miR-122對人乳頭瘤病毒E6蛋白表達(dá)的抑制效應(yīng)與機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義宮頸癌作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在女性癌癥中占據(jù)顯著地位。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，全球新增宮頸癌病例約60.4萬例，死亡病例約34.2萬例，嚴(yán)重影響著女性的生命質(zhì)量與壽命。長期以來，大量的流行病學(xué)、分子生物學(xué)研究已明確，人乳頭瘤病毒（HumanPapillomavirus，HPV）持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的主要病因。HPV病毒基因組包含多個開放閱讀框，其中E6和E7蛋白被公認(rèn)為是致癌的關(guān)鍵蛋白。HPVE6蛋白在宮頸癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中扮演著至關(guān)重要的角色，具有多重致癌機(jī)制。E6蛋白能夠與細(xì)胞內(nèi)重要的抑癌基因p53緊密結(jié)合，通過招募E6相關(guān)蛋白（E6-associatedprotein，E6AP）形成復(fù)合物，促進(jìn)p53蛋白發(fā)生泛素化修飾，進(jìn)而被蛋白酶體降解，導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控紊亂，細(xì)胞獲得無限增殖能力。研究表明，在超過90%的宮頸癌組織中，均檢測到E6蛋白高表達(dá)以及p53蛋白的異常缺失或低表達(dá)。E6蛋白還可干擾細(xì)胞內(nèi)其他重要的信號通路，如通過與hDlg、Paxillin等細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白相互作用，破壞細(xì)胞極性和細(xì)胞間連接，增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。E6蛋白能夠激活端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）的表達(dá)，維持端粒長度，使癌細(xì)胞得以持續(xù)增殖，逃避細(xì)胞衰老和凋亡。這些研究充分表明，E6蛋白在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等多個關(guān)鍵環(huán)節(jié)中發(fā)揮著核心驅(qū)動作用。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）作為一類內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，長度約為22個核苷酸，廣泛存在于各種生物體中，通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）部分互補(bǔ)配對，在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控。miRNA參與了生物體幾乎所有重要的生物學(xué)過程，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝以及免疫調(diào)節(jié)等。異常表達(dá)的miRNA與多種人類疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其是在腫瘤領(lǐng)域，miRNA既可以作為抑癌基因抑制腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移，也可能充當(dāng)癌基因促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。miR-122最初被發(fā)現(xiàn)是肝臟特異性高表達(dá)的miRNA，約占肝臟中所有miRNA表達(dá)量的70%。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miR-122不僅在肝臟的發(fā)育、代謝等生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，還參與了多種肝臟疾病，如病毒性肝炎、肝硬化、肝細(xì)胞癌等的病理進(jìn)程。越來越多的研究證據(jù)表明，miR-122在其他類型的腫瘤中也具有重要的調(diào)控功能，其表達(dá)水平的異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。近期的研究發(fā)現(xiàn)，miR-122在宮頸癌中表達(dá)下調(diào)，并且初步研究提示miR-122可能對HPVE6蛋白的表達(dá)具有抑制作用，但其具體的作用機(jī)制以及對宮頸癌生物學(xué)行為的影響尚不完全清楚。本研究聚焦于miR-122對HPVE6蛋白表達(dá)的抑制作用及其深層次分子機(jī)制。通過深入探究miR-122與HPVE6蛋白之間的調(diào)控關(guān)系，有望揭示宮頸癌發(fā)生發(fā)展的新機(jī)制，為宮頸癌的早期診斷、精準(zhǔn)治療以及預(yù)后評估提供全新的理論依據(jù)和潛在的分子靶點(diǎn)。在基礎(chǔ)研究層面，這將豐富我們對HPV致癌機(jī)制以及miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用機(jī)制的認(rèn)識；在臨床應(yīng)用方面，可能為開發(fā)基于miR-122的新型靶向治療策略提供理論基礎(chǔ)，從而提高宮頸癌患者的治療效果和生存質(zhì)量，具有重要的科學(xué)價值和臨床意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1HPV的研究現(xiàn)狀HPV作為一類雙鏈環(huán)狀DNA病毒，其病毒顆粒由蛋白衣殼和核心單拷貝的病毒基因組DNA構(gòu)成。自1974年ZurHausen首次提出HPV感染與宮頸癌關(guān)系密切，報道宮頸癌中HPV陽性率高達(dá)99％，HPV的研究便成為了醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的焦點(diǎn)之一。目前，已鑒定出超過200種HPV亞型，根據(jù)其致癌性，可分為高危型和低危型。高危型HPV，如HPV-16、18、31、33、45等，持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的主要病因；低危型HPV，如HPV-6、11等，通常與良性病變，如尖銳濕疣等相關(guān)。HPV病毒基因組包含多個開放閱讀框，其中E6和E7基因是病毒的主要致癌基因。HPVE6蛋白能夠與細(xì)胞內(nèi)的多種關(guān)鍵蛋白相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞周期失控、細(xì)胞凋亡受阻以及基因組不穩(wěn)定等一系列惡性生物學(xué)行為。E6蛋白與p53蛋白結(jié)合，通過招募E6AP形成E6-E6AP-p53復(fù)合物，促使p53蛋白發(fā)生泛素化修飾，進(jìn)而被蛋白酶體降解，使得細(xì)胞無法正常啟動凋亡程序，持續(xù)增殖。E6蛋白還可通過激活端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）的表達(dá)，維持端粒長度，賦予癌細(xì)胞無限增殖的能力。研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌組織中，HPVE6蛋白的表達(dá)水平與腫瘤的分期、分級以及患者的預(yù)后密切相關(guān)，高表達(dá)的E6蛋白往往預(yù)示著更差的臨床結(jié)局。在HPV的檢測技術(shù)方面，目前常用的方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、雜交捕獲技術(shù)、基因芯片技術(shù)等。PCR技術(shù)具有高靈敏度和特異性，能夠準(zhǔn)確檢測出HPV的亞型；雜交捕獲技術(shù)則可實(shí)現(xiàn)對高危型HPV的定量檢測，有助于評估病毒載量與疾病進(jìn)展的關(guān)系；基因芯片技術(shù)則可同時檢測多種HPV亞型，具有高通量、快速的特點(diǎn)。這些檢測技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，為HPV感染的早期診斷和防治提供了有力的技術(shù)支持。1.2.2miR-122的研究現(xiàn)狀miR-122作為一種長度約22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，最初被發(fā)現(xiàn)是肝臟特異性高表達(dá)的miRNA，在肝臟的發(fā)育、代謝以及疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在肝臟發(fā)育過程中，miR-122的表達(dá)水平逐漸升高，其通過靶向切割或抑制靶基因的翻譯，調(diào)控肝臟細(xì)胞的分化和成熟。研究表明，miR-122可通過抑制CUTL1基因的表達(dá)，促進(jìn)肝臟細(xì)胞的分化，CUTL1是一種肝臟細(xì)胞發(fā)育中某些特定基因的轉(zhuǎn)錄抑制子，miR-122表達(dá)水平的升高使其靶基因CUTL1表達(dá)下調(diào)，從而間接參與肝臟細(xì)胞的分化。在肝臟代謝方面，miR-122參與了膽固醇、脂肪酸和甘油三酯等脂質(zhì)代謝過程。miR-122通過靶向結(jié)合低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1（LRP1）的mRNA，抑制其表達(dá)，從而調(diào)節(jié)肝臟對膽固醇的攝取和代謝。miR-122還可通過調(diào)控脂肪酸合成酶（FASN）、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）等關(guān)鍵酶的表達(dá)，影響脂肪酸的合成和代謝。miR-122與多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在丙型肝炎病毒（HCV）感染中，miR-122可與HCV基因組的5'非編碼區(qū)（5'UTR）特異性結(jié)合，促進(jìn)HCV的復(fù)制和翻譯，成為HCV感染的關(guān)鍵宿主因子?；谶@一機(jī)制，開發(fā)針對miR-122的反義寡核苷酸（ASO），可有效抑制HCV的復(fù)制，為HCV感染的治療提供了新的策略。在肝細(xì)胞癌（HCC）中，miR-122的表達(dá)水平顯著下調(diào)，其通過靶向多個癌基因和信號通路，如Ras、c-Myc、PI3K/AKT等，發(fā)揮抑癌作用。研究發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)miR-122在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，可抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。除了肝臟疾病，miR-122在其他腫瘤中的作用也逐漸受到關(guān)注。在乳腺癌、胃癌、肺癌等腫瘤中，miR-122的表達(dá)水平發(fā)生異常改變，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在乳腺癌中，miR-122可通過抑制HER2基因的表達(dá)，降低癌細(xì)胞對曲妥珠單抗的耐藥性，增強(qiáng)化療效果；在胃癌中，miR-122可通過靶向調(diào)控MMP2、MMP9等基因的表達(dá)，抑制癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。1.2.3miR-122對HPVE6蛋白表達(dá)抑制機(jī)制的研究現(xiàn)狀近年來，隨著對miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用機(jī)制研究的不斷深入，miR-122與HPVE6蛋白之間的調(diào)控關(guān)系逐漸受到關(guān)注。已有研究初步表明，miR-122可能通過直接靶向HPVE6mRNA的3'UTR，抑制其翻譯過程，從而降低HPVE6蛋白的表達(dá)水平。使用RNAhybrid軟件，鑒定了miR-122與HPV16E6mRNA之間的潛在結(jié)合位點(diǎn)，通過過表達(dá)和敲低miR-122功能實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了miR-122可以直接與HPV16E6mRNA結(jié)合并顯著抑制其表達(dá)。然而，目前關(guān)于miR-122對HPVE6蛋白表達(dá)抑制機(jī)制的研究仍存在諸多不足。一方面，miR-122與HPVE6mRNA結(jié)合的具體分子機(jī)制尚未完全明確，包括結(jié)合位點(diǎn)的精確位置、結(jié)合親和力以及結(jié)合后對mRNA結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的影響等，仍有待進(jìn)一步深入研究。雖然已鑒定出潛在結(jié)合位點(diǎn)，但這些位點(diǎn)在不同HPV亞型中的保守性以及其對miR-122調(diào)控作用的影響尚未系統(tǒng)研究。另一方面，miR-122是否通過其他間接途徑影響HPVE6蛋白的表達(dá)，如通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的信號通路，影響HPVE6基因的轉(zhuǎn)錄或E6蛋白的穩(wěn)定性等，目前尚不清楚。在細(xì)胞內(nèi)，信號通路復(fù)雜交織，miR-122可能通過調(diào)控多個信號分子，間接影響HPVE6蛋白的表達(dá)，但相關(guān)研究仍處于探索階段。此外，miR-122對HPVE6蛋白表達(dá)的抑制作用在體內(nèi)的生理病理意義以及其與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，還需要更多的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床研究來驗(yàn)證。目前大多數(shù)研究僅在細(xì)胞水平進(jìn)行，缺乏動物模型和臨床樣本的驗(yàn)證，限制了對其實(shí)際應(yīng)用價值的評估。1.3研究內(nèi)容與方法1.3.1研究內(nèi)容構(gòu)建miR-122穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系：選取HPV陽性的宮頸癌細(xì)胞系，如SiHa、CaSki細(xì)胞系，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法或慢病毒感染法，將攜帶miR-122基因的表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞中，通過G418篩選或熒光標(biāo)記篩選，獲得miR-122穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆。使用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）和Westernblot技術(shù)，對篩選得到的細(xì)胞克隆進(jìn)行鑒定，確保miR-122在細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定且高效的表達(dá)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供穩(wěn)定的細(xì)胞模型。檢測miR-122對HPVE6蛋白表達(dá)的影響：運(yùn)用Westernblot實(shí)驗(yàn)，檢測miR-122穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系以及對照細(xì)胞系中HPVE6蛋白的表達(dá)水平，分析miR-122過表達(dá)對E6蛋白表達(dá)的抑制作用。通過設(shè)置不同的時間點(diǎn)和miR-122表達(dá)梯度，研究miR-122對E6蛋白表達(dá)抑制作用的時效性和劑量依賴性。利用RT-PCR技術(shù)，檢測HPVE6mRNA的表達(dá)水平，明確miR-122對E6基因轉(zhuǎn)錄的影響，從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平全面分析miR-122對HPVE6蛋白表達(dá)的調(diào)控作用。探究miR-122抑制HPVE6蛋白表達(dá)的機(jī)制：采用生物信息學(xué)方法，如TargetScan、miRanda等軟件，預(yù)測miR-122與HPVE6mRNA的潛在結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建包含野生型和突變型E6mRNA3'UTR的熒光素酶報告基因載體，將其與miR-122mimics或inhibitor共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，通過檢測熒光素酶活性，驗(yàn)證miR-122與E6mRNA的直接靶向關(guān)系。利用免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)，確定miR-122是否與E6蛋白存在直接相互作用，并進(jìn)一步探究其作用機(jī)制。研究miR-122對細(xì)胞內(nèi)與E6蛋白相關(guān)信號通路，如p53信號通路、PI3K/AKT信號通路等的影響，探討miR-122是否通過調(diào)控這些信號通路間接影響HPVE6蛋白的表達(dá)。分析miR-122抑制HPVE6蛋白表達(dá)對細(xì)胞生物學(xué)意義：通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，如CCK-8法、EdU摻入法，檢測miR-122抑制HPVE6蛋白表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞增殖能力的影響。運(yùn)用細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)，如AnnexinV-FITC/PI雙染法、TUNEL法，分析miR-122對宮頸癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。開展細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，如Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)，研究miR-122抑制E6蛋白表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。通過裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，將miR-122穩(wěn)定表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞和對照細(xì)胞分別接種到裸鼠體內(nèi)，觀察腫瘤的生長情況，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-122在體內(nèi)對宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。探討miR-122的生物學(xué)作用及其臨床應(yīng)用前景：收集宮頸癌患者的組織標(biāo)本和臨床資料，采用qRT-PCR技術(shù)檢測miR-122在宮頸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)水平，分析miR-122表達(dá)與患者臨床病理特征，如腫瘤分期、分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等的相關(guān)性。通過生存分析，評估m(xù)iR-122表達(dá)水平對宮頸癌患者預(yù)后的影響，探討其作為潛在預(yù)后標(biāo)志物的可能性?；谇捌趯?shí)驗(yàn)結(jié)果，探索以miR-122為靶點(diǎn)的宮頸癌治療策略，如設(shè)計(jì)合成miR-122類似物或抑制劑，進(jìn)行體內(nèi)外治療實(shí)驗(yàn)，評估其治療效果和安全性，為宮頸癌的臨床治療提供新的思路和方法。1.3.2研究方法細(xì)胞培養(yǎng)：將HPV陽性的宮頸癌細(xì)胞系SiHa、CaSki等復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時，先用PBS清洗細(xì)胞2次，加入適量0.25%胰蛋白酶消化液，消化1-2min，待細(xì)胞變圓脫落后，加入含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化，吹打均勻后，按1:3-1:5的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。Westernblot：收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液（含PMSF），冰上裂解30min，使細(xì)胞充分裂解。4℃、12000rpm離心15min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5min使蛋白變性。根據(jù)目的蛋白分子量大小，配制合適濃度的SDS-PAGE凝膠，將變性后的蛋白樣品上樣，進(jìn)行電泳分離。電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為100V、1-2h。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中，室溫封閉1h，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉后，將膜與一抗（如抗HPVE6抗體、抗β-actin抗體）4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，然后與相應(yīng)的二抗（如HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體）室溫孵育1h。再次用TBST洗膜3次，每次10min，最后采用化學(xué)發(fā)光試劑（如ECL試劑）進(jìn)行顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄結(jié)果。RT-PCR：使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，具體操作按照試劑說明書進(jìn)行。提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白測定儀檢測其完整性和純度。取1μg總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列根據(jù)目的基因（如HPVE6、miR-122、U6等）設(shè)計(jì)。PCR反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸30s，共35-40個循環(huán)；最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄結(jié)果，以U6作為內(nèi)參，采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。免疫共沉淀：收集細(xì)胞，加入適量IP裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min。4℃、12000rpm離心15min，取上清液，加入適量的抗體（如抗miR-122抗體、抗HPVE6抗體），4℃孵育過夜。次日，加入適量ProteinA/G磁珠，繼續(xù)4℃孵育2-4h，使抗體與磁珠結(jié)合。用磁力架分離磁珠，棄上清液，用IP洗滌緩沖液洗滌磁珠3-5次。最后，加入適量的SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5min，使結(jié)合在磁珠上的蛋白釋放出來。將釋放的蛋白樣品進(jìn)行Westernblot檢測，分析miR-122與HPVE6蛋白是否存在相互作用。細(xì)胞增殖和凋亡實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法，將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種5000-10000個細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，分別加入不同處理組（如miR-122mimics組、inhibitor組、對照組等）。培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1-4h，用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度值（OD值），以O(shè)D值表示細(xì)胞增殖活性。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)采用AnnexinV-FITC/PI雙染法，將細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后，進(jìn)行不同處理。處理結(jié)束后，收集細(xì)胞，用PBS清洗2次，加入適量BindingBuffer重懸細(xì)胞，再加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，避光孵育15-20min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。組織學(xué)檢測：收集宮頸癌患者的手術(shù)切除組織標(biāo)本和癌旁正常組織標(biāo)本，一部分標(biāo)本立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫涣硪徊糠謽?biāo)本用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，制成組織切片。采用qRT-PCR技術(shù)檢測組織中miR-122的表達(dá)水平，具體操作同細(xì)胞RNA提取和RT-PCR。對于石蠟切片，采用免疫組織化學(xué)（IHC）方法檢測HPVE6蛋白的表達(dá)，將切片脫蠟至水，進(jìn)行抗原修復(fù)，用3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，然后與一抗（抗HPVE6抗體）4℃孵育過夜。次日，用PBS洗片3次，每次5min，與二抗（如HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體）室溫孵育30-60min。再次用PBS洗片3次，每次5min，最后用DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。通過顯微鏡觀察并拍照記錄結(jié)果，分析miR-122和HPVE6蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)情況及其與臨床病理特征的關(guān)系。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1人乳頭瘤病毒（HPV）概述人乳頭瘤病毒（HumanPapillomavirus，HPV）屬于乳頭瘤病毒科乳頭瘤病毒屬，是一種雙鏈環(huán)狀DNA病毒，其病毒顆粒呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)，直徑約為45-55nm，由蛋白衣殼和核心單拷貝的病毒基因組DNA構(gòu)成。HPV的基因組長度約為7800-7900個堿基對（bp），根據(jù)功能可分為三個區(qū)域：早期區(qū)（Earlygene，E）、晚期區(qū)（Lategene，L）和上游調(diào)節(jié)區(qū)（Upstreamregulatoryregion，URR），也被稱為長控制區(qū)（Longcontrolregion，LCR）或者非編碼區(qū)。早期區(qū)含有E1、E2、E4、E5、E6和E7共6個基因，全長約4500bp，主要參與病毒基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程。E1蛋白具有ATP酶和解旋酶活性，與E2蛋白共同識別病毒基因組的復(fù)制起點(diǎn)，在病毒DNA復(fù)制起始和延伸過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。E2蛋白不僅參與病毒復(fù)制，還是病毒基因轉(zhuǎn)錄的主要調(diào)節(jié)因子，通過與病毒基因組上的特定序列結(jié)合，調(diào)控早期基因和晚期基因的轉(zhuǎn)錄。E4蛋白由E1和E4基因拼接而成，在病毒復(fù)制的晚期發(fā)揮作用，可與細(xì)胞內(nèi)的多種蛋白相互作用，影響細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和細(xì)胞周期進(jìn)程。E5蛋白是一種跨膜蛋白，能夠激活細(xì)胞內(nèi)的生長因子受體，如表皮生長因子受體（EGFR），促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化。晚期區(qū)含L1和L2兩個基因，長約2500bp，L1為主要衣殼蛋白，約占衣殼蛋白總量的80%，是高度保守的糖蛋白；L2為次要衣殼蛋白，是高度可變核蛋白。L1蛋白具有自我組裝成病毒樣顆粒（Virus-LikeParticles，VLP）的能力，VLP與天然的病毒顆粒具有完全相同的抗原表位，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)并產(chǎn)生保護(hù)性抗體，但由于其不含有病毒DNA，因此沒有感染性和致病性。L2蛋白在病毒感染過程中協(xié)助L1蛋白完成病毒顆粒的組裝，并參與病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的過程。上游調(diào)節(jié)區(qū)位于L1基因和E6基因之間，含有多個結(jié)合位點(diǎn)，包括啟動子、增強(qiáng)子等調(diào)控元件，參與調(diào)控病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄。該區(qū)域的序列具有高度的變異性，不同亞型的HPV在該區(qū)域的差異較大，這可能導(dǎo)致病毒在感染宿主細(xì)胞后的生物學(xué)行為和致病機(jī)制有所不同。根據(jù)HPV的致病潛力，可將其分為高危型（HR-HPV）、中間型和低危型（LR-HPV）三大類。高危型HPV，如HPV-16、18、31、33、45等，其持續(xù)性感染是造成宮頸癌及多種生殖道癌癥的主要病原體。在中國，69.1%的宮頸癌病例為HPV16和HPV18感染，14.7%為HPV31、33、52、58和59。低危型HPV，如HPV-6、11、42、43、44等，主要與各種良性的皮膚或黏膜病變，如扁平疣、尖銳濕疣等相關(guān)，并可致宮頸上皮內(nèi)瘤變CINI和部分CINⅡ。HPV與宮頸癌的關(guān)系極為密切，幾乎所有（99%以上）的宮頸癌組織中都能檢測到高危型HPV的感染。高危型HPV的基因組可與宿主基因組整合，干擾細(xì)胞的正常生長和分化，導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中，HPV的E6和E7基因起著關(guān)鍵的致癌作用。2.2miR-122概述miR-122是一種內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，屬于miRNA家族成員。它最早于2002年由Lagos-Quintana等人在研究小鼠肝臟組織的miRNA表達(dá)譜時發(fā)現(xiàn)。通過克隆測序技術(shù)，研究人員從肝臟組織的小RNA文庫中鑒定出了miR-122，發(fā)現(xiàn)其在肝臟中呈現(xiàn)高豐度表達(dá)。miR-122基因位于人染色體18q21.3區(qū)域，其前體（pre-miR-122）長度約為70-80個核苷酸，具有典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在細(xì)胞核內(nèi)，miR-122基因首先由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成初始轉(zhuǎn)錄本（pri-miR-122），pri-miR-122經(jīng)過核酸內(nèi)切酶Drosha及其輔助因子DGCR8的加工，切割形成pre-miR-122。隨后，pre-miR-122被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中被核酸內(nèi)切酶Dicer進(jìn)一步切割，形成成熟的miR-122，其長度約為22個核苷酸。miR-122在組織分布上具有高度的特異性，主要在肝臟中高表達(dá)，約占肝臟中所有miRNA表達(dá)量的70%。在肝臟發(fā)育過程中，miR-122的表達(dá)水平隨著肝臟細(xì)胞的分化和成熟逐漸升高，對肝臟的正常發(fā)育和功能維持起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-122通過靶向結(jié)合多個靶基因的mRNA，如CUTL1、ADAM17等，調(diào)控肝臟細(xì)胞的增殖、分化和代謝等生物學(xué)過程。除了在肝臟中高表達(dá)外，miR-122在其他組織和細(xì)胞中也有低水平的表達(dá)。在脂肪組織中，miR-122參與了脂肪細(xì)胞的分化和脂質(zhì)代謝過程，通過靶向調(diào)控脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)，影響脂肪細(xì)胞的功能。在心肌細(xì)胞中，miR-122的表達(dá)水平與心肌細(xì)胞的肥大和凋亡密切相關(guān)。研究表明，在心肌肥厚模型中，miR-122的表達(dá)水平顯著下調(diào)，過表達(dá)miR-122可抑制心肌細(xì)胞的肥大和凋亡，改善心臟功能。miR-122的功能十分廣泛，主要通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）部分互補(bǔ)配對，在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。當(dāng)miR-122與靶基因mRNA結(jié)合后，可通過兩種主要機(jī)制抑制靶基因的表達(dá)：一是抑制靶基因mRNA的翻譯過程，使核糖體無法正常結(jié)合和翻譯mRNA，從而減少蛋白質(zhì)的合成；二是誘導(dǎo)靶基因mRNA的降解，通過核酸酶的作用，使mRNA被切割和降解，降低其在細(xì)胞內(nèi)的含量。在肝臟疾病方面，miR-122與病毒性肝炎、肝硬化、肝細(xì)胞癌等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在丙型肝炎病毒（HCV）感染中，miR-122可與HCV基因組的5'非編碼區(qū)（5'UTR）特異性結(jié)合，促進(jìn)HCV的復(fù)制和翻譯，成為HCV感染的關(guān)鍵宿主因子。基于這一機(jī)制，開發(fā)針對miR-122的反義寡核苷酸（ASO），可有效抑制HCV的復(fù)制，為HCV感染的治療提供了新的策略。在肝細(xì)胞癌（HCC）中，miR-122的表達(dá)水平顯著下調(diào)，其通過靶向多個癌基因和信號通路，如Ras、c-Myc、PI3K/AKT等，發(fā)揮抑癌作用。研究發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)miR-122在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，可抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。在其他腫瘤中，miR-122也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在乳腺癌中，miR-122可通過抑制HER2基因的表達(dá)，降低癌細(xì)胞對曲妥珠單抗的耐藥性，增強(qiáng)化療效果；在胃癌中，miR-122可通過靶向調(diào)控MMP2、MMP9等基因的表達(dá)，抑制癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。越來越多的研究表明，miR-122作為一種重要的調(diào)控分子，在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其潛在的臨床應(yīng)用價值也逐漸受到關(guān)注。三、miR-122對HPVE6蛋白表達(dá)的影響3.1miR-122穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建為深入研究miR-122對HPVE6蛋白表達(dá)的影響，本研究選取了HPV陽性的宮頸癌細(xì)胞系SiHa和CaSki。SiHa細(xì)胞系含有單拷貝的HPV16基因組，CaSki細(xì)胞系則含有約600拷貝的HPV16基因組，這兩種細(xì)胞系在宮頸癌研究中被廣泛應(yīng)用，能夠?yàn)檠芯刻峁┝己玫募?xì)胞模型。將凍存的SiHa和CaSki細(xì)胞從液氮中取出，迅速放入37℃水浴鍋中進(jìn)行復(fù)蘇，待細(xì)胞完全融化后，用含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液，再用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時，用0.25%胰蛋白酶消化液進(jìn)行消化傳代，按1:3-1:5的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，以維持細(xì)胞的良好生長狀態(tài)。本研究采用慢病毒感染法構(gòu)建miR-122穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。首先，根據(jù)miR-122的成熟序列，設(shè)計(jì)并合成引物，通過PCR擴(kuò)增獲得miR-122基因片段。將擴(kuò)增得到的miR-122基因片段與慢病毒表達(dá)載體pGCSIL-GFP（含綠色熒光蛋白GFP基因）進(jìn)行連接，構(gòu)建重組慢病毒表達(dá)載體pGCSIL-GFP-miR-122。對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒pGCSIL-GFP-miR-122與包裝質(zhì)粒（如psPAX2、pMD2.G）共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，進(jìn)行慢病毒的包裝。轉(zhuǎn)染時，使用Lipofectamine3000試劑，按照試劑說明書進(jìn)行操作，將質(zhì)粒與Lipofectamine3000試劑混合，室溫孵育15-20min，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，然后將其加入到293T細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)48-72h。收集含有慢病毒的上清液，通過超速離心或超濾的方法濃縮病毒液，并測定病毒滴度。將對數(shù)生長期的SiHa和CaSki細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種5×10?個細(xì)胞，培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。將濃縮后的慢病毒液加入到細(xì)胞中，同時加入終濃度為8μg/mL的聚凝胺（Polybrene），以提高病毒感染效率。輕輕混勻后，繼續(xù)培養(yǎng)12-24h。更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72h，通過熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)情況，初步判斷病毒感染效率。為獲得穩(wěn)定表達(dá)miR-122的細(xì)胞系，使用嘌呤霉素進(jìn)行篩選。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的嘌呤霉素最佳篩選濃度，在感染后的細(xì)胞培養(yǎng)基中加入嘌呤霉素，每2-3天更換一次含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基。在篩選過程中，未感染慢病毒的細(xì)胞逐漸死亡，而成功感染并穩(wěn)定表達(dá)miR-122的細(xì)胞則能夠存活下來。經(jīng)過1-2周的篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)miR-122的SiHa和CaSki細(xì)胞克隆。將篩選得到的細(xì)胞克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）和Westernblot技術(shù)對miR-122穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系進(jìn)行鑒定。提取穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系和對照細(xì)胞系（未感染慢病毒的細(xì)胞）的總RNA和總蛋白。qRT-PCR檢測miR-122的表達(dá)水平，以U6作為內(nèi)參，采用2?ΔΔCt法計(jì)算miR-122的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，與對照細(xì)胞系相比，miR-122穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系中miR-122的表達(dá)水平顯著升高。Westernblot檢測miR-122靶分子的表達(dá)情況，以β-actin作為內(nèi)參，驗(yàn)證miR-122在細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)。結(jié)果表明，miR-122穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系中靶分子的表達(dá)水平明顯降低，進(jìn)一步證實(shí)了miR-122在細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定且高效的表達(dá)。3.2miR-122對HPVE6蛋白表達(dá)影響的檢測Westernblot實(shí)驗(yàn)，也被稱為蛋白質(zhì)免疫印跡，是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法，用于檢測樣品中特定蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。其原理基于抗原抗體特異性結(jié)合的免疫學(xué)原理，結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）的高分辨率蛋白質(zhì)分離能力。在該實(shí)驗(yàn)中，首先通過PAGE將蛋白質(zhì)樣品依據(jù)分子量大小進(jìn)行分離，隨后利用電轉(zhuǎn)技術(shù)將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固相膜（如硝酸纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜）上，使蛋白質(zhì)固定在膜上。接著，將膜與針對目標(biāo)蛋白的特異性抗體（一抗）孵育，一抗與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合。再加入標(biāo)記有酶（如辣根過氧化物酶，HRP）或熒光基團(tuán)的二抗，二抗與一抗特異性結(jié)合。最后，通過底物顯色（如使用DAB底物顯色）或化學(xué)發(fā)光（如使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑）的方法，使目標(biāo)蛋白條帶可視化，通過分析條帶的有無、強(qiáng)弱來確定目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況。本實(shí)驗(yàn)采用Westernblot技術(shù)檢測miR-122對HPVE6蛋白表達(dá)的影響，具體步驟如下：蛋白樣品制備：收集miR-122穩(wěn)定表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞系（實(shí)驗(yàn)組）和對照細(xì)胞系（未轉(zhuǎn)染miR-122的細(xì)胞，對照組），用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞2-3次，以去除培養(yǎng)液及其他雜質(zhì)。向細(xì)胞中加入適量含蛋白酶抑制劑和PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解30min，期間輕輕搖晃，使細(xì)胞充分裂解。將裂解后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15min，取上清液，即為總蛋白樣品。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書操作，將蛋白樣品稀釋至相同濃度，以便后續(xù)上樣量一致。SDS-PAGE電泳：根據(jù)目的蛋白HPVE6的分子量大小，配制合適濃度的分離膠和濃縮膠。一般情況下，HPVE6蛋白分子量約為15-18kDa，可配制12%-15%的分離膠。將配制好的分離膠緩慢倒入玻璃板之間，至膠高度約為玻璃板高度的2/3，隨后小心加入一層水飽和異丁醇或異丙醇封膠，以隔絕空氣，促進(jìn)膠的聚合。待分離膠聚合后（約30-60min），倒掉封膠液，用去離子水沖洗膠面2-3次，去除殘留的異丁醇或異丙醇。接著配制濃縮膠，倒入分離膠上方，立即插入梳子，避免產(chǎn)生氣泡。待濃縮膠聚合后（約20-30min），小心拔出梳子，用去離子水沖洗加樣孔，去除殘留的膠。將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5min使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品加入到加樣孔中，同時加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。接通電源，先以80V恒壓電泳至溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠，然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至距膠下緣約1cm處，停止電泳。轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后，小心撬開玻璃板，將凝膠從玻璃板上取下，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15-20min，使凝膠充分平衡。準(zhǔn)備一張與凝膠大小相同的PVDF膜，將PVDF膜放入甲醇中浸泡1-2min，使其活化，然后將PVDF膜放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15-20min。按照“海綿-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿”的順序，在轉(zhuǎn)膜夾中依次放置各層，每層之間要確保緊密貼合，避免產(chǎn)生氣泡。將轉(zhuǎn)膜夾放入轉(zhuǎn)膜槽中，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，接通電源，采用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為100V、1-2h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出PVDF膜，用麗春紅染液染色5-10min，觀察蛋白Marker條帶，確認(rèn)轉(zhuǎn)膜是否成功。染色后，用去離子水沖洗PVDF膜，直至背景無色。免疫反應(yīng)：將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜放入5%脫脂奶粉（用TBST配制）中，室溫封閉1h，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將膜與抗HPVE6抗體（一抗）4℃孵育過夜，一抗用5%脫脂奶粉按適當(dāng)比例稀釋（根據(jù)抗體說明書確定稀釋比例，一般為1:500-1:2000）。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的一抗。將膜與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（二抗）室溫孵育1h，二抗用5%脫脂奶粉按適當(dāng)比例稀釋（一般為1:2000-1:5000）。孵育結(jié)束后，再次用TBST洗膜3次，每次10min，去除未結(jié)合的二抗?；瘜W(xué)發(fā)光顯色：將ECL化學(xué)發(fā)光試劑A液和B液按1:1的比例混合，均勻滴加到PVDF膜上，使膜完全覆蓋試劑，室溫孵育1-2min。將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光成像儀中，曝光1-5min，根據(jù)條帶亮度調(diào)整曝光時間，獲取清晰的蛋白條帶圖像。結(jié)果分析方面，使用ImageJ等圖像分析軟件對Westernblot條帶進(jìn)行灰度值分析。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計(jì)算HPVE6蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值，作為HPVE6蛋白的相對表達(dá)量。通過比較實(shí)驗(yàn)組和對照組中HPVE6蛋白的相對表達(dá)量，分析miR-122對HPVE6蛋白表達(dá)的影響。若實(shí)驗(yàn)組中HPVE6蛋白的相對表達(dá)量顯著低于對照組，則表明miR-122過表達(dá)能夠抑制HPVE6蛋白的表達(dá)；反之，若實(shí)驗(yàn)組中HPVE6蛋白的相對表達(dá)量與對照組無明顯差異或高于對照組，則表明miR-122對HPVE6蛋白表達(dá)無抑制作用或可能促進(jìn)其表達(dá)。同時，設(shè)置不同時間點(diǎn)或不同miR-122表達(dá)水平的實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)一步研究miR-122對HPVE6蛋白表達(dá)抑制作用的時效性和劑量依賴性。3.3miR-122對HPVE6mRNA表達(dá)影響的檢測逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）是一種將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。其原理是首先提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以O(shè)ligo（dT）或隨機(jī)引物為引導(dǎo)，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后，以cDNA為模板，利用設(shè)計(jì)好的特異性引物，在TaqDNA聚合酶的作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得大量的目的基因片段或檢測基因的表達(dá)水平。RT-PCR技術(shù)極大地提高了RNA檢測的靈敏性，使對微量RNA樣品的分析成為可能，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析、RNA病毒檢測、cDNA克隆等領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR技術(shù)檢測miR-122對HPVE6mRNA表達(dá)的影響，具體步驟如下：總RNA提?。菏占痬iR-122穩(wěn)定表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞系（實(shí)驗(yàn)組）和對照細(xì)胞系（未轉(zhuǎn)染miR-122的細(xì)胞，對照組），用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞2-3次，去除培養(yǎng)液及雜質(zhì)。向細(xì)胞中加入適量TRIzol試劑，按照試劑說明書進(jìn)行操作，充分裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的RNA釋放出來。加入氯仿，劇烈振蕩后離心，使溶液分層，RNA存在于上層水相中。將水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入異丙醇，沉淀RNA。離心后棄上清，用75%乙醇洗滌RNA沉淀，晾干后用適量DEPC水溶解RNA。通過瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白測定儀檢測RNA的完整性和純度，確保RNA無降解且A260/A280比值在1.8-2.0之間，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：取1μg總RNA，加入適量的Oligo（dT）引物或隨機(jī)引物，70℃加熱5-10min，使RNA變性，然后迅速置于冰上冷卻。在反應(yīng)體系中加入5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNase抑制劑等，總體積為20μl。輕輕混勻后，42℃孵育60min，使mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。最后，70℃加熱15min使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，終止反應(yīng)。將得到的cDNA保存于-20℃?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增：根據(jù)HPVE6基因和內(nèi)參基因（如β-actin、GAPDH等）的序列，設(shè)計(jì)并合成特異性引物。引物設(shè)計(jì)遵循一定的原則，如引物長度一般為18-25個核苷酸，GC含量在40%-60%之間，避免引物自身或引物之間形成二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)等。PCR反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液，總體積為25μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3-5min，使DNA雙鏈完全解開；95℃變性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸30-60s，共進(jìn)行35-40個循環(huán)；最后72℃延伸5-10min，使擴(kuò)增產(chǎn)物充分延伸。瓊脂糖凝膠電泳：配制1.5%-2%的瓊脂糖凝膠，加入適量的核酸染料（如GoldView、EB等），使其均勻混合。將PCR產(chǎn)物與6×上樣緩沖液混合，然后加入到凝膠的加樣孔中，同時加入DNAMarker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在1×TAE或TBE電泳緩沖液中，以80-120V的電壓進(jìn)行電泳，使DNA片段在凝膠中遷移。電泳結(jié)束后，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中，觀察并拍照記錄結(jié)果。結(jié)果分析方面，通過凝膠成像系統(tǒng)分析PCR產(chǎn)物條帶的亮度和位置。以β-actin或GAPDH等內(nèi)參基因作為對照，采用2?ΔΔCt法計(jì)算HPVE6mRNA的相對表達(dá)量。具體計(jì)算方法為：首先計(jì)算目的基因（HPVE6）和內(nèi)參基因的Ct值，然后計(jì)算ΔCt值（目的基因Ct值減去內(nèi)參基因Ct值）。實(shí)驗(yàn)組和對照組的ΔCt值相減得到ΔΔCt值。最后，根據(jù)公式2?ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。若實(shí)驗(yàn)組中HPVE6mRNA的相對表達(dá)量顯著低于對照組，則表明miR-122過表達(dá)能夠抑制HPVE6mRNA的表達(dá)；反之，若實(shí)驗(yàn)組中HPVE6mRNA的相對表達(dá)量與對照組無明顯差異或高于對照組，則表明miR-122對HPVE6mRNA表達(dá)無抑制作用或可能促進(jìn)其表達(dá)。同時，可通過設(shè)置不同時間點(diǎn)或不同miR-122表達(dá)水平的實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)一步研究miR-122對HPVE6mRNA表達(dá)抑制作用的時效性和劑量依賴性。四、miR-122抑制HPVE6蛋白表達(dá)的機(jī)理4.1miR-122與HPVE6蛋白的相互作用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）實(shí)驗(yàn)是基于抗原與抗體之間的特異性結(jié)合原理，用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，能夠在接近生理?xiàng)l件的狀態(tài)下，從復(fù)雜的細(xì)胞或組織提取物中富集目標(biāo)蛋白及其結(jié)合伙伴，進(jìn)而分析蛋白質(zhì)復(fù)合體的組成，確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)是否存在生理性相互作用。在細(xì)胞裂解過程中，采用溫和的裂解條件，以維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的天然相互作用。當(dāng)使用針對目標(biāo)蛋白的特異性抗體進(jìn)行免疫沉淀時，與該目標(biāo)蛋白在體內(nèi)結(jié)合的其他蛋白質(zhì)也會一同被沉淀下來。通過對沉淀復(fù)合物進(jìn)行后續(xù)的蛋白質(zhì)分析技術(shù)，如SDS-PAGE和WesternBlotting等，可鑒定出與目標(biāo)蛋白相互作用的蛋白質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)采用免疫共沉淀技術(shù)，以確定miR-122與HPVE6蛋白是否存在直接相互作用，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：樣本制備：收集miR-122穩(wěn)定表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞系（實(shí)驗(yàn)組）和對照細(xì)胞系（未轉(zhuǎn)染miR-122的細(xì)胞，對照組），用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞2-3次，以去除培養(yǎng)液及其他雜質(zhì)。向細(xì)胞中加入適量含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的IP裂解液（如含1%NP-40的Tris-HCl緩沖液），冰上裂解30min，期間輕輕搖晃，使細(xì)胞充分裂解。將裂解后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15min，取上清液，即為總蛋白樣品。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品稀釋至相同濃度，以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。免疫沉淀：取適量的蛋白樣品，分別加入抗miR-122抗體和抗HPVE6抗體（實(shí)驗(yàn)組），以及正常IgG抗體作為陰性對照。將抗體與蛋白樣品充分混合，4℃孵育過夜，使抗體與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物。次日，加入適量ProteinA/G磁珠，繼續(xù)4℃孵育2-4h，使磁珠與抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合。ProteinA/G磁珠能夠特異性地結(jié)合抗體的Fc段，從而將抗原-抗體復(fù)合物沉淀下來。洗滌與洗脫：用磁力架分離磁珠，棄去上清液。用IP洗滌緩沖液（如含0.1%NP-40的Tris-HCl緩沖液）洗滌磁珠3-5次，每次洗滌時，將磁珠重懸于洗滌緩沖液中，輕輕振蕩或旋轉(zhuǎn)孵育5-10min，然后用磁力架分離，棄去上清液，以去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)。最后，加入適量的SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5min，使結(jié)合在磁珠上的蛋白釋放出來，得到免疫共沉淀產(chǎn)物。蛋白質(zhì)檢測：將免疫共沉淀產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)蛋白分子量大小將蛋白質(zhì)分離。電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中，室溫封閉1h，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉后，將膜與抗miR-122抗體或抗HPVE6抗體（一抗）4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，然后與相應(yīng)的二抗（如HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體）室溫孵育1h。再次用TBST洗膜3次，每次10min，最后采用化學(xué)發(fā)光試劑（如ECL試劑）進(jìn)行顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄結(jié)果。若在實(shí)驗(yàn)組中，使用抗miR-122抗體進(jìn)行免疫沉淀后，能夠檢測到HPVE6蛋白條帶，或者使用抗HPVE6抗體進(jìn)行免疫沉淀后，能夠檢測到miR-122條帶，而在陰性對照中未檢測到相應(yīng)條帶，則表明miR-122與HPVE6蛋白存在直接相互作用。為進(jìn)一步確定其作用機(jī)制，可對免疫共沉淀復(fù)合物進(jìn)行質(zhì)譜分析，鑒定與miR-122和HPVE6蛋白相互作用的其他蛋白質(zhì)，深入探究它們之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)和分子機(jī)制。同時，可通過突變miR-122或HPVE6蛋白的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，重復(fù)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，觀察相互作用的變化情況，以明確參與相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域或氨基酸殘基。4.2miR-122的胞內(nèi)靶向調(diào)控機(jī)制生物信息學(xué)在預(yù)測miR-122與HPVE6mRNA結(jié)合位點(diǎn)方面發(fā)揮著重要作用，它通過多種算法和數(shù)據(jù)庫，能夠快速、高效地從海量的基因數(shù)據(jù)中挖掘潛在的調(diào)控關(guān)系。常用的預(yù)測軟件包括TargetScan、miRanda、PicTar等，這些軟件基于不同的算法和原理，對miR-122與HPVE6mRNA的互補(bǔ)配對情況、結(jié)合自由能、位點(diǎn)保守性等因素進(jìn)行綜合分析，從而預(yù)測出可能的結(jié)合位點(diǎn)。以TargetScan為例，其算法主要基于種子序列匹配原則，即miR-122的5'端第2-8個核苷酸（種子區(qū)域）與HPVE6mRNA的3'UTR區(qū)域進(jìn)行精確匹配。同時，考慮到結(jié)合位點(diǎn)周圍的核苷酸組成、mRNA二級結(jié)構(gòu)等因素對結(jié)合穩(wěn)定性的影響。通過將miR-122的序列輸入到TargetScan軟件中，并設(shè)置相應(yīng)的參數(shù)，如物種為人類、數(shù)據(jù)庫為最新版本等，軟件會在HPVE6mRNA的3'UTR序列中搜索與miR-122種子區(qū)域互補(bǔ)配對的位點(diǎn)，并給出每個預(yù)測位點(diǎn)的結(jié)合分值和保守性評估。結(jié)合分值越高，表明miR-122與該位點(diǎn)的結(jié)合親和力越強(qiáng)；保守性評估則反映了該位點(diǎn)在不同物種間的保守程度，保守性越高，其生物學(xué)意義可能越重要。miRanda軟件則采用了更為復(fù)雜的算法，它不僅考慮了miR-122與HPVE6mRNA的堿基互補(bǔ)配對情況，還對結(jié)合位點(diǎn)的自由能進(jìn)行精確計(jì)算。自由能是衡量分子間相互作用穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，自由能越低，miR-122與HPVE6mRNA結(jié)合越穩(wěn)定。miRanda通過動態(tài)規(guī)劃算法，計(jì)算出miR-122與HPVE6mRNA結(jié)合時的最小自由能，并根據(jù)自由能閾值篩選出潛在的結(jié)合位點(diǎn)。同時，miRanda還會對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行多重過濾和驗(yàn)證，提高預(yù)測的準(zhǔn)確性。為了驗(yàn)證miR-122與HPVE6mRNA的結(jié)合及對其表達(dá)的抑制作用，本研究采用了熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)。熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)是一種常用的分子生物學(xué)技術(shù)，其原理是將目的基因的3'UTR區(qū)域克隆到熒光素酶報告基因載體的下游，當(dāng)該載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中后，熒光素酶的表達(dá)受到目的基因3'UTR的調(diào)控。如果miR-122能夠與目的基因3'UTR結(jié)合，就會抑制熒光素酶的表達(dá)，通過檢測熒光素酶活性的變化，即可判斷miR-122與目的基因3'UTR是否存在相互作用。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：構(gòu)建熒光素酶報告基因載體：根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增HPVE6mRNA的3'UTR野生型序列。以HPV陽性宮頸癌細(xì)胞系的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的3'UTR野生型序列克隆到熒光素酶報告基因載體（如pGL3-control載體）的多克隆位點(diǎn)處，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL3-E6-WT。同時，采用定點(diǎn)突變技術(shù)，對預(yù)測的miR-122結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，構(gòu)建突變型重組質(zhì)粒pGL3-E6-Mut。對構(gòu)建好的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序驗(yàn)證，確保插入序列的準(zhǔn)確性。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將宮頸癌細(xì)胞系（如SiHa細(xì)胞）接種于24孔板中，每孔接種5×10?個細(xì)胞，培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。將miR-122mimics（模擬miR-122的功能，促進(jìn)其表達(dá)）、miR-122inhibitor（抑制miR-122的功能，降低其表達(dá)）以及陰性對照（NC）分別與重組質(zhì)粒pGL3-E6-WT或pGL3-E6-Mut共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染時，使用Lipofectamine3000試劑，按照試劑說明書進(jìn)行操作，將質(zhì)粒和miR-122相關(guān)試劑與Lipofectamine3000試劑混合，室溫孵育15-20min，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，然后將其加入到細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)48-72h。熒光素酶活性檢測：轉(zhuǎn)染結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，用PBS沖洗細(xì)胞2-3次。按照熒光素酶檢測試劑盒（如Dual-LuciferaseReporterAssaySystem）的說明書，加入適量的細(xì)胞裂解液，冰上裂解15-20min，使細(xì)胞充分裂解。將裂解后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心5min，取上清液。將上清液加入到96孔板中，每孔加入適量的熒光素酶底物，立即用多功能酶標(biāo)儀檢測熒光素酶活性。同時，檢測內(nèi)參基因（如Renilla熒光素酶基因）的活性，用于校正轉(zhuǎn)染效率。以Renilla熒光素酶活性為內(nèi)參，計(jì)算Firefly熒光素酶活性與Renilla熒光素酶活性的比值，作為相對熒光素酶活性。結(jié)果分析方面，如果miR-122mimics與pGL3-E6-WT共轉(zhuǎn)染組的相對熒光素酶活性顯著低于陰性對照與pGL3-E6-WT共轉(zhuǎn)染組，而miR-122inhibitor與pGL3-E6-WT共轉(zhuǎn)染組的相對熒光素酶活性顯著高于陰性對照與pGL3-E6-WT共轉(zhuǎn)染組，則表明miR-122能夠與HPVE6mRNA的3'UTR野生型序列結(jié)合，抑制熒光素酶的表達(dá)。如果miR-122mimics或inhibitor與pGL3-E6-Mut共轉(zhuǎn)染組的相對熒光素酶活性與陰性對照與pGL3-E6-Mut共轉(zhuǎn)染組無明顯差異，則進(jìn)一步證實(shí)miR-122是通過與預(yù)測的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，發(fā)揮對HPVE6mRNA表達(dá)的抑制作用。4.3其他生物學(xué)路線分析干擾素信號通路在機(jī)體抗病毒免疫反應(yīng)中發(fā)揮著核心作用。干擾素（Interferon，IFN）是一類由機(jī)體細(xì)胞在病毒感染、雙鏈RNA刺激或其他免疫調(diào)節(jié)信號激活下產(chǎn)生的細(xì)胞因子。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能，可分為Ⅰ型（如IFN-α、IFN-β）、Ⅱ型（IFN-γ）和Ⅲ型（IFN-λ）干擾素。當(dāng)細(xì)胞受到病毒感染時，病毒核酸（如雙鏈RNA）被細(xì)胞內(nèi)的模式識別受體（PRRs）識別，激活一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終誘導(dǎo)干擾素基因的表達(dá)。干擾素分泌到細(xì)胞外后，與相鄰細(xì)胞表面的干擾素受體結(jié)合，激活JAK-STAT信號通路。在JAK-STAT信號通路中，干擾素與受體結(jié)合后，使受體相關(guān)的酪氨酸激酶JAK磷酸化并激活，進(jìn)而磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）。STAT蛋白磷酸化后形成二聚體，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與干擾素刺激基因（ISG）啟動子區(qū)域的特定序列結(jié)合，啟動ISG的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生一系列具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等功能的蛋白質(zhì)，如蛋白激酶R（PKR）、2'，5'-寡腺苷酸合成酶（OAS）、Mx蛋白等，這些蛋白質(zhì)通過不同的機(jī)制抑制病毒的復(fù)制和傳播。PKR可磷酸化真核起始因子eIF2α，抑制病毒蛋白的翻譯；OAS能夠激活核糖核酸酶L，降解病毒RNA；Mx蛋白則可抑制病毒的組裝和釋放。為研究miR-122對干擾素信號通路的影響，本研究通過轉(zhuǎn)染miR-122mimics或inhibitor，改變細(xì)胞內(nèi)miR-122的表達(dá)水平。采用實(shí)時熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)，檢測干擾素信號通路相關(guān)分子，如IFN-α、IFN-β、JAK1、STAT1、ISG15等的mRNA和蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)miR-122能夠顯著上調(diào)IFN-α、IFN-β的表達(dá)水平，同時增強(qiáng)JAK1、STAT1的磷酸化水平，促進(jìn)ISG15等干擾素刺激基因的表達(dá)。相反，抑制miR-122的表達(dá)則導(dǎo)致IFN-α、IFN-β表達(dá)下調(diào)，JAK1、STAT1磷酸化水平降低，ISG15等基因表達(dá)受到抑制。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-122對干擾素信號通路的影響，采用干擾素刺激實(shí)驗(yàn)。用干擾素（如IFN-α）處理細(xì)胞，同時轉(zhuǎn)染miR-122mimics或inhibitor，觀察細(xì)胞對干擾素的反應(yīng)。結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-122的細(xì)胞在干擾素刺激下，抗病毒蛋白的表達(dá)水平顯著升高，病毒復(fù)制受到明顯抑制；而抑制miR-122表達(dá)的細(xì)胞對干擾素的反應(yīng)減弱，抗病毒蛋白表達(dá)水平降低，病毒復(fù)制增加。在細(xì)胞內(nèi)，miR-122還可能與其他分子相互作用，間接影響HPVE6蛋白的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-122與腫瘤抑制因子p53存在密切的相互調(diào)控關(guān)系。p53作為一種重要的抑癌基因，在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。miR-122可通過直接靶向調(diào)控MDM2基因的表達(dá)，間接影響p53的穩(wěn)定性。MDM2是p53的負(fù)調(diào)控因子，能夠與p53結(jié)合，促進(jìn)p53的泛素化降解。miR-122通過抑制MDM2的表達(dá)，解除其對p53的抑制作用，使p53蛋白水平升高，進(jìn)而激活下游一系列與細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)的基因表達(dá)。在HPV感染的宮頸癌細(xì)胞中，miR-122與p53的相互作用可能對HPVE6蛋白的表達(dá)產(chǎn)生重要影響。HPVE6蛋白能夠通過與p53結(jié)合，促進(jìn)p53的降解，從而逃避細(xì)胞的凋亡機(jī)制。miR-122可能通過上調(diào)p53蛋白水平，增強(qiáng)細(xì)胞對HPVE6蛋白的免疫監(jiān)視和清除能力。研究表明，在miR-122過表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞中，p53蛋白水平升高，HPVE6蛋白的表達(dá)受到抑制，細(xì)胞的增殖和侵襲能力下降。miR-122還可能與其他信號通路中的關(guān)鍵分子相互作用，如PI3K/AKT信號通路、MAPK信號通路等。PI3K/AKT信號通路在細(xì)胞的增殖、存活、代謝等過程中發(fā)揮重要作用，該通路的異常激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-122可通過靶向調(diào)控PI3K/AKT信號通路中的關(guān)鍵分子，如PI3K、AKT等，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力。在HPV感染的宮頸癌細(xì)胞中，miR-122可能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路，間接影響HPVE6蛋白的表達(dá)和細(xì)胞的生物學(xué)行為。綜上所述，miR-122可能通過影響干擾素信號通路，以及與其他分子如p53、PI3K/AKT信號通路相關(guān)分子等相互作用，間接影響HPVE6蛋白的表達(dá)，這些間接作用機(jī)制為深入理解miR-122在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供了新的視角，也為宮頸癌的治療提供了更多潛在的靶點(diǎn)和策略。五、miR-122抑制HPVE6蛋白表達(dá)的生物學(xué)意義5.1對細(xì)胞增殖的影響細(xì)胞增殖是生物體生長、發(fā)育、繁殖和遺傳的基礎(chǔ)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，細(xì)胞的異常增殖是一個關(guān)鍵特征。檢測細(xì)胞增殖能力的方法眾多，其中CCK-8法和EdU摻入法是較為常用的兩種方法。CCK-8法，即CellCountingKit-8法，其原理基于WST-8（化學(xué)名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽）在電子耦合試劑1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-methoxyPMS）的作用下，被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，通過酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度值（OD值），可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量，從而評估細(xì)胞的增殖活性。EdU摻入法，EdU（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine）即5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷，是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖時期代替胸腺嘧啶（T）摻入正在復(fù)制的DNA分子中。通過基于EdU與熒光染料的Click反應(yīng)，即可直接并準(zhǔn)確地檢測出DNA復(fù)制活性。與傳統(tǒng)的BrdU檢測方法相比，EdU檢測法具有無需DNA變性、檢測時間短、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。本研究采用CCK-8法和EdU摻入法檢測miR-122抑制HPVE6蛋白表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞增殖能力的影響。以HPV陽性的宮頸癌細(xì)胞系SiHa和CaSki為研究對象，將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染miR-122mimics，過表達(dá)miR-122）、對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照NC）和空白組（未進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染處理）。CCK-8實(shí)驗(yàn)步驟如下：將對數(shù)生長期的細(xì)胞以每孔5000-10000個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5-6個復(fù)孔。培養(yǎng)24h后，按照分組分別加入miR-122mimics、陰性對照NC和無血清培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入10μLCCK-8試劑，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。將96孔板放入37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1-4h，使CCK-8試劑充分與細(xì)胞反應(yīng)。孵育結(jié)束后，用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的OD值。EdU摻入實(shí)驗(yàn)步驟如下：將細(xì)胞以每孔5×10?-1×10?個細(xì)胞的密度接種于24孔板中，每組設(shè)置3-4個復(fù)孔。培養(yǎng)24h后，按照分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理。轉(zhuǎn)染48h后，向培養(yǎng)基中加入EdU工作液，使其終濃度為10-50μM，繼續(xù)培養(yǎng)2-4h，使EdU充分摻入正在復(fù)制的DNA中。棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞2-3次，每次5min，以去除未摻入的EdU。加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min，固定結(jié)束后，用PBS清洗細(xì)胞2-3次。加入0.5%TritonX-100通透細(xì)胞10-15min，然后用PBS清洗細(xì)胞2-3次。按照EdU檢測試劑盒說明書，加入Click反應(yīng)液，避光孵育30min，使EdU與熒光染料發(fā)生Click反應(yīng)。孵育結(jié)束后，用PBS清洗細(xì)胞3-5次，最后加入Hoechst33342染液，室溫孵育10-15min，對細(xì)胞核進(jìn)行染色。用熒光顯微鏡觀察并拍照，隨機(jī)選取5-10個視野，計(jì)數(shù)EdU陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算EdU陽性細(xì)胞百分比，以評估細(xì)胞增殖能力。結(jié)果分析方面，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，對照組和空白組細(xì)胞的OD值逐漸升高，表明細(xì)胞在不斷增殖。而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-122mimics后，OD值顯著低于對照組和空白組，且在48h和72h時差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明miR-122過表達(dá)能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖活性。EdU摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果與CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中EdU陽性細(xì)胞百分比顯著低于對照組和空白組（P<0.05）。進(jìn)一步說明miR-122抑制HPVE6蛋白表達(dá)后，能夠有效降低宮頸癌細(xì)胞的DNA合成能力，抑制細(xì)胞增殖。綜上所述，miR-122抑制HPVE6蛋白表達(dá)后，能夠顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖能力，這一結(jié)果為深入理解miR-122在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為宮頸癌的治療提供了潛在的靶點(diǎn)和策略。5.2對細(xì)胞凋亡的影響細(xì)胞凋亡，又被稱為程序性細(xì)胞死亡，是一種由基因調(diào)控的細(xì)胞自主有序的死亡方式，在維持機(jī)體正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。細(xì)胞凋亡過程涉及一系列復(fù)雜的生化和形態(tài)學(xué)變化，包括細(xì)胞膜皺縮、染色質(zhì)凝聚、DNA斷裂、凋亡小體形成等。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，細(xì)胞凋亡機(jī)制的異常往往導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的無限增殖和存活，因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為腫瘤治療的重要策略之一。檢測細(xì)胞凋亡的方法眾多，其中AnnexinV-FITC/PI雙染法和TUNEL法是較為常用且靈敏度較高的兩種方法。AnnexinV-FITC/PI雙染法基于細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸（PS）外翻的特性。在正常細(xì)胞中，PS主要位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡早期，PS可從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。AnnexinV是一種分子量為35-36KD的Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將AnnexinV進(jìn)行異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記，以標(biāo)記了的AnnexinV作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將AnnexinV與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來?；罴?xì)胞表現(xiàn)為AnnexinV?/PI?，早期凋亡細(xì)胞為AnnexinV?/PI?，晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞則為AnnexinV?/PI?。TUNEL法，即末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法（Terminal-deoxynucleotidylTransferaseMediateddUTPNick-EndLabeling），是一種基于分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的細(xì)胞凋亡檢測方法。其原理是細(xì)胞在發(fā)生凋亡時，會激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶可以使染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端。在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將地高辛（Digoxigenin）或熒光素等標(biāo)記的dUTP連接到DNA的3'-末端，再通過與連接了報告酶（如過氧化物酶或堿性磷酸酶）的抗地高辛抗體或熒光顯微鏡檢測，從而特異準(zhǔn)確地定位出正在凋亡的細(xì)胞。該方法能夠?qū)ν暾膯蝹€凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，可用于石蠟切片、冰凍切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的凋亡測定，能檢測出極少量的凋亡細(xì)胞，靈敏度高。本研究采用AnnexinV-FITC/PI雙染法和TUNEL法檢測miR-122抑制HPVE6蛋白表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響。以HPV陽性的宮頸癌細(xì)胞系SiHa和CaSki為研究對象，將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染miR-122mimics，過表達(dá)miR-122）、對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照NC）和空白組（未進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染處理）。AnnexinV-