伸時間過長會導致產物非特異性增長.但對很低濃度的目的序列，則可適當增

長延伸反映的時間。一般在擴增反映完畢后,都需要一步較長時間(10-30min)

的延伸反映,以獲得盡也許完整的產物，這對以后進行克隆或測序反映尤為重

要。爾.循環(huán)次數(shù)：當其它參數(shù)擬定之后，循環(huán)次數(shù)重要取決于DNA濃度。

一般而言25-30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多，會使PCR產物中非特異

性產物大量增長。通常經(jīng)25-30輪循環(huán)擴增后，反映中TaqDNA聚合南已

經(jīng)局限性，假如此時產物量仍不夠，需要進一步擴增，可將擴增的DNA樣品

稀釋103-105倍作為模板，重新加入各種反映底物進行擴增，這樣經(jīng)60輪循

環(huán)后，擴增水平可達109-1010。擴增產物的量還與擴增效率有關，擴增產物的

量可用下列公式表達：C=Co(1+P)no其中:C為擴增產物量,CO為起始D

NA量，P為增效率，n為循環(huán)次數(shù)。在擴增后期,由于產物積累，使本來呈指

數(shù)擴增的反映變成平坦的曲線，產物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升，這稱為平臺效應。

平臺期會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續(xù)大量擴增，達成較

高水平。因此,應適當調節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結束反映，減少非特異性產物。

會④四、提高PCR擴噌特異性

1,遞減PCR（TouchDownPCR）A遞減PCR通過在PCR的前幾個循環(huán)

使用嚴緊的退火條件提高特異性。循環(huán)設在比估算的Tm高大約5c的退入溫

度下開始，然后每個循環(huán)減少1℃到2°C（當然，也可以每幾個循環(huán)降1-2℃）,直

到退火溫度低于Tm5℃o特異性最高的目的模板會被優(yōu)先擴增，這些產物在

隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴增占據(jù)優(yōu)勢。遞減PCR對于那些不了解引物和目的模板

同源性限度的方法更為有用，如AFLP?DNA指紋分析。

2.熱啟動

熱啟動PCR是除了好的引物設計之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。

盡管TaqDNA聚合酶的最佳延伸溫度在72℃,聚合酶在室溫仍然有活性。因

此，在進行PCR反映配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫

度時會產生非特異性的產物。這些非特異性產物一旦形成，就會被有效擴增。

在用于引物設計的位點由于遺傳元件的定位而受限時,如定點突變、表達克隆或

用于DNA工程的遺傳元件的構建和操作,熱啟動PCR尤為有效。并且,熱啟動

在很大限度上防止引物二聚的發(fā)生。限制TaqDNA聚合酶活性的常用方法

是在冰上配制PCR反映液，并將其置于預熱的PCR儀。這種方法簡樸便宜，

但并不能完畢克制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產物的擴增。熱啟動

通過克制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達成變性溫度。涉及延

緩加入TaqDNA聚合酶在內的大部分手工熱啟動方法十分煩瑣，特別是對

高通量應用。其他的熱啟動方法使用蠟防護層將一種基本成分，入鎂離子或酶,

包裹起來，或者將反映成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時，因蠟

熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。象手動熱啟動方法同樣，蠟防護層法

比較煩瑣，易于污染，不合用于于高通量應用。A.促進PCR的添加劑

退火溫度，引物設計和鎂離子濃度的優(yōu)化足以對大多數(shù)模板進行高特異性的擴

增，但是，某些模板，涉及高GC含量的模板，需要其他的措施。影響DNA

熔解溫度的添加劑提供了提高產物特異性和產量的此外一種方法。為獲得最佳

的結果需要模板的完全變性。此外，二級結構會阻止引物結合和酶的延伸。P

CR添加劑，涉及甲酰胺,DMSO,甘油，甜菜堿以及PCRxEnhancerSolu

tion可以增強擴增。它們也許的機理是減少熔解溫度，從而有助于引物退火

并輔助DNA聚合酶延伸通過二級結構區(qū)。PCRxSolution尚有其他優(yōu)點。

在同P1atinumTaqDNA聚合酶和PlatinumPfxDNA聚合酶一起使用

時，僅需很少的鎂離子優(yōu)化。這樣，將P1atinum技術同添加劑結合，增強了特

異性，同時減少了第三種方法■鎂離子優(yōu)化的依賴。為獲得最佳結果，應優(yōu)化添加

劑的濃度，特別是會克制TaqDNA聚合酶的DMS0,甲酰胺和甘油。心.

巢式PCR

使用巢式引物進行連續(xù)多輪擴增可以提高特異性和靈敏度。第一輪是15到2

0個循環(huán)的標準擴增。將一小部分起始擴增產物稀釋100到1000倍加入到

第二輪擴增中進行15到20個循環(huán)。或者,也可以通過凝膠純化將起始擴增產

物進行大小選擇。在第二輪擴增中使用一套巢式引物，其可以同第一套引物內

側的靶序列結合。巢式PCR的使用減少了擴增多個靶位點的也許性，由于同兩

套引物都互補的靶序列很少。而使用同樣的引物對進行總數(shù)相同的循環(huán)（30到

40）會擴增非特異性靶位點。巢式PCR可以增長有限量靶序列（如稀有mRN

A）的靈敏度，并且提高了困難PCR（如5RACE）的特異性。④

五、PCR產物測序A對于PCR產物的測序有兩個方式:1MDNA直接測序:

指直接分析不經(jīng)分離?的PCR擴增產物，假如各個位點上堿基序列都是一致的,

則所得信號是擬定的，否則,在那些有相異堿基的位點出現(xiàn)模糊信號，假如模

板在多數(shù)情況下被對的擴增，則少數(shù)的突變將被掩蓋，這是結果顯示的是模板的

序列.但是，當擴增的前幾輪即出現(xiàn)錯誤擴增并被后續(xù)的循環(huán)積累,這時就不再反

映模板的狀況.2.PCR產物經(jīng)克隆后測序：這是對單克隆測序，其結果是反

映單一擴增產物的序列，結果是擬定的.

A六、PCR污染與對策

PCR反映的最大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題

是易污染，極其微量的污染即可導致假陽性的產生.1A、污染因素

（一）標本間交叉污染標本污染重要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，

由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而導致互相間交叉污染;標本核酸

模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染;有些微生物標本特別是病

毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染.

（二）PCR試劑的污染：重要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、

容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.A（三）PCR擴增產物污染.

這是PCR反映中最重要最常見的污染問題.由于PCR產物拷貝量大（一般為

1013拷貝/ml）,遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的PCR產

物污染，就可導致假陽就可形成假陽性.△尚有一種容易忽視，最也許導致PCR

產物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠,在操作

時比較劇烈地搖動反映管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成

氣溶膠而污染.據(jù)計算一個氣溶膠顆?？珊?8000拷貝,因而由其導致的污染

是一個值得特別重視的問題Q（四）實驗室中克隆質粒的污染:在分子生物學實驗

室及某些用克隆質粒做陽性對照的檢查室，這個問題也比較常見.由于克隆質粒

在單位容積內含量相稱高，此外在純化過程中需用較多的用品及試劑，并且在

活細胞內的質粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力.其污染

也許性也很人.2M污染的監(jiān)測

一個好的實驗室，要時刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染是什么因素導致的污染，

以便采用措施，防止和消除污染Q對照實驗：S）陽性對照:在建立PCR反映實

驗室及一般的檢查單位都應設有PCR陽性對照，它是PCR反映是否成功、

產物條帶位置及大小是否合乎理論規(guī)定的一個重要的參考標志.陽性對照要選

擇擴增度中檔、反復性好,經(jīng)各種鑒定是該產物的標本，如以重組質粒為陽性對

照，其含量宜低不宜高（100個拷貝以下）.但陽性對照特別是重組質粒及高濃

度陽性標本，其對檢測或擴增樣品污染的也許性很大.因而當某一PCR試劑

經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢查人員心中有數(shù)時，在以后的實驗中可免設陽性對照.

2）陰性對照:每次PCR實驗務必做陰性對照.它涉及①標本對照:被檢的標不是

血清就用鑒定后的正常血清作對照;被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細

胞作對照.②試劑對照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進行PCR

擴增，以監(jiān)測試劑是否污染.

3）反復性實驗心）選擇不同區(qū)域的引物進行PCR擴增

3、防止污染的方法

（一）合理分隔實驗室:招樣品的解決、配制PCR反映液、PCR循環(huán)擴增及P

CR產物的鑒定等環(huán)節(jié)分區(qū)或分室進行，特別注意樣本解決及PCR產物的鑒定

應與其它環(huán)節(jié)嚴格分開.最佳能劃分①標本解決區(qū)；②PCR反映液制備區(qū);③PC

R循環(huán)擴增區(qū)；④PCR產物鑒定區(qū).其實驗用品及吸樣槍應專用.實驗前應

將實驗室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA.

（二）吸樣槍:吸樣槍污染是一個值得注意的問題.由于操作時不慎將樣品或模板

核酸吸入槍內或粘上槍頭是一個嚴重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時要

十分小心，吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完畢，忌多次抽吸，以免交叉污染或產氣

憤溶膠污染內三）預混和分裝PCR試劑：所有的PCR試劑都應小量分裝，如

有也許，PCR反映液應預先配制好，然后小量分裝，?20℃保存.以減少反復加

樣次數(shù)，避免污染機會.此外，PCR試劑,PCR反映液應與樣品及PCR產物

分開保存，不應放于同一冰盒或同一冰箱.

（四）防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應一次性使用.

（五）設立適當?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ?，陽性對照以能出現(xiàn)擴增條帶的最低量的標

準病原體核酸為宜,并注意交叉污染的也許性，每次反映都應有一管不加模板的

試劑對照及相應不具有被擴增核酸的樣品作陰性對照.

（六）減少PCR循環(huán)次數(shù)，只要PCR產物達成檢測水平就適可而止.

（七）選擇質量好的Eppendorf管,以避免樣本外溢及外來核酸的進入，打

開離心管前應先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部.開管動作要把,以防管

內液體濺出.A4、PCR污染解決對策（這是從另一篇文章總結而來，與前面的

部分略有反復，大家隨便看看吧）PCR檢測微量感染因子時，一定要注意產物殘

留污染的問題。A

一.污染的防止A進行PCR操作時，操作人員應當嚴格遵守一些操作規(guī)程，最

大限度地減少也許出現(xiàn)的APCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)。④（一）劃分操作區(qū)：

目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實現(xiàn)完全團管操作,但無論是否可以達成

單人單管,均規(guī)定實驗操作在三個不同的區(qū)域內進行FCR的前解決和后解決

要在不同的隔離區(qū)內進行：1A.標本解決區(qū)，涉及擴增摸板的制備;2A.pcR

擴增區(qū)，涉及反映液的配制和PCR擴增；3A,產物分析區(qū)，凝膠電泳分析，

產物拍照及重組克隆的制備。A各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材專用,要有一

定的方向性。如:標本制備-PCR擴增？產物分析？產物解決…牢記產物分

析區(qū)的產物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū)。

（二）分裝試劑:PCR擴增所需要的試劑均應在裝有紫外燈的超凈工作臺或負

壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴增

后的DNA和其他來源

的DNA：

1.PCR用水應為高壓的雙蒸水；

2.引物和dNTP用高壓的雙蒸水在尢PCR擴增產物區(qū)配制；裂.引物和dNT

P應分裝儲存，分裝時應標明時間，以備發(fā)生污染時查找因素。A（三）實驗操

作注意事項盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反映的因素，樣品間的交

叉污染也是因素之一。因此，不僅要在進行擴增反映是謹慎認真，在樣品的收集、

抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應當注意：

1.戴一次性手套，若不小心濺上反映液，立即更換手套；

2.使用一次性吸頭,嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用,吸頭不要長時間暴露

于空氣中,避免氣溶膠的污染；

3.避免反映液飛濺，打開反映管時為避免此種情況,開蓋前稍離心收集液體于管

底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面;心.操

作多份樣品時，制備反映混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好,然后分

裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增長反映的精確度35.最后加入反

映模板，加入后蓋緊反映管；

6.操作時設立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反映的可靠性，又可以

協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性；

7.盡也許用可替換或可高壓解決的加樣器，由于加樣器最容易受產物氣溶膠

或標本DNA的污染，最佳使用可替換或高壓解決的加樣器。如沒有這種特殊

的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應當專用，不能交叉使用，特別是PCR

產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū)；A8.反復實驗，驗證結果，慎下結

論。④

二.追蹤污染源

假如不慎發(fā)生污染情況，應從下面幾條出發(fā)，逐個分析，排除污染。

（一）設立陰陽性對照:有助于監(jiān)測反映體系各成分的污染情況。選擇陽性對照時,

應選擇擴增弱，且反復性好的樣品，因強陽性對照可產生大量不必要的擴增序列，

反而也許成為潛在的污染源。假如以含靶序列的重組質粒為對照，100個拷貝

之內的靶序列就足以產生陽性擴增。陰性對照的選擇亦要慎重，由于PCR敏感

性極高，可以從其它方法（Sourthern印跡或點雜交等）檢測陰性的標本中檢測

出極微量的靶分子。此外，每次擴增均應涉及PCR體系中各試劑的時機對照，

即涉及PCR反映所需的所有成分，而不加模板DNA,這對監(jiān)測試劑中PCR

產物殘留污染是非常有益的。假如擴增結果中試劑對照為陽性結果，就是某一

種或數(shù)種試劑被污染了。此時，要所有更換一批新的試劑進行擴增，擴增時設

立不同的反映管，每一管具有一種被檢測試劑，在檢出污染試劑后，應立即解

決。A（二）環(huán)境污染:在排除試劑污染的也許性外,更換試劑后，若不久又發(fā)現(xiàn)

試劑被污染了，假如防止措施比較嚴密，則考慮也許為環(huán)境污染。

環(huán)境污染中常見的污染源重要有：

1.模板提取時真空抽干裝置;A2.凝膠電泳加樣器;秘.電泳裝置;4.紫外分析

儀泠5.切膠用刀或手術刀片；

6.離心機；

7.冰箱門把手，冷凍架，門把手或實驗臺面等;此時可用擦拭實驗來查找可疑污

染源。1）用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源;2）0.1ml去離子水

浸泡；3）取5ml做PCR實驗；4）電泳檢測結果。

8.氣溶膠。假如通過上述追蹤實驗，仍不能查找到確切污染源，則污染也許是

由空氣中PCR產物的氣溶膠導致的，此時就應當更換實驗場合，若條件不允許，

則重新設計新的弓I物（與原引物無相關性）。A

三.污染解決

（-）環(huán)境污染

1.稀酸解決法：對可疑器具用1m。1/L鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA脫

喋吟泠2.紫外照射（UV）法：紫外波長（nm）一般選擇254/300nm,照射30

min即可。需要注意的是，選擇UV作為消除殘留PCR產物污染時，要考慮P

CR產物的長度與產物序列中堿基的分布,UV照射僅對500bp以上長片

段有效，對短片段效果不大。UV照射時,PCR產物中喀咤堿基會形成二聚體，

這些二聚體可使延伸終止，但并不是DNA鏈中所有喀咤均能形成二聚體，且

UV照射還可使二聚體斷裂。形成二聚體的限度取決于UV波長，喀陡二聚

體的類型及與二聚體位點相鄰核甘酸的序列。在受照射的長DNA鏈上，形成

二聚體缺陷的數(shù)量少于0.065/堿基，其他非二聚體的光照損傷（如環(huán)丁烷型喀

嚏復合體,胸腺喀唾乙二醇,DNA鏈間與鏈內的交聯(lián)和DNA斷裂等）均可終止T

aqDNA聚合酶的延伸。這些位點的數(shù)量與二聚體位點相稱。假如這些位點（

0.13/堿基）在DNA分子上隨機分布，一個500bp片段的DNA分子鏈上將有3

2處損傷位點，那么,105個這樣的分子中每個分子中會至少有一處損傷。相反，

假如100bp的片段，每條鏈上僅有6處損傷，105個拷貝分子中將有許多分子

沒有任何損傷。這就是UV照射有一定的片段長度限制的因素。A△（二）反映液

污染A可采用下列方法之一解決：

1.DNaseI法:PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5UDNa

seI,室溫反映30min后加熱滅活，然后加入模板和Taq聚合酶進行正常

PCR擴增。該方法的優(yōu)點是不需要知道污染DNA的序列；

2.內切酶法：選擇辨認4個堿基的內切酶（如MspI和TaqI等），

可同時選擇幾種，以克服用一種酶只能辨認特定序列的缺陷，室溫作用1h后加

熱滅活進行PCR；

3.紫外照射法:未加模板和Taq聚合前的PCR混合液進行紫外照射，注意

事項與方法同上述UV照射法;張.g射線輻射法：1.5kGy的輻射可完

全破壞0.1ng基因組DNA,2.0kGy可破壞104拷貝的質粒分子,4.0k

Gy仍不影響PCR,但高于此限度會使PCR擴增效率下降。引物可受照射而

不影響PCR,g射線是通過水的離子化產生自由基來破壞DNA的。

4（三）尿喀咤糖甘酶（UNG）法

由于UV照射的去污染作用對500bp以下的片段效果不好，而臨床用于檢測

的PCR擴增片段通常為300bp左右，因此UNG的防止作用日益受到直