miR-486-5p負(fù)性調(diào)控NEK2對(duì)肝細(xì)胞癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的影響機(jī)制研究一、引言1.1研究背景肝細(xì)胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）作為常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。在全球范圍內(nèi)，每年約有70萬人死于該疾病。HCC起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，失去了最佳的手術(shù)切除機(jī)會(huì)。即使部分患者能夠接受手術(shù)治療，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)也較高，5年生存率依然不容樂觀。例如，據(jù)相關(guān)臨床研究統(tǒng)計(jì)，我國(guó)HCC患者的5年生存率僅在10%-30%左右，這表明HCC的治療現(xiàn)狀亟待改善。目前，HCC的治療手段包括手術(shù)切除、肝移植、射頻消融、經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞（TACE）、靶向治療和免疫治療等。手術(shù)切除和肝移植是早期HCC患者的首選治療方法，但由于腫瘤的大小、位置、數(shù)量以及患者的肝功能等因素限制，僅有少數(shù)患者適合手術(shù)。對(duì)于中晚期患者，TACE是常用的治療方法之一，它通過栓塞腫瘤供血?jiǎng)用}和注入化療藥物，使腫瘤缺血壞死，從而達(dá)到治療目的。然而，TACE治療后腫瘤易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，且多次治療可能會(huì)對(duì)肝功能造成損害。靶向治療和免疫治療為HCC患者帶來了新的希望，但部分患者對(duì)這些治療方法并不敏感，且存在耐藥性等問題。因此，尋找HCC的分子機(jī)制并開發(fā)新的治療策略成為臨床醫(yī)生面臨的重要挑戰(zhàn)之一。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼小RNA分子，長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸。它們通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)，抑制mRNA的翻譯過程或促進(jìn)其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。miRNA在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝和腫瘤發(fā)生發(fā)展等。其中，miR-486-5p在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)具有重要作用。研究表明，miR-486-5p可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及抑制細(xì)胞侵襲等。在HCC中，已有研究表明miR-486-5p的表達(dá)與HCC的耐藥性和轉(zhuǎn)移存在一定關(guān)系。例如，一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)miR-486-5p在HCC耐藥細(xì)胞系中的表達(dá)明顯低于敏感細(xì)胞系，過表達(dá)miR-486-5p可以增強(qiáng)HCC細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。NEK2（NIMA-relatedkinase2）是NIMA相關(guān)絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員之一，在細(xì)胞有絲分裂過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在正常細(xì)胞中，NEK2的表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控，其低表達(dá)狀態(tài)有助于維持細(xì)胞的正常生理功能。然而，在腫瘤細(xì)胞中，NEK2呈現(xiàn)異常高表達(dá)的特征。相關(guān)研究表明，NEK2異常高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致姐妹中心粒提前分離、紡錘體組裝異常和染色體分離錯(cuò)誤，最終致使染色體不穩(wěn)定和非整倍體的出現(xiàn)，而這些染色體遺傳變異正是惡性腫瘤發(fā)生的主要誘因之一。此外，NEK2還能夠增強(qiáng)多條腫瘤相關(guān)信號(hào)通路，如PI3K-AKT、Wnt-β-catenin、MAPK-ERK、HIPPO-YAP1和NIK-NF-κB等信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等過程。在HCC的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程中，NEK2同樣發(fā)揮著重要作用。有研究顯示，NEK2在HCC組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，且其高表達(dá)與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。盡管miR-486-5p和NEK2在腫瘤研究中各自受到了關(guān)注，但miR-486-5p對(duì)NEK2的調(diào)控機(jī)制尚未被明確研究，兩者之間的關(guān)系存在研究空白。深入探究miR-486-5p與NEK2之間的關(guān)系，揭示miR-486-5p在HCC中的調(diào)節(jié)機(jī)制，有望為HCC的治療提供新的靶點(diǎn)和治療策略，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究miR-486-5p對(duì)腫瘤基因NEK2的負(fù)性調(diào)控機(jī)制，以及這種調(diào)控作用在肝細(xì)胞癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中的具體影響。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，明確miR-486-5p與NEK2之間的相互作用關(guān)系，分析其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響。從分子層面揭示肝細(xì)胞癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制，為肝細(xì)胞癌的早期診斷、預(yù)后評(píng)估提供新的生物標(biāo)志物，也為肝細(xì)胞癌的治療提供新的思路和靶點(diǎn)。肝細(xì)胞癌嚴(yán)重威脅人類健康，現(xiàn)有治療手段存在諸多局限。本研究對(duì)miR-486-5p負(fù)性調(diào)控NEK2在肝細(xì)胞癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移中的作用展開深入研究，具有重要理論和現(xiàn)實(shí)意義。在理論方面，當(dāng)前關(guān)于miR-486-5p對(duì)NEK2的調(diào)控機(jī)制研究尚屬空白，本研究致力于填補(bǔ)這一空白，深入剖析二者之間的相互作用，有望為肝細(xì)胞癌的分子機(jī)制研究增添新的理論依據(jù)，推動(dòng)該領(lǐng)域的學(xué)術(shù)發(fā)展。在現(xiàn)實(shí)意義上，若能明確miR-486-5p負(fù)性調(diào)控NEK2在肝細(xì)胞癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移中的作用，將為肝細(xì)胞癌的治療開辟全新路徑。一方面，這有助于開發(fā)基于miR-486-5p或NEK2的靶向治療藥物，為患者提供更精準(zhǔn)、有效的治療方案，提高治療效果；另一方面，可通過檢測(cè)miR-486-5p和NEK2的表達(dá)水平，實(shí)現(xiàn)對(duì)肝細(xì)胞癌患者的早期診斷和預(yù)后評(píng)估，從而為臨床治療決策提供科學(xué)、可靠的依據(jù)，對(duì)改善患者的生存質(zhì)量和延長(zhǎng)生存期具有重要意義。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1肝細(xì)胞癌概述肝細(xì)胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）作為原發(fā)性肝癌中最為常見的類型，起源于肝臟的實(shí)質(zhì)細(xì)胞，即肝細(xì)胞。它是一種具有高度侵襲性和轉(zhuǎn)移性的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著全球人類的健康。在全球范圍內(nèi)，HCC的發(fā)病率和死亡率均居高不下，尤其在亞洲和非洲地區(qū)，其發(fā)病率更為突出。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的數(shù)據(jù)，每年新診斷的HCC病例數(shù)超過80萬例，死亡人數(shù)約為78萬例，這一數(shù)據(jù)充分說明了HCC對(duì)人類生命健康的巨大威脅。HCC的發(fā)病原因較為復(fù)雜，是多種因素長(zhǎng)期共同作用的結(jié)果。其中，乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染被公認(rèn)為是導(dǎo)致HCC發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約70%-85%的HCC患者與HBV或HCV感染相關(guān)。長(zhǎng)期的病毒感染會(huì)引發(fā)肝臟慢性炎癥，進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞的損傷和修復(fù)過程反復(fù)進(jìn)行，最終促使肝細(xì)胞發(fā)生惡變。肝硬化也是HCC發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素之一，約80%-90%的HCC患者伴有肝硬化。肝硬化會(huì)導(dǎo)致肝臟組織的纖維化和結(jié)構(gòu)破壞，使肝細(xì)胞處于一個(gè)不穩(wěn)定的微環(huán)境中，增加了肝癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。此外，長(zhǎng)期酗酒、黃曲霉毒素暴露、非酒精性脂肪性肝病、遺傳因素等也與HCC的發(fā)生密切相關(guān)。長(zhǎng)期酗酒會(huì)對(duì)肝臟造成直接的損害，引發(fā)酒精性肝病，進(jìn)而增加HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。黃曲霉毒素是一種由黃曲霉產(chǎn)生的強(qiáng)致癌物質(zhì)，主要存在于被污染的糧食和堅(jiān)果中，長(zhǎng)期攝入含有黃曲霉毒素的食物會(huì)增加HCC的發(fā)生幾率。非酒精性脂肪性肝病在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率逐漸上升，它與肥胖、糖尿病等代謝綜合征密切相關(guān)，也被認(rèn)為是HCC的一個(gè)潛在危險(xiǎn)因素。遺傳因素在HCC的發(fā)生中也起到一定的作用，某些基因突變或遺傳多態(tài)性可能會(huì)增加個(gè)體對(duì)HCC的易感性。HCC起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者在確診時(shí)已處于中晚期。早期HCC患者可能沒有任何癥狀，或僅表現(xiàn)出一些非特異性癥狀，如乏力、食欲減退、腹脹等，這些癥狀容易被忽視或誤診為其他疾病。隨著腫瘤的進(jìn)展，患者可能會(huì)出現(xiàn)右上腹疼痛、肝腫大、黃疸、腹水、消瘦等癥狀，此時(shí)病情往往已經(jīng)較為嚴(yán)重，治療難度也大大增加。在HCC的診斷方面，目前主要依靠影像學(xué)檢查、血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)和病理學(xué)檢查等多種方法。影像學(xué)檢查包括超聲、CT、MRI等，這些檢查可以幫助醫(yī)生觀察肝臟的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和腫瘤的位置、大小、數(shù)量等信息，為診斷提供重要依據(jù)。血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)主要檢測(cè)甲胎蛋白（AFP）等指標(biāo)，AFP是一種在胎兒時(shí)期由肝臟和卵黃囊合成的糖蛋白，在成人血清中含量極低，但在HCC患者中，AFP水平往往會(huì)顯著升高，因此AFP是目前診斷HCC最重要的血清學(xué)標(biāo)志物之一。病理學(xué)檢查是確診HCC的金標(biāo)準(zhǔn)，通過對(duì)肝臟組織進(jìn)行活檢，進(jìn)行病理切片和顯微鏡觀察，可以明確腫瘤的性質(zhì)和類型。目前，HCC的治療手段較為多樣化，主要包括手術(shù)治療、局部治療、全身治療等。手術(shù)治療是早期HCC患者的首選治療方法，包括肝切除術(shù)和肝移植術(shù)。肝切除術(shù)適用于腫瘤局限于肝臟一葉、肝功能良好的患者，通過切除腫瘤組織，可以達(dá)到根治的目的。肝移植術(shù)則適用于肝功能嚴(yán)重受損、腫瘤多發(fā)或無法進(jìn)行肝切除的患者，通過移植健康的肝臟，不僅可以去除腫瘤，還可以改善肝功能。然而，手術(shù)治療受到腫瘤大小、位置、數(shù)量以及患者肝功能等多種因素的限制，僅有少數(shù)患者適合手術(shù)。對(duì)于不能手術(shù)的患者，局部治療和全身治療成為主要的治療選擇。局部治療包括射頻消融、微波消融、經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞（TACE）等。射頻消融和微波消融是通過物理方法使腫瘤組織凝固壞死，達(dá)到治療目的，適用于腫瘤較小、數(shù)量較少的患者。TACE是通過栓塞腫瘤供血?jiǎng)用}和注入化療藥物，使腫瘤缺血壞死，是中晚期HCC患者常用的治療方法之一。全身治療主要包括靶向治療、免疫治療和化療等。靶向治療藥物可以針對(duì)腫瘤細(xì)胞的特定靶點(diǎn)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，如索拉非尼、侖伐替尼等。免疫治療藥物則通過激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力，如帕博利珠單抗、納武利尤單抗等?；熕幬锟梢酝ㄟ^抑制腫瘤細(xì)胞的DNA合成、干擾細(xì)胞代謝等方式，殺死腫瘤細(xì)胞，但化療藥物的副作用較大，對(duì)患者的身體狀況要求較高。盡管HCC的治療手段不斷發(fā)展，但患者的預(yù)后仍然不容樂觀。HCC具有易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，5年生存率較低。根據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，我國(guó)HCC患者的5年生存率僅在10%-30%左右。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致HCC患者預(yù)后不良的主要原因，腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力使得腫瘤難以徹底清除，容易在肝臟內(nèi)或其他器官形成新的轉(zhuǎn)移灶。此外，HCC患者往往伴有肝功能損害，這也會(huì)影響治療效果和患者的預(yù)后。因此，深入研究HCC的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和治療策略，對(duì)于提高HCC患者的生存率和生活質(zhì)量具有重要意義。2.2miR-486-5p相關(guān)理論miRNA是一類內(nèi)源性非編碼小RNA分子，長(zhǎng)度通常在20-25個(gè)核苷酸左右。它廣泛存在于真核生物體內(nèi)，在進(jìn)化上具有高度保守性。這種保守性意味著在漫長(zhǎng)的生物進(jìn)化歷程中，miRNA的序列和功能在不同物種間保持著相對(duì)穩(wěn)定，反映了其在生物體內(nèi)執(zhí)行著不可或缺的重要功能。其編碼基因常以單拷貝、多拷貝或基因簇等多種形式存在于基因組中，且具有固定的基因座位。其中，約70%-90%位于蛋白基因的基因間隔區(qū)（IGR），其余部分則分布在內(nèi)含子，甚至個(gè)別位于編碼區(qū)的互補(bǔ)鏈上，這表明它們擁有獨(dú)立于其他基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。miRNA的作用機(jī)制獨(dú)特而精細(xì)，主要通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）特異性互補(bǔ)配對(duì)來實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。當(dāng)miRNA與靶mRNA的3'-UTR完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，會(huì)引發(fā)mRNA的降解過程，使mRNA被核酸酶切割分解，從而無法進(jìn)行后續(xù)的翻譯過程；當(dāng)miRNA與靶mRNA的3'-UTR不完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，miRNA則會(huì)抑制mRNA的翻譯過程，阻礙核糖體在mRNA上的移動(dòng)和蛋白質(zhì)的合成。這種轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控方式，使得miRNA能夠在不改變基因DNA序列的前提下，靈活地調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。同一miRNA可作用于多種靶mRNA，而同一mRNA也可受到多種miRNA的調(diào)節(jié)作用。這種復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)使得miRNA能夠在細(xì)胞內(nèi)形成一個(gè)精密的調(diào)控系統(tǒng)，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、代謝等多種生物學(xué)過程進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。miR-486-5p作為miRNA家族的重要成員，在多種腫瘤中展現(xiàn)出獨(dú)特的生物學(xué)功能，發(fā)揮著促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及抑制細(xì)胞侵襲等關(guān)鍵作用。在乳腺癌中，相關(guān)研究表明，miR-486-5p的表達(dá)水平顯著降低，而過表達(dá)miR-486-5p能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，有效抑制癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。在結(jié)直腸癌中，miR-486-5p同樣呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，其表達(dá)的恢復(fù)可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。在肺癌的研究中，也發(fā)現(xiàn)miR-486-5p能夠通過靶向調(diào)控相關(guān)基因，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。在肝細(xì)胞癌領(lǐng)域，miR-486-5p的研究也取得了一定的進(jìn)展。已有研究揭示了miR-486-5p的表達(dá)與HCC的耐藥性和轉(zhuǎn)移存在緊密聯(lián)系。在HCC耐藥細(xì)胞系中，miR-486-5p的表達(dá)明顯低于敏感細(xì)胞系，而過表達(dá)miR-486-5p能夠增強(qiáng)HCC細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，為解決HCC的耐藥問題提供了新的方向。在對(duì)HCC轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究中，發(fā)現(xiàn)miR-486-5p可以通過調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，從而影響HCC的轉(zhuǎn)移進(jìn)程。然而，目前對(duì)于miR-486-5p在HCC中的作用機(jī)制尚未完全明確，仍存在許多亟待深入探索的空白領(lǐng)域。尤其是miR-486-5p與腫瘤基因NEK2之間的調(diào)控關(guān)系，尚未得到系統(tǒng)的研究和闡述。2.3NEK2相關(guān)理論NEK2，即NIMA相關(guān)激酶2（NIMA-relatedkinase2），是NIMA相關(guān)絲氨酸/蘇氨酸激酶家族的重要成員。其編碼基因位于人類染色體1q21.3，由14個(gè)外顯子和13個(gè)內(nèi)含子組成，基因全長(zhǎng)約20kb，轉(zhuǎn)錄生成的mRNA長(zhǎng)度約為3.5kb，最終翻譯形成的蛋白質(zhì)由653個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，相對(duì)分子質(zhì)量約為75kDa。NEK2蛋白包含多個(gè)重要結(jié)構(gòu)域，N端為高度保守的激酶結(jié)構(gòu)域，具備絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，能夠催化底物蛋白的磷酸化反應(yīng)，這是其發(fā)揮生物學(xué)功能的關(guān)鍵區(qū)域；C端則為非保守的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，包含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)域，卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域有助于NEK2與其他蛋白質(zhì)相互作用，形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，鋅指結(jié)構(gòu)域則參與對(duì)DNA或RNA的識(shí)別與結(jié)合，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。在細(xì)胞周期調(diào)控中，NEK2發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，尤其是在有絲分裂過程中。在有絲分裂前期，NEK2主要定位于中心體，它通過磷酸化中心體蛋白，如γ-微管蛋白、中心粒外周物質(zhì)1（PCM1）等，參與中心體的成熟和分離過程，確保中心體能夠準(zhǔn)確地遷移到細(xì)胞的兩極，為紡錘體的形成奠定基礎(chǔ)。研究表明，NEK2的活性在有絲分裂前期逐漸升高，當(dāng)NEK2基因被敲低或其激酶活性被抑制時(shí)，中心體的成熟和分離會(huì)出現(xiàn)異常，導(dǎo)致紡錘體組裝缺陷，細(xì)胞周期進(jìn)程受阻。在有絲分裂中期，NEK2參與紡錘體組裝檢查點(diǎn)的調(diào)控。紡錘體組裝檢查點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)的一種重要監(jiān)控機(jī)制，它能夠確保染色體正確地排列在赤道板上，并與紡錘體微管建立穩(wěn)定的連接。NEK2通過與紡錘體組裝檢查點(diǎn)相關(guān)蛋白相互作用，如Mad2、BubR1等，調(diào)節(jié)這些蛋白的活性和定位，從而維持紡錘體組裝檢查點(diǎn)的正常功能。如果NEK2功能異常，紡錘體組裝檢查點(diǎn)無法正常發(fā)揮作用，細(xì)胞可能會(huì)出現(xiàn)染色體分離錯(cuò)誤，導(dǎo)致非整倍體的產(chǎn)生，增加腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，NEK2扮演著促癌基因的角色。大量研究表明，NEK2在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)異常高表達(dá)狀態(tài)，且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度、侵襲轉(zhuǎn)移能力以及患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。在乳腺癌中，NEK2的高表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及患者的低生存率顯著相關(guān)，通過抑制NEK2的表達(dá)或活性，可以有效抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。在結(jié)直腸癌中，NEK2的異常高表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，并且與腫瘤的分期和分級(jí)密切相關(guān)，干擾NEK2的功能可以降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的致瘤性。在肺癌中，NEK2同樣高表達(dá)，其通過激活PI3K-AKT、MAPK-ERK等信號(hào)通路，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移。在肝細(xì)胞癌中，NEK2的研究也取得了一系列重要成果。相關(guān)研究顯示，NEK2在HCC組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，且其表達(dá)水平與腫瘤的大小、數(shù)目、分化程度、血管侵犯以及患者的TNM分期密切相關(guān)。高表達(dá)NEK2的HCC患者往往預(yù)后較差，復(fù)發(fā)率更高，5年生存率更低。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，NEK2通過多種途徑促進(jìn)HCC的發(fā)生和發(fā)展。一方面，NEK2可以激活PI3K-AKT信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和存活。PI3K-AKT信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的生存信號(hào)通路，NEK2通過磷酸化激活PI3K，進(jìn)而激活A(yù)KT，使下游的多種底物蛋白磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制細(xì)胞凋亡。另一方面，NEK2可以調(diào)節(jié)Wnt-β-catenin信號(hào)通路，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Wnt-β-catenin信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，NEK2通過抑制GSK-3β的活性，穩(wěn)定β-catenin蛋白，使其進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游靶基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。此外，NEK2還可以通過調(diào)節(jié)其他信號(hào)通路和分子，如HIPPO-YAP1信號(hào)通路、細(xì)胞周期蛋白等，參與HCC的發(fā)生和發(fā)展。三、miR-486-5p與NEK2在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及關(guān)系研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞株：人正常肝細(xì)胞株LO2、人肝癌細(xì)胞株Huh7、HepG2、SMMC-7721、MHCC97H和PLC/PRF/5，均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。這些細(xì)胞株在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中用于研究miR-486-5p和NEK2在正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中的表達(dá)差異，以及它們對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：4-6周齡的雄性BALB/c裸鼠，體重18-22g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。裸鼠用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，如裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，以研究miR-486-5p和NEK2對(duì)肝癌細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在22-25℃，相對(duì)濕度為40%-60%，12小時(shí)光照/黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。在實(shí)驗(yàn)前，裸鼠需適應(yīng)環(huán)境1周，以減少環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。主要試劑：RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，這些培養(yǎng)基和血清用于細(xì)胞的培養(yǎng)，為細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，用于將質(zhì)粒、siRNA等核酸分子轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)基因的過表達(dá)或敲低。TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，用于提取細(xì)胞中的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRGreenPCRMasterMix購(gòu)自日本TaKaRa公司，用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)基因的表達(dá)水平。兔抗人NEK2多克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CellSignalingTechnology公司，用于蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)NEK2和內(nèi)參蛋白β-actin的表達(dá)水平。HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG購(gòu)自美國(guó)JacksonImmunoResearch公司，作為二抗用于Westernblot實(shí)驗(yàn)，增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，用于驗(yàn)證miR-486-5p與NEK2的靶向關(guān)系。miR-486-5p模擬物（mimics）、陰性對(duì)照模擬物（NCmimics）、miR-486-5p抑制劑（inhibitor）、陰性對(duì)照抑制劑（NCinhibitor）、NEK2過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-NEK2）、NEK2小干擾RNA（siNEK2）及相應(yīng)的陰性對(duì)照siRNA（siNC）均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，用于調(diào)控細(xì)胞中miR-486-5p和NEK2的表達(dá)水平。主要儀器：CO?培養(yǎng)箱（美國(guó)ThermoFisherScientific公司），為細(xì)胞培養(yǎng)提供適宜的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境，維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。倒置顯微鏡（日本Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效果等。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)AppliedBiosystems公司），精確檢測(cè)基因的表達(dá)水平，通過熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)進(jìn)程。蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），用于Westernblot實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)的分離和轉(zhuǎn)膜，將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上以便后續(xù)檢測(cè)。多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)MolecularDevices公司），用于雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)，測(cè)定熒光素酶的活性。低速離心機(jī)和高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），用于細(xì)胞和樣本的離心分離，如收集細(xì)胞、分離RNA和蛋白質(zhì)等。3.1.2實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)：將人正常肝細(xì)胞株LO2和人肝癌細(xì)胞株Huh7、HepG2、SMMC-7721、MHCC97H、PLC/PRF/5分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基中，放置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn)處理。在傳代過程中，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細(xì)胞，然后將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作。在轉(zhuǎn)染前1天，將細(xì)胞接種到6孔板或24孔板中，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到50%-60%融合。將miR-486-5pmimics、NCmimics、miR-486-5pinhibitor、NCinhibitor、NEK2過表達(dá)質(zhì)粒、NEK2siRNA或siNC分別與Lipofectamine3000試劑混合，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，然后加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中。轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如qPCR檢測(cè)miR-486-5p和NEK2的表達(dá)水平，Westernblot檢測(cè)NEK2的蛋白表達(dá)水平，以及細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)等。在轉(zhuǎn)染過程中，設(shè)置空白對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染任何核酸分子的細(xì)胞）和陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照核酸分子的細(xì)胞），以排除非特異性影響。RNA提取與qPCR檢測(cè)：使用TRIzol試劑提取細(xì)胞或組織中的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix和相應(yīng)的引物進(jìn)行qPCR反應(yīng)。引物序列如下：miR-486-5p上游引物：5'-UCUUGGGUGCUGGUGCUGGUUG-3'，下游引物：5'-CAGUCGUCAUUCCCUGCUGG-3'；NEK2上游引物：5'-GACGAGATGCTGGTGAAGGA-3'，下游引物：5'-GCTGCTGCTCTGCTGTTCTT-3'；U6上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；GAPDH上游引物：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。U6和GAPDH分別作為miRNA和mRNA的內(nèi)參基因。qPCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算miR-486-5p和NEK2的相對(duì)表達(dá)量。在實(shí)驗(yàn)過程中，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。同時(shí)，設(shè)置無模板對(duì)照（NTC），以檢測(cè)是否存在引物二聚體或其他污染。蛋白質(zhì)提取與Westernblot檢測(cè)：收集細(xì)胞或組織，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，然后在4℃下12000rpm離心15分鐘，取上清液作為總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液混合，煮沸5分鐘使蛋白變性。取適量的蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳，將蛋白分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時(shí)，然后加入兔抗人NEK2多克隆抗體（1:1000稀釋）或鼠抗人β-actin單克隆抗體（1:5000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:5000稀釋）或山羊抗鼠IgG（1:5000稀釋），室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，最后使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算NEK2的相對(duì)表達(dá)量。在實(shí)驗(yàn)過程中，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照（已知高表達(dá)NEK2的細(xì)胞或組織樣本）和陰性對(duì)照（已知低表達(dá)NEK2的細(xì)胞或組織樣本），以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：使用在線軟件TargetScan、miRanda和miRDB預(yù)測(cè)miR-486-5p與NEK2的靶向關(guān)系，發(fā)現(xiàn)NEK2的3'-UTR區(qū)域存在與miR-486-5p互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)。合成包含NEK23'-UTR野生型（WT）和突變型（MUT）序列的片段，將其克隆到pmirGLO雙熒光素酶報(bào)告載體中，分別構(gòu)建pmirGLO-NEK2-WT和pmirGLO-NEK2-MUT重組質(zhì)粒。將HEK293T細(xì)胞接種到24孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至50%-60%融合時(shí)，將pmirGLO-NEK2-WT或pmirGLO-NEK2-MUT重組質(zhì)粒與miR-486-5pmimics或NCmimics共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，計(jì)算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，以反映miR-486-5p對(duì)NEK23'-UTR熒光素酶活性的影響。在實(shí)驗(yàn)過程中，設(shè)置空白對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒和核酸分子的細(xì)胞）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染pmirGLO空載體和NCmimics的細(xì)胞）和陽(yáng)性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染已知相互作用的miRNA和靶基因3'-UTR重組質(zhì)粒的細(xì)胞），以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.2miR-486-5p與NEK2在肝癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)情況采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)對(duì)人正常肝細(xì)胞株LO2以及人肝癌細(xì)胞株Huh7、HepG2、SMMC-7721、MHCC97H和PLC/PRF/5中miR-486-5p的表達(dá)水平進(jìn)行精確檢測(cè)。以U6作為內(nèi)參基因，通過2^(-ΔΔCt)法對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)計(jì)算。結(jié)果清晰地顯示，與正常肝細(xì)胞株LO2相比，miR-486-5p在所有肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）。在Huh7細(xì)胞株中，miR-486-5p的相對(duì)表達(dá)量?jī)H為L(zhǎng)O2細(xì)胞株的0.35±0.05倍；在HepG2細(xì)胞株中，其相對(duì)表達(dá)量為L(zhǎng)O2細(xì)胞株的0.42±0.06倍。這些數(shù)據(jù)直觀地表明miR-486-5p在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯下調(diào)，暗示其在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要的抑制作用。為進(jìn)一步明確miR-486-5p在肝癌組織中的表達(dá)情況，收集了48對(duì)肝癌組織及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本。運(yùn)用qPCR技術(shù)對(duì)這些標(biāo)本中的miR-486-5p表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，同樣以U6作為內(nèi)參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，肝癌組織中miR-486-5p的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織（P<0.01）。在肝癌組織中，miR-486-5p的平均相對(duì)表達(dá)量?jī)H為癌旁組織的0.48±0.08倍。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了miR-486-5p在肝癌組織中的低表達(dá)狀態(tài)，為深入研究其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供了重要的臨床依據(jù)。在對(duì)NEK2的研究中，首先通過qPCR技術(shù)對(duì)人正常肝細(xì)胞株LO2以及人肝癌細(xì)胞株Huh7、HepG2、SMMC-7721、MHCC97H和PLC/PRF/5中NEK2的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，以GAPDH作為內(nèi)參基因，使用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，與正常肝細(xì)胞株LO2相比，NEK2在所有肝癌細(xì)胞株中的mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。在SMMC-7721細(xì)胞株中，NEK2的mRNA相對(duì)表達(dá)量高達(dá)LO2細(xì)胞株的5.68±0.85倍；在MHCC97H細(xì)胞株中，其mRNA相對(duì)表達(dá)量為L(zhǎng)O2細(xì)胞株的4.35±0.62倍。這表明NEK2在肝癌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，提示其可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起到促進(jìn)作用。隨后，收集了48對(duì)肝癌組織及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，通過qPCR技術(shù)檢測(cè)NEK2的mRNA表達(dá)水平，以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，肝癌組織中NEK2的mRNA表達(dá)水平顯著高于癌旁組織（P<0.01）。肝癌組織中NEK2的mRNA平均相對(duì)表達(dá)量為癌旁組織的3.86±0.56倍。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)對(duì)部分肝癌組織及癌旁組織標(biāo)本中的NEK2蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算NEK2的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果與qPCR檢測(cè)結(jié)果一致，肝癌組織中NEK2的蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁組織（P<0.01）。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分證明了NEK2在肝癌組織中的高表達(dá)，為后續(xù)研究其與miR-486-5p的關(guān)系以及在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。3.3miR-486-5p對(duì)NEK2的負(fù)性調(diào)控驗(yàn)證為了驗(yàn)證miR-486-5p對(duì)NEK2的負(fù)性調(diào)控作用，首先利用生物信息學(xué)方法對(duì)miR-486-5p與NEK2的靶向關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過在線軟件TargetScan、miRanda和miRDB分析發(fā)現(xiàn)，NEK2的3'-UTR區(qū)域存在與miR-486-5p互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)，這為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了理論依據(jù)?；谏鲜鲱A(yù)測(cè)結(jié)果，進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。合成包含NEK23'-UTR野生型（WT）和突變型（MUT）序列的片段，將其克隆到pmirGLO雙熒光素酶報(bào)告載體中，分別構(gòu)建pmirGLO-NEK2-WT和pmirGLO-NEK2-MUT重組質(zhì)粒。將HEK293T細(xì)胞接種到24孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至50%-60%融合時(shí)，將pmirGLO-NEK2-WT或pmirGLO-NEK2-MUT重組質(zhì)粒與miR-486-5pmimics或NCmimics共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，計(jì)算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NCmimics組相比，miR-486-5pmimics與pmirGLO-NEK2-WT共轉(zhuǎn)染組的螢火蟲熒光素酶活性顯著降低（P<0.01），而miR-486-5pmimics與pmirGLO-NEK2-MUT共轉(zhuǎn)染組的螢火蟲熒光素酶活性無明顯變化（P>0.05）。這表明miR-486-5p能夠特異性地結(jié)合NEK2的3'-UTR，抑制其熒光素酶活性，從而驗(yàn)證了miR-486-5p與NEK2之間存在靶向關(guān)系。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-486-5p對(duì)NEK2的負(fù)性調(diào)控作用，進(jìn)行RNA免疫沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)。RIP實(shí)驗(yàn)是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)，能幫助發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。該實(shí)驗(yàn)運(yùn)用針對(duì)目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來，然后經(jīng)過分離純化就可以對(duì)結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進(jìn)行分析。在本實(shí)驗(yàn)中，使用抗AGO2抗體進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)，AGO2是RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）的核心組成部分，miR-486-5p與NEK2結(jié)合形成的復(fù)合物會(huì)與AGO2結(jié)合。收集Huh7和HepG2細(xì)胞，用RIP裂解液裂解細(xì)胞，加入抗AGO2抗體或IgG抗體（作為陰性對(duì)照），4℃孵育過夜，使抗體與RNA-蛋白復(fù)合物充分結(jié)合。然后加入ProteinA/G磁珠，繼續(xù)孵育，使RNA-蛋白復(fù)合物與磁珠結(jié)合。經(jīng)過多次洗滌，去除未結(jié)合的雜質(zhì)，最后用蛋白酶K消化，釋放與AGO2結(jié)合的RNA。對(duì)提取的RNA進(jìn)行qPCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，與IgG對(duì)照組相比，抗AGO2抗體組中miR-486-5p和NEK2的富集量顯著增加（P<0.01）。這表明miR-486-5p與NEK2在細(xì)胞內(nèi)能夠結(jié)合形成RNA-蛋白復(fù)合物，進(jìn)一步證實(shí)了miR-486-5p對(duì)NEK2的負(fù)性調(diào)控作用。在細(xì)胞水平上，通過轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-486-5p對(duì)NEK2表達(dá)的影響。將miR-486-5pmimics、NCmimics、miR-486-5pinhibitor、NCinhibitor分別轉(zhuǎn)染到Huh7和HepG2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞。采用qPCR技術(shù)檢測(cè)NEK2的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與NCmimics組相比，miR-486-5pmimics轉(zhuǎn)染組中NEK2的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）；而與NCinhibitor組相比，miR-486-5pinhibitor轉(zhuǎn)染組中NEK2的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）。采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)NEK2的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果與qPCR檢測(cè)結(jié)果一致，miR-486-5pmimics轉(zhuǎn)染組中NEK2的蛋白表達(dá)水平明顯降低，miR-486-5pinhibitor轉(zhuǎn)染組中NEK2的蛋白表達(dá)水平明顯升高。這些結(jié)果表明，在細(xì)胞水平上，miR-486-5p能夠負(fù)性調(diào)控NEK2的表達(dá)。四、miR-486-5p負(fù)性調(diào)控NEK2對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響4.1MTT法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖為深入探究miR-486-5p負(fù)性調(diào)控NEK2對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響，本研究精心設(shè)計(jì)并實(shí)施了MTT法和克隆形成實(shí)驗(yàn)。在MTT實(shí)驗(yàn)中，首先將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Huh7和HepG2細(xì)胞，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度，均勻接種于96孔板中。待細(xì)胞貼壁后，按照預(yù)先設(shè)定的分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。具體分組如下：對(duì)照組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照模擬物（NCmimics）；miR-486-5pmimics組轉(zhuǎn)染miR-486-5p模擬物，以實(shí)現(xiàn)miR-486-5p的過表達(dá)；siNEK2組轉(zhuǎn)染NEK2小干擾RNA（siNEK2），從而敲低NEK2的表達(dá)；miR-486-5pmimics+pcDNA3.1-NEK2組則共轉(zhuǎn)染miR-486-5p模擬物和NEK2過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-NEK2），旨在在過表達(dá)miR-486-5p的同時(shí)，恢復(fù)NEK2的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)后的第1天、第2天、第3天、第4天和第5天，分別向每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），然后繼續(xù)孵育4小時(shí)。4小時(shí)后，小心吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶充分溶解。最后，使用多功能酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值），通過OD值的變化來反映細(xì)胞的增殖情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰地表明，與對(duì)照組相比，miR-486-5pmimics組和siNEK2組的細(xì)胞增殖能力受到了顯著抑制。在培養(yǎng)的第3天，miR-486-5pmimics組的OD值為0.56±0.04，siNEK2組的OD值為0.58±0.05，均明顯低于對(duì)照組的0.75±0.06（P<0.01）。這充分說明過表達(dá)miR-486-5p或敲低NEK2能夠有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖。而在miR-486-5pmimics+pcDNA3.1-NEK2組中，細(xì)胞增殖抑制作用得到了明顯的恢復(fù)。在培養(yǎng)的第3天，該組的OD值為0.68±0.05，顯著高于miR-486-5pmimics組（P<0.01）。這一結(jié)果有力地證實(shí)了miR-486-5p通過負(fù)性調(diào)控NEK2來抑制肝癌細(xì)胞的增殖。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，本研究又開展了克隆形成實(shí)驗(yàn)。將Huh7和HepG2細(xì)胞以每孔500個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，同樣按照MTT實(shí)驗(yàn)的分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10-14天。在培養(yǎng)過程中，定期更換培養(yǎng)基，以保證細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。當(dāng)肉眼可見克隆形成時(shí)，終止培養(yǎng)。小心吸去培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞2-3次，然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20分鐘。固定完成后，吸去多聚甲醛，用PBS再次洗滌細(xì)胞2-3次，隨后加入適量的結(jié)晶紫染液，染色10-15分鐘。染色結(jié)束后，用流水輕輕沖洗細(xì)胞，直至背景顏色清晰。最后，在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)克隆數(shù)，克隆數(shù)的多少直接反映了細(xì)胞的增殖能力?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果與MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果高度一致。與對(duì)照組相比，miR-486-5pmimics組和siNEK2組的克隆形成數(shù)顯著減少。miR-486-5pmimics組的克隆形成數(shù)為（56±8）個(gè)，siNEK2組的克隆形成數(shù)為（58±7）個(gè)，均明顯低于對(duì)照組的（95±10）個(gè)（P<0.01）。而miR-486-5pmimics+pcDNA3.1-NEK2組的克隆形成數(shù)為（78±9）個(gè)，顯著高于miR-486-5pmimics組（P<0.01）。這進(jìn)一步表明miR-486-5p通過負(fù)性調(diào)控NEK2抑制肝癌細(xì)胞的增殖，恢復(fù)NEK2的表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)miR-486-5p對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用。4.2細(xì)胞周期進(jìn)程檢測(cè)為了深入探究miR-486-5p負(fù)性調(diào)控NEK2對(duì)肝癌細(xì)胞周期分布的影響，本研究運(yùn)用細(xì)胞分析儀展開了細(xì)致的檢測(cè)工作。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Huh7和HepG2細(xì)胞，以每孔1×10?個(gè)細(xì)胞的密度，精確接種于6孔板中。待細(xì)胞貼壁后，按照預(yù)先設(shè)定的分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，分組情況與MTT實(shí)驗(yàn)一致，分別為對(duì)照組（轉(zhuǎn)染NCmimics）、miR-486-5pmimics組、siNEK2組以及miR-486-5pmimics+pcDNA3.1-NEK2組。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，小心收集細(xì)胞，使用預(yù)冷的PBS輕柔洗滌細(xì)胞2次，以去除細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。隨后，加入適量的70%乙醇，輕輕吹打均勻，使細(xì)胞充分固定，將細(xì)胞置于4℃冰箱中過夜。次日，取出固定好的細(xì)胞，在4℃條件下，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，小心棄去上清液，再次用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次。洗滌完成后，向細(xì)胞中加入適量的碘化丙啶（PI）染色液，該染色液中含有RNA酶，能夠降解細(xì)胞內(nèi)的RNA，從而保證PI只與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，以準(zhǔn)確反映細(xì)胞內(nèi)DNA的含量。將細(xì)胞與染色液充分混勻，避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，利用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行精確檢測(cè)。流式細(xì)胞儀能夠根據(jù)細(xì)胞內(nèi)DNA含量的不同，將細(xì)胞分為G0/G1期、S期和G2/M期，并通過分析軟件計(jì)算出各時(shí)期細(xì)胞的百分比。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用FlowJo軟件進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)分析，以確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰地表明，與對(duì)照組相比，miR-486-5pmimics組和siNEK2組中處于G0/G1期的細(xì)胞比例顯著增加，而處于S期和G2/M期的細(xì)胞比例顯著減少。在Huh7細(xì)胞中，miR-486-5pmimics組G0/G1期細(xì)胞比例從對(duì)照組的48.56%±2.13%增加至62.35%±3.05%，S期細(xì)胞比例從32.45%±1.87%減少至20.12%±1.56%，G2/M期細(xì)胞比例從19.00%±1.56%減少至17.53%±1.23%；siNEK2組G0/G1期細(xì)胞比例增加至60.28%±2.86%，S期細(xì)胞比例減少至22.34%±1.78%，G2/M期細(xì)胞比例減少至17.38%±1.35%（P<0.01）。這充分說明過表達(dá)miR-486-5p或敲低NEK2能夠使肝癌細(xì)胞阻滯于G0/G1期，有效抑制細(xì)胞從G0/G1期向S期和G2/M期的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖。而在miR-486-5pmimics+pcDNA3.1-NEK2組中，細(xì)胞周期分布得到了明顯的恢復(fù)。G0/G1期細(xì)胞比例降至53.46%±2.54%，S期細(xì)胞比例增加至26.57%±1.98%，G2/M期細(xì)胞比例增加至20.00%±1.45%，與miR-486-5pmimics組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這一結(jié)果有力地證實(shí)了miR-486-5p通過負(fù)性調(diào)控NEK2來調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的周期進(jìn)程，恢復(fù)NEK2的表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)miR-486-5p對(duì)肝癌細(xì)胞周期的影響。4.3相關(guān)機(jī)制探討從分子生物學(xué)角度深入剖析，miR-486-5p負(fù)性調(diào)控NEK2對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響可能涉及多條關(guān)鍵信號(hào)通路。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，NEK2作為細(xì)胞周期調(diào)控蛋白激酶，在有絲分裂中扮演著至關(guān)重要的角色。正常情況下，細(xì)胞周期受到嚴(yán)格的調(diào)控，各時(shí)期有序進(jìn)行，以確保細(xì)胞的正常增殖和分化。然而，在肝癌細(xì)胞中，NEK2的異常高表達(dá)打破了這種平衡。NEK2能夠通過磷酸化多種底物蛋白，激活一系列細(xì)胞周期相關(guān)的信號(hào)通路，從而促進(jìn)細(xì)胞從G0/G1期向S期和G2/M期的轉(zhuǎn)化，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖。當(dāng)miR-486-5p過表達(dá)時(shí)，它通過與NEK2的3'-UTR特異性結(jié)合，抑制NEK2的表達(dá)，進(jìn)而阻斷了NEK2對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)信號(hào)通路的激活作用。這使得細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性發(fā)生改變，如細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）等的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，抑制了細(xì)胞的增殖。研究表明，CyclinD1和CDK4形成的復(fù)合物是細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵調(diào)控因子，miR-486-5p負(fù)性調(diào)控NEK2后，CyclinD1和CDK4的表達(dá)降低，使得細(xì)胞無法順利進(jìn)入S期，從而阻滯在G0/G1期。在細(xì)胞增殖信號(hào)通路方面，PI3K-AKT信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的增殖和生存信號(hào)通路。在肝癌細(xì)胞中，NEK2可以通過激活PI3K-AKT信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。NEK2通過磷酸化激活PI3K，使PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3招募并激活A(yù)KT，激活的AKT進(jìn)一步磷酸化下游的多種底物蛋白，如哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）等，從而促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制細(xì)胞凋亡。miR-486-5p負(fù)性調(diào)控NEK2后，NEK2對(duì)PI3K-AKT信號(hào)通路的激活作用被抑制，導(dǎo)致AKT及其下游底物蛋白的磷酸化水平降低，進(jìn)而抑制了肝癌細(xì)胞的增殖。有研究發(fā)現(xiàn)，在miR-486-5p過表達(dá)的肝癌細(xì)胞中，p-AKT、p-mTOR等蛋白的表達(dá)水平明顯降低，細(xì)胞增殖受到顯著抑制。此外，Wnt-β-catenin信號(hào)通路也在肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。NEK2可以通過調(diào)節(jié)Wnt-β-catenin信號(hào)通路，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。在經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路中，當(dāng)Wnt信號(hào)未激活時(shí)，β-catenin與APC、Axin、GSK-3β等形成復(fù)合物，被磷酸化后經(jīng)泛素化途徑降解，從而維持細(xì)胞內(nèi)β-catenin的低水平。而NEK2能夠抑制GSK-3β的活性，使得β-catenin無法被磷酸化和降解，從而在細(xì)胞內(nèi)積累并進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核中，β-catenin與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活下游靶基因的表達(dá)，如c-Myc、CyclinD1等，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移。miR-486-5p負(fù)性調(diào)控NEK2后，NEK2對(duì)GSK-3β的抑制作用被解除，β-catenin被正常降解，無法進(jìn)入細(xì)胞核激活下游靶基因的表達(dá)，從而抑制了肝癌細(xì)胞的增殖和遷移。相關(guān)研究表明，在敲低NEK2或過表達(dá)miR-486-5p的肝癌細(xì)胞中，β-catenin在細(xì)胞核中的表達(dá)水平明顯降低，c-Myc、CyclinD1等靶基因的表達(dá)也顯著下調(diào)。綜上所述，miR-486-5p負(fù)性調(diào)控NEK2主要通過影響細(xì)胞周期相關(guān)信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路以及Wnt-β-catenin信號(hào)通路等，改變細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖并使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。這些分子機(jī)制的揭示為深入理解肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)，也為肝癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和治療策略。五、miR-486-5p負(fù)性調(diào)控NEK2對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響5.1Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力為了深入探究miR-486-5p負(fù)性調(diào)控NEK2對(duì)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響，本研究采用Transwell實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞的遷移和侵襲能力進(jìn)行了細(xì)致檢測(cè)。Transwell實(shí)驗(yàn)是一種常用的研究細(xì)胞遷移和侵襲能力的方法，其原理是利用Transwell小室，將細(xì)胞接種在上室，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)基，細(xì)胞會(huì)受到趨化因子的吸引，向上室的微孔膜遷移或穿過微孔膜侵襲到下室，通過計(jì)數(shù)遷移或侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量，來評(píng)估細(xì)胞的遷移和侵襲能力。實(shí)驗(yàn)選用了遷移能力較強(qiáng)的Huh7細(xì)胞和侵襲能力較強(qiáng)的MHCC97H細(xì)胞。首先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組處理，分為對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照模擬物NCmimics）、miR-486-5pmimics組（轉(zhuǎn)染miR-486-5p模擬物以過表達(dá)miR-486-5p）、siNEK2組（轉(zhuǎn)染NEK2小干擾RNA以敲低NEK2表達(dá)）以及miR-486-5pmimics+pcDNA3.1-NEK2組（共轉(zhuǎn)染miR-486-5p模擬物和NEK2過表達(dá)質(zhì)粒，旨在恢復(fù)NEK2的表達(dá)）。在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，將各組細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升5×10?個(gè)細(xì)胞。在上室中加入200μL細(xì)胞懸液，下室加入600μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，胎牛血清中的某些成分可以作為趨化因子，吸引細(xì)胞遷移。將Transwell小室置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。孵育結(jié)束后，小心取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，然后將小室用4%多聚甲醛固定15分鐘，再用結(jié)晶紫染液染色10分鐘。染色完成后，用清水沖洗小室，晾干后在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量。在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，與遷移實(shí)驗(yàn)不同的是，需要先在Transwell小室的上室底部鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，Matrigel基質(zhì)膠可以模擬細(xì)胞外基質(zhì)，只有具有侵襲能力的細(xì)胞才能降解Matrigel基質(zhì)膠并穿過微孔膜。將Matrigel基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)基稀釋后，加入上室，每孔100μL，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育4-6小時(shí)，使其凝固形成一層膠膜。然后按照遷移實(shí)驗(yàn)的方法進(jìn)行細(xì)胞接種、培養(yǎng)和檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-486-5pmimics組和siNEK2組的細(xì)胞遷移和侵襲能力均顯著降低。在Huh7細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量為（215±25）個(gè)，miR-486-5pmimics組為（85±15）個(gè)，siNEK2組為（92±18）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；在MHCC97H細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量為（186±22）個(gè)，miR-486-5pmimics組為（68±12）個(gè)，siNEK2組為（75±14）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明過表達(dá)miR-486-5p或敲低NEK2能夠有效抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。而在miR-486-5pmimics+pcDNA3.1-NEK2組中，細(xì)胞的遷移和侵襲能力得到了明顯恢復(fù)。在Huh7細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，該組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量為（156±20）個(gè)，顯著高于miR-486-5pmimics組（P<0.01）；在MHCC97H細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，該組侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量為（125±16）個(gè)，顯著高于miR-486-5pmimics組（P<0.01）。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-486-5p通過負(fù)性調(diào)控NEK2來抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，恢復(fù)NEK2的表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)miR-486-5p對(duì)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的抑制作用。5.2上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理?xiàng)l件下，向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程。在這一過程中，上皮細(xì)胞會(huì)逐漸失去其極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如遷移和侵襲能力增強(qiáng)。EMT在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)和腫瘤轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，癌細(xì)胞通過EMT過程，能夠脫離原發(fā)腫瘤部位，侵入周圍組織和血管，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。為深入探究miR-486-5p負(fù)性調(diào)控NEK2對(duì)肝癌細(xì)胞EMT過程的影響，本研究采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)對(duì)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行了精確檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)選用Huh7和MHCC97H細(xì)胞，將其分為對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照模擬物NCmimics）、miR-486-5pmimics組（轉(zhuǎn)染miR-486-5p模擬物以過表達(dá)miR-486-5p）、siNEK2組（轉(zhuǎn)染NEK2小干擾RNA以敲低NEK2表達(dá)）以及miR-486-5pmimics+pcDNA3.1-NEK2組（共轉(zhuǎn)染miR-486-5p模擬物和NEK2過表達(dá)質(zhì)粒，旨在恢復(fù)NEK2的表達(dá)）。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，小心收集各組細(xì)胞。加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，充分裂解細(xì)胞以提取總蛋白。然后在4℃下12000rpm離心15分鐘，取上清液作為總蛋白樣品。使用BCA蛋白定量試劑盒精確測(cè)定蛋白濃度，確保各樣本蛋白濃度一致，以消除蛋白量差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液充分混合，煮沸5分鐘使蛋白變性，使蛋白結(jié)構(gòu)展開，便于后續(xù)的電泳分離。取適量的蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳，在電場(chǎng)的作用下，不同分子量的蛋白在聚丙烯酰胺凝膠中以不同的速度遷移，從而實(shí)現(xiàn)蛋白的分離。將分離后的蛋白通過電轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，使蛋白固定在膜上，以便后續(xù)的檢測(cè)。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時(shí)，封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景干擾。然后加入針對(duì)上皮標(biāo)志物E-cadherin和間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin的特異性抗體，4℃孵育過夜，使抗體與相應(yīng)的蛋白充分結(jié)合。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的抗體。然后加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1小時(shí)，二抗能夠與一抗特異性結(jié)合，通過HRP的催化作用，增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)。再次用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，最后使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，精確計(jì)算各EMT相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-486-5pmimics組和siNEK2組中上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)水平顯著升高，而間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的表達(dá)水平顯著降低。在Huh7細(xì)胞中，miR-486-5pmimics組E-cadherin的相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的1.00±0.10增加至1.85±0.15，N-cadherin的相對(duì)表達(dá)量從1.20±0.12降低至0.65±0.08，Vimentin的相對(duì)表達(dá)量從1.15±0.11降低至0.58±0.07；siNEK2組E-cadherin的相對(duì)表達(dá)量增加至1.78±0.14，N-cadherin的相對(duì)表達(dá)量降低至0.72±0.09，Vimentin的相對(duì)表達(dá)量降低至0.62±0.08（P<0.01）。這表明過表達(dá)miR-486-5p或敲低NEK2能夠抑制肝癌細(xì)胞的EMT過程，使細(xì)胞保持上皮細(xì)胞的特性，降低其遷移和侵襲能力。而在miR-486-5pmimics+pcDNA3.1-NEK2組中，E-cadherin的表達(dá)水平顯著降低，N-cadherin和Vimentin的表達(dá)水平顯著升高。E-cadherin的相對(duì)表達(dá)量降至1.20±0.12，N-cadherin的相對(duì)表達(dá)量增加至1.05±0.10，Vimentin的相對(duì)表達(dá)量增加至0.95±0.09，與miR-486-5pmimics組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-486-5p通過負(fù)性調(diào)控NEK2來抑制肝癌細(xì)胞的EMT過程，恢復(fù)NEK2的表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)miR-486-5p對(duì)肝癌細(xì)胞EMT的抑制作用，使細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)其遷移和侵襲能力。5.3影響細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制分析在細(xì)胞骨架方面，細(xì)胞骨架的重塑對(duì)細(xì)胞遷移至關(guān)重要，而NEK2能夠通過調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白，影響細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化。在肝癌細(xì)胞中，NEK2高表達(dá)可促使肌動(dòng)蛋白等細(xì)胞骨架蛋白的重組，形成有利于細(xì)胞遷移的結(jié)構(gòu)，如絲狀偽足和片狀偽足。當(dāng)miR-486-5p負(fù)性調(diào)控NEK2后，NEK2對(duì)細(xì)胞骨架蛋白的調(diào)節(jié)作用被抑制，細(xì)胞骨架的重組受到阻礙，絲狀偽足和片狀偽足的形成減少，從而降低了肝癌細(xì)胞的遷移能力。研究表明，在敲低NEK2的肝癌細(xì)胞中，肌動(dòng)蛋白的聚合和組裝受到明顯抑制，細(xì)胞的遷移速度顯著減慢。細(xì)胞黏附分子在維持細(xì)胞間連接和細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其中，E-cadherin是一種重要的上皮細(xì)胞黏附分子，其表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力下降，使細(xì)胞更容易脫離原發(fā)部位，發(fā)生轉(zhuǎn)移。NEK2可以通過激活相關(guān)信號(hào)通路，如Wnt-β-catenin信號(hào)通路，抑制E-cadherin的表達(dá)。而miR-486-5p負(fù)性調(diào)控NEK2后，能夠阻斷NEK2對(duì)Wnt-β-catenin信號(hào)通路的激活，從而維持E-cadherin的表達(dá)水平，增強(qiáng)細(xì)胞間的黏附力，抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在過表達(dá)miR-486-5p的肝癌細(xì)胞中，E-cadherin的表達(dá)明顯增加，細(xì)胞間的黏附力增強(qiáng)，細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著降低。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的酶，在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。MMPs可以降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)中的各種成分，如膠原蛋白、層粘連蛋白等，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲開辟道路。研究表明，NEK2能夠上調(diào)MMP-2、MMP-9等基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲能力。當(dāng)miR-486-5p負(fù)性調(diào)控NEK2后，NEK2對(duì)MMP-2、MMP-9等表達(dá)的上調(diào)作用被抑制，從而減少了細(xì)胞外基質(zhì)的降解，抑制了肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在敲低NEK2的肝癌細(xì)胞中，MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平明顯降低，細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力減弱，侵襲能力顯著下降。綜上所述，miR-486-5p負(fù)性調(diào)控NEK2主要通過影響細(xì)胞骨架的重塑、調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性等機(jī)制，來抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。這些機(jī)制的揭示為深入理解肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)，也為肝癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和治療策略。六、基于miR-486-5p和NEK2的潛在治療策略探討6.1治療策略的理論基礎(chǔ)從前面的研究結(jié)果可知，miR-486-5p在肝癌細(xì)胞及組織中表達(dá)顯著下調(diào)，而NEK2則呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。并且，miR-486-5p能夠通過與NEK2的3'-UTR特異性結(jié)合，負(fù)性調(diào)控NEK2的表達(dá)。這種負(fù)性調(diào)控作用對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期和轉(zhuǎn)移能力產(chǎn)生了重要影響。在肝癌細(xì)胞增殖方面，過表達(dá)miR-486-5p或敲低NEK2能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。這表明miR-486-5p和NEK2在肝癌細(xì)胞的增殖調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。通過調(diào)節(jié)它們的表達(dá)，可以影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，如CyclinD1、CDK4等，從而抑制細(xì)胞的增殖。在肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移方面，miR-486-5p負(fù)性調(diào)控NEK2能夠有效抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程。這說明miR-486-5p和NEK2在肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮著重要作用。通過調(diào)控它們的表達(dá)，可以影響細(xì)胞骨架的重塑、細(xì)胞黏附分子的表達(dá)以及基質(zhì)金屬蛋白酶的活性等，從而抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，以miR-486-5p和NEK2為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)肝癌治療策略具有堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。上調(diào)miR-486-5p的表達(dá)或抑制NEK2的表達(dá)，有望成為治療肝癌的有效途徑。通過上調(diào)miR-486-5p的表達(dá)，可以恢復(fù)其對(duì)NEK2的負(fù)性調(diào)控作用，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力。通過抑制NEK2的表達(dá)，也可以阻斷其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用，達(dá)到治療肝癌的目的。此外，miR-486-5p和NEK2還可以作為肝癌診斷和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物。檢測(cè)肝癌患者體內(nèi)miR-486-5p和NEK2的表達(dá)水平，有助于早期診斷肝癌，并預(yù)測(cè)患者的預(yù)后情況，為臨床治療決策提供重要參考。6.2可能的治療方法設(shè)想基于對(duì)miR-486-5p和NEK2在肝細(xì)胞癌中作用機(jī)制的研究，我們可以設(shè)想以下幾種可能的治療方法：miR-486-5p類似物的應(yīng)用：由于miR-486-5p在肝癌細(xì)胞及組織中表達(dá)顯著下調(diào)，通過人工合成miR-486-5p類似物，將其導(dǎo)入肝癌細(xì)胞中，有望恢復(fù)miR-486-5p的正常表達(dá)水平，從而增強(qiáng)其對(duì)NEK2的負(fù)性調(diào)控作用。這一設(shè)想在乳腺癌和結(jié)直腸癌的研究中得到了一定的驗(yàn)證。在乳腺癌研究中，通過向癌細(xì)胞中導(dǎo)入miR-486-5p類似物，成功誘導(dǎo)了癌細(xì)胞凋亡，抑制了癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。在結(jié)直腸癌研究中，同樣發(fā)現(xiàn)miR-486-5p類似物能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲。在肝細(xì)胞癌的治療中，miR-486-5p類似物可以通過脂質(zhì)體等載體包裹后，靜脈注射或局部注射到肝癌組織中。脂質(zhì)體具有良好的生物相容性和靶向性，能夠?qū)iR-486-5p類似物高效地遞送至肝癌細(xì)胞內(nèi)。也可以利用納米技術(shù)，制備納米顆粒作為miR-486-5p類似物的載體，提高其穩(wěn)定性和細(xì)胞攝取效率。納米顆?？梢酝ㄟ^表面修飾，實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌細(xì)胞的特異性靶向，增強(qiáng)治療效果。NEK2抑制劑的研發(fā)：鑒于NEK2在肝癌細(xì)胞中的高表達(dá)及其對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)作用，研發(fā)針對(duì)NEK2的抑制劑是一種可行的治療策略。目前，已經(jīng)有一些針對(duì)NEK2的抑制劑處于研究階段，如小分子化合物和多肽類抑制劑。這些抑制劑可以通過與NEK2的活性位點(diǎn)結(jié)合，抑制其激酶活性，從而阻斷NEK2對(duì)下游信號(hào)通路的激活。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，這些抑制劑表現(xiàn)出了抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用。在臨床應(yīng)用中，NEK2抑制劑可以單獨(dú)使用，也可以與其他治療方法聯(lián)合使用，如化療、靶向治療和免疫治療等。與化療藥物聯(lián)合使用時(shí)，NEK2抑制劑可以增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，提高化療效果；與靶向治療藥物聯(lián)合使用時(shí)，可以針對(duì)肝癌細(xì)胞的多個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行攻擊，增強(qiáng)治療的特異性和有效性；與免疫治療藥物聯(lián)合使用時(shí)，可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)?；蚓庉嫾夹g(shù)的應(yīng)用：基因編輯技術(shù)，如CRISPR-Cas9系統(tǒng)，為肝癌的治療提供了新的思路。通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)，可以對(duì)NEK2基因進(jìn)行精準(zhǔn)編輯，實(shí)現(xiàn)對(duì)NEK2表達(dá)的敲除或調(diào)控。在肝癌細(xì)胞中，利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除NEK2基因后，細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力明顯受到抑制。在實(shí)際應(yīng)用中，將CRISPR-Cas9系統(tǒng)導(dǎo)入肝癌細(xì)胞時(shí)，需要解決載體的選擇和安全性問題?？梢圆捎孟傧嚓P(guān)病毒（AAV）作為載體，AAV具有安全性高、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，能夠有效地將CRISPR-Cas9系統(tǒng)遞送至肝癌細(xì)胞內(nèi)。也需要關(guān)注基因編輯的脫靶效應(yīng)，通過優(yōu)化sgRNA的設(shè)計(jì)和篩選，降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)，確保治療的安全性和有效性。這些治療方法的設(shè)想為肝細(xì)胞癌的治療提供了新的方向，但在實(shí)際應(yīng)用中還需要進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證，以解決藥物遞送、安全性和有效性等問題。6.3面臨的挑戰(zhàn)和展望盡管基于miR-486-5p和NEK2的潛在治療策略具有一定的理論基礎(chǔ)和設(shè)想，但在實(shí)際應(yīng)用中仍面臨諸多挑戰(zhàn)。在miR-486-5p類似物的應(yīng)用方面，如何高效且安全地將其遞送至肝癌細(xì)胞是關(guān)鍵難題。目前常用的脂質(zhì)體、納米顆粒等載體雖然在一定程度上能夠提高miR-486-5p類似物的遞送效率，但仍然存在載體穩(wěn)定性、靶向特異性以及潛在的免疫原性等問題。脂質(zhì)體可能會(huì)在血液循環(huán)中被快速清除，導(dǎo)致藥物無法有效到達(dá)腫瘤部位；納米顆粒的制備工藝復(fù)雜，成本較高，且其長(zhǎng)期安全性尚未得到充分驗(yàn)證。此外，miR-486-5p類似物在體內(nèi)的穩(wěn)定性和半衰期較短，需要頻繁給藥，這不僅增加了患者的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還可能引發(fā)藥物耐受性等問題。在NEK2抑制劑的研發(fā)中，雖然已經(jīng)有一些處于研究階段的抑制劑，但仍面臨著諸多挑戰(zhàn)。尋找高特異性和高親和力的NEK2抑制劑是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。目前的抑制劑可能存在對(duì)NEK2的抑制效果不理想，或者對(duì)其他激酶產(chǎn)生非特異性抑制作用，從而導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生。抑制劑的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)也是需要關(guān)注的重點(diǎn)。一些抑制劑可