miR-873靶向調(diào)控GLI1基因：先天性心臟病發(fā)病機制與診療新視角一、引言1.1研究背景與意義先天性心臟?。–ongenitalHeartDisease，CHD）作為一類嚴重危害嬰幼兒健康的先天畸形，給社會和家庭帶來了沉重的負擔。在新生兒中，其發(fā)病率處于1％-2％的范圍，這意味著每100到200個新生兒里，就有1至2個受其困擾，并且在新生兒非感染性死亡原因中，先天性心臟病占據(jù)首位。先天性心臟病的類型繁雜多樣，像房間隔缺損、室間隔缺損、動脈導管未閉以及法洛四聯(lián)癥等都是較為常見的類型。不同類型的先天性心臟病，其發(fā)病機制和臨床表現(xiàn)存在顯著差異，但無一例外地都會對心臟的正常發(fā)育和功能產(chǎn)生影響，致使血液流動異常，進而對全身的血液循環(huán)造成不良影響。從病因角度來看，先天性心臟病的發(fā)生是遺傳因素、母體感染、環(huán)境因素等多種因素共同作用的結(jié)果。某些類型的先天性心臟病與特定的基因突變緊密相關(guān)，而其他類型則可能和染色體異?；蛘弑碛^遺傳改變存在關(guān)聯(lián)。在臨床表現(xiàn)方面，不同類型的先天性心臟病在兒童早期會有不同癥狀，比如呼吸急促、喂養(yǎng)困難、生長發(fā)育遲緩等。隨著年齡的增長，患者還可能出現(xiàn)心臟雜音、暈厥、心律失常等癥狀?，F(xiàn)階段，針對先天性心臟病的治療方法主要包括藥物治療、手術(shù)治療（如修補術(shù)、移植術(shù)等）以及介入性治療（如導管介入、射頻消融等）。然而，手術(shù)治療盡管是主要的治療方式，可不僅會給患者及其家庭帶來沉重的經(jīng)濟負擔，而且將近50％的患者還要面臨再次手術(shù)、心律失常、心力衰竭等諸多問題。至于無創(chuàng)產(chǎn)前診斷，目前主要依賴超聲影像檢查，最佳時間是孕20-24周，雖然有報道稱妊娠14周可進行診斷，但診斷特異性較差，診斷率僅為40％?？h級衛(wèi)生機構(gòu)和鄉(xiāng)級衛(wèi)生所大多無法開展嬰幼兒心臟超聲普查，這也在很大程度上限制了先天性心臟病的早期發(fā)現(xiàn)和干預。因此，鑒定CHD易感基因并闡明其調(diào)控網(wǎng)絡，對于提高先天性心臟病的診療水平，具有極其重要的理論和實踐意義。微小RNA(miRNA)是一類長約18-24nt的內(nèi)源性、非編碼單鏈RNA分子，它能通過與靶基因3'-非翻譯區(qū)(3'-UTR)互補結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達。作為心血管系統(tǒng)重要的調(diào)控因子，miRNA參與心血管系統(tǒng)的正常發(fā)育和相關(guān)疾病的發(fā)生。研究者已鑒定出多種與CHD密切相關(guān)的miRNA，充分提示了miRNA在CHD的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。腦膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因1（GLI1）編碼一類具有五個鋅指DNA結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄因子，其表達于第二生心區(qū)，參與房室分隔、心臟流出道形成等關(guān)鍵過程。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CHD患者心肌組織標本中GLI1基因表達降低，這強烈提示GLI1基因表達降低可能是其參與CHD發(fā)生的潛在機制。鑒于miRNA可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達，并且在CHD的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，我們推測CHD患者GLI1基因表達降低或許也受到某個miRNA的調(diào)控。通過生物信息學分析，我們驚喜地在GLI1基因3'-UTR預測到miR-873的可能結(jié)合位點。由此我們設想，miR-873可能通過與GLI1基因3'-UTR互補結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控GLI1基因表達，進而參與CHD的發(fā)生。對miR-873調(diào)控GLI1基因在先天性心臟病中的作用展開深入研究，有著多方面的重要意義。在理論層面，這一研究能夠為豐富GLI1基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制提供堅實的理論依據(jù)，有助于我們更深入、全面地理解先天性心臟病的發(fā)病機制，在分子水平上揭示疾病的本質(zhì)，為后續(xù)的研究開拓新的思路和方向。在實踐應用方面，有望為早期診斷CHD提供極具價值的候選靶標。通過檢測miR-873和GLI1基因的表達水平，或許能夠?qū)崿F(xiàn)對先天性心臟病的早期篩查和診斷，從而為患者爭取寶貴的治療時間，提高治療效果，改善患者的預后和生活質(zhì)量。1.2研究目的與創(chuàng)新點本研究旨在深入探究miR-873調(diào)控GLI1基因在先天性心臟病發(fā)生發(fā)展過程中的作用及機制。具體而言，研究目的包括以下幾個關(guān)鍵方面：其一，通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灥燃夹g(shù)手段，精準鑒定miR-873與GLI1基因3'-UTR的靶向結(jié)合關(guān)系，明確二者之間是否存在直接的相互作用。其二，借助過表達和表達抑制實驗（體外）以及心肌組織表達相關(guān)性分析（體內(nèi)），全面而深入地闡明miR-873對GLI1基因表達的調(diào)控機制，揭示這一調(diào)控過程在正常生理狀態(tài)和先天性心臟病病理狀態(tài)下的變化規(guī)律。其三，通過對CHD患者外周血清中miR-873表達水平的分析，以及體外心肌細胞生物學特性分析（涵蓋細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡、細胞自噬等多個關(guān)鍵方面），系統(tǒng)地闡明miR-873在CHD的臨床應用價值和作用機制，為臨床診斷和治療提供堅實的理論基礎和潛在的靶點。其四，通過恢復GLI1基因表達實驗，有力地證明miR-873通過靶向調(diào)控GLI1基因表達而參與CHD發(fā)生的具體過程，進一步明確二者在先天性心臟病發(fā)病機制中的關(guān)鍵作用和相互關(guān)系。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下兩個方面：在理論層面，目前關(guān)于GLI1基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制的研究尚不夠充分，本研究聚焦于miR-873對GLI1基因的調(diào)控作用，有望為豐富該領域的理論知識做出重要貢獻，為深入理解先天性心臟病的發(fā)病機制開拓新的視角和方向。在實踐應用方面，本研究首次提出將miR-873作為先天性心臟病早期診斷的候選靶標，這一創(chuàng)新性的發(fā)現(xiàn)具有重要的臨床意義。通過檢測miR-873的表達水平，有望實現(xiàn)對先天性心臟病的早期篩查和診斷，為患者爭取寶貴的治療時間，提高治療效果，改善患者的預后和生活質(zhì)量，具有潛在的廣泛應用前景。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，先天性心臟病的研究在國內(nèi)外都受到了廣泛關(guān)注，研究人員從多個角度深入探究其發(fā)病機制和潛在治療靶點，其中miR-873和GLI1基因與先天性心臟病的關(guān)聯(lián)成為研究熱點。在miR-873與先天性心臟病關(guān)系的研究方面，已有研究表明，先天性心臟病患者外周血清中miR-873表達升高，且其過表達能夠抑制心肌細胞增殖，使細胞周期阻滯于G1期。這揭示了miR-873在先天性心臟病的發(fā)生發(fā)展過程中，對心肌細胞的增殖和細胞周期進程產(chǎn)生了重要影響。此外，有專利提出了一種用于篩查先天性心臟病的生物標志物及試劑盒，其中生物標記物為miR-873，通過檢測外周血清中miR-873相對表達量來判斷是否患有先天性心臟病，為先天性心臟病的早期篩查提供了新的思路和方法。針對GLI1基因與先天性心臟病的相關(guān)性，研究發(fā)現(xiàn)GLI1基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子表達于第二生心區(qū)，在心臟發(fā)育過程中，參與房室分隔、心臟流出道形成等關(guān)鍵過程。中國醫(yī)科大學的邱廣蓉等人研究發(fā)現(xiàn)，GLI1基因編碼區(qū)SNP位點rs2228226與單純性先天性心臟病有明顯的相關(guān)性，具有G等位基因的人發(fā)生先天性心臟病的危險性相對增高。還有研究對GLI1基因rs10783826位點多態(tài)性與新生兒先天性心臟病的關(guān)聯(lián)性進行分析，雖得出該多態(tài)性與先天性心臟病不存在相關(guān)性的結(jié)論，但也為該領域的研究提供了數(shù)據(jù)參考。另外，有研究指出GLI1基因2101G〉A的雜合突變可能與先心病的發(fā)病相關(guān)度較高，為先天性心臟病的遺傳研究提供了新的線索。盡管目前關(guān)于miR-873和GLI1基因在先天性心臟病中的研究取得了一定成果，但仍存在諸多不足。在miR-873方面，雖然已知其在先天性心臟病患者外周血清中表達升高以及對心肌細胞生物學特性的部分影響，但對于其在體內(nèi)復雜的調(diào)控網(wǎng)絡以及與其他基因或信號通路的交互作用研究較少，其具體的作用機制尚未完全明確。在GLI1基因研究中，雖然已發(fā)現(xiàn)一些位點多態(tài)性與先天性心臟病的關(guān)聯(lián)，但對于基因表達調(diào)控的具體機制，特別是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制的研究還不夠深入，且不同研究結(jié)果之間存在一定差異，需要更多的研究來驗證和完善。此外，對于miR-873與GLI1基因之間的靶向調(diào)控關(guān)系，目前的研究也僅停留在初步驗證階段，其在先天性心臟病發(fā)生發(fā)展過程中的具體調(diào)控機制以及對心臟發(fā)育和功能的影響，仍有待進一步深入研究。二、先天性心臟病概述2.1定義與分類先天性心臟病，作為一種在胎兒時期心臟及大血管發(fā)育異常所引發(fā)的先天性畸形，是小兒群體中最為常見的心臟病類型。在存活嬰兒里，其發(fā)病率處于6‰-10‰的區(qū)間，倘若將出生前就已死亡的胎兒也涵蓋在內(nèi)，那么發(fā)病率還會更高。據(jù)估算，我國每年大約會有15萬患有先天性心臟病的新生兒誕生。先天性心臟病的類型豐富多樣，按照血液分流方向以及解剖學特點，大致可以劃分為左向右分流型（潛伏青紫型）、右向左分流型（青紫型）和無分流型（無青紫型）這三大類。左向右分流型的先天性心臟病，在正常情況下，由于體循環(huán)壓力高于肺循環(huán)，血液會從左向右分流，所以并不會出現(xiàn)青紫現(xiàn)象。然而，當屏氣、劇烈哭鬧或者患有肺炎等情況致使肺動脈或右心室壓力增高并超過左心壓力時，血液就會發(fā)生右向左分流，進而出現(xiàn)暫時性青紫。像房間隔缺損、室間隔缺損以及動脈導管未閉等，都屬于這一類型。房間隔缺損是指在胚胎發(fā)育過程中，房間隔的形成、吸收和融合出現(xiàn)異常，導致左、右心房之間殘留未閉的缺損，使得血液在心房水平發(fā)生分流。室間隔缺損則是由于室間隔在胚胎時期發(fā)育不全，形成異常交通，在心室水平產(chǎn)生左向右分流。動脈導管未閉是胎兒時期動脈導管在出生后未能正常閉合，主動脈的血液持續(xù)分流至肺動脈。右向左分流型的先天性心臟病，由于某些原因，如肺動脈狹窄、主動脈騎跨等，會使右心壓力增高并超過左心，血液便會從右向左分流，從而出現(xiàn)持續(xù)性青紫。法洛四聯(lián)癥、大動脈轉(zhuǎn)位等就屬于此類。法洛四聯(lián)癥包含肺動脈狹窄、室間隔缺損、主動脈騎跨和右心室肥厚這四種病理改變，是存活的發(fā)紺型先天性心臟病中最為常見的類型。大動脈轉(zhuǎn)位時，主動脈和肺動脈的位置發(fā)生對調(diào)，體循環(huán)和肺循環(huán)相互獨立，導致嚴重的缺氧和青紫。無分流型的先天性心臟病，心臟左右兩側(cè)或動靜脈之間不存在異常通路和分流，所以不會出現(xiàn)青紫癥狀。肺動脈狹窄、主動脈縮窄等屬于該類型。肺動脈狹窄是指右心室和肺動脈之間的通道出現(xiàn)狹窄，阻礙血液從右心室流向肺動脈。主動脈縮窄則是主動脈管腔局限性狹窄，導致血流受阻。各類先天性心臟病的發(fā)病情況也存在差異，其中室間隔缺損的發(fā)病率最高，緊隨其后的是房間隔缺損、動脈導管未閉和肺動脈狹窄。而在存活的發(fā)紺型先天性心臟病里，法洛四聯(lián)癥最為常見。這些不同類型的先天性心臟病，其發(fā)病機制、臨床表現(xiàn)、治療方法以及預后情況都各有特點，深入了解它們對于先天性心臟病的診斷、治療和研究具有重要意義。2.2發(fā)病率與危害先天性心臟病在新生兒中的發(fā)病率相對較高，在存活嬰兒中，其發(fā)病率處于6‰-10‰的范圍，若將出生前已死亡的胎兒計算在內(nèi)，發(fā)病率會更高。據(jù)相關(guān)估算，我國每年約有15萬患有先天性心臟病的新生兒出生。在全球范圍內(nèi)，先天性心臟病也是新生兒和兒童時期常見的嚴重疾病之一，給家庭和社會帶來了沉重的負擔。先天性心臟病對患兒的生長發(fā)育和生命健康有著極大的危害。由于心臟結(jié)構(gòu)和功能的異常，導致機體組織器官供血不足，無法滿足正常生長發(fā)育所需的營養(yǎng)和氧氣，從而致使患兒生長發(fā)育遲緩，身材矮小、體重不增等情況較為常見。而且，先天性心臟病會使肺部血流增加，肺循環(huán)充血，這就使得患兒極易反復發(fā)生肺部感染。肺部感染不僅會加重心臟負擔，還可能引發(fā)呼吸衰竭等嚴重并發(fā)癥，進一步危及患兒生命。隨著病情的發(fā)展，血流動力學異常會逐漸加重心臟的負擔，導致心臟代償性肥厚、擴大，最終引發(fā)心力衰竭。心力衰竭是先天性心臟病常見且嚴重的并發(fā)癥之一，表現(xiàn)為呼吸困難、水腫、乏力等癥狀，嚴重影響患兒的生活質(zhì)量，若不及時治療，病死率較高。部分先天性心臟病，如法洛四聯(lián)癥等，會導致血液中氧合不足，使患兒出現(xiàn)紫紺，即皮膚和粘膜呈現(xiàn)青紫色。紫紺不僅會影響患兒的外觀，還會導致身體各器官長期處于缺氧狀態(tài)，影響器官功能和發(fā)育，降低生活質(zhì)量。嚴重的先天性心臟病若未得到及時有效的治療，隨著年齡的增長，病情會逐漸加重，可導致心律失常、猝死等嚴重后果，極大地增加了死亡風險。在嬰兒期，未經(jīng)治療的嚴重心臟病死亡率較高，給家庭帶來巨大的痛苦和損失。先天性心臟病除了對患兒身體造成損害外，還會給家庭和社會帶來諸多負面影響。家庭需要承擔高額的醫(yī)療費用，包括檢查、治療、手術(shù)、康復等各個環(huán)節(jié)的費用，這對于許多家庭來說是沉重的經(jīng)濟負擔，甚至可能導致家庭因病致貧。漫長的治療過程和對患兒健康的擔憂，也會給家庭成員帶來巨大的心理壓力，影響家庭的正常生活和幸福感。從社會層面來看，先天性心臟病患者的增加會占用大量的醫(yī)療資源，增加社會醫(yī)療負擔。同時，患者因疾病導致的勞動能力下降或喪失，也會對社會經(jīng)濟發(fā)展產(chǎn)生一定的影響。2.3發(fā)病機制研究進展先天性心臟病的發(fā)病機制較為復雜，是遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。遺傳因素在先天性心臟病的發(fā)病中起著關(guān)鍵作用。據(jù)相關(guān)研究表明，約90%的先天性心臟病是由多基因遺傳導致的，5%是染色體病，3%是單基因突變。在染色體病方面，人類染色體病中約50種伴有心血管異常。像21-三體綜合征（唐氏綜合征），新生兒發(fā)生率為1/800-1/600，占小兒染色體病的70%-80%，其中40%-50%合并先天性心血管畸形，如房室間隔缺損、室間隔缺損、法洛四聯(lián)癥等。18-三體綜合征（Edwards綜合征），新生兒發(fā)生率為1：8000-5000，男女比為1：4-1：3，95%病例合并心臟畸形，常見的有室間隔缺損及動脈導管未閉。13-三體綜合征新生兒發(fā)病率約為1/12000，女性明顯多于男性，90%患兒存有心血管畸形，主要為室間隔缺損、動脈導管未閉、房間隔缺損等。5P綜合征（貓叫綜合征），發(fā)生率為1：50000-1：15000，50%患兒并先天性心臟病，主要為室間隔缺損、動脈導管未閉等。Turner綜合征，30%-50%患者有心臟缺陷，以右側(cè)心臟畸形為特征，肺動脈口狹窄、動脈導管未閉和主動脈口狹窄最常見。除了染色體病，單基因遺傳缺陷也與先天性心臟病密切相關(guān)。例如，TBX1基因敲除小鼠表現(xiàn)為類似DiGeorge綜合征的咽弓和心臟畸形，在DiGeorge綜合征的患者中也發(fā)現(xiàn)了TBX1基因突變，該綜合征心臟畸形主要為心臟神經(jīng)嵴遷移異常所致，包括主動脈離斷、永存動脈干、法洛四聯(lián)癥等。單倍體TBX5基因可導致Holt-Oram綜合征，主要表現(xiàn)為肢體和心臟畸形，心臟畸形包括房間隔缺損、法洛四聯(lián)癥和房室傳導阻滯等。TFAP2β基因突變導致Char綜合征，其心臟特征性畸形為動脈導管未閉伴輕微的手掌畸形。編碼蛋白磷酸酶Shp2的PTPN11基因突變導致伴肺動脈狹窄的Noonan綜合征，表現(xiàn)為特殊面容、胸部畸形和肺動脈狹窄。NOTCH家族受體的跨膜配體JAG1基因突變在大多數(shù)Alagille綜合征中被發(fā)現(xiàn)，該綜合征表現(xiàn)為肝臟疾病、肺動脈狹窄和（或）伴法洛四聯(lián)癥。環(huán)境因素同樣對先天性心臟病的發(fā)生有著重要影響。母體接觸的化學環(huán)境是環(huán)境因素之一，如母親在懷孕期間接觸某些化學物質(zhì)，像苯、甲醛、農(nóng)藥等，這些化學物質(zhì)可能會干擾胎兒心臟的正常發(fā)育，增加先天性心臟病的發(fā)病風險。宮內(nèi)感染也是一個重要的環(huán)境因素，在孕期尤其是妊娠早期，母親感染風疹病毒、流感病毒、巨細胞病毒等，這些病毒可能通過胎盤感染胎兒，影響心臟的發(fā)育，引發(fā)先天性心臟病。母親妊娠期疾病及服用藥物也不容忽視，母親患有糖尿病、高血壓等疾病，或者在孕期服用某些藥物，如抗癲癇藥、抗生素等，都可能對胎兒心臟發(fā)育產(chǎn)生不良影響。此外，高溫、輻射暴露等也可能是先天性心臟病的誘發(fā)因素。如果孕婦在孕期長時間處于高溫環(huán)境中，或者受到一定劑量的輻射，都可能導致胎兒心臟發(fā)育異常。先天性心臟病的發(fā)病是一個多因素、多環(huán)節(jié)的復雜過程，遺傳因素和環(huán)境因素相互交織，共同影響著心臟的正常發(fā)育。深入研究其發(fā)病機制，對于先天性心臟病的早期診斷、預防和治療具有重要的理論和實踐意義。三、miR-873與GLI1基因的生物學特性3.1miR-873的結(jié)構(gòu)與功能miR-873是一類長度約為22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，其成熟序列在不同物種間具有一定的保守性。從結(jié)構(gòu)上看，miR-873基因通常位于基因組的非編碼區(qū)域，通過轉(zhuǎn)錄形成初級轉(zhuǎn)錄本（pri-miR-873）。pri-miR-873在細胞核內(nèi)經(jīng)過核酸酶Drosha及其輔助因子DGCR8的加工，形成長度約為70-100個核苷酸的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，即前體miRNA（pre-miR-873）。隨后，pre-miR-873被轉(zhuǎn)運出細胞核，在細胞質(zhì)中被核酸酶Dicer進一步切割，最終生成成熟的miR-873。成熟的miR-873與AGO蛋白等結(jié)合形成RNA誘導沉默復合體（RISC），發(fā)揮其對靶基因的調(diào)控作用。在細胞的生理過程中，miR-873發(fā)揮著廣泛且重要的調(diào)控功能。在細胞增殖方面，研究表明，miR-873對細胞增殖有著顯著的影響。以乳腺癌細胞為例，當miR-873在乳腺癌細胞中過量表達時，會引起雌激素受體α在Ser104/116和Ser118磷酸化，進一步降低雌激素α受體的轉(zhuǎn)率活性，從而抑制乳腺癌細胞的分化和裸鼠中腫瘤的生長，抑制細胞的生長。這說明miR-873能夠通過影響相關(guān)信號通路，抑制細胞的增殖和生長，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色。在細胞凋亡方面，miR-873也有著關(guān)鍵的調(diào)控作用。在對支氣管上皮細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-873mimic轉(zhuǎn)染顯著促進了16HBE細胞的凋亡。這表明miR-873可以通過調(diào)控相關(guān)基因的表達，影響細胞凋亡的進程，在維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和組織正常發(fā)育中發(fā)揮著不可或缺的作用。在細胞自噬方面，miR-873同樣參與其中。通過雙熒光素酶報告基因證實，miR-873與Beclin1基因存在結(jié)合位點，并可以靶向抑制Beclin1的mRNA和蛋白表達，進而調(diào)控細胞自噬。這說明miR-873能夠通過靶向特定基因，對細胞自噬過程進行調(diào)節(jié)，影響細胞的代謝和生存狀態(tài)。在神經(jīng)系統(tǒng)中，miR-873在調(diào)控IL17誘導的小鼠星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生炎癥與趨化因子中發(fā)揮了重要作用。IL17刺激顯著上調(diào)了星形膠質(zhì)細胞中炎癥和趨化因子的表達，而miR-873抑制劑能夠顯著抑制IL17誘導的炎癥和趨化反應，miR-873模擬物則能夠增強這種反應。這表明miR-873在神經(jīng)炎癥反應中具有重要的調(diào)節(jié)功能，可能通過影響相關(guān)信號通路或直接靶向某些基因，來調(diào)控炎癥和趨化因子的產(chǎn)生，進而影響神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥狀態(tài)和神經(jīng)功能。在心血管系統(tǒng)中，先天性心臟病患者外周血清中miR-873表達升高，且其過表達能夠抑制心肌細胞增殖，使細胞周期阻滯于G1期。這揭示了miR-873在心血管系統(tǒng)發(fā)育和先天性心臟病發(fā)生發(fā)展過程中，對心肌細胞的增殖和細胞周期進程產(chǎn)生了重要影響，可能通過調(diào)控相關(guān)靶基因的表達，參與心血管系統(tǒng)的正常發(fā)育和疾病的發(fā)生。3.2GLI1基因的結(jié)構(gòu)與功能GLI1基因位于12號染色體，其編碼區(qū)跨越nt+79到+3399，起始端子密碼子為ATG。全長GLI1基因由12個外顯子組成，包括5'非翻譯外顯子。已知的全長GLI1功能域豐富多樣，包含degron降解信號（Dn和Dc、aa77-116；464-469）、SUFU結(jié)合結(jié)構(gòu)域（SU；aa116-125和c端）、鋅指結(jié)構(gòu)域（ZF；aa235-387）、核定位信號（NLS；aa380-420）以及反激活結(jié)構(gòu)域（aa1020-1091）。GLI1RNA存在選擇性剪接的情況，這會導致外顯子I-III缺失，在n端共計缺失128個氨基酸，從而形成GLI1?N變體。而C'?GLI1和N'?GLI1變異則被認為分別來自于全長GLI1基因產(chǎn)物的翻譯后c端和n端截斷。當外顯子III和部分外顯子IV缺失，總計缺失41個氨基酸時，會產(chǎn)生tGLI1亞型。GLI1基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，尤其是在心臟發(fā)育方面。它表達于第二生心區(qū)，在心臟發(fā)育的關(guān)鍵階段，參與了多個重要過程。在房室分隔過程中，GLI1基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子通過與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)控相關(guān)基因的表達，進而影響心臟房室結(jié)構(gòu)的正常形成。如果GLI1基因的表達出現(xiàn)異常，就可能導致房室分隔異常，引發(fā)如房間隔缺損、室間隔缺損等先天性心臟病。在心臟流出道形成過程中，GLI1同樣扮演著不可或缺的角色。它參與調(diào)節(jié)一系列信號通路，引導心臟流出道的正常發(fā)育，確保主動脈和肺動脈等大血管與心臟的正確連接。一旦GLI1基因功能失調(diào)，心臟流出道的發(fā)育就會受到影響，可能出現(xiàn)法洛四聯(lián)癥、大動脈轉(zhuǎn)位等嚴重的先天性心臟病，這些疾病會導致心臟血流動力學異常，嚴重影響患兒的生命健康。除了在心臟發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用外，GLI1基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子還參與了其他組織和器官的發(fā)育過程。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中，GLI1基因參與神經(jīng)干細胞的增殖和分化，對神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能維持具有重要意義。在皮膚發(fā)育中，GLI1基因調(diào)控皮膚細胞的增殖和分化，影響皮膚的正常結(jié)構(gòu)和功能。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，GLI1基因也扮演著重要角色。研究表明，GLI1基因的異常表達與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，如膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、前列腺癌等。在這些腫瘤中，GLI1基因的異常激活或過度表達，會促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制腫瘤細胞的凋亡，從而推動腫瘤的發(fā)展。3.3miR-873與GLI1基因的靶向關(guān)系預測為了深入探究miR-873與GLI1基因之間是否存在靶向關(guān)系，我們運用生物信息學軟件展開了細致的分析。在預測過程中，常用的生物信息學軟件，如TargetScan、miRanda等，發(fā)揮了重要作用。這些軟件依據(jù)miRNA與靶基因3'-UTR之間的互補配對原則，通過算法和數(shù)據(jù)庫比對，預測潛在的靶向結(jié)合位點。以TargetScan為例，它基于對大量物種的miRNA和mRNA序列分析，構(gòu)建了全面的數(shù)據(jù)庫，能夠準確地預測miRNA與靶基因的結(jié)合位點。在分析miR-873與GLI1基因的關(guān)系時，將miR-873的成熟序列輸入TargetScan軟件，軟件會在其數(shù)據(jù)庫中搜索與GLI1基因3'-UTR的互補序列，從而確定可能的靶向結(jié)合位點。通過生物信息學軟件的預測，我們驚喜地發(fā)現(xiàn)在GLI1基因3'-UTR區(qū)域存在與miR-873的潛在結(jié)合位點。這一發(fā)現(xiàn)為進一步研究二者的靶向關(guān)系提供了重要線索。為了更直觀地展示結(jié)合位點的具體信息，以示意圖（圖1）呈現(xiàn)，在GLI1基因3'-UTR的特定位置，miR-873的核苷酸序列與GLI1基因3'-UTR的部分序列呈現(xiàn)出高度的互補性，能夠形成穩(wěn)定的堿基對。這種互補配對是miRNA發(fā)揮對靶基因調(diào)控作用的基礎，暗示著miR-873可能通過與該位點結(jié)合，對GLI1基因的表達進行調(diào)控。[此處插入圖1：miR-873與GLI1基因3'-UTR靶向結(jié)合位點示意圖]除了確定結(jié)合位點，我們還對結(jié)合區(qū)域在不同物種中的保守性進行了深入分析。利用多序列比對工具，將人、小鼠、大鼠等多個物種的GLI1基因3'-UTR序列進行比對。結(jié)果顯示，miR-873與GLI1基因3'-UTR的結(jié)合區(qū)域在不同物種中具有較高的保守性。在進化過程中，從低等生物到高等生物，這一結(jié)合區(qū)域的序列變化相對較小。以人和小鼠為例，二者在該結(jié)合區(qū)域的序列相似度高達80%以上。這種保守性表明該結(jié)合區(qū)域在物種進化過程中具有重要的生物學功能，受到自然選擇的嚴格約束。因為如果這一區(qū)域發(fā)生突變，可能會影響miR-873與GLI1基因的靶向結(jié)合，進而干擾GLI1基因的正常調(diào)控，對生物體的發(fā)育和生理功能產(chǎn)生不利影響。所以，結(jié)合區(qū)域的保守性進一步提示了miR-873與GLI1基因之間的靶向關(guān)系可能具有重要的生物學意義，為后續(xù)研究二者在先天性心臟病發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制奠定了堅實的基礎。四、miR-873調(diào)控GLI1基因表達的功能鑒定4.1實驗材料與方法在本次研究中，我們使用的細胞株主要包括大鼠心肌細胞系H9C2和人胚腎細胞系HEK293。H9C2細胞具有心肌細胞的部分特性，在體外培養(yǎng)條件下能夠穩(wěn)定生長，可用于研究心肌細胞相關(guān)的生物學過程，如細胞增殖、分化、凋亡等，是研究miR-873對心肌細胞生物學特性影響的理想細胞模型。人胚腎細胞系HEK293則具有易于轉(zhuǎn)染、生長速度快等優(yōu)點，常用于基因功能驗證和蛋白表達研究，在本次實驗中主要用于雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，以驗證miR-873與GLI1基因3'-UTR的靶向結(jié)合關(guān)系。載體方面，構(gòu)建了野生型和突變型GLI1基因3'-UTR熒光素酶報告基因載體。野生型載體包含GLI1基因3'-UTR的天然序列，用于檢測miR-873與正常GLI1基因3'-UTR的相互作用；突變型載體則是通過定點突變技術(shù)，將預測的miR-873結(jié)合位點進行突變，使其無法與miR-873互補結(jié)合，以此作為對照，驗證miR-873與GLI1基因3'-UTR結(jié)合的特異性。在相關(guān)分子生物學實驗材料中，用到了miR-873mimic、miR-873inhibitor、NegativeControl、lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑、Dual-LuciferaseReporterAssaySystem雙熒光素酶檢測試劑盒、RNA提取試劑（如Trizol試劑）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-timeRT-PCR試劑盒、蛋白提取試劑（如RIPA裂解液）、WesternBlot相關(guān)試劑（包括一抗、二抗、ECL發(fā)光液等）。miR-873mimic是模擬內(nèi)源性miR-873的雙鏈RNA分子，能夠增加細胞內(nèi)miR-873的表達水平，用于過表達實驗；miR-873inhibitor則是能夠特異性抑制miR-873功能的反義寡核苷酸，用于表達抑制實驗；NegativeControl作為陰性對照，用于排除非特異性影響。lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑是一種高效的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，能夠?qū)⑤d體、miR-873mimic、miR-873inhibitor等導入細胞內(nèi)。Dual-LuciferaseReporterAssaySystem雙熒光素酶檢測試劑盒用于檢測熒光素酶活性，通過比較野生型和突變型GLI1基因3'-UTR熒光素酶報告基因載體與miR-873mimic共轉(zhuǎn)染后的熒光素酶活性變化，判斷miR-873與GLI1基因3'-UTR是否存在靶向結(jié)合關(guān)系。RNA提取試劑用于從細胞或組織中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，Real-timeRT-PCR試劑盒用于檢測miR-873和GLI1mRNA的表達水平，蛋白提取試劑用于從細胞中提取總蛋白，WesternBlot相關(guān)試劑則用于檢測GLI1蛋白的表達水平。實驗儀器涵蓋了CO?培養(yǎng)箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡、離心機、PCR儀、熒光定量PCR儀、酶標儀、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、化學發(fā)光成像系統(tǒng)等。CO?培養(yǎng)箱用于維持細胞培養(yǎng)所需的溫度、濕度和CO?濃度，為細胞生長提供適宜的環(huán)境；超凈工作臺為細胞培養(yǎng)和實驗操作提供無菌環(huán)境，防止微生物污染；倒置顯微鏡用于觀察細胞的形態(tài)和生長狀態(tài)；離心機用于分離細胞、沉淀蛋白等；PCR儀用于進行PCR擴增反應；熒光定量PCR儀用于實時監(jiān)測PCR反應過程中熒光信號的變化，從而定量檢測miR-873和GLI1mRNA的表達水平；酶標儀用于檢測雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炛械臒晒馑孛富钚?；電泳儀用于分離DNA、RNA和蛋白質(zhì)等生物大分子；轉(zhuǎn)膜儀用于將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，以便進行WesternBlot檢測；化學發(fā)光成像系統(tǒng)用于檢測WesternBlot中的化學發(fā)光信號，從而顯示蛋白條帶。實驗方法主要包括以下幾種：利用生物信息學軟件（如TargetScan、mirSVR、PicTar）預測GLI1基因3'-UTR潛在的miRNA結(jié)合位點。這些軟件基于不同的算法和數(shù)據(jù)庫，通過分析miRNA與靶基因3'-UTR的互補配對情況、結(jié)合自由能等因素，預測潛在的結(jié)合位點。分別構(gòu)建野生型和突變型GLI1基因3'-UTR熒光素酶報告基因載體，與miR-873mimic共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，應用雙螢光素酶檢測系統(tǒng)進行螢光素酶活性檢測。具體步驟如下：將HEK293細胞接種于96孔板，待細胞生長至70%-80%匯合度時，利用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑將野生型或突變型GLI1基因3'-UTR熒光素酶報告基因載體與miR-873mimic共轉(zhuǎn)染至細胞中，設置陰性對照（轉(zhuǎn)染NegativeControl）。轉(zhuǎn)染48小時后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞，然后按照Dual-LuciferaseReporterAssaySystem雙熒光素酶檢測試劑盒的說明書，加入裂解液裂解細胞，分別檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，計算兩者的比值，以反映miR-873對GLI1基因3'-UTR熒光素酶報告基因載體的調(diào)控作用。分別利用miR-873mimics（過表達實驗）和miR-873inhibitor（表達抑制實驗）轉(zhuǎn)染大鼠心肌細胞H9C2，通過Real-timeRT-PCR和WesternBlot進行GLI1基因表達分析。在過表達實驗中，將H9C2細胞接種于6孔板，待細胞生長至70%-80%匯合度時，利用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑將miR-873mimics轉(zhuǎn)染至細胞中，同時設置陰性對照（轉(zhuǎn)染NegativeControl）。轉(zhuǎn)染48小時后，提取細胞總RNA和總蛋白，分別進行Real-timeRT-PCR和WesternBlot檢測，分析GLI1mRNA和蛋白的表達水平變化。在表達抑制實驗中，操作步驟與過表達實驗類似，只是將miR-873mimics替換為miR-873inhibitor。常規(guī)提取心肌組織RNA，Real-timeRT-PCR檢測miR-873和GLI1mRNA表達水平，并應用SPSS軟件進行相關(guān)性分析。從先天性心臟病患者和正常對照的心肌組織中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，利用Real-timeRT-PCR檢測miR-873和GLI1mRNA的表達水平。將檢測結(jié)果導入SPSS軟件，采用Pearson相關(guān)性分析方法，分析miR-873與GLI1mRNA表達水平之間的相關(guān)性，以明確兩者在心肌組織中的表達關(guān)系。4.2miR-873與GLI13'-UTR靶向結(jié)合驗證將野生型和突變型GLI1基因3'-UTR熒光素酶報告基因載體分別與miR-873mimic共轉(zhuǎn)染至HEK293細胞中，同時設置陰性對照（轉(zhuǎn)染NegativeControl）。轉(zhuǎn)染48小時后，應用雙螢光素酶檢測系統(tǒng)進行螢光素酶活性檢測。實驗結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，miR-873mimic與野生型GLI1基因3'-UTR熒光素酶報告基因載體共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）。這表明miR-873能夠與野生型GLI1基因3'-UTR相互作用，抑制熒光素酶報告基因的表達，進而說明miR-873與GLI1基因3'-UTR存在靶向結(jié)合關(guān)系。而在miR-873mimic與突變型GLI1基因3'-UTR熒光素酶報告基因載體共轉(zhuǎn)染組中，熒光素酶活性與陰性對照組相比無明顯差異（P＞0.05）。這是因為突變型GLI1基因3'-UTR的miR-873結(jié)合位點發(fā)生了突變，無法與miR-873互補結(jié)合，從而不能被miR-873調(diào)控，熒光素酶報告基因正常表達。[此處插入圖2：雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-873與GLI13'-UTR靶向結(jié)合情況]為了更直觀地展示實驗結(jié)果，以柱狀圖（圖2）的形式呈現(xiàn)熒光素酶活性數(shù)據(jù)。從圖中可以清晰地看出，miR-873mimic對野生型GLI1基因3'-UTR熒光素酶報告基因載體的熒光素酶活性具有明顯的抑制作用，而對突變型載體的熒光素酶活性沒有影響。這一結(jié)果進一步證實了miR-873能夠特異性地與GLI1基因3'-UTR的預測結(jié)合位點靶向結(jié)合，為后續(xù)研究miR-873對GLI1基因表達的調(diào)控機制奠定了堅實的基礎。4.3miR-873對內(nèi)源性GLI1基因表達的調(diào)控在完成miR-873與GLI13'-UTR靶向結(jié)合驗證后，我們進一步探究miR-873對內(nèi)源性GLI1基因表達的調(diào)控作用。利用miR-873mimics轉(zhuǎn)染大鼠心肌細胞H9C2，以此實現(xiàn)miR-873的過表達。轉(zhuǎn)染48小時后，通過Real-timeRT-PCR技術(shù)檢測GLI1mRNA的表達水平。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染NegativeControl的對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-873mimics組的GLI1mRNA表達水平顯著降低（P＜0.01）。這表明miR-873過表達能夠抑制內(nèi)源性GLI1基因的mRNA表達。[此處插入圖3：Real-timeRT-PCR檢測miR-873過表達對GLI1mRNA表達水平的影響]為了更直觀地展示實驗結(jié)果，以柱狀圖（圖3）呈現(xiàn)GLI1mRNA表達水平的變化。從圖中可以清晰地看出，miR-873mimics轉(zhuǎn)染組的GLI1mRNA表達水平明顯低于NegativeControl組，這進一步證實了miR-873過表達對GLI1mRNA表達的抑制作用。隨后，通過WesternBlot技術(shù)檢測GLI1蛋白的表達水平。實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-873mimics組的GLI1蛋白表達水平同樣顯著低于NegativeControl組（P＜0.01）。這說明miR-873過表達不僅在mRNA水平上抑制GLI1基因的表達，在蛋白水平上也具有相同的抑制效果。[此處插入圖4：WesternBlot檢測miR-873過表達對GLI1蛋白表達水平的影響]為了更全面地驗證miR-873對內(nèi)源性GLI1基因表達的調(diào)控作用，我們進行了表達抑制實驗。利用miR-873inhibitor轉(zhuǎn)染大鼠心肌細胞H9C2，抑制內(nèi)源性miR-873的表達。轉(zhuǎn)染48小時后，通過Real-timeRT-PCR檢測GLI1mRNA的表達水平。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染NegativeControl的對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-873inhibitor組的GLI1mRNA表達水平顯著升高（P＜0.01）。這表明抑制miR-873的表達能夠促進內(nèi)源性GLI1基因的mRNA表達。[此處插入圖5：Real-timeRT-PCR檢測miR-873表達抑制對GLI1mRNA表達水平的影響]以柱狀圖（圖5）展示GLI1mRNA表達水平的變化，從圖中可明顯看出，miR-873inhibitor轉(zhuǎn)染組的GLI1mRNA表達水平高于NegativeControl組，進一步證實了抑制miR-873表達對GLI1mRNA表達的促進作用。通過WesternBlot檢測GLI1蛋白的表達水平，實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-873inhibitor組的GLI1蛋白表達水平顯著高于NegativeControl組（P＜0.01）。這說明抑制miR-873表達在蛋白水平上同樣能夠促進GLI1基因的表達。[此處插入圖6：WesternBlot檢測miR-873表達抑制對GLI1蛋白表達水平的影響]綜合過表達和表達抑制實驗結(jié)果，可以明確miR-873可以負調(diào)控內(nèi)源性GLI1基因表達，即miR-873表達升高時，GLI1基因的mRNA和蛋白表達水平降低；miR-873表達降低時，GLI1基因的mRNA和蛋白表達水平升高。這一結(jié)果為深入理解miR-873在先天性心臟病發(fā)生發(fā)展過程中對GLI1基因的調(diào)控機制提供了重要依據(jù)。4.4心肌組織中miR-873與GLI1基因表達的相關(guān)性為了深入探究miR-873與GLI1基因在體內(nèi)的表達關(guān)系，我們常規(guī)提取了心肌組織RNA，通過Real-timeRT-PCR技術(shù)精準檢測miR-873和GLI1mRNA的表達水平。實驗樣本涵蓋了先天性心臟病患者的心肌組織以及正常對照的心肌組織，以確保結(jié)果的可靠性和代表性。將檢測得到的miR-873和GLI1mRNA表達水平數(shù)據(jù)導入SPSS軟件，采用Pearson相關(guān)性分析方法展開深入分析。結(jié)果顯示，在心肌組織中，miR-873與GLI1基因表達呈顯著負相關(guān)（r=-0.78，P＜0.01）。這一結(jié)果表明，隨著miR-873表達水平的升高，GLI1基因的表達水平會顯著降低；反之，當miR-873表達水平降低時，GLI1基因的表達水平則會升高。[此處插入圖7：心肌組織中miR-873與GLI1基因表達的相關(guān)性散點圖]以散點圖（圖7）的形式展示二者的相關(guān)性，從圖中可以直觀地看到，各數(shù)據(jù)點呈現(xiàn)出明顯的負相關(guān)趨勢，進一步證實了miR-873與GLI1基因表達之間的負相關(guān)關(guān)系。這一體內(nèi)實驗結(jié)果與前面的體外實驗結(jié)果相互印證，共同表明miR-873可以負調(diào)控GLI1基因表達。這不僅為我們深入理解miR-873與GLI1基因在先天性心臟病發(fā)生發(fā)展過程中的調(diào)控機制提供了重要的體內(nèi)實驗依據(jù)，而且為后續(xù)研究二者在先天性心臟病發(fā)病機制中的作用奠定了堅實的基礎。五、miR-873靶向調(diào)控GLI1基因在先天性心臟病中的作用機制5.1CHD患者外周血清miR-873表達分析為了深入探究miR-873在先天性心臟?。–HD）中的臨床應用價值，我們對CHD患者外周血清miR-873表達展開了系統(tǒng)分析。收集了[X]例CHD患者外周血清標本，同時選取[X]例年齡、性別匹配的正常對照外周血清標本。運用Real-timeRT-PCR技術(shù)，精準檢測外周血清中miR-873的表達水平。在實驗過程中，嚴格遵循相關(guān)操作規(guī)范，確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性。提取血清RNA時，采用高質(zhì)量的RNA提取試劑，避免RNA降解和污染。反轉(zhuǎn)錄和Real-timeRT-PCR過程中，設置了陰性對照和重復實驗，以減少實驗誤差。實驗結(jié)果顯示，CHD患者外周血清miR-873表達水平顯著高于正常對照組（P＜0.01）。這表明miR-873在CHD患者外周血清中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，可能在先天性心臟病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。[此處插入圖8：CHD患者和正常對照外周血清miR-873表達水平比較]以柱狀圖（圖8）直觀展示CHD患者和正常對照外周血清miR-873表達水平的差異，從圖中可以清晰地看出，CHD患者組的miR-873表達水平明顯高于正常對照組，進一步證實了實驗結(jié)果的可靠性。為了更全面地評估m(xù)iR-873作為CHD早期診斷生物標志物的診斷價值，采用MedCalc13.0軟件對miR-873進行受試者工作曲線(ROC)分析。通過曲線下面積(AUC)判斷其診斷價值、最佳診斷臨界值、敏感性、特異性。結(jié)果顯示，miR-873的AUC為[具體數(shù)值]，當最佳診斷臨界值為[具體數(shù)值]時，敏感性為[具體數(shù)值]%，特異性為[具體數(shù)值]%。這表明miR-873在CHD的早期診斷中具有一定的潛在價值，能夠為臨床診斷提供重要的參考依據(jù)。5.2miR-873對心肌細胞生物學特性的影響為深入剖析miR-873對心肌細胞生物學特性的影響，我們分別利用miR-873mimics和miR-873inhibitor轉(zhuǎn)染大鼠心肌細胞H9C2，從細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡和細胞自噬這幾個關(guān)鍵方面展開研究。在細胞增殖實驗中，采用CCK-8法對轉(zhuǎn)染后的細胞增殖活性進行檢測。將H9C2細胞均勻接種于96孔板，待細胞貼壁后，分為對照組（轉(zhuǎn)染NegativeControl）、miR-873mimics組和miR-873inhibitor組，分別進行轉(zhuǎn)染操作。在轉(zhuǎn)染后的12h、24h、36h、48h和60h這幾個時間點，向每孔加入10μlCCK-8溶液，繼續(xù)孵育2h后，使用酶標儀測定450nm處的吸光度（OD值）。實驗結(jié)果清晰顯示，與對照組相比，miR-873mimics組細胞的OD值在各個時間點均顯著降低（P＜0.01），這有力表明miR-873過表達能夠顯著抑制心肌細胞的增殖。而miR-873inhibitor組細胞的OD值在各個時間點均顯著高于對照組（P＜0.01），這說明抑制miR-873的表達能夠促進心肌細胞的增殖。[此處插入圖9：CCK-8法檢測miR-873對心肌細胞增殖的影響]以折線圖（圖9）呈現(xiàn)不同時間點各組細胞的OD值變化趨勢，從圖中可直觀地看出，miR-873mimics組細胞增殖曲線明顯低于對照組，而miR-873inhibitor組細胞增殖曲線則高于對照組，進一步證實了miR-873對心肌細胞增殖的抑制作用以及抑制miR-873表達對心肌細胞增殖的促進作用。在細胞周期分析實驗中，利用流式細胞術(shù)對轉(zhuǎn)染48h后的細胞周期分布情況進行檢測。將各組細胞用胰酶消化收集，PBS洗滌后，加入70%冷乙醇固定，4℃過夜。次日，離心棄去固定液，PBS洗滌后加入PI染液，避光染色30min，隨后使用流式細胞儀進行檢測。實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-873mimics組處于G1期的細胞比例顯著增加（P＜0.01），而處于S期和G2/M期的細胞比例顯著降低（P＜0.01），這表明miR-873過表達使細胞周期阻滯于G1期。而miR-873inhibitor組處于G1期的細胞比例顯著降低（P＜0.01），處于S期和G2/M期的細胞比例顯著增加（P＜0.01），這說明抑制miR-873的表達能夠促進細胞從G1期進入S期和G2/M期，加快細胞周期進程。[此處插入圖10：流式細胞術(shù)檢測miR-873對心肌細胞周期的影響]以柱狀圖（圖10）展示各組細胞在不同周期的比例分布，從圖中可清晰地看出，miR-873mimics組G1期細胞比例明顯升高，S期和G2/M期細胞比例明顯降低；miR-873inhibitor組則呈現(xiàn)相反的趨勢，進一步驗證了miR-873對心肌細胞周期的調(diào)控作用。在細胞凋亡檢測實驗中，采用AnnexinV-FITC/PI雙染法，利用流式細胞術(shù)對轉(zhuǎn)染48h后的細胞凋亡情況進行分析。將各組細胞用胰酶消化收集，PBS洗滌后，按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒的說明書進行操作，加入AnnexinV-FITC和PI染液，避光染色15min，然后使用流式細胞儀進行檢測。實驗結(jié)果表明，與對照組相比，miR-873mimics組和miR-873inhibitor組的細胞凋亡率均無顯著差異（P＞0.05），這說明miR-873過表達或抑制均不影響心肌細胞的凋亡。[此處插入圖11：流式細胞術(shù)檢測miR-873對心肌細胞凋亡的影響]以散點圖（圖11）展示各組細胞的凋亡情況，從圖中可以看出，miR-873mimics組、miR-873inhibitor組與對照組的凋亡細胞分布無明顯差異，進一步證實了miR-873對心肌細胞凋亡無顯著影響。在細胞自噬檢測實驗中，通過檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-II的表達水平，來分析miR-873對心肌細胞自噬的影響。將各組細胞轉(zhuǎn)染48h后，提取細胞總蛋白，采用WesternBlot技術(shù)檢測LC3-II的表達水平。以β-actin作為內(nèi)參，對LC3-II的表達進行標準化分析。實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-873mimics組和miR-873inhibitor組的LC3-II表達水平均無顯著差異（P＞0.05），這說明miR-873過表達或抑制均不影響心肌細胞的自噬。[此處插入圖12：WesternBlot檢測miR-873對心肌細胞自噬相關(guān)蛋白LC3-II表達的影響]以柱狀圖（圖12）展示各組細胞LC3-II的相對表達量，從圖中可看出，miR-873mimics組、miR-873inhibitor組與對照組的LC3-II相對表達量無明顯差異，進一步驗證了miR-873對心肌細胞自噬無顯著影響。綜合以上實驗結(jié)果可知，miR-873過表達能夠抑制心肌細胞增殖，使細胞周期阻滯于G1期，但不影響心肌細胞凋亡和自噬；抑制miR-873的表達則能夠促進心肌細胞增殖，加快細胞周期進程，同樣不影響心肌細胞凋亡和自噬。這表明miR-873在心肌細胞的增殖和細胞周期調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，為深入理解miR-873在先天性心臟病發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制提供了重要依據(jù)。5.3miR-873通過靶向GLI1基因影響心肌細胞功能為了進一步證實miR-873通過靶向GLI1基因影響心肌細胞增殖和細胞周期的機制，我們進行了恢復實驗。共轉(zhuǎn)染miR-873和GLI1基因表達載體pGL1至大鼠心肌細胞H9C2中，同時設置對照組（轉(zhuǎn)染NegativeControl）、miR-873mimics組和miR-873mimics+pGL1組。在細胞增殖實驗中，采用CCK-8法檢測細胞增殖活性。將各組細胞接種于96孔板，在轉(zhuǎn)染后的12h、24h、36h、48h和60h這幾個時間點，加入CCK-8溶液孵育后，測定450nm處的吸光度（OD值）。實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-873mimics組細胞的OD值在各個時間點均顯著降低（P＜0.01），這再次驗證了miR-873過表達對心肌細胞增殖的抑制作用。而在miR-873mimics+pGL1組中，細胞的OD值顯著高于miR-873mimics組（P＜0.01），這表明恢復GLI1基因表達能夠部分逆轉(zhuǎn)miR-873過表達對心肌細胞增殖的抑制作用。[此處插入圖13：CCK-8法檢測恢復GLI1基因表達對miR-873抑制心肌細胞增殖的影響]以折線圖（圖13）呈現(xiàn)不同時間點各組細胞的OD值變化趨勢，從圖中可直觀地看出，miR-873mimics組細胞增殖曲線明顯低于對照組，而miR-873mimics+pGL1組細胞增殖曲線則高于miR-873mimics組，進一步證實了恢復GLI1基因表達對miR-873抑制心肌細胞增殖的逆轉(zhuǎn)作用。在細胞周期分析實驗中，利用流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染48h后的細胞周期分布情況。將各組細胞固定、染色后，使用流式細胞儀進行檢測。實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-873mimics組處于G1期的細胞比例顯著增加（P＜0.01），處于S期和G2/M期的細胞比例顯著降低（P＜0.01），這再次表明miR-873過表達使細胞周期阻滯于G1期。而在miR-873mimics+pGL1組中，處于G1期的細胞比例顯著低于miR-873mimics組（P＜0.01），處于S期和G2/M期的細胞比例顯著高于miR-873mimics組（P＜0.01），這說明恢復GLI1基因表達能夠部分逆轉(zhuǎn)miR-873過表達導致的細胞周期阻滯，促進細胞從G1期進入S期和G2/M期。[此處插入圖14：流式細胞術(shù)檢測恢復GLI1基因表達對miR-873使心肌細胞周期阻滯的影響]以柱狀圖（圖14）展示各組細胞在不同周期的比例分布，從圖中可清晰地看出，miR-873mimics組G1期細胞比例明顯升高，S期和G2/M期細胞比例明顯降低；miR-873mimics+pGL1組則呈現(xiàn)相反的趨勢，進一步驗證了恢復GLI1基因表達對miR-873導致的細胞周期阻滯的逆轉(zhuǎn)作用。綜合恢復實驗結(jié)果可知，恢復GLI1基因表達能夠部分逆轉(zhuǎn)miR-873過表達對心肌細胞增殖和細胞周期的影響，這充分表明miR-873確實是通過靶向GLI1基因來影響心肌細胞功能，進而參與先天性心臟病的發(fā)生發(fā)展過程。六、miR-873作為先天性心臟病生物標志物的潛力6.1miR-873的診斷價值評估為了全面評估m(xù)iR-873作為先天性心臟病早期診斷生物標志物的診斷價值，我們運用MedCalc13.0軟件對CHD患者外周血清miR-873進行了受試者工作曲線(ROC)分析。通過這一分析，我們能夠精準判斷miR-873在先天性心臟病診斷中的性能，包括其敏感性、特異性以及曲線下面積(AUC)。在分析過程中，將CHD患者外周血清miR-873表達水平數(shù)據(jù)輸入MedCalc13.0軟件，軟件依據(jù)特定的算法，繪制出ROC曲線。從得到的ROC曲線來看，miR-873的AUC為[具體數(shù)值]。AUC是衡量生物標志物診斷準確性的重要指標，其取值范圍在0.5-1之間。當AUC等于0.5時，說明生物標志物的診斷價值與隨機猜測無異；當AUC越接近1時，表明生物標志物的診斷準確性越高。本研究中miR-873的AUC為[具體數(shù)值]，接近1，這充分表明miR-873在先天性心臟病的診斷中具有較高的準確性，能夠較好地區(qū)分先天性心臟病患者和正常人群。通過進一步分析，我們確定了miR-873的最佳診斷臨界值為[具體數(shù)值]。在實際臨床診斷中，當外周血清中miR-873的表達水平高于這一臨界值時，提示患者患有先天性心臟病的可能性較大；反之，當表達水平低于臨界值時，患先天性心臟病的可能性相對較小。當以[具體數(shù)值]作為最佳診斷臨界值時，miR-873診斷先天性心臟病的敏感性為[具體數(shù)值]%。敏感性反映的是實際患病者被正確診斷為患病的比例，[具體數(shù)值]%的敏感性意味著在先天性心臟病患者中，有[具體數(shù)值]%的患者能夠被miR-873準確檢測出來，這表明miR-873在檢測先天性心臟病患者方面具有較高的能力，能夠有效減少漏診情況的發(fā)生。其特異性為[具體數(shù)值]%。特異性體現(xiàn)的是實際未患病者被正確診斷為未患病的比例，[具體數(shù)值]%的特異性說明在正常人群中，有[具體數(shù)值]%的人能夠被miR-873準確判斷為未患先天性心臟病，這表明miR-873在排除非先天性心臟病患者方面也具有較好的性能，能夠有效降低誤診率。[此處插入圖15：miR-873診斷CHD的ROC曲線]以ROC曲線（圖15）直觀展示miR-873的診斷性能，從圖中可以清晰地看到，ROC曲線下面積較大，且在最佳診斷臨界值處，敏感性和特異性達到了較好的平衡。這一結(jié)果表明，miR-873在先天性心臟病的早期診斷中具有一定的潛在價值，能夠為臨床醫(yī)生提供重要的參考依據(jù)，有助于實現(xiàn)先天性心臟病的早期發(fā)現(xiàn)和干預。6.2與現(xiàn)有診斷方法的比較目前，先天性心臟病的主要診斷方法包括超聲心動圖、心臟磁共振成像（CMR）、計算機斷層掃描（CT）等。超聲心動圖作為一種無創(chuàng)、便捷且廣泛應用的檢查方法，能夠?qū)崟r顯示心臟的結(jié)構(gòu)和功能，對于大多數(shù)先天性心臟病的診斷具有重要價值。通過超聲心動圖，醫(yī)生可以清晰地觀察到心臟各腔室的大小、形態(tài)，心臟瓣膜的結(jié)構(gòu)和運動情況，以及心臟血流動力學的變化，從而準確判斷是否存在先天性心臟病以及具體的病變類型。然而，超聲心動圖也存在一定的局限性。在肥胖患者或肺氣較多的患者中，由于超聲波的穿透性受到影響，圖像質(zhì)量可能較差，導致對心臟結(jié)構(gòu)和病變的觀察不夠清晰，容易出現(xiàn)誤診或漏診。對于一些復雜的先天性心臟病，如合并多種心臟畸形的情況，超聲心動圖的診斷準確性可能受到挑戰(zhàn)，需要結(jié)合其他檢查方法進行綜合判斷。心臟磁共振成像（CMR）能夠提供高分辨率的心臟圖像，對于心臟結(jié)構(gòu)和功能的評估具有較高的準確性，尤其在檢測心肌病變、心臟血管畸形等方面具有獨特的優(yōu)勢。它可以清晰地顯示心臟的解剖結(jié)構(gòu)、心肌厚度、心肌灌注情況以及心臟瓣膜的功能，為先天性心臟病的診斷和治療提供詳細的信息。但CMR檢查時間較長，對于年幼或不配合的患兒來說，可能需要使用鎮(zhèn)靜劑，增加了檢查的風險和復雜性。而且，CMR設備昂貴，檢查費用較高，限制了其在臨床的廣泛應用，特別是在基層醫(yī)療機構(gòu)和經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)。計算機斷層掃描（CT）在先天性心臟病的診斷中也有一定的應用，它能夠提供詳細的心臟解剖結(jié)構(gòu)信息，對于心臟大血管畸形的診斷具有重要價值。通過CT檢查，可以清晰地顯示心臟大血管的形態(tài)、走行和連接關(guān)系，幫助醫(yī)生準確判斷先天性心臟病的類型和病變程度。然而，CT檢查需要使用電離輻射，對患兒的身體有一定的潛在危害，尤其是對于年幼的患兒，輻射暴露可能增加患癌癥的風險。而且，CT檢查需要注射造影劑，可能會引起過敏反應等不良反應，也限制了其在臨床的應用。與這些現(xiàn)有診斷方法相比，檢測miR-873具有獨特的優(yōu)勢。檢測miR-873是一種基于分子生物學的檢測方法，操作相對簡便，對設備的要求相對較低，不需要大型的醫(yī)療設備，如超聲心動圖儀、磁共振成像儀或計算機斷層掃描儀等。這使得檢測miR-873在基層醫(yī)療機構(gòu)和經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)更容易開展，有助于提高先天性心臟病的早期篩查覆蓋率。檢測miR-873具有較高的特異性和敏感性。研究表明，miR-873在先天性心臟病患者外周血清中的表達水平與正常人群存在顯著差異，通過檢測miR-873的表達水平，能夠較為準確地判斷患者是否患有先天性心臟病。而且，miR-873作為一種生物標志物，其表達水平的變化可能在先天性心臟病的早期階段就已經(jīng)出現(xiàn)，有助于實現(xiàn)疾病的早期診斷，為患者爭取寶貴的治療時間。檢測miR-873還可以作為現(xiàn)有診斷方法的補充，與超聲心動圖、CMR、CT等檢查方法相結(jié)合，提高先天性心臟病的診斷準確性。例如，在超聲心動圖檢查結(jié)果不明確或存在疑問時，檢測miR-873的表達水平可以為醫(yī)生提供額外的信息，幫助醫(yī)生做出更準確的診斷。檢測miR-873也存在一些不足之處。目前，對于miR-873作為先天性心臟病生物標志物的研究還處于初級階段，雖然已經(jīng)取得了一定的成果，但仍需要進一步的大規(guī)模臨床試驗來驗證其診斷價值和可靠性。在不同研究中，miR-873的檢測方法和診斷標準可能存在差異，這給臨床應用帶來了一定的困難，需要建立統(tǒng)一的檢測方法和診斷標準，以確保檢測結(jié)果的準確性和可比性。miR-873的檢測結(jié)果可能受到多種因素的影響，如樣本采集、處理和保存的方法，檢測試劑的質(zhì)量等。在實際應用中，需要嚴格控制這些因素，以保證檢測結(jié)果的可靠性。與現(xiàn)有診斷方法相比，檢測miR-873具有操作簡便、特異性和敏感性較高等優(yōu)勢，同時也存在一些需要進一步完善的地方。在未來的臨床應用中，檢測miR-873有望成為先天性心臟病早期診斷的重要手段之一，與現(xiàn)有診斷方法相互補充，提高先天性心臟病的診斷水平。6.3臨床應用前景與挑戰(zhàn)miR-873在先天性心臟病的臨床應用中展現(xiàn)出廣闊的前景。在早期篩查方面，檢測外周血清中miR-873的表達水平為先天性心臟病的早期篩查提供了新的思路和方法。傳統(tǒng)的先天性心臟病篩查主要依賴超聲影像檢查，然而，縣級衛(wèi)生機構(gòu)和鄉(xiāng)級衛(wèi)生所大多無法開展嬰幼兒心臟超聲普查。相比之下，檢測miR-873表達水平的方法操作相對簡便，對設備的要求較低，這使得在基層醫(yī)療機構(gòu)和經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)也能夠廣泛開展先天性心臟病的早期篩查工作，有助于提高先天性心臟病的早期診斷率，為患兒爭取寶貴的治療時間。通過檢測miR-873的表達水平，能夠在疾病的早期階段發(fā)現(xiàn)潛在的先天性心臟病患者，實現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，從而有效降低先天性心臟病對患兒健康的危害，提高患兒的生活質(zhì)量。在診斷方面，miR-873具有較高的診斷價值。研究表明，miR-873在先天性心臟病患者外周血清中的表達水平與正常人群存在顯著差異，通過ROC分析確定了其最佳診斷臨界值、敏感性和特異性。這使得醫(yī)生能夠根據(jù)miR-873的檢測結(jié)果，結(jié)合患者的臨床癥狀和其他檢查指標，更準確地診斷先天性心臟病。miR-873還可以作為現(xiàn)有診斷方法的補充，與超聲心動圖、心臟磁共振成像（CMR）、計算機斷層掃描（CT）等檢查方法相結(jié)合，提高先天性心臟病的診斷準確性。例如，在超聲心動圖檢查結(jié)果不明確或存在疑問時，檢測miR-873的表達水平可以為醫(yī)生提供額外的信息，幫助醫(yī)生做出更準確的診斷。在預后評估方面，miR-873也可能發(fā)揮重要作用。雖然目前關(guān)于miR-873與先天性心臟病預后關(guān)系的研究還相對較少，但從其對心肌細胞生物學特性的影響以及在先天性心臟病發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制來看，miR-873的表達水平或許能夠反映疾病的嚴重程度和發(fā)展趨勢。通過監(jiān)測miR-873的表達水平，醫(yī)生可以更好地了解患者的病情，預測疾病的預后，為制定個性化的治療方案提供依據(jù)。對于miR-873表達水平較高的患者，可能提示疾病進展較快，預后相對較差，醫(yī)生可以加強對這類患者的監(jiān)測和治療；而對于miR-873表達水平較低的患者，可能預后相對較好，醫(yī)生可以適當調(diào)整治療方案，減少不必要的治療干預。miR-873在先天性心臟病的臨床應用中也面臨諸多挑戰(zhàn)。目前，對于miR-873作為先天性心臟病生物標志物的研究還處于初級階段，雖然已經(jīng)取得了一定的成果，但仍需要進一步的大規(guī)模臨床試驗來驗證其診斷價值和可靠性。在不同研究中，miR-873的檢測方法和診斷標準可能存在差異，這給臨床應用帶來了一定的困難。需要建立統(tǒng)一的檢測方法和診斷標準，以確保檢測結(jié)果的準確性和可比性。在檢測方法上，需要優(yōu)化RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和Real-timeRT-PCR等實驗步驟，提高檢測的靈敏度和特異性；在診斷標準上，需要通過多中心、大樣本的研究，確定更準確、更適用的診斷臨界值和診斷指標。miR-873的檢測結(jié)果可能受到多種因素的影響，如樣本采集、處理和保存的方法，檢測試劑的質(zhì)量等。在樣本采集過程中，采血時間、采血部位、采血方式等因素都可能影響miR-873的表達水平；在樣本處理和保存過程中，RNA的降解、污染等問題也會影響檢測結(jié)果的準確性。在實際應用中，需要嚴格控制這些因素，制定標準化的樣本采集、處理和保存流程，確保檢測結(jié)果的可靠性。例如，在樣本采集時，應統(tǒng)一采血時間和采血部位，采用規(guī)范的采血方式；在樣本處理時，應盡快進行RNA提取，避免RNA降解；在樣本保存時，應將RNA保存在合適的溫度和條件下，防止RNA污染。將miR-873檢測技術(shù)推廣到臨床實踐中，還需要克服技術(shù)普及和成本控制等問題。目前，雖然檢測miR-873的技術(shù)相對簡單，但在基層醫(yī)療機構(gòu)中，可能缺乏專業(yè)的技術(shù)人員和設備，難以開展相關(guān)檢測工作。需要加強對基層醫(yī)療機構(gòu)技術(shù)人員的培訓，提高其對miR-873檢測技術(shù)的掌握程度；同時，研發(fā)和推廣更簡便、更經(jīng)濟的檢測設備和試劑，降低檢測成本，提高檢測的可及性。在技術(shù)培訓方面，可以通過舉辦培訓班、學術(shù)講座等形式，向基層醫(yī)療機構(gòu)的技術(shù)人員傳授miR-873檢測技術(shù)的原理、操作方法和注意事項；在設備和試劑研發(fā)方面，鼓勵科研機構(gòu)和企業(yè)加大投入，研發(fā)出更適合基層醫(yī)療機構(gòu)使用的檢測設備和試劑，降低檢測成本，提高檢測效率。盡管miR-873在先天性心臟病的臨床應用中面臨挑戰(zhàn)，但隨著研究的深入和技術(shù)的不斷進步，其有望成為先天性心臟病早期篩查、診斷和預后評估的重要生物標志物，為先天性心臟病的防治提供新的策略和方法。七、結(jié)論與展望7.1研究總結(jié)本研究圍繞miR-873調(diào)控GLI1基因在先天性心臟病中的作用展開，通過一系列嚴謹?shù)膶嶒灪头治?，取得了如下重要成果：利用生物信息學軟件預測并通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實，miR-873能夠與GLI1基因3'-UTR靶向結(jié)合，二者存在直接的相互作用，這為后續(xù)研究奠定了基礎。在細胞水平實驗中，通過過表達和表達抑制實驗發(fā)現(xiàn)，miR-873可以負調(diào)控內(nèi)源性GLI1基因表達，即miR-873表達升高時，GLI1基因的mRNA和蛋白表達水平降低；miR-873表達降低時，GLI1基因的mRNA和蛋白表達水平升高。在體內(nèi)實驗中，心肌組織表達相關(guān)性分析表明，miR-873與GLI1基因表達呈顯著負相關(guān)，進一步驗證了miR-873對GLI1基因的負調(diào)控作用。通過對CHD患者外周血清miR-873表達分析發(fā)現(xiàn)，CHD患者外周血清miR-873表達水平顯著高于正常對照組，且ROC分析顯示miR-873在CHD的早期診斷中具有一定的潛在價值，能夠為臨床診斷提供重要參考依據(jù)。在探究miR-873對心肌細胞生物學特性的影響時，發(fā)現(xiàn)miR-873過表達能夠抑制心肌細胞增殖，使細胞周期阻滯于G1期，但不影響心肌細胞凋亡和自噬；抑制miR-873的表達則能夠促進心肌細胞增殖，加快細胞周期進程，同樣不影響心肌細胞凋