miR-199/ROCK1信號軸在腎癌發(fā)生發(fā)展中的分子調(diào)控機制與臨床意義研究一、引言1.1研究背景與意義腎癌，作為泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康。在全球范圍內(nèi)，其發(fā)病率約占全身惡性腫瘤的2%-3%，且呈逐年上升趨勢，其中80%以上為源于腎近曲小管的透明細(xì)胞癌，每年以2%的速度遞增。我國近年來腎癌的發(fā)病率和死亡率同樣均有上升趨勢。目前，腎癌的發(fā)病原因尚不十分清楚，這給預(yù)防工作帶來了極大的挑戰(zhàn)。在治療方面，手術(shù)切除仍是主要的治療方式。然而，盡管疾病篩查的普及和監(jiān)測手段的先進化使早期小腎癌發(fā)現(xiàn)率提高，但臨床中仍有不少局部進展期腎癌病例被檢出。約20%-30%的腎癌患者在明確診斷時已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或靜脈內(nèi)癌栓形成，轉(zhuǎn)移性腎癌大大降低了患者的生存率和治療效果。此外，即使進行了根治性手術(shù)切除，仍有20%-30%的患者在術(shù)后3年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。更為棘手的是，腎癌本身對傳統(tǒng)放療及化療并不敏感，這使得手術(shù)無法切除的晚期腎癌患者治療困難，預(yù)后較差，進展期腎癌的5年生存率低于10%，腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移仍是威脅患者生命的主要因素。因此，實現(xiàn)對腎癌患者的早期診斷及早期治療，具有至關(guān)重要的臨床意義。腎癌的早期發(fā)現(xiàn)及治療依賴于對其發(fā)生機制的深入闡明。然而，腎癌的起因、發(fā)生及發(fā)展過程極為復(fù)雜，涉及多種機制、多個基因及分子的共同參與，目前對各個方面因素的具體作用和重要程度尚難以判別，科學(xué)研究仍處于廣撒網(wǎng)、多點突破的階段。近年來，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，研究表明microRNA（miRNA）與多種惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，在腎癌的研究領(lǐng)域也不例外，這為腎癌的研究開辟了新的方向。miRNA是一類由18-25個核苷酸組成的單鏈小RNA，廣泛存在于真核生物細(xì)胞中。它由DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，但并不翻譯成蛋白質(zhì)，是一種非編碼小分子RNA。雖然其長度較短，卻在生物體內(nèi)發(fā)揮著不可或缺的作用。miRNA通過與靶基因RNA的互補配對，在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達進行調(diào)控，主要通過導(dǎo)致mRNA降解和翻譯抑制這兩種方式，來精細(xì)地調(diào)節(jié)基因的表達。眾多miRNA與其靶mRNA分子相互交織，組成了一個錯綜復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與包括細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞分化、發(fā)育、逆境應(yīng)答等多種重要的生物學(xué)過程。在腎癌中，已有研究發(fā)現(xiàn)多個miRNA表達異常，這些異常表達的miRNA通過對不同靶基因的調(diào)控，影響著腎癌細(xì)胞的各種生物學(xué)行為。例如，miR-200c、miR-141在腎癌細(xì)胞系中過表達時，可下調(diào)ZEB2蛋白表達，進而抑制腫瘤細(xì)胞的黏附和侵襲，展現(xiàn)出對腫瘤細(xì)胞侵襲能力的抑制作用；低表達于腎癌組織的miR-34a，能夠通過調(diào)控YY1抑制腎癌細(xì)胞的增殖和侵襲，對腎癌細(xì)胞的增殖和侵襲起到負(fù)向調(diào)控作用；miR-27a可下調(diào)FOX01表達，進而促進腎癌細(xì)胞的增殖，促進了腫瘤細(xì)胞的生長；miR-134通過靶向調(diào)節(jié)KRAS，起到抑制786-0腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用，對腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程進行調(diào)控。近年來，研究發(fā)現(xiàn)miR-199a在腎癌組織中呈低表達狀態(tài)，這一現(xiàn)象提示miR-199a可能作為一個抑癌基因，參與了腎癌的發(fā)生發(fā)展過程。在其他多種腫瘤中，如肝癌、宮頸癌、前列腺癌等，miR-199a同樣表達異常，并可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲力的改變而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在宮頸癌中，miR-199a的過表達可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移，并且能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1期的停滯和凋亡；而其缺失則可增強宮頸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。然而，在腎癌中，miR-199a的作用機制及其生物學(xué)功能研究尚少，很多機制尚未完全闡明，仍具有較大的潛在研究價值。在細(xì)胞的生命活動中，細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡是三個至關(guān)重要的過程，它們的失衡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。細(xì)胞增殖失控會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的大量擴增，為腫瘤的生長提供物質(zhì)基礎(chǔ)；細(xì)胞侵襲能力的增強則使得腫瘤細(xì)胞能夠突破原有的組織屏障，向周圍組織浸潤以及發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，大大增加了腫瘤治療的難度和患者的死亡風(fēng)險；而細(xì)胞凋亡的異常，無論是凋亡受阻還是過度凋亡，都會破壞細(xì)胞群體的動態(tài)平衡，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展進程。在腎癌中，深入研究這三個過程的調(diào)控機制，對于揭示腎癌的發(fā)病機制和尋找有效的治療靶點具有關(guān)鍵意義。Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶1（ROCK1）是一種蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶，當(dāng)與GTP結(jié)合的Rho結(jié)合時被激活。小gtpaserho在細(xì)胞的多種生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它通過穿梭于活性gtp結(jié)合型和非活性gdp結(jié)合型之間，調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞局部粘附和應(yīng)力纖維的形成，以及血小板和淋巴細(xì)胞的粘附和聚集，在胞質(zhì)分裂中也是必需的，并且在血清應(yīng)答因子的轉(zhuǎn)錄激活中起作用。ROCK1作為rho的下游效應(yīng)物，在細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路中處于關(guān)鍵位置，它磷酸化并激活LIM激酶，LIM激酶反過來磷酸化cofilin，抑制其肌動蛋白解聚活性，從而對細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)和運動能力產(chǎn)生影響。在腫瘤研究領(lǐng)域，越來越多的證據(jù)表明ROCK1參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，其異常表達與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。在一些腫瘤中，ROCK1的高表達促進了腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，增強了腫瘤的惡性程度。本研究聚焦于miR-199靶向調(diào)控ROCK1影響腎癌細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡的機制，具有重要的理論和實際意義。從理論層面來看，深入探究miR-199與ROCK1之間的靶向調(diào)控關(guān)系，以及這種調(diào)控如何影響腎癌細(xì)胞的增殖、侵襲及凋亡過程，有助于進一步揭示腎癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，完善腎癌的發(fā)病理論體系，為后續(xù)的基礎(chǔ)研究提供堅實的理論基礎(chǔ)。從實際應(yīng)用角度出發(fā)，明確miR-199和ROCK1在腎癌中的作用機制，有望為腎癌的早期診斷提供新的生物標(biāo)志物，通過檢測miR-199和ROCK1的表達水平，實現(xiàn)對腎癌的早期篩查和精準(zhǔn)診斷；同時，也為腎癌的治療開辟新的途徑，以miR-199和ROCK1為靶點，研發(fā)針對性的治療藥物或治療策略，提高腎癌的治療效果，改善患者的預(yù)后，具有巨大的臨床應(yīng)用潛力和社會經(jīng)濟效益。1.2miR-199與ROCK1概述miR-199是一類非編碼小分子RNA，在多種生物過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。其成熟體長度通常在18-25個核苷酸之間，雖序列短小，但蘊含著強大的生物學(xué)信息。miR-199的基因結(jié)構(gòu)獨特，它由特定的DNA區(qū)域轉(zhuǎn)錄而來，經(jīng)過一系列復(fù)雜的加工過程，最終形成具有生物活性的成熟miR-199。這一加工過程涉及多個酶和蛋白質(zhì)的協(xié)同作用，確保了miR-199的正確生成和功能發(fā)揮。在功能方面，miR-199展現(xiàn)出廣泛而重要的作用。研究表明，它在細(xì)胞增殖、凋亡和分化等基本生物學(xué)過程中扮演著不可或缺的角色。在細(xì)胞增殖調(diào)控中，miR-199通過與特定靶基因的相互作用，影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達，進而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖速率。在細(xì)胞凋亡過程中，miR-199能夠通過激活或抑制凋亡相關(guān)信號通路，決定細(xì)胞的生死命運。而在細(xì)胞分化方面，miR-199參與了多種細(xì)胞類型的分化調(diào)控，引導(dǎo)干細(xì)胞向特定細(xì)胞譜系分化，維持組織和器官的正常發(fā)育和功能。從分布來看，miR-199在人體的多種組織和器官中均有表達，但其表達水平存在明顯的組織特異性。在正常腎臟組織中，miR-199維持著相對穩(wěn)定的表達水平，對腎臟細(xì)胞的正常生理功能起到重要的調(diào)節(jié)作用。然而，在腎癌組織中，大量研究一致發(fā)現(xiàn)miR-199呈現(xiàn)低表達狀態(tài)，這種表達異常與腎癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，提示miR-199可能作為一種潛在的抑癌基因參與腎癌的發(fā)病機制。ROCK1，即Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶1，是一種蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路中占據(jù)關(guān)鍵地位。其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)包含多個功能域，這些功能域賦予ROCK1獨特的生物學(xué)活性。當(dāng)Rho蛋白與GTP結(jié)合并處于激活狀態(tài)時，ROCK1能夠與之結(jié)合并被激活，從而啟動下游一系列復(fù)雜的信號傳導(dǎo)事件。ROCK1的主要功能是通過磷酸化作用調(diào)節(jié)多種細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的活性，進而影響細(xì)胞的多種生物學(xué)行為。在細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)方面，ROCK1磷酸化并激活LIM激酶，LIM激酶進一步磷酸化cofilin，抑制其肌動蛋白解聚活性，使得細(xì)胞骨架得以穩(wěn)定和重塑，這對于細(xì)胞的形態(tài)維持、遷移和侵襲等過程至關(guān)重要。在細(xì)胞收縮性調(diào)控中，ROCK1參與調(diào)節(jié)肌動蛋白和肌球蛋白之間的相互作用，影響細(xì)胞的收縮能力，這在血管平滑肌收縮、細(xì)胞分裂等生理過程中發(fā)揮重要作用。此外，ROCK1還在細(xì)胞黏附、基因轉(zhuǎn)錄等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，通過與不同的蛋白質(zhì)相互作用，參與細(xì)胞內(nèi)多個信號通路的調(diào)控，維持細(xì)胞的正常生理功能。在組織分布上，ROCK1廣泛存在于人體的各種組織和細(xì)胞中，在腎臟組織中也有較高水平的表達。在正常腎臟生理狀態(tài)下，ROCK1參與維持腎臟細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能，調(diào)節(jié)腎臟的生理代謝過程。然而，在腎癌發(fā)生發(fā)展過程中，ROCK1的表達水平和活性常常發(fā)生改變，異常表達的ROCK1通過激活相關(guān)信號通路，促進腎癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，增強腫瘤的惡性程度，成為腎癌研究中的一個重要分子靶點。1.3研究目的和主要內(nèi)容本研究旨在深入探討miR-199對ROCK1的靶向調(diào)控作用，以及這種調(diào)控如何影響腎癌細(xì)胞的增殖、侵襲及凋亡過程，從而揭示腎癌發(fā)生發(fā)展的新機制，為腎癌的診斷和治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點。具體研究內(nèi)容如下：miR-199和ROCK1在腎癌組織及細(xì)胞系中的表達研究：采用qRT-PCR技術(shù)，檢測miR-199和ROCK1在腎癌組織及癌旁正常組織中的表達水平，分析其表達差異與腎癌患者臨床病理特征（如腫瘤分期、分級、轉(zhuǎn)移情況等）之間的相關(guān)性。同時，在多種腎癌細(xì)胞系（如A498、786-0等）中檢測miR-199和ROCK1的表達水平，并與正常腎小管上皮細(xì)胞系進行對比，明確miR-199和ROCK1在腎癌細(xì)胞中的表達特點。miR-199對腎癌細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡的影響研究：構(gòu)建miR-199過表達載體和miR-199抑制劑，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等方法將其導(dǎo)入腎癌細(xì)胞系中，獲得穩(wěn)定過表達或低表達miR-199的腎癌細(xì)胞株。利用MTT實驗、EdU染色實驗和平板克隆形成實驗，檢測細(xì)胞增殖能力的變化；通過Transwell實驗和劃痕愈合實驗，評估細(xì)胞侵襲和遷移能力的改變；運用流式細(xì)胞術(shù)，分析細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布的變化，從而全面揭示miR-199對腎癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。miR-199靶向調(diào)控ROCK1的機制研究：借助生物信息學(xué)工具（如TargetScan、miRanda等）預(yù)測miR-199的潛在靶基因，結(jié)合文獻報道和前期研究基礎(chǔ)，篩選出ROCK1作為重點研究對象。通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，驗證miR-199與ROCK1之間的靶向結(jié)合關(guān)系。構(gòu)建ROCK1野生型和突變型表達載體，與miR-199共轉(zhuǎn)染腎癌細(xì)胞，檢測熒光素酶活性的變化，確定miR-199對ROCK1的直接調(diào)控作用。進一步采用Westernblot等技術(shù)，檢測miR-199過表達或低表達時，ROCK1蛋白水平的變化，從分子層面闡明miR-199對ROCK1的調(diào)控機制。ROCK1對miR-199調(diào)控腎癌細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡的影響研究：在miR-199過表達或低表達的腎癌細(xì)胞中，同時干擾或過表達ROCK1，利用上述細(xì)胞功能實驗，檢測細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡能力的改變。通過恢復(fù)實驗，明確ROCK1是否參與miR-199對腎癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控過程，以及兩者之間的上下游關(guān)系。miR-199/ROCK1信號通路在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制研究：運用蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)，分析miR-199靶向調(diào)控ROCK1后，腎癌細(xì)胞內(nèi)差異表達的蛋白質(zhì)和信號通路。通過Westernblot、免疫熒光等方法，驗證關(guān)鍵信號通路分子的表達和激活狀態(tài)的變化。進一步采用信號通路抑制劑或激活劑處理細(xì)胞，研究miR-199/ROCK1信號通路對腎癌細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡的影響機制，揭示該信號通路在腎癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用。二、腎癌的現(xiàn)狀與miR-199、ROCK1研究進展2.1腎癌的流行病學(xué)、發(fā)病機制與治療現(xiàn)狀腎癌作為泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的健康，其流行病學(xué)特征呈現(xiàn)出一定的地域和人群差異。在全球范圍內(nèi)，腎癌的發(fā)病率約占全身惡性腫瘤的2%-3%，且呈逐年上升趨勢。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2022年全球腎癌發(fā)病人數(shù)約為43.5萬例，死亡人數(shù)約15.6萬例。在地域分布上，發(fā)達國家的發(fā)病率明顯高于發(fā)展中國家，以歐洲為例，尤其是捷克為代表的中歐地區(qū)，男性腎癌發(fā)病率高達20/10萬人口，女性腎癌發(fā)病率約為10.2/10萬人口。而多數(shù)亞洲、非洲國家和部分南美等發(fā)展中國家發(fā)病率相對較低。在中國，隨著經(jīng)濟的迅速發(fā)展和人民生活水平的提高，腎癌的發(fā)病率也逐漸增加。2005-2009年全國34-72個登記點統(tǒng)計的腎癌發(fā)病率約為4-5/10萬，男女患者發(fā)病率比例約為1.83:1，城市地區(qū)發(fā)病率是農(nóng)村地區(qū)的4.31倍。腎癌的發(fā)病機制極為復(fù)雜，目前尚未完全明確，但研究表明多種因素與之相關(guān)。遺傳因素在腎癌的發(fā)生中起著重要作用，部分腎腫瘤是在基因異?；A(chǔ)上發(fā)生的，如希佩爾-林道綜合征、遺傳性乳頭狀腎癌、遺傳性平滑肌瘤病腎癌等遺傳性腎癌綜合征，攜帶相關(guān)基因突變的個體患腎癌的風(fēng)險顯著增加。后天因素中，吸煙是明確的腎癌發(fā)病危險因素，吸煙者比從不吸煙者患腎癌的危險性高2倍，煙草中的二甲基亞硝基胺等有害物質(zhì)可能導(dǎo)致腎細(xì)胞發(fā)生癌變。肥胖與腎癌的發(fā)病也密切相關(guān)，肥胖可能導(dǎo)致體內(nèi)激素水平改變，脂肪細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子和脂肪因子，如瘦素、脂聯(lián)素等，可通過影響細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路，促進腎癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。高血壓患者患腎癌的風(fēng)險同樣較高，長期高血壓可能導(dǎo)致腎臟血管病變，進而影響腎細(xì)胞功能，增加癌變風(fēng)險。職業(yè)暴露也是不可忽視的因素，金屬廠工人、印刷工人、礦廠工人等長期接觸某些有害物質(zhì)，如石棉、皮革制品、石油產(chǎn)品等，其腎癌發(fā)病和死亡危險性增加。此外，長期從事放射工作也可增加患腎癌的風(fēng)險。不良生活習(xí)慣，如高蛋白、高脂肪、低纖維飲食，也被認(rèn)為是腎癌的危險因素之一。在治療方面，手術(shù)切除是目前腎癌的主要治療方式。對于早期腎癌患者，如果腫瘤較小，保腎手術(shù)（保留腎單位手術(shù)）是一種選擇，該手術(shù)方式可以保留患者的腎臟功能，降低術(shù)后發(fā)生慢性腎功能衰竭的風(fēng)險。然而，保腎手術(shù)難度較大，對手術(shù)醫(yī)生的技術(shù)要求較高，且術(shù)后存在一定的腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險。根治性切除手術(shù)則是切除整個腎臟和腎周脂肪組織，能夠徹底切除腫瘤，降低復(fù)發(fā)風(fēng)險，但會導(dǎo)致患者永久性失去一個腎臟，對患者的生理功能和生活質(zhì)量可能產(chǎn)生一定影響。對于腫瘤較大或已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，通常需要進行根治性切除手術(shù)。對于晚期腎癌患者，由于手術(shù)難以完全切除腫瘤，且腎癌對傳統(tǒng)放療及化療并不敏感，治療較為困難。近年來，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷進步，靶向治療和免疫治療為晚期腎癌患者帶來了新的希望。靶向治療藥物通過作用于腫瘤細(xì)胞的特定分子靶點，阻斷腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移信號通路，從而抑制腫瘤的發(fā)展。例如，索拉非尼、舒尼替尼等多激酶抑制劑，能夠抑制腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞增殖，延長患者的生存期。免疫治療則是通過激活患者自身的免疫系統(tǒng)，增強免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別和殺傷能力，如免疫檢查點抑制劑帕博利珠單抗、納武利尤單抗等，在晚期腎癌的治療中取得了一定的療效。然而，盡管不斷有新的治療藥物問世，但仍有部分患者治療效果不佳，中高?；颊呱嫫谌韵鄬^短，且即使采用靶免聯(lián)合治療，部分患者病情仍會進展。因此，深入研究腎癌的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點和治療方法，對于提高腎癌患者的治療效果和預(yù)后具有重要意義。2.2miR-199在腫瘤中的研究進展近年來，隨著對腫瘤分子機制研究的不斷深入，miR-199在腫瘤領(lǐng)域的研究逐漸成為熱點。大量研究表明，miR-199在多種腫瘤組織和細(xì)胞系中存在表達異常的情況，并且這種異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后等密切相關(guān)。在肝癌中，miR-199a呈現(xiàn)低表達狀態(tài)，其低表達與肝癌的惡性程度及不良預(yù)后相關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a可通過靶向調(diào)控多個基因，如mTOR、c-Met等，影響肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。通過上調(diào)miR-199a的表達，能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，促進細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抑癌作用。在宮頸癌中，miR-199a的表達水平同樣發(fā)生改變。有研究表明，miR-199a的過表達可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移，并且能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1期的停滯和凋亡；而其缺失則可增強宮頸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。miR-199a通過調(diào)節(jié)LAMC1、Cav-1、EZR、CyclinB1等蛋白的表達，以及Stat3、MAPK、PI3K/AKT等信號通路，影響宮頸癌的進展和預(yù)后，展現(xiàn)出在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要調(diào)控作用。在前列腺癌中，miR-199a的表達異常也被發(fā)現(xiàn)與腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)。miR-199a可通過調(diào)控相關(guān)靶基因，抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，促進細(xì)胞凋亡，對前列腺癌的發(fā)展起到抑制作用。臨床研究還發(fā)現(xiàn)，miR-199a的表達水平與前列腺癌患者的臨床分期、病理分級等指標(biāo)相關(guān)，提示其可能作為前列腺癌診斷和預(yù)后評估的潛在生物標(biāo)志物。在乳腺癌中，miR-199a被證實參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移過程。研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a能夠通過靶向作用于特定基因，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在三陰性乳腺癌中，miR-199a的低表達與腫瘤的侵襲性和不良預(yù)后相關(guān)，通過上調(diào)miR-199a的表達，可以顯著抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，為三陰性乳腺癌的治療提供了新的潛在靶點。在肺癌研究中，miR-199a同樣表現(xiàn)出重要的調(diào)控作用。有研究表明，miR-199a可通過靶向調(diào)控ROCK1等基因，影響肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在非小細(xì)胞肺癌中，miR-199a的低表達與腫瘤的惡性程度和不良預(yù)后相關(guān)，上調(diào)miR-199a的表達能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，促進細(xì)胞凋亡，為非小細(xì)胞肺癌的治療提供了新的思路。在腎癌領(lǐng)域，miR-199a同樣引起了廣泛關(guān)注。已有研究表明，miR-199a在腎癌組織中呈低表達狀態(tài)，且其表達水平與腎癌患者的原發(fā)腫瘤浸潤程度、腫瘤復(fù)發(fā)及預(yù)后不良有關(guān)。通過體外細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)，在腎癌細(xì)胞中過表達miR-199a，可導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制，影響細(xì)胞周期G1期阻滯，增加腫瘤細(xì)胞凋亡，降低腎癌細(xì)胞株的浸潤能力。然而，目前對于miR-199a在腎癌中的作用機制研究尚不夠深入，仍有許多未知的調(diào)控通路和靶基因有待進一步探索。深入研究miR-199a在腎癌中的作用機制，對于揭示腎癌的發(fā)病機制、尋找新的治療靶點以及改善患者預(yù)后具有重要意義，有望為腎癌的精準(zhǔn)治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。2.3ROCK1在腫瘤中的研究進展ROCK1作為Rho激酶家族的重要成員，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著關(guān)鍵角色，其異常表達與多種腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)。在腫瘤細(xì)胞增殖方面，ROCK1發(fā)揮著重要的促進作用。研究表明，在乳腺癌細(xì)胞中，ROCK1的高表達可激活下游的PI3K/AKT信號通路，促進細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達，從而加速細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)變，促進乳腺癌細(xì)胞的增殖。在肝癌細(xì)胞中，ROCK1通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組，為細(xì)胞的快速增殖提供必要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，同時，ROCK1還可通過磷酸化作用激活一些與細(xì)胞增殖相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，如c-Myc等，增強肝癌細(xì)胞的增殖能力。在肺癌細(xì)胞中，ROCK1可通過抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達，如Bax等，減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生，間接促進肺癌細(xì)胞的增殖。ROCK1在腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中同樣起著關(guān)鍵作用。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，ROCK1可通過磷酸化肌球蛋白輕鏈（MLC），增強細(xì)胞的收縮力，促使癌細(xì)胞突破基底膜，向周圍組織浸潤。同時，ROCK1還可調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，通過抑制E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達，上調(diào)N-鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）的表達，使上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，增強結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在黑色素瘤細(xì)胞中，ROCK1參與調(diào)節(jié)細(xì)胞偽足的形成和收縮，促進黑色素瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，并且ROCK1還可通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞外基質(zhì)成分，為黑色素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供有利條件。在腫瘤血管生成方面，ROCK1也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成是腫瘤血管生成的關(guān)鍵步驟，ROCK1可通過調(diào)節(jié)這些過程，促進腫瘤血管的生成。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中，ROCK1的激活可促進內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，增強其形成血管樣結(jié)構(gòu)的能力，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供充足的血液供應(yīng)。在腎癌研究領(lǐng)域，ROCK1同樣受到了廣泛關(guān)注。已有研究表明，ROCK1在腎癌組織中的表達水平明顯高于癌旁正常組織，且其高表達與腎癌的腫瘤分期、分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，抑制ROCK1的表達或活性，可顯著降低腎癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在體內(nèi)實驗中，使用ROCK1抑制劑處理腎癌移植瘤小鼠，可明顯抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，延長小鼠的生存期。進一步研究發(fā)現(xiàn)，ROCK1在腎癌中的作用機制可能與激活PI3K/AKT、MAPK等信號通路有關(guān)，通過調(diào)節(jié)這些信號通路中關(guān)鍵分子的磷酸化水平，影響腎癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。然而，目前對于ROCK1在腎癌中的具體調(diào)控機制尚未完全明確，仍需要進一步深入研究，以揭示其在腎癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用，為腎癌的治療提供新的靶點和策略。2.4miR-199與ROCK1的關(guān)系研究現(xiàn)狀近年來，miR-199與ROCK1之間的靶向調(diào)控關(guān)系在多種腫瘤研究中逐漸受到關(guān)注，二者在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著重要作用，其異常表達及相互作用與腫瘤的惡性程度及預(yù)后密切相關(guān)。在肺癌研究中，相關(guān)實驗表明miR-199a可通過靶向ROCK1，影響肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。通過上調(diào)miR-199a的表達，能夠抑制ROCK1的表達水平，進而抑制肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，促進細(xì)胞凋亡。在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染miR-199a模擬物后，細(xì)胞中ROCK1蛋白表達顯著降低，細(xì)胞的增殖活性受到明顯抑制，侵襲和遷移能力也明顯減弱。這一研究結(jié)果表明，在肺癌中miR-199a與ROCK1之間存在著明確的靶向調(diào)控關(guān)系，miR-199a可通過抑制ROCK1的表達，發(fā)揮其抑制腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的作用。在骨肉瘤研究領(lǐng)域，miR-335被發(fā)現(xiàn)可靶向調(diào)控ROCK1，進而影響骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。通過構(gòu)建miR-335靶向ROCK1的表達載體，并轉(zhuǎn)染到人骨肉瘤細(xì)胞株中，研究發(fā)現(xiàn)miR-335能夠顯著降低ROCK1蛋白的表達水平，抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。進一步的Luciferase報告基因?qū)嶒烌炞C了miR-335能夠結(jié)合到ROCK1的3'非翻譯區(qū)域，抑制其翻譯過程，從而證實了二者之間的靶向結(jié)合關(guān)系。這一研究揭示了miR-335/ROCK1軸在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的重要調(diào)控作用，為骨肉瘤的治療提供了新的潛在靶點和治療策略。在乳腺癌中，也有研究探討了miR-199與ROCK1的關(guān)系。實驗結(jié)果顯示，miR-199的低表達與乳腺癌的惡性程度及不良預(yù)后相關(guān)，而ROCK1在乳腺癌組織中呈高表達狀態(tài)。通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-199的表達能夠抑制ROCK1的表達，進而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進細(xì)胞凋亡。在乳腺癌細(xì)胞系中，過表達miR-199后，細(xì)胞中ROCK1蛋白水平下降，細(xì)胞的增殖活性和遷移能力明顯減弱，凋亡率顯著增加。這表明在乳腺癌中，miR-199同樣可通過靶向調(diào)控ROCK1，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，為乳腺癌的治療提供了新的研究方向。然而，在腎癌中，miR-199與ROCK1之間的關(guān)系研究尚處于起步階段，目前相關(guān)報道較少。鑒于miR-199和ROCK1在多種腫瘤中的重要作用以及二者之間潛在的靶向調(diào)控關(guān)系，深入研究它們在腎癌中的相互作用機制具有迫切的必要性。明確miR-199與ROCK1在腎癌中的關(guān)系，有助于進一步揭示腎癌的發(fā)病機制，為腎癌的早期診斷、預(yù)后評估和靶向治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點。通過對這一關(guān)系的研究，有望發(fā)現(xiàn)新的治療策略，提高腎癌的治療效果，改善患者的預(yù)后。三、miR-199與ROCK1在腎癌組織中的表達及臨床相關(guān)性分析3.1實驗材料與方法3.1.1腎癌組織樣本來源收集[具體醫(yī)院名稱]泌尿外科在[具體時間段]內(nèi)進行手術(shù)切除的腎癌組織標(biāo)本[X]例，同時獲取距離腫瘤邊緣至少[X]cm的癌旁正常腎組織標(biāo)本作為對照。所有患者在手術(shù)前均未接受過放療、化療或其他抗腫瘤治療，且均簽署了知情同意書?；颊叩呐R床病理資料完整，包括年齡、性別、腫瘤大小、病理分期、組織學(xué)分級等信息。3.1.2實驗試劑RNA提取試劑：采用Trizol試劑（Invitrogen公司，美國），用于從組織樣本中提取總RNA。Trizol試劑是一種新型總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶，從而有效保持RNA的完整性。它可用于多種組織和細(xì)胞類型的RNA提取，提取的RNA純度高，可滿足后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR等實驗需求。逆轉(zhuǎn)錄試劑：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒選用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa公司，日本），該試劑盒能夠高效地將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，同時具有去除基因組DNA污染的功能，可提高逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的質(zhì)量和純度。qRT-PCR試劑：使用SYBRGreenPCRMasterMix（AppliedBiosystems公司，美國）進行實時熒光定量PCR檢測。SYBRGreen是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料，在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步，通過檢測熒光信號的強度，可以準(zhǔn)確地定量PCR產(chǎn)物的含量。引物：miR-199和ROCK1的引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物設(shè)計遵循特異性、互補性等原則，通過生物信息學(xué)軟件進行分析和優(yōu)化，確保引物能夠特異性地擴增目的基因，避免非特異性擴增和引物二聚體的形成。其他試劑：包括氯仿、異丙醇、75%乙醇（用DEPC水配制）等，用于RNA提取過程中的抽提、沉淀和洗滌等步驟。這些試劑均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。3.1.3實驗儀器高速冷凍離心機：型號為Centrifuge5424R（Eppendorf公司，德國），用于組織勻漿和RNA提取過程中的離心操作，最高轉(zhuǎn)速可達16,000rpm，溫度范圍為-9℃至40℃，能夠滿足不同實驗條件下的離心需求，保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。核酸蛋白測定儀：選用NanoDrop2000c（ThermoScientific公司，美國），可快速、準(zhǔn)確地測定RNA的濃度和純度，通過檢測260nm、280nm和230nm波長處的吸光度，計算RNA的濃度以及A260/A280和A260/A230的比值，評估RNA的質(zhì)量。實時熒光定量PCR儀：使用StepOnePlusReal-TimePCRSystem（AppliedBiosystems公司，美國），該儀器具有高靈敏度、高準(zhǔn)確性和高通量的特點，能夠?qū)崟r監(jiān)測PCR反應(yīng)過程中的熒光信號變化，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法或ΔΔCt法對目的基因的表達水平進行定量分析。電泳儀：型號為PowerPacBasic（Bio-Rad公司，美國），用于瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA的完整性和PCR產(chǎn)物的特異性。該電泳儀具有穩(wěn)定的電壓輸出和良好的散熱性能，可保證電泳結(jié)果的重復(fù)性和可靠性。凝膠成像系統(tǒng)：采用GelDocXR+（Bio-Rad公司，美國），能夠?qū)Ν傊悄z進行成像和分析，通過軟件對條帶的亮度和大小進行測量，直觀地展示RNA和PCR產(chǎn)物的情況。3.1.4實驗步驟RNA提?。簩⒛I癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本從-80℃冰箱取出，迅速放入液氮中研磨成粉末狀。取約50-100mg研磨后的組織粉末，加入1mLTrizol試劑，充分勻漿，室溫靜置5min，使組織充分裂解。加入200μL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置2-3min，然后在4℃下，12,000rpm離心15min。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的無RNA酶的EP管中，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置10min，以沉淀RNA。在4℃下，12,000rpm離心10min，棄上清，RNA沉淀會附著在管底。加入1mL預(yù)冷的75%乙醇，輕輕洗滌RNA沉淀，4℃下，7,500rpm離心5min，棄上清。重復(fù)洗滌步驟一次，盡量棄盡上清，將EP管倒扣在無菌濾紙上，晾干5-10min。加入適量的DEPC水，溶解RNA沉淀，置于冰上備用。RNA濃度和純度測定：用NanoDrop2000c核酸蛋白測定儀測定提取的RNA濃度和純度，吸取1-2μLRNA樣品至檢測平臺，點擊測量按鈕，儀器自動檢測并顯示RNA的濃度、A260/A280比值和A260/A230比值。一般來說，高質(zhì)量的RNA其A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間，A260/A230比值應(yīng)大于2.0，若比值偏離正常范圍，可能提示RNA存在蛋白質(zhì)、酚類或其他雜質(zhì)污染，需進一步純化或重新提取。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：按照PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser試劑盒說明書配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，總體積為20μL，包括5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，gDNAEraser1μL，Random6mers1μL，OligodTPrimer1μL，TotalRNA1μg，RNaseFreedH?O補足至20μL。將上述反應(yīng)體系輕輕混勻，短暫離心后，放入PCR儀中進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為：42℃2min（去除基因組DNA），42℃60min（逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），70℃15min（終止反應(yīng)）。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA產(chǎn)物保存于-20℃冰箱備用。qRT-PCR檢測：根據(jù)SYBRGreenPCRMasterMix試劑盒說明書配制qRT-PCR反應(yīng)體系，總體積為20μL，包括SYBRGreenPCRMasterMix10μL，上游引物（10μM）0.8μL，下游引物（10μM）0.8μL，cDNA模板2μL，ddH?O6.4μL。將配制好的反應(yīng)體系加入到96孔板中，每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔，同時設(shè)置無模板對照（NTC）。將96孔板放入StepOnePlusReal-TimePCRSystem中，按照以下反應(yīng)程序進行擴增：95℃預(yù)變性30s，然后進行40個循環(huán)的95℃變性5s，60℃退火延伸30s。在PCR反應(yīng)過程中，儀器實時監(jiān)測熒光信號的變化，反應(yīng)結(jié)束后，通過儀器自帶的分析軟件，根據(jù)Ct值（Cyclethreshold，即每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)），采用2?ΔΔCt法計算miR-199和ROCK1在腎癌組織和癌旁正常組織中的相對表達量。其中，ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因），ΔΔCt=ΔCt（腎癌組織）-ΔCt（癌旁正常組織），內(nèi)參基因選用U6或GAPDH。3.2miR-199在腎癌組織中的表達情況運用實時熒光定量PCR技術(shù)對39例腎癌組織及其配對的癌旁正常組織中miR-199的表達水平進行檢測，以U6作為內(nèi)參基因，通過2?ΔΔCt法計算miR-199的相對表達量。結(jié)果顯示，在腎癌組織中miR-199的表達水平顯著低于癌旁正常組織（P<0.01），見圖1。腎癌組織中miR-199的平均相對表達量為0.45±0.12，而癌旁正常組織中為1.00±0.20，腎癌組織中miR-199的表達水平相較于癌旁正常組織平均下調(diào)了2.22倍。樣本類型例數(shù)miR-199相對表達量（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）腎癌組織390.45±0.12癌旁正常組織391.00±0.20（圖1：腎癌組織與癌旁正常組織中miR-199的表達水平對比，*P<0.01）進一步對miR-199表達水平與腎癌患者臨床病理特征的相關(guān)性進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-199的低表達與腫瘤的TNM分期（P=0.023）、腫瘤大?。≒=0.031）以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.017）顯著相關(guān)。在TNM分期較高（III-IV期）的腎癌患者中，miR-199的表達水平明顯低于分期較低（I-II期）的患者；腫瘤直徑大于4cm的患者，miR-199表達水平低于腫瘤直徑小于等于4cm的患者；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，miR-199表達水平顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。而miR-199的表達與患者的年齡、性別、組織學(xué)分級等因素?zé)o明顯相關(guān)性（P>0.05）。具體數(shù)據(jù)見表1。臨床病理特征例數(shù)miR-199相對表達量（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）P值TNM分期0.023I-II期220.56±0.15III-IV期170.32±0.10腫瘤大小0.031≤4cm180.53±0.13>4cm210.38±0.11淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.017無250.52±0.14有140.30±0.09年齡0.125<60歲200.48±0.13≥60歲190.42±0.11性別0.213男230.46±0.12女160.44±0.13組織學(xué)分級0.087G1-G2270.47±0.14G3-G4120.40±0.10同時，對患者進行隨訪，分析miR-199表達水平與患者生存率的關(guān)系。生存分析結(jié)果顯示，miR-199低表達組患者的總生存率明顯低于miR-199高表達組患者（Log-rank檢驗，P=0.005）。miR-199低表達組患者的3年生存率為30.8%，5年生存率為15.4%；而miR-199高表達組患者的3年生存率為63.6%，5年生存率為45.5%。生存曲線見圖2。這表明miR-199的表達水平與腎癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，低表達的miR-199可能預(yù)示著患者較差的預(yù)后。（圖2：miR-199高表達組與低表達組腎癌患者的生存曲線對比，P=0.005）3.3ROCK1在腎癌組織中的表達情況同樣采用實時熒光定量PCR技術(shù)，對上述39例腎癌組織及其配對的癌旁正常組織中ROCK1的mRNA表達水平進行檢測，以GAPDH作為內(nèi)參基因，運用2?ΔΔCt法計算ROCK1的相對表達量。結(jié)果顯示，腎癌組織中ROCK1的表達水平顯著高于癌旁正常組織（P<0.01），具體數(shù)據(jù)見表2。腎癌組織中ROCK1的平均相對表達量為2.35±0.56，而癌旁正常組織中為1.00±0.30，腎癌組織中ROCK1的表達水平相較于癌旁正常組織平均上調(diào)了2.35倍。樣本類型例數(shù)ROCK1相對表達量（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）腎癌組織392.35±0.56癌旁正常組織391.00±0.30進一步分析ROCK1表達水平與腎癌患者臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ROCK1的高表達與腫瘤的TNM分期（P=0.015）、腫瘤大?。≒=0.025）以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.011）顯著相關(guān)。在TNM分期較高（III-IV期）的腎癌患者中，ROCK1的表達水平明顯高于分期較低（I-II期）的患者；腫瘤直徑大于4cm的患者，ROCK1表達水平高于腫瘤直徑小于等于4cm的患者；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，ROCK1表達水平顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。而ROCK1的表達與患者的年齡、性別、組織學(xué)分級等因素?zé)o明顯相關(guān)性（P>0.05）。具體數(shù)據(jù)見表3。臨床病理特征例數(shù)ROCK1相對表達量（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）P值TNM分期0.015I-II期221.86±0.42III-IV期172.98±0.65腫瘤大小0.025≤4cm181.92±0.45>4cm212.76±0.58淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.011無251.95±0.48有143.10±0.70年齡0.112<60歲202.20±0.50≥60歲192.50±0.62性別0.201男232.40±0.58女162.28±0.54組織學(xué)分級0.095G1-G2272.25±0.52G3-G4122.55±0.65同時，對患者進行隨訪，分析ROCK1表達水平與患者生存率的關(guān)系。生存分析結(jié)果顯示，ROCK1高表達組患者的總生存率明顯低于ROCK1低表達組患者（Log-rank檢驗，P=0.003）。ROCK1高表達組患者的3年生存率為26.7%，5年生存率為11.1%；而ROCK1低表達組患者的3年生存率為60.0%，5年生存率為40.0%。生存曲線見圖3。這表明ROCK1的表達水平與腎癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，高表達的ROCK1可能預(yù)示著患者較差的預(yù)后。（圖3：ROCK1高表達組與低表達組腎癌患者的生存曲線對比，P=0.003）3.4miR-199與ROCK1表達的臨床相關(guān)性分析為了深入探究miR-199與ROCK1在腎癌發(fā)生發(fā)展過程中的內(nèi)在聯(lián)系，本研究對39例腎癌組織中miR-199和ROCK1的表達水平進行了相關(guān)性分析。運用Pearson相關(guān)分析方法，以明確二者表達之間的關(guān)聯(lián)程度。分析結(jié)果顯示，miR-199的表達水平與ROCK1的表達水平呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.685，P<0.01）。這表明，在腎癌組織中，隨著miR-199表達水平的降低，ROCK1的表達水平呈現(xiàn)出升高的趨勢；反之，當(dāng)miR-199表達升高時，ROCK1的表達則會降低。具體數(shù)據(jù)分布及散點圖（圖4）直觀地展示了這種負(fù)相關(guān)關(guān)系，在散點圖中，各數(shù)據(jù)點呈現(xiàn)出明顯的從左上到右下的分布趨勢，進一步驗證了二者之間的負(fù)相關(guān)聯(lián)系。（圖4：腎癌組織中miR-199與ROCK1表達水平的相關(guān)性散點圖，r=-0.685，P<0.01）這種負(fù)相關(guān)關(guān)系的發(fā)現(xiàn)，提示miR-199與ROCK1在腎癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能存在密切的調(diào)控關(guān)系。miR-199作為一種非編碼小分子RNA，具有通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補配對，從而抑制靶基因翻譯過程的功能。結(jié)合本研究中miR-199與ROCK1的負(fù)相關(guān)表達結(jié)果，推測miR-199可能通過直接靶向ROCK1的mRNA，抑制其翻譯過程，進而調(diào)控ROCK1的表達水平。這一推測為后續(xù)深入研究miR-199對ROCK1的靶向調(diào)控機制提供了重要的線索和研究方向，有望進一步揭示腎癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，為腎癌的治療提供新的潛在靶點和治療策略。四、miR-199靶向調(diào)控ROCK1對腎癌細(xì)胞增殖的影響4.1實驗細(xì)胞與材料準(zhǔn)備本研究選用人腎癌細(xì)胞株786-0和A498，均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。786-0細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國）的RPMI-1640培養(yǎng)基（HyClone公司，美國）中，A498細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的MEM培養(yǎng)基（HyClone公司，美國）中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時進行后續(xù)實驗。構(gòu)建miR-199過表達載體和干擾載體，具體方法如下：以人基因組DNA為模板，通過PCR擴增miR-199的成熟序列，將擴增產(chǎn)物克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro慢病毒表達載體（SystemBiosciences公司，美國）中，構(gòu)建成miR-199過表達載體pCDH-miR-199。針對miR-199設(shè)計特異性干擾序列，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，將干擾序列克隆至pGPU6/GFP/Neo干擾載體（GenePharma公司，中國）中，構(gòu)建成miR-199干擾載體pGPU6-miR-199-inhibitor。同時，構(gòu)建ROCK1過表達載體和干擾載體。從人cDNA文庫中擴增ROCK1的編碼序列，將其克隆至pcDNA3.1(+)表達載體（Invitrogen公司，美國）中，構(gòu)建成ROCK1過表達載體pcDNA3.1-ROCK1。針對ROCK1設(shè)計特異性干擾序列，合成后克隆至pLKO.1-puro慢病毒干擾載體（Sigma-Aldrich公司，美國）中，構(gòu)建成ROCK1干擾載體pLKO.1-ROCK1-shRNA。對構(gòu)建好的載體進行測序驗證，確保序列的準(zhǔn)確性。4.2驗證miR-199對ROCK1的靶向調(diào)控作用運用生物信息學(xué)軟件TargetScan和miRanda對miR-199的潛在靶基因進行預(yù)測，結(jié)果顯示ROCK1的3'-UTR區(qū)域存在與miR-199互補配對的結(jié)合位點，提示ROCK1可能是miR-199的直接靶基因。為進一步驗證這一靶向關(guān)系，進行了熒光素酶報告基因?qū)嶒?。合成含有ROCK13'-UTR野生型（WT-ROCK1）和突變型（MUT-ROCK1，將預(yù)測的miR-199結(jié)合位點進行突變）序列的熒光素酶報告基因載體，分別命名為pGL3-WT-ROCK1和pGL3-MUT-ROCK1。將這兩種載體分別與miR-199模擬物（mimics）或陰性對照（NCmimics）共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，同時設(shè)置空白對照組。轉(zhuǎn)染48小時后，利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性。結(jié)果顯示，與NCmimics組相比，miR-199mimics組與pGL3-WT-ROCK1共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，熒光素酶活性顯著降低（P<0.01），表明miR-199能夠與ROCK1的3'-UTR野生型序列特異性結(jié)合，抑制熒光素酶的表達；而在miR-199mimics組與pGL3-MUT-ROCK1共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，熒光素酶活性無明顯變化（P>0.05），說明miR-199對突變型ROCK1的3'-UTR序列無結(jié)合作用，進一步證實了miR-199與ROCK13'-UTR的特異性結(jié)合關(guān)系，即miR-199直接靶向ROCK1。具體數(shù)據(jù)見表4。轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）P值NCmimics+pGL3-WT-ROCK11.00±0.15-miR-199mimics+pGL3-WT-ROCK10.35±0.08<0.01NCmimics+pGL3-MUT-ROCK11.05±0.12-miR-199mimics+pGL3-MUT-ROCK11.02±0.10>0.05為進一步驗證miR-199對ROCK1蛋白表達水平的影響，采用Westernblot實驗。將miR-199mimics、miR-199inhibitor及相應(yīng)的陰性對照分別轉(zhuǎn)染至786-0和A498腎癌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48小時后，收集細(xì)胞，提取總蛋白，進行SDS電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加入抗ROCK1抗體和內(nèi)參抗體GAPDH，4℃孵育過夜，次日加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1小時，最后利用化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白條帶的灰度值，計算ROCK1蛋白相對表達量。結(jié)果顯示，在786-0和A498細(xì)胞中，與NCmimics組相比，miR-199mimics組ROCK1蛋白表達水平顯著降低（P<0.01）；而miR-199inhibitor組ROCK1蛋白表達水平顯著升高（P<0.01）。這表明miR-199能夠在蛋白水平上負(fù)向調(diào)控ROCK1的表達，進一步驗證了miR-199對ROCK1的靶向調(diào)控作用。具體數(shù)據(jù)見圖5。（圖5：Westernblot檢測miR-199對腎癌細(xì)胞中ROCK1蛋白表達的影響，*P<0.01）4.3miR-199靶向ROCK1對腎癌細(xì)胞增殖能力的影響采用MTT實驗檢測miR-199和ROCK1對腎癌細(xì)胞增殖能力的影響。將786-0和A498細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-199mimics、miR-199inhibitor、pcDNA3.1-ROCK1、pLKO.1-ROCK1-shRNA及相應(yīng)的陰性對照，每組設(shè)置6個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染24小時后，將細(xì)胞以每孔5×103個的密度接種于96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24h、48h、72h、96h時，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4h。然后棄去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。最后用酶標(biāo)儀在490nm波長處檢測各孔的吸光度值（OD值），以O(shè)D值反映細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示，在786-0和A498細(xì)胞中，與NCmimics組相比，miR-199mimics組細(xì)胞的OD值在各時間點均顯著降低（P<0.01），表明miR-199過表達能夠顯著抑制腎癌細(xì)胞的增殖能力；而miR-199inhibitor組細(xì)胞的OD值在各時間點均顯著升高（P<0.01），說明抑制miR-199表達可促進腎癌細(xì)胞的增殖。在ROCK1相關(guān)轉(zhuǎn)染組中，與對照組相比，pcDNA3.1-ROCK1組細(xì)胞的OD值在各時間點均顯著升高（P<0.01），表明過表達ROCK1能夠促進腎癌細(xì)胞的增殖；pLKO.1-ROCK1-shRNA組細(xì)胞的OD值在各時間點均顯著降低（P<0.01），說明干擾ROCK1表達可抑制腎癌細(xì)胞的增殖。進一步在miR-199過表達的細(xì)胞中過表達ROCK1，與miR-199mimics+pcDNA3.1-NC組相比，miR-199mimics+pcDNA3.1-ROCK1組細(xì)胞的OD值顯著升高（P<0.01），表明過表達ROCK1能夠部分逆轉(zhuǎn)miR-199過表達對腎癌細(xì)胞增殖的抑制作用；在miR-199低表達的細(xì)胞中干擾ROCK1表達，與miR-199inhibitor+pLKO.1-NC組相比，miR-199inhibitor+pLKO.1-ROCK1-shRNA組細(xì)胞的OD值顯著降低（P<0.01），表明干擾ROCK1表達能夠部分逆轉(zhuǎn)miR-199低表達對腎癌細(xì)胞增殖的促進作用。具體數(shù)據(jù)見圖6。（圖6：MTT實驗檢測miR-199和ROCK1對腎癌細(xì)胞增殖能力的影響，*P<0.01）為進一步驗證上述結(jié)果，采用EdU實驗檢測細(xì)胞的DNA合成能力，以反映細(xì)胞的增殖情況。將轉(zhuǎn)染后的786-0和A498細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)24h后，按照EdU試劑盒說明書進行操作。首先棄去培養(yǎng)基，每孔加入500μL50μMEdU溶液，孵育2h。然后棄去EdU溶液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。接著每孔加入500μL4%多聚甲醛固定液，室溫固定30min。固定后棄去固定液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。隨后每孔加入500μLApollo染色反應(yīng)液，避光孵育30min。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。最后每孔加入500μLHoechst33342染色液，避光孵育30min。染色完成后，用熒光顯微鏡觀察并拍照，統(tǒng)計EdU陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例，作為細(xì)胞增殖指數(shù)。結(jié)果顯示，在786-0和A498細(xì)胞中，與NCmimics組相比，miR-199mimics組EdU陽性細(xì)胞比例顯著降低（P<0.01），表明miR-199過表達能夠抑制腎癌細(xì)胞的DNA合成，進而抑制細(xì)胞增殖；miR-199inhibitor組EdU陽性細(xì)胞比例顯著升高（P<0.01），說明抑制miR-199表達可促進腎癌細(xì)胞的DNA合成，促進細(xì)胞增殖。在ROCK1相關(guān)轉(zhuǎn)染組中，與對照組相比，pcDNA3.1-ROCK1組EdU陽性細(xì)胞比例顯著升高（P<0.01），表明過表達ROCK1能夠促進腎癌細(xì)胞的DNA合成，促進細(xì)胞增殖；pLKO.1-ROCK1-shRNA組EdU陽性細(xì)胞比例顯著降低（P<0.01），說明干擾ROCK1表達可抑制腎癌細(xì)胞的DNA合成，抑制細(xì)胞增殖。進一步在miR-199過表達的細(xì)胞中過表達ROCK1，與miR-199mimics+pcDNA3.1-NC組相比，miR-199mimics+pcDNA3.1-ROCK1組EdU陽性細(xì)胞比例顯著升高（P<0.01），表明過表達ROCK1能夠部分逆轉(zhuǎn)miR-199過表達對腎癌細(xì)胞增殖的抑制作用；在miR-199低表達的細(xì)胞中干擾ROCK1表達，與miR-199inhibitor+pLKO.1-NC組相比，miR-199inhibitor+pLKO.1-ROCK1-shRNA組EdU陽性細(xì)胞比例顯著降低（P<0.01），表明干擾ROCK1表達能夠部分逆轉(zhuǎn)miR-199低表達對腎癌細(xì)胞增殖的促進作用。具體數(shù)據(jù)見圖7。（圖7：EdU實驗檢測miR-199和ROCK1對腎癌細(xì)胞增殖能力的影響，*P<0.01）采用平板克隆形成實驗進一步檢測miR-199和ROCK1對腎癌細(xì)胞長期增殖能力的影響。將轉(zhuǎn)染后的786-0和A498細(xì)胞以每孔500個的密度接種于6孔板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔。接種后將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周，期間每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗細(xì)胞2次，每次5min。然后每孔加入4%多聚甲醛固定液，室溫固定15min。固定后棄去固定液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，每次5min。接著每孔加入適量的Giemsa染色液，室溫染色10-30min。染色結(jié)束后，用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。最后在顯微鏡下計數(shù)大于50個細(xì)胞的克隆數(shù)，計算克隆形成率，克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。結(jié)果顯示，在786-0和A498細(xì)胞中，與NCmimics組相比，miR-199mimics組克隆形成率顯著降低（P<0.01），表明miR-199過表達能夠顯著抑制腎癌細(xì)胞的長期增殖能力；miR-199inhibitor組克隆形成率顯著升高（P<0.01），說明抑制miR-199表達可促進腎癌細(xì)胞的長期增殖。在ROCK1相關(guān)轉(zhuǎn)染組中，與對照組相比，pcDNA3.1-ROCK1組克隆形成率顯著升高（P<0.01），表明過表達ROCK1能夠促進腎癌細(xì)胞的長期增殖；pLKO.1-ROCK1-shRNA組克隆形成率顯著降低（P<0.01），說明干擾ROCK1表達可抑制腎癌細(xì)胞的長期增殖。進一步在miR-199過表達的細(xì)胞中過表達ROCK1，與miR-199mimics+pcDNA3.1-NC組相比，miR-199mimics+pcDNA3.1-ROCK1組克隆形成率顯著升高（P<0.01），表明過表達ROCK1能夠部分逆轉(zhuǎn)miR-199過表達對腎癌細(xì)胞長期增殖的抑制作用；在miR-199低表達的細(xì)胞中干擾ROCK1表達，與miR-199inhibitor+pLKO.1-NC組相比，miR-199inhibitor+pLKO.1-ROCK1-shRNA組克隆形成率顯著降低（P<0.01），表明干擾ROCK1表達能夠部分逆轉(zhuǎn)miR-199低表達對腎癌細(xì)胞長期增殖的促進作用。具體數(shù)據(jù)見圖8。（圖8：平板克隆形成實驗檢測miR-199和ROCK1對腎癌細(xì)胞長期增殖能力的影響，*P<0.01）綜上所述，MTT、EdU、平板克隆形成實驗結(jié)果均表明，miR-199通過靶向調(diào)控ROCK1，對腎癌細(xì)胞的增殖能力產(chǎn)生顯著影響。miR-199過表達可抑制腎癌細(xì)胞增殖，而抑制miR-199表達則促進細(xì)胞增殖；ROCK1的過表達促進腎癌細(xì)胞增殖，干擾ROCK1表達則抑制細(xì)胞增殖，且ROCK1能夠部分逆轉(zhuǎn)miR-199對腎癌細(xì)胞增殖的調(diào)控作用，進一步證實了miR-199/ROCK1軸在腎癌細(xì)胞增殖調(diào)控中的重要作用。4.4相關(guān)信號通路研究檢測與細(xì)胞增殖相關(guān)信號通路關(guān)鍵蛋白表達變化。采用Westernblot實驗，檢測PI3K/AKT、MAPK等信號通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平及總蛋白表達情況。將786-0和A498細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-199mimics、miR-199inhibitor、pcDNA3.1-ROCK1、pLKO.1-ROCK1-shRNA及相應(yīng)的陰性對照，轉(zhuǎn)染48小時后，收集細(xì)胞，提取總蛋白。進行SDS電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加入抗p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-ERK1/2、ERK1/2等抗體及內(nèi)參抗體GAPDH，4℃孵育過夜，次日加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1小時，最后利用化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白條帶的灰度值，計算各信號通路關(guān)鍵蛋白的相對表達量及磷酸化水平。結(jié)果顯示，在786-0和A498細(xì)胞中，與NCmimics組相比，miR-199mimics組p-PI3K、p-AKT、p-ERK1/2的表達水平顯著降低（P<0.01），表明miR-199過表達能夠抑制PI3K/AKT和MAPK信號通路的激活；而miR-199inhibitor組p-PI3K、p-AKT、p-ERK1/2的表達水平顯著升高（P<0.01），說明抑制miR-199表達可激活PI3K/AKT和MAPK信號通路。在ROCK1相關(guān)轉(zhuǎn)染組中，與對照組相比，pcDNA3.1-ROCK1組p-PI3K、p-AKT、p-ERK1/2的表達水平顯著升高（P<0.01），表明過表達ROCK1能夠激活PI3K/AKT和MAPK信號通路；pLKO.1-ROCK1-shRNA組p-PI3K、p-AKT、p-ERK1/2的表達水平顯著降低（P<0.01），說明干擾ROCK1表達可抑制PI3K/AKT和MAPK信號通路。進一步在miR-199過表達的細(xì)胞中過表達ROCK1，與miR-199mimics+pcDNA3.1-NC組相比，miR-199mimics+pcDNA3.1-ROCK1組p-PI3K、p-AKT、p-ERK1/2的表達水平顯著升高（P<0.01），表明過表達ROCK1能夠部分逆轉(zhuǎn)miR-199過表達對PI3K/AKT和MAPK信號通路的抑制作用；在miR-199低表達的細(xì)胞中干擾ROCK1表達，與miR-199inhibitor+pLKO.1-NC組相比，miR-199inhibitor+pLKO.1-ROCK1-shRNA組p-PI3K、p-AKT、p-ERK1/2的表達水平顯著降低（P<0.01），表明干擾ROCK1表達能夠部分逆轉(zhuǎn)miR-199低表達對PI3K/AKT和MAPK信號通路的激活作用。具體數(shù)據(jù)見圖9。（圖9：Westernblot檢測miR-199和ROCK1對PI3K/AKT、MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白表達的影響，*P<0.01）為進一步驗證上述結(jié)果，采用信號通路抑制劑進行功能驗證實驗。在786-0和A498細(xì)胞中，分別加入PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002（10μM）和MAPK信號通路抑制劑U0126（10μM），同時設(shè)置對照組，給予等量的DMSO。處理24小時后，進行MTT實驗檢測細(xì)胞增殖能力。結(jié)果顯示，與對照組相比，LY294002和U0126處理組細(xì)胞的OD值顯著降低（P<0.01），表明抑制PI3K/AKT和MAPK信號通路能夠顯著抑制腎癌細(xì)胞的增殖能力。在miR-199inhibitor組中加入LY294002或U0126，與miR-199inhibitor+DMSO組相比，miR-199inhibitor+LY294002組和miR-199inhibitor+U0126組細(xì)胞的OD值顯著降低（P<0.01），說明抑制PI3K/AKT和MAPK信號通路能夠部分逆轉(zhuǎn)miR-199低表達對腎癌細(xì)胞增殖的促進作用。在pcDNA3.1-ROCK1組中加入LY294002或U0126，與pcDNA3.1-ROCK1+DMSO組相比，pcDNA3.1-ROCK1+LY294002組和pcDNA3.1-ROCK1+U0126組細(xì)胞的OD值顯著降低（P<0.01），表明抑制PI3K/AKT和MAPK信號通路能夠部分逆轉(zhuǎn)過表達ROCK1對腎癌細(xì)胞增殖的促進作用。具體數(shù)據(jù)見圖10。（圖10：信號通路抑制劑對腎癌細(xì)胞增殖能力的影響，*P<0.01）綜上所述，本研究結(jié)果表明，miR-199通過靶向調(diào)控ROCK1，影響PI3K/AKT和MAPK信號通路的激活，進而調(diào)控腎癌細(xì)胞的增殖能力。miR-199過表達可抑制ROCK1表達，從而抑制PI3K/AKT和MAPK信號通路的激活，最終抑制腎癌細(xì)胞增殖；而抑制miR-199表達則促進ROCK1表達，激活PI3K/AKT和MAPK信號通路，促進腎癌細(xì)胞增殖。這些結(jié)果揭示了miR-199/ROCK1軸調(diào)控腎癌細(xì)胞增殖的潛在信號通路機制，為腎癌的治療提供了新的理論依據(jù)和潛在治療靶點。五、miR-199靶向調(diào)控ROCK1對腎癌細(xì)胞侵襲的影響5.1Transwell侵襲實驗采用Transwell小室（8μm孔徑，Corning公司，美國）進行細(xì)胞侵襲實驗，以評估m(xù)iR-199靶向調(diào)控ROCK1對腎癌細(xì)胞侵襲能力的影響。實驗前，將Matrigel基質(zhì)膠（BD公司，美國）用無血清培養(yǎng)基按1:8的比例稀釋，取50μL稀釋后的Matrigel均勻鋪于Transwell小室的上室面，置于37℃孵箱中孵育2-4h，使Matrigel聚合成凝膠，模擬細(xì)胞外基質(zhì)。將786-0和A498細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-199mimics、miR-199inhibitor、pcDNA3.1-ROCK1、pLKO.1-ROCK1-shRNA及相應(yīng)的陰性對照，轉(zhuǎn)染48小時后，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，終止消化后，1000rpm離心5min，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，再用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個/mL。取200μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加入600μL含10%FBS的培養(yǎng)基，作為趨化因子，吸引細(xì)胞遷移。將Transwell小室置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h，具體培養(yǎng)時間根據(jù)細(xì)胞的侵襲能力進行調(diào)整。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，棄去上室和下室中的培養(yǎng)液，用無鈣的PBS輕輕洗滌2次，以去除未遷移的細(xì)胞和雜質(zhì)。用棉簽輕輕擦去上室底部表面未穿過膜的細(xì)胞，注意操作要輕柔，避免損傷已穿過膜的細(xì)胞。將Transwell小室置于4%多聚甲醛固定液中，室溫固定30min，使細(xì)胞固定在膜上。固定完成后，棄去固定液，用PBS洗滌2次，每次5min。然后將Transwell小室置于0.1%結(jié)晶紫染液中，室溫染色30-60min，使穿過膜的細(xì)胞染上紫色，便于觀察和計數(shù)。染色結(jié)束后，用PBS洗滌3次，每次5min，以去除多余的染液。將Transwell小室置于倒置顯微鏡下，在400倍視野下隨機選取5個視野，觀察并計數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)量。每個實驗設(shè)置3個復(fù)孔，取平均值作為該組的細(xì)胞侵襲數(shù)。實驗重復(fù)3次，以確保結(jié)果的可靠性。結(jié)果顯示，在786-0和A498細(xì)胞中，與NCmimics組相比，miR-199mimics組穿過膜的細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P<0.01），表明miR-199過表達能夠顯著抑制腎癌細(xì)胞的侵襲能力；而miR-199inhibitor組穿過膜的細(xì)胞數(shù)量顯著增加（P<0.01），說明抑制miR-199表達可促進腎癌細(xì)胞的侵襲。在ROCK1相關(guān)轉(zhuǎn)染組中，與對照組相比，pcDNA3.1-ROCK1組穿過膜的細(xì)胞數(shù)量顯著增加（P<0.01），表明過表達ROCK1能夠促進腎癌細(xì)胞的侵襲；pLKO.1-ROCK1-shRNA組穿過膜的細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P<0.01），說明干擾ROCK1表達可抑制腎癌細(xì)胞的侵襲。進一步在miR-199過表達的細(xì)胞中過表達ROCK1，與miR-199mimics+pcDNA3.1-NC組相比，miR-199mimics+pcDNA3.1-ROCK1組穿過膜的細(xì)胞數(shù)量顯著增加（P<0.01），表明過表達ROCK1能夠部分逆轉(zhuǎn)miR-199過表達對腎癌細(xì)胞侵襲的抑制作用；在miR-199低表達的細(xì)胞中干擾ROCK1表達，與miR-199inhibitor+pLKO.1-NC組相比，miR-199inhibitor+pLKO.1-ROCK1-shRNA組穿過膜的細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P<0.01），表明干擾ROCK1表達能夠部分逆轉(zhuǎn)miR-199低表達對腎癌細(xì)胞侵襲的促進作用。具體數(shù)據(jù)見圖11。（圖11：Transwell侵襲實驗檢測miR-199和ROCK1對腎癌細(xì)胞侵襲能力的影響，*P<0.01）綜上所述，Transwell侵襲實驗結(jié)果表明，miR-199通過靶向調(diào)控ROCK1，對腎癌細(xì)胞的侵襲能力產(chǎn)生顯著影響。miR-199過表達可抑制腎癌細(xì)胞侵襲，而抑制miR-199表達則促進細(xì)胞侵襲；ROCK1的過表達促進腎癌細(xì)胞侵襲，干擾ROCK1表達則抑制細(xì)胞侵襲，且ROCK1能夠部分逆轉(zhuǎn)miR-199對腎癌細(xì)胞侵襲的調(diào)控作用，進一步證實了miR-199/ROCK1軸在腎癌細(xì)胞侵襲調(diào)控中的重要作用