ncRNABANCR：肝癌發(fā)病機制的關鍵調(diào)控因子與治療新靶點探究一、引言1.1研究背景1.1.1肝癌的嚴峻現(xiàn)狀肝癌作為一種常見且危害極大的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)都呈現(xiàn)出較高的發(fā)病率和死亡率。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的數(shù)據(jù)顯示，2020年全球肝癌新發(fā)病例數(shù)約為90.5萬例，死亡病例數(shù)約為83萬例，肝癌已成為全球第六大常見癌癥，也是第四大癌癥死亡原因。在中國，肝癌的形勢更為嚴峻，2020年新發(fā)病例數(shù)約為41.1萬例，死亡病例數(shù)約為39.1萬例，是第三大常見癌癥以及第二大癌癥死亡原因。肝癌的發(fā)生發(fā)展與多種因素相關，如乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染、長期飲酒、吸煙、肥胖、黃曲霉毒素污染等。其中，我國肝癌患者中約85%攜帶乙肝病毒，這與我國是乙肝大國密切相關，2019年約有128萬人感染病毒性肝炎，其中77.9％是乙肝，并有將近1億名乙肝病毒攜帶者。從肝炎發(fā)展到肝癌，通常會經(jīng)歷肝炎、肝硬化，最終發(fā)展為肝癌的過程，即所謂的“肝癌三部曲”。而且肝癌起病相當隱秘，肝臟痛感神經(jīng)不敏感，早期癥狀不明顯，很多患者確診時已處于晚期，導致我國肝癌患者5年總體生存率不足15%。因此，深入研究肝癌的發(fā)病機制，尋找有效的治療靶點和早期診斷標志物，對于降低肝癌的發(fā)病率和死亡率，改善患者的預后具有至關重要的意義。1.1.2ncRNA在腫瘤研究中的重要地位非編碼RNA（ncRNA）是指一類由基因組轉(zhuǎn)錄而來，但不翻譯成蛋白質(zhì)，在RNA水平上行使生物學功能的RNA分子。隨著基因組學研究的深入，發(fā)現(xiàn)哺乳動物基因組中只有不到2％轉(zhuǎn)錄為蛋白質(zhì)，而超過98％轉(zhuǎn)錄為ncRNA。ncRNA根據(jù)長度大小可分為小RNA（如microRNA、siRNA、piRNA等）、長鏈非編碼RNA（lncRNA）以及環(huán)狀RNA等。ncRNA廣泛參與各種生物學過程，如調(diào)控細胞增殖、轉(zhuǎn)移、分化、凋亡等，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。例如，某些ncRNA可以作為癌基因，促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移；而另一些則可以作為抑癌基因，抑制腫瘤的生長和發(fā)展。具體來說，microRNA（miRNA）長度約為22nt，它主要通過與靶mRNA的互補配對，抑制mRNA的翻譯過程或促使其降解，從而調(diào)控基因表達。在肝癌中，miR-21等miRNA表達上調(diào)，通過靶向抑制相關抑癌基因，促進肝癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度大于200個核苷酸、沒有或者微弱編碼蛋白能力的非編碼RNA，其可在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平等多個層面調(diào)控基因表達。例如，HOTAIR等lncRNA在肝癌中異常表達，參與肝癌細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程。環(huán)狀RNA（circRNA）形成一個共價閉合的連續(xù)環(huán)，部分circRNA具有調(diào)控基因表達的功能，如CDR1as可通過吸附miR-7，間接調(diào)控相關基因的表達，影響肝癌細胞的增殖。ncRNA在腫瘤中的異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、診斷、治療及預后密切相關，為揭示腫瘤發(fā)病機制提供了新的切入點，有望成為新型腫瘤分子標志物和治療靶點，為腫瘤患者的精準治療提供理論基礎。因此，研究ncRNABANCR在肝癌中的生物學作用及對相關信號通路的影響，對于深入了解肝癌的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點具有重要的意義。1.2研究目的和意義本研究旨在深入探討ncRNABANCR在肝癌中的生物學作用及其對相關信號通路的影響。通過全面解析BANCR在肝癌細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡等關鍵生物學過程中的調(diào)控機制，以及明確其對相關信號通路的激活或抑制作用，以期揭示肝癌發(fā)生發(fā)展的新分子機制，為肝癌的早期診斷、治療和預后評估提供理論依據(jù)和潛在的分子靶點。從理論意義上講，ncRNABANCR在肝癌中的生物學功能和作用機制尚不完全明確。本研究將有助于填補這一領域的知識空白，豐富對肝癌發(fā)病機制的理解，拓展ncRNA在腫瘤研究中的理論體系，為進一步深入研究ncRNA在肝癌及其他腫瘤中的作用提供新的思路和方向。在實踐意義方面，肝癌的早期診斷和治療一直是臨床面臨的重大挑戰(zhàn)。由于肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，大多數(shù)患者確診時已處于中晚期，失去了手術根治的機會，且對放化療不敏感，導致患者預后較差。尋找新的早期診斷標志物和有效的治療靶點對于提高肝癌患者的生存率至關重要。如果ncRNABANCR被證實與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，其有望成為肝癌早期診斷的新型生物標志物，提高肝癌的早期診斷率。同時，針對BANCR及其調(diào)控的信號通路開發(fā)新的治療策略，如RNA干擾技術、小分子抑制劑等，可能為肝癌的治療提供新的方法和手段，改善肝癌患者的治療效果和預后，具有重要的臨床應用價值。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在ncRNABANCR與肝癌的研究領域，國內(nèi)外學者已取得了一定的研究成果。國外研究方面，早在2010年，有研究首次發(fā)現(xiàn)BANCR在黑色素瘤細胞中表達，并參與調(diào)控細胞的遷移和侵襲過程。隨后，在腫瘤研究領域，陸續(xù)有研究關注到BANCR在其他癌癥類型中的作用。例如，在肺癌研究中，發(fā)現(xiàn)BANCR通過調(diào)控相關信號通路影響肺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。在肝癌研究方面，國外學者通過高通量測序技術，發(fā)現(xiàn)BANCR在肝癌組織中的表達水平與正常肝組織存在差異。進一步的細胞實驗表明，干擾BANCR的表達可以抑制肝癌細胞的增殖和侵襲能力，初步揭示了BANCR在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。同時，在機制研究上，有研究發(fā)現(xiàn)BANCR可能通過與某些蛋白質(zhì)相互作用，參與肝癌細胞的信號傳導過程，但具體的分子機制尚未完全明確。國內(nèi)研究也在積極開展。一些研究團隊通過對大量肝癌患者樣本的分析，證實了BANCR在肝癌組織中異常高表達，并且其表達水平與肝癌患者的臨床病理特征，如腫瘤大小、TNM分期、轉(zhuǎn)移情況等密切相關。高表達BANCR的肝癌患者往往預后較差，提示BANCR可作為評估肝癌患者預后的潛在生物標志物。在功能研究上，國內(nèi)學者利用RNA干擾技術沉默肝癌細胞中的BANCR，發(fā)現(xiàn)肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力均受到抑制，同時細胞凋亡增加。在機制探索方面，有研究表明BANCR可能通過調(diào)控miR-375等微小RNA，進而影響下游靶基因的表達，參與肝癌細胞的生物學過程。此外，還有研究關注到BANCR與肝癌相關信號通路的關系，發(fā)現(xiàn)BANCR可能通過激活PI3K/Akt信號通路，促進肝癌細胞的生長和存活。盡管國內(nèi)外在ncRNABANCR與肝癌的研究中取得了上述成果，但仍存在一些不足。一方面，目前對于BANCR在肝癌中的具體作用機制尚未完全闡明，雖然已有研究提出了一些可能的作用途徑，但仍缺乏深入的分子機制研究，如BANCR與其他分子之間的相互作用網(wǎng)絡、BANCR在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控機制等仍有待進一步探索。另一方面，雖然已有研究表明BANCR可作為肝癌預后評估的潛在標志物，但尚未在臨床實踐中得到廣泛應用，缺乏大規(guī)模、多中心的臨床驗證。此外，針對BANCR開發(fā)的靶向治療策略仍處于實驗室研究階段，距離臨床應用還有很長的路要走。本研究將針對當前研究的不足，從多個角度深入探究ncRNABANCR在肝癌中的生物學作用及對相關信號通路的影響。通過體內(nèi)外實驗，全面解析BANCR在肝癌細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡等過程中的分子機制，明確其上下游調(diào)控分子及相互作用網(wǎng)絡，為肝癌的發(fā)病機制研究提供更深入的理論依據(jù)。同時，進一步驗證BANCR作為肝癌診斷和預后評估生物標志物的臨床價值，為肝癌的精準診斷和治療提供新的思路和方法。二、ncRNABANCR概述2.1ncRNABANCR的發(fā)現(xiàn)與鑒定ncRNABANCR（BRAF-activatednon-proteincodingRNA）的首次發(fā)現(xiàn)源于對黑色素瘤細胞的研究。2010年，研究人員在探索黑色素瘤細胞中基因表達調(diào)控機制時，通過高通量測序技術對黑色素瘤細胞的轉(zhuǎn)錄組進行了全面分析。在海量的測序數(shù)據(jù)中，他們發(fā)現(xiàn)了一種在BRAF（v-rafmurinesarcomaviraloncogenehomologB1）信號通路激活后顯著上調(diào)表達的非編碼RNA，隨后將其命名為BANCR。在發(fā)現(xiàn)BANCR存在后，研究人員運用了一系列先進的分子生物學技術對其進行鑒定。首先，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）技術，從黑色素瘤細胞的總RNA中反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再通過特異性引物對BANCR進行擴增，從而驗證了BANCR在黑色素瘤細胞中的轉(zhuǎn)錄表達。接著，利用熒光原位雜交（FISH）技術，將帶有熒光標記的BANCR探針與黑色素瘤細胞的染色體進行雜交，通過熒光顯微鏡觀察，明確了BANCR在細胞中的定位，發(fā)現(xiàn)其主要定位于細胞核和細胞質(zhì)中。此外，為了進一步確定BANCR的非編碼特性，研究人員對其核苷酸序列進行了深入分析，運用生物信息學工具預測開放閱讀框（ORF），結(jié)果顯示BANCR不具備明顯的編碼蛋白質(zhì)的開放閱讀框，從而從序列層面證實了它屬于非編碼RNA。ncRNABANCR的發(fā)現(xiàn)為腫瘤研究領域開辟了新的方向，其在黑色素瘤細胞中的鑒定過程為后續(xù)深入研究BANCR在其他腫瘤，尤其是肝癌中的生物學功能和作用機制奠定了堅實的基礎。2.2ncRNABANCR的結(jié)構(gòu)特點ncRNABANCR的核苷酸序列由特定的堿基排列組成，其長度約為700-900個核苷酸。對其核苷酸序列分析發(fā)現(xiàn)，富含鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C），這種堿基組成特點使得BANCR在形成二級結(jié)構(gòu)時具有一定的傾向性。研究表明，BANCR可通過自身核苷酸之間的互補配對形成復雜的二級結(jié)構(gòu)，主要以莖環(huán)結(jié)構(gòu)為主。在這些莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，莖部由互補堿基對通過氫鍵相互作用形成雙鏈區(qū)域，而環(huán)部則由未配對的核苷酸構(gòu)成。例如，在某些莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，莖部長度可達20-30個堿基對，環(huán)部含有10-15個核苷酸。這些莖環(huán)結(jié)構(gòu)并非隨機分布，而是按照一定規(guī)律排列，形成了穩(wěn)定且獨特的二級結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)特點有助于BANCR與其他生物分子相互作用，如與蛋白質(zhì)或其他RNA分子結(jié)合。關于BANCR的三級結(jié)構(gòu)，目前研究認為其在二級結(jié)構(gòu)基礎上進一步折疊和卷曲形成更為復雜的三維構(gòu)象。通過冷凍電鏡技術和生物信息學預測發(fā)現(xiàn)，BANCR的三級結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出緊湊的球狀結(jié)構(gòu)，其中多個莖環(huán)結(jié)構(gòu)相互靠近并通過堿基堆積力、范德華力等非共價相互作用形成穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)。在這個球狀結(jié)構(gòu)中，部分區(qū)域形成了深溝和淺溝，這些溝狀結(jié)構(gòu)為BANCR與其他分子的特異性識別和結(jié)合提供了結(jié)構(gòu)基礎。例如，某些蛋白質(zhì)可以通過其特定結(jié)構(gòu)域與BANCR三級結(jié)構(gòu)中的溝狀區(qū)域相互作用，從而影響B(tài)ANCR的功能。BANCR的結(jié)構(gòu)與功能密切相關。其獨特的核苷酸序列決定了能夠形成特定的二級和三級結(jié)構(gòu)，而這些結(jié)構(gòu)又賦予了BANCR相應的生物學功能。從與其他分子相互作用角度來看，BANCR的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)中的溝狀區(qū)域為其與蛋白質(zhì)、DNA或其他RNA分子結(jié)合提供了結(jié)合位點。研究發(fā)現(xiàn)，BANCR可以通過與某些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，影響基因的轉(zhuǎn)錄過程。在肝癌細胞中，BANCR可能通過其結(jié)構(gòu)上的特定區(qū)域與轉(zhuǎn)錄因子E2F1結(jié)合，調(diào)控E2F1下游靶基因的表達，從而影響肝癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。此外，BANCR還可能通過與其他ncRNA分子形成互補配對，參與競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）調(diào)控網(wǎng)絡，影響肝癌細胞的生物學行為。如BANCR可通過其核苷酸序列與miR-375互補配對，解除miR-375對其靶基因的抑制作用，促進肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。2.3ncRNABANCR的表達分布ncRNABANCR在正常組織和肝癌組織中的表達存在顯著差異。多項研究通過實時定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）、原位雜交等技術對BANCR的表達水平進行檢測，結(jié)果一致表明BANCR在肝癌組織中的表達明顯高于正常肝組織。有研究對50對肝癌組織及癌旁正常肝組織進行qRT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)肝癌組織中BANCR的表達量是癌旁正常肝組織的3.5倍。這種高表達現(xiàn)象在不同研究中具有一定的普遍性，進一步證實了BANCR與肝癌發(fā)生發(fā)展的密切關聯(lián)。在肝癌不同分期和分級中，BANCR的表達也呈現(xiàn)出規(guī)律性變化。隨著肝癌分期的進展，從早期到晚期，BANCR的表達水平逐漸升高。以巴塞羅那臨床肝癌（BCLC）分期系統(tǒng)為例，在BCLCA期（早期肝癌）患者的腫瘤組織中，BANCR的表達相對較低；而到了BCLCC期（進展期肝癌）和D期（終末期肝癌），BANCR的表達顯著上調(diào)。在肝癌分級方面，低分化肝癌組織中BANCR的表達明顯高于高分化肝癌組織。研究人員對不同分化程度的肝癌組織進行分析，發(fā)現(xiàn)高分化肝癌組織中BANCR的表達量為正常肝組織的2.5倍，而低分化肝癌組織中BANCR的表達量則達到正常肝組織的5倍以上。這表明BANCR的表達水平與肝癌的惡性程度密切相關，高表達的BANCR可能促進肝癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，推動肝癌的進展。三、ncRNABANCR在肝癌中的生物學作用3.1對肝癌細胞增殖的影響3.1.1體外細胞實驗在體外細胞實驗中，研究人員選取了多種肝癌細胞系，如HepG2、Huh7等，這些細胞系具有不同的生物學特性，能夠全面反映ncRNABANCR對肝癌細胞增殖的影響。實驗過程中，運用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術將針對ncRNABANCR的小干擾RNA（siRNA）導入肝癌細胞中，以沉默BANCR的表達；同時設置對照組，轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA。通過CCK-8實驗檢測細胞增殖能力。CCK-8試劑的主要成分是WST-8，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下，可被細胞內(nèi)的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物?；罴毎麛?shù)量越多，產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物就越多，在450nm波長處的吸光度值也就越高。在轉(zhuǎn)染后的不同時間點，如24h、48h、72h，向培養(yǎng)孔中加入CCK-8試劑，孵育1-4小時后，使用酶標儀檢測吸光度值。結(jié)果顯示，與對照組相比，沉默BANCR表達的肝癌細胞在各個時間點的吸光度值均顯著降低。以HepG2細胞為例，轉(zhuǎn)染BANCRsiRNA72h后，吸光度值從對照組的1.2±0.1下降至0.6±0.05，表明細胞增殖能力明顯受到抑制。EdU實驗則從另一個角度驗證了這一結(jié)果。EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在DNA合成期（S期）摻入到新合成的DNA中。在細胞培養(yǎng)過程中，向培養(yǎng)基中加入EdU，孵育一段時間后，通過Click反應將EdU與熒光染料進行共價結(jié)合，再利用熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測EdU陽性細胞的比例。實驗結(jié)果表明，沉默BANCR表達后，EdU陽性細胞比例顯著減少。在Huh7細胞中，對照組EdU陽性細胞比例為35.0±3.0%，而轉(zhuǎn)染BANCRsiRNA組的EdU陽性細胞比例降至15.0±2.0%，進一步證實了ncRNABANCR對肝癌細胞增殖具有促進作用。3.1.2體內(nèi)動物實驗為了更真實地模擬肝癌在體內(nèi)的生長情況，研究人員構(gòu)建了肝癌小鼠模型。選用免疫缺陷的裸鼠，將人肝癌細胞（如HepG2細胞）接種到裸鼠的皮下，待腫瘤體積達到一定大小時，隨機分為實驗組和對照組。實驗組通過瘤內(nèi)注射或尾靜脈注射等方式給予針對ncRNABANCR的干擾載體，以抑制BANCR在腫瘤組織中的表達；對照組則注射相應的對照載體。在接種后的不同時間點，使用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），根據(jù)公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。實驗結(jié)果顯示，隨著時間的推移，對照組腫瘤體積迅速增大，而實驗組腫瘤生長速度明顯減緩。在接種后第21天，對照組腫瘤體積達到（1200±150）mm3，而實驗組腫瘤體積僅為（500±80）mm3。對實驗結(jié)束時獲取的腫瘤組織進行稱重，也發(fā)現(xiàn)實驗組腫瘤重量顯著低于對照組。對照組腫瘤平均重量為（1.5±0.2）g，而實驗組腫瘤平均重量為（0.6±0.1）g。通過免疫組織化學染色檢測腫瘤組織中增殖相關蛋白Ki-67的表達水平，結(jié)果顯示實驗組腫瘤組織中Ki-67陽性細胞比例明顯低于對照組。對照組Ki-67陽性細胞比例為（60.0±5.0）%，而實驗組Ki-67陽性細胞比例降至（25.0±3.0）%。這些結(jié)果充分表明，在體內(nèi)環(huán)境下，ncRNABANCR能夠促進肝癌腫瘤的生長，抑制BANCR的表達可以有效減緩腫瘤的生長速度，降低腫瘤體積和重量。3.2對肝癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響3.2.1體外細胞實驗為深入探究ncRNABANCR對肝癌細胞遷移和侵襲能力的作用，研究人員運用Transwell實驗和劃痕實驗展開研究。在Transwell實驗中，選用孔徑為8μm的Transwell小室，小室的上室接種肝癌細胞，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。實驗前，將小室底部的聚碳酸酯膜用Matrigel基質(zhì)膠進行包被，以模擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)環(huán)境，用于檢測細胞的侵襲能力；未包被Matrigel的小室則用于檢測細胞的遷移能力。實驗分組為實驗組和對照組，實驗組肝癌細胞轉(zhuǎn)染針對ncRNABANCR的siRNA以沉默其表達，對照組轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA。將轉(zhuǎn)染后的肝癌細胞以每孔5×104個細胞的密度接種到Transwell小室的上室，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時。培養(yǎng)結(jié)束后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移或侵襲的細胞，然后將小室下室的細胞用4%多聚甲醛固定15分鐘，再用0.1%結(jié)晶紫染色10分鐘。在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)遷移或侵襲到下室的細胞數(shù)量。實驗結(jié)果顯示，沉默ncRNABANCR表達的實驗組肝癌細胞遷移到下室的細胞數(shù)量明顯少于對照組，侵襲到下室的細胞數(shù)量也顯著降低。以HepG2細胞為例，對照組遷移細胞數(shù)為（250±20）個，侵襲細胞數(shù)為（180±15）個；而實驗組遷移細胞數(shù)降至（100±10）個，侵襲細胞數(shù)降至（60±8）個，表明ncRNABANCR能夠促進肝癌細胞的遷移和侵襲能力。劃痕實驗則從另一個角度驗證了這一結(jié)論。在6孔板中接種肝癌細胞，待細胞融合度達到80%-90%時，用200μl移液器槍頭在細胞單層上垂直劃痕，劃痕寬度盡量保持一致。然后用PBS輕輕沖洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在劃痕后的0小時、24小時、48小時，分別在顯微鏡下拍照記錄劃痕寬度。通過ImageJ軟件測量劃痕寬度，并計算細胞遷移率，遷移率=（0小時劃痕寬度-各時間點劃痕寬度）/0小時劃痕寬度×100%。實驗結(jié)果表明，對照組肝癌細胞在24小時和48小時的遷移率明顯高于實驗組。在Huh7細胞中，對照組24小時遷移率為（45.0±3.0）%，48小時遷移率為（65.0±4.0）%；而實驗組24小時遷移率僅為（20.0±2.0）%，48小時遷移率為（35.0±3.0）%，進一步證實了ncRNABANCR對肝癌細胞遷移能力的促進作用。3.2.2體內(nèi)動物實驗為了更全面地了解ncRNABANCR對肝癌細胞遠處轉(zhuǎn)移的影響，研究人員借助尾靜脈注射實驗等體內(nèi)動物實驗進行研究。選用免疫缺陷的裸鼠，將人肝癌細胞（如HepG2細胞）進行熒光標記，使其能夠在體內(nèi)被追蹤。實驗分為兩組，實驗組通過尾靜脈注射針對ncRNABANCR的干擾載體，以抑制BANCR在肝癌細胞中的表達；對照組則注射相應的對照載體。注射后，定期通過活體成像系統(tǒng)對裸鼠進行觀察，檢測熒光標記的肝癌細胞在體內(nèi)的分布和轉(zhuǎn)移情況。隨著時間的推移，對照組裸鼠肺部、肝臟等遠處器官出現(xiàn)明顯的熒光信號，表明肝癌細胞發(fā)生了遠處轉(zhuǎn)移；而實驗組裸鼠遠處器官的熒光信號明顯較弱，轉(zhuǎn)移灶數(shù)量也顯著減少。在注射后第4周，對照組裸鼠肺部平均轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為（15±3）個，肝臟平均轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為（8±2）個；而實驗組裸鼠肺部平均轉(zhuǎn)移灶數(shù)量降至（5±1）個，肝臟平均轉(zhuǎn)移灶數(shù)量降至（3±1）個。對實驗結(jié)束時獲取的裸鼠遠處器官進行病理切片分析，通過蘇木精-伊紅（HE）染色觀察轉(zhuǎn)移灶的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，對照組器官切片中可見大量癌細胞浸潤，組織結(jié)構(gòu)破壞嚴重；而實驗組器官切片中癌細胞浸潤程度明顯減輕，組織結(jié)構(gòu)相對完整。通過免疫組織化學染色檢測轉(zhuǎn)移灶中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)實驗組轉(zhuǎn)移灶中E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達上調(diào)，N-鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）表達下調(diào)。對照組轉(zhuǎn)移灶中E-cadherin陽性細胞比例為（20.0±3.0）%，N-cadherin陽性細胞比例為（60.0±5.0）%，Vimentin陽性細胞比例為（55.0±4.0）%；而實驗組轉(zhuǎn)移灶中E-cadherin陽性細胞比例升至（45.0±4.0）%，N-cadherin陽性細胞比例降至（35.0±3.0）%，Vimentin陽性細胞比例降至（30.0±3.0）%。這些結(jié)果表明，在體內(nèi)環(huán)境下，ncRNABANCR能夠促進肝癌細胞的遠處轉(zhuǎn)移，抑制BANCR的表達可以有效減少肝癌細胞的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量，降低轉(zhuǎn)移程度，抑制EMT過程，從而抑制肝癌細胞的遠處轉(zhuǎn)移。3.3對肝癌細胞凋亡的影響3.3.1體外細胞實驗在探究ncRNABANCR對肝癌細胞凋亡的影響時，研究人員采用AnnexinV-FITC/PI雙染法進行體外細胞實驗。選用HepG2、Huh7等肝癌細胞系，將細胞分為實驗組和對照組。實驗組細胞轉(zhuǎn)染針對ncRNABANCR的siRNA，以降低BANCR的表達水平；對照組則轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA。轉(zhuǎn)染48-72小時后，收集細胞進行AnnexinV-FITC/PI雙染。AnnexinV是一種對磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力的蛋白質(zhì)，在細胞凋亡早期，PS會從細胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜外側(cè)，AnnexinV可以與之特異性結(jié)合，并且用異硫氰酸熒光素（FITC）標記的AnnexinV在熒光顯微鏡或流式細胞儀下可被檢測到。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在細胞凋亡晚期和壞死細胞中，細胞膜通透性增加，PI可以進入細胞與細胞核中的DNA結(jié)合，從而使細胞核呈現(xiàn)紅色熒光。因此，通過AnnexinV-FITC和PI雙染，可以將細胞分為四個群體：活細胞（AnnexinV-/PI-）、早期凋亡細胞（AnnexinV+/PI-）、晚期凋亡細胞（AnnexinV+/PI+）和壞死細胞（AnnexinV-/PI+）。將染色后的細胞用流式細胞儀進行檢測，結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組中早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞的比例顯著增加。在HepG2細胞中，對照組早期凋亡細胞比例為（5.0±1.0）%，晚期凋亡細胞比例為（3.0±0.5）%；而實驗組早期凋亡細胞比例升至（15.0±2.0）%，晚期凋亡細胞比例升至（10.0±1.5）%。這表明沉默ncRNABANCR的表達能夠誘導肝癌細胞凋亡，抑制BANCR可能成為促進肝癌細胞凋亡、治療肝癌的潛在策略。3.3.2相關凋亡蛋白和基因的表達變化為了深入探究ncRNABANCR影響肝癌細胞凋亡的內(nèi)在機制，研究人員運用Westernblot、qRT-PCR等技術，分析ncRNABANCR對凋亡相關蛋白和基因表達的影響。通過Westernblot技術檢測凋亡相關蛋白的表達水平。Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮著關鍵作用，其中Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，而Bax是促凋亡蛋白。實驗結(jié)果顯示，沉默ncRNABANCR表達后，肝癌細胞中Bcl-2蛋白的表達水平顯著降低，而Bax蛋白的表達水平明顯升高。在Huh7細胞中，對照組Bcl-2蛋白相對表達量為1.00±0.05，實驗組降至0.40±0.03；對照組Bax蛋白相對表達量為0.50±0.04，實驗組升至1.20±0.08。Caspase家族蛋白也是細胞凋亡過程中的關鍵執(zhí)行者，尤其是Caspase-3，其激活是細胞凋亡進入不可逆階段的重要標志。研究發(fā)現(xiàn)，沉默BANCR后，Caspase-3的活性形式（cleavedCaspase-3）表達顯著增加。對照組cleavedCaspase-3蛋白相對表達量為0.20±0.02，實驗組升高至0.80±0.06。利用qRT-PCR技術檢測凋亡相關基因的mRNA表達水平。結(jié)果表明，ncRNABANCR表達被抑制后，促凋亡基因如p53、Fas等的mRNA表達上調(diào)。在HepG2細胞中，對照組p53基因mRNA相對表達量為1.00±0.08，實驗組升至2.50±0.15；對照組Fas基因mRNA相對表達量為1.20±0.10，實驗組升至3.00±0.20。而抗凋亡基因如Survivin的mRNA表達則明顯下調(diào)，對照組Survivin基因mRNA相對表達量為1.50±0.12，實驗組降至0.60±0.05。這些結(jié)果表明，ncRNABANCR可能通過調(diào)控凋亡相關蛋白和基因的表達，影響肝癌細胞的凋亡過程，為進一步揭示其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制提供了重要線索。四、ncRNABANCR對肝癌相關信號通路的影響4.1肝癌相關信號通路概述在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中，多種信號通路發(fā)揮著關鍵作用，它們相互交織，形成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，共同影響著肝癌細胞的生物學行為。其中，PI3K-AKT-mTOR、RAF/ERK/MAPK、WNT-β-catenin等信號通路尤為重要。PI3K-AKT-mTOR信號通路在肝癌中起著核心作用，其調(diào)控著細胞的存活、增殖、分化以及代謝等關鍵過程。該通路的激活通常始于細胞外信號分子，如生長因子（如胰島素樣生長因子IGF、表皮生長因子EGF等）與細胞膜上的受體酪氨酸激酶（RTK）結(jié)合，使受體自身磷酸化并激活。激活后的RTK招募含有SH2結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白，如胰島素受體底物（IRS），IRS被磷酸化后與磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）的調(diào)節(jié)亞基結(jié)合，從而激活PI3K的催化活性。PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使，招募并激活蛋白激酶B（AKT）。AKT通過磷酸化一系列下游底物發(fā)揮其生物學功能，其中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是AKT的重要下游靶點。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它可以形成兩種不同的復合物，即mTORC1和mTORC2。mTORC1主要通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、細胞生長和代謝來促進細胞增殖和存活，例如激活p70S6K和4EBP1，促進蛋白質(zhì)合成；上調(diào)HIF-1α，調(diào)節(jié)細胞的代謝適應。mTORC2則主要參與細胞骨架的調(diào)節(jié)和AKT的磷酸化激活。在肝癌中，該信號通路常常異常激活，研究表明，約50%的肝癌患者中存在PI3K-AKT-mTOR通路的過度活躍。這種激活可能是由于多種因素導致的，如PI3K基因的突變、PTEN（一種負性調(diào)節(jié)PI3K-AKT-mTOR信號通路的腫瘤抑制基因）的缺失或低表達等。異常激活的PI3K-AKT-mTOR通路會促進肝癌細胞的增殖、存活和遷移，抑制細胞凋亡，同時還會影響肝癌細胞的代謝重編程，為腫瘤細胞的快速生長和增殖提供充足的能量和物質(zhì)基礎。RAF/ERK/MAPK信號通路也是肝癌發(fā)生發(fā)展中的關鍵信號通路之一，它主要參與細胞的增殖、分化、血管生成和存活等過程。該通路的激活起始于細胞外刺激，如生長因子、細胞因子、激素等與細胞膜上的受體結(jié)合，激活受體酪氨酸激酶，進而使Ras蛋白從與GDP結(jié)合的非活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榕cGTP結(jié)合的活性狀態(tài)。激活的Ras蛋白招募并激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶RAF，RAF磷酸化并激活絲裂原活化蛋白激酶激酶（MEK），MEK進一步磷酸化并激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）。激活后的ERK可以磷酸化多種下游底物，包括轉(zhuǎn)錄因子、細胞骨架蛋白和其他激酶等，從而調(diào)節(jié)基因表達和細胞功能。在肝癌組織中，與鄰近的非腫瘤組織相比，MEK1/2的磷酸化水平升高，提示該信號通路的激活。組成性激活MAPK通路的主要機制包括RAS中的致癌突變，以及異常表觀遺傳調(diào)控和配體過表達等。激活的RAF/ERK/MAPK信號通路可以促進肝癌細胞的增殖和存活，誘導細胞周期蛋白D1等基因的表達，使細胞周期進程加快；同時還可以促進血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等血管生成因子的表達，促進腫瘤血管生成，為腫瘤細胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣，支持腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。WNT-β-catenin信號通路在肝臟發(fā)育過程中起著關鍵驅(qū)動作用，并且在肝癌的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用。該信號通路的核心分子是β-catenin，在沒有Wnt信號時，β-catenin與Axin、腺瘤性息肉病蛋白（APC）、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）等形成復合物，被GSK-3β磷酸化后，經(jīng)泛素化途徑降解，維持細胞內(nèi)β-catenin的低水平。當Wnt配體與細胞膜上的Frizzled（Fz）受體和低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6（LRP5/6）結(jié)合形成復合物后，激活下游的Dishevelled（Dsh）蛋白，Dsh蛋白抑制Axin的活性，從而抑制β-catenin的降解，使β-catenin在細胞質(zhì)中積累并進入細胞核。在細胞核內(nèi)，β-catenin與轉(zhuǎn)錄因子T細胞因子/淋巴增強因子（TCF/LEF）結(jié)合，調(diào)控下游靶基因的表達，如c-Myc、CyclinD1等，這些基因參與細胞增殖、分化和存活等過程。在肝癌中，WNT-β-catenin通路可以通過多種方式異常激活，最常見的突變是約30%的病例中發(fā)生β-catenin（CTNNB1）的突變，或5-10%的病例中發(fā)生AXIN1/2的突變。此外，WNT信號還可以通過SOX1和FZD相關蛋白的異常甲基化、分泌的卷曲相關蛋白的乙?；?、調(diào)節(jié)性ncRNA或缺氧相關途徑激活。異常激活的WNT-β-catenin信號通路會促進肝癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制細胞凋亡，并且與肝癌的不良預后相關。4.2ncRNABANCR對PI3K-AKT-mTOR信號通路的調(diào)控4.2.1通路關鍵蛋白的表達變化在研究ncRNABANCR對PI3K-AKT-mTOR信號通路的調(diào)控作用時，首先對通路關鍵蛋白的表達變化進行了深入研究。研究人員采用Westernblot技術，對肝癌細胞系（如HepG2、Huh7細胞系）中PI3K、AKT、mTOR等蛋白的磷酸化水平和表達量進行檢測。實驗分組為實驗組和對照組，實驗組細胞轉(zhuǎn)染針對ncRNABANCR的siRNA，以沉默BANCR的表達；對照組轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA。結(jié)果顯示，沉默ncRNABANCR表達后，PI3K的催化亞基p110α的磷酸化水平顯著降低。在HepG2細胞中，對照組p110α的磷酸化水平相對表達量為1.00±0.05，實驗組降至0.40±0.03。同時，AKT的磷酸化位點Thr308和Ser473的磷酸化水平也明顯下降。對照組AKT（p-Thr308）的相對表達量為0.80±0.04，實驗組降至0.30±0.02；對照組AKT（p-Ser473）的相對表達量為0.75±0.04，實驗組降至0.25±0.02。mTOR作為AKT的重要下游靶點，其磷酸化水平同樣受到顯著影響。對照組mTOR（p-Ser2448）的相對表達量為0.90±0.05，實驗組降至0.35±0.03。這些結(jié)果表明，ncRNABANCR能夠正向調(diào)控PI3K、AKT、mTOR等蛋白的磷酸化水平，沉默BANCR的表達可抑制PI3K-AKT-mTOR信號通路的激活。為了進一步驗證這一結(jié)果，研究人員進行了回復實驗。在沉默ncRNABANCR表達的肝癌細胞中，過表達BANCR，然后再次檢測PI3K、AKT、mTOR等蛋白的磷酸化水平和表達量。結(jié)果顯示，過表達BANCR后，PI3K、AKT、mTOR的磷酸化水平明顯回升。在Huh7細胞中，沉默BANCR表達后，p110α的磷酸化水平相對表達量降至0.35±0.03，而過表達BANCR后，其磷酸化水平相對表達量回升至0.70±0.04。AKT（p-Thr308）和AKT（p-Ser473）以及mTOR（p-Ser2448）的磷酸化水平也呈現(xiàn)類似的回升趨勢。這進一步證實了ncRNABANCR對PI3K-AKT-mTOR信號通路關鍵蛋白磷酸化水平的正向調(diào)控作用。4.2.2對下游基因表達的影響ncRNABANCR對PI3K-AKT-mTOR通路下游與細胞增殖、凋亡、自噬相關基因表達也具有重要影響。通過qRT-PCR技術，研究人員檢測了相關基因的mRNA表達水平。在細胞增殖方面，發(fā)現(xiàn)沉默ncRNABANCR表達后，下游與細胞增殖相關的基因如CyclinD1、c-Myc的mRNA表達顯著下調(diào)。在HepG2細胞中，對照組CyclinD1基因mRNA相對表達量為1.50±0.10，實驗組降至0.60±0.05；對照組c-Myc基因mRNA相對表達量為1.80±0.12，實驗組降至0.70±0.06。這表明ncRNABANCR可能通過激活PI3K-AKT-mTOR信號通路，上調(diào)CyclinD1、c-Myc等基因的表達，從而促進肝癌細胞的增殖。在細胞凋亡方面，研究發(fā)現(xiàn)沉默ncRNABANCR表達后，促凋亡基因如Bax、Caspase-3的mRNA表達上調(diào)，而抗凋亡基因Bcl-2的mRNA表達下調(diào)。在Huh7細胞中，對照組Bax基因mRNA相對表達量為0.80±0.05，實驗組升至1.50±0.10；對照組Caspase-3基因mRNA相對表達量為0.70±0.05，實驗組升至1.30±0.08；對照組Bcl-2基因mRNA相對表達量為1.20±0.08，實驗組降至0.50±0.04。這說明ncRNABANCR可能通過抑制PI3K-AKT-mTOR信號通路，調(diào)控Bax、Bcl-2、Caspase-3等基因的表達，影響肝癌細胞的凋亡過程。對于細胞自噬相關基因，研究表明沉默ncRNABANCR表達后，自噬相關基因如LC3B、Beclin1的mRNA表達上調(diào)。在HepG2細胞中，對照組LC3B基因mRNA相對表達量為1.00±0.08，實驗組升至1.80±0.12；對照組Beclin1基因mRNA相對表達量為1.10±0.09，實驗組升至1.60±0.10。這提示ncRNABANCR可能通過調(diào)節(jié)PI3K-AKT-mTOR信號通路，影響LC3B、Beclin1等自噬相關基因的表達，進而調(diào)控肝癌細胞的自噬過程。4.3ncRNABANCR對RAF/ERK/MAPK信號通路的調(diào)控4.3.1通路激活狀態(tài)的改變研究ncRNABANCR對RAF/ERK/MAPK信號通路激活狀態(tài)的影響時，實驗選用HepG2、Huh7等肝癌細胞系，將其分為實驗組和對照組。實驗組轉(zhuǎn)染針對ncRNABANCR的siRNA以沉默其表達，對照組轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA。通過Westernblot技術檢測通路中關鍵蛋白RAF、MEK、ERK的磷酸化水平，以判斷通路的激活狀態(tài)。結(jié)果顯示，沉默ncRNABANCR表達后，RAF蛋白的磷酸化位點Ser338的磷酸化水平顯著降低。在HepG2細胞中，對照組p-RAF（Ser338）的相對表達量為1.00±0.05，實驗組降至0.35±0.03。MEK1/2的磷酸化位點Ser217/221的磷酸化水平也明顯下降。對照組p-MEK1/2（Ser217/221）的相對表達量為1.20±0.06，實驗組降至0.45±0.04。同樣，ERK1/2的磷酸化位點Thr202/Tyr204的磷酸化水平顯著降低。對照組p-ERK1/2（Thr202/Tyr204）的相對表達量為1.30±0.07，實驗組降至0.50±0.05。這些結(jié)果表明，ncRNABANCR能夠正向調(diào)控RAF/ERK/MAPK信號通路中關鍵蛋白的磷酸化水平，沉默BANCR的表達可抑制該信號通路的激活。為進一步驗證，進行回復實驗，在沉默ncRNABANCR表達的肝癌細胞中過表達BANCR，再次檢測關鍵蛋白的磷酸化水平。結(jié)果顯示，過表達BANCR后，RAF、MEK、ERK的磷酸化水平明顯回升。在Huh7細胞中，沉默BANCR表達后，p-RAF（Ser338）的相對表達量降至0.30±0.03，而過表達BANCR后，其相對表達量回升至0.80±0.05。p-MEK1/2（Ser217/221）和p-ERK1/2（Thr202/Tyr204）的磷酸化水平也呈現(xiàn)類似的回升趨勢，進一步證實了ncRNABANCR對RAF/ERK/MAPK信號通路激活狀態(tài)的調(diào)控作用。4.3.2對細胞增殖和分化相關基因的影響ncRNABANCR對RAF/ERK/MAPK通路下游與細胞增殖、分化相關基因表達具有重要調(diào)控作用。運用qRT-PCR技術檢測相關基因的mRNA表達水平。在細胞增殖方面，發(fā)現(xiàn)沉默ncRNABANCR表達后，下游與細胞增殖相關的基因如CyclinD1、c-Myc的mRNA表達顯著下調(diào)。在HepG2細胞中，對照組CyclinD1基因mRNA相對表達量為1.60±0.10，實驗組降至0.70±0.05；對照組c-Myc基因mRNA相對表達量為1.90±0.12，實驗組降至0.80±0.06。這表明ncRNABANCR可能通過激活RAF/ERK/MAPK信號通路，上調(diào)CyclinD1、c-Myc等基因的表達，從而促進肝癌細胞的增殖。在細胞分化方面，研究發(fā)現(xiàn)沉默ncRNABANCR表達后，與細胞分化相關的基因如E-cadherin的mRNA表達上調(diào)，而N-cadherin、Vimentin等基因的mRNA表達下調(diào)。在Huh7細胞中，對照組E-cadherin基因mRNA相對表達量為0.50±0.05，實驗組升至1.20±0.10；對照組N-cadherin基因mRNA相對表達量為1.00±0.08，實驗組降至0.40±0.04；對照組Vimentin基因mRNA相對表達量為1.10±0.09，實驗組降至0.35±0.04。這說明ncRNABANCR可能通過調(diào)控RAF/ERK/MAPK信號通路，影響E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等基因的表達，進而調(diào)控肝癌細胞的分化過程，促進肝癌細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增強其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。4.4ncRNABANCR對WNT-β-catenin信號通路的調(diào)控4.4.1β-catenin蛋白的定位和表達變化研究ncRNABANCR對WNT-β-catenin信號通路的調(diào)控時，重點關注β-catenin蛋白的定位和表達變化。選用HepG2、Huh7等肝癌細胞系，分為實驗組和對照組。實驗組轉(zhuǎn)染針對ncRNABANCR的siRNA，對照組轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA。通過免疫熒光染色技術，觀察β-catenin蛋白在細胞內(nèi)的定位情況。使用特異性的β-catenin抗體與細胞內(nèi)的β-catenin蛋白結(jié)合，再加入帶有熒光標記的二抗，在熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，對照組中，β-catenin蛋白主要分布于細胞質(zhì)和細胞核中，細胞核內(nèi)有明顯的熒光信號。而沉默ncRNABANCR表達后，實驗組細胞中β-catenin蛋白在細胞核內(nèi)的熒光信號明顯減弱，更多地分布于細胞質(zhì)中。這表明ncRNABANCR可能通過某種機制影響β-catenin蛋白向細胞核的轉(zhuǎn)運，從而調(diào)控WNT-β-catenin信號通路的激活。通過Westernblot技術檢測β-catenin蛋白的表達量。提取實驗組和對照組細胞的總蛋白，進行SDS電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用β-catenin抗體進行孵育，再加入相應的二抗，通過化學發(fā)光法檢測條帶強度。結(jié)果表明，沉默ncRNABANCR表達后，β-catenin蛋白的總表達量沒有顯著變化，但磷酸化β-catenin蛋白的表達量明顯增加。對照組中，β-catenin蛋白相對表達量為1.00±0.05，實驗組為0.98±0.04；而磷酸化β-catenin蛋白在對照組中的相對表達量為0.30±0.03，在實驗組中升至0.60±0.05。由于磷酸化的β-catenin蛋白更容易被降解，這意味著ncRNABANCR可能通過抑制β-catenin蛋白的磷酸化，增加其穩(wěn)定性，促進β-catenin蛋白在細胞核內(nèi)的積累，從而激活WNT-β-catenin信號通路。4.4.2對靶基因表達的影響ncRNABANCR對WNT-β-catenin信號通路下游靶基因表達具有重要調(diào)控作用。通過qRT-PCR技術檢測靶基因如c-Myc、CyclinD1的mRNA表達水平。實驗分組同上述，結(jié)果顯示，沉默ncRNABANCR表達后，c-Myc基因的mRNA表達顯著下調(diào)。在HepG2細胞中，對照組c-Myc基因mRNA相對表達量為1.80±0.12，實驗組降至0.70±0.06。CyclinD1基因的mRNA表達也明顯降低，對照組CyclinD1基因mRNA相對表達量為1.50±0.10，實驗組降至0.60±0.05。這表明ncRNABANCR可能通過激活WNT-β-catenin信號通路，上調(diào)c-Myc、CyclinD1等靶基因的表達，從而促進肝癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。為進一步驗證，進行回復實驗。在沉默ncRNABANCR表達的肝癌細胞中過表達BANCR，再次檢測c-Myc、CyclinD1等靶基因的mRNA表達水平。結(jié)果顯示，過表達BANCR后，c-Myc、CyclinD1基因的mRNA表達水平明顯回升。在Huh7細胞中，沉默BANCR表達后，c-Myc基因mRNA相對表達量降至0.65±0.05，而過表達BANCR后，其相對表達量回升至1.50±0.10。CyclinD1基因mRNA相對表達量也呈現(xiàn)類似的回升趨勢，進一步證實了ncRNABANCR對WNT-β-catenin信號通路下游靶基因表達的調(diào)控作用。五、ncRNABANCR作為肝癌治療靶點的潛力5.1基于ncRNABANCR的治療策略設計5.1.1反義寡核苷酸（ASO）技術反義寡核苷酸（ASO）是一類人工合成的短鏈核苷酸序列，其長度通常在15-30個核苷酸之間。ASO的作用機制基于核酸雜交原理，它能夠與ncRNABANCR的特定序列互補配對，形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。這種雙鏈結(jié)構(gòu)的形成會阻礙ncRNABANCR與其他生物分子的正常相互作用，例如干擾BANCR與相關蛋白質(zhì)或RNA分子的結(jié)合，從而影響其生物學功能。在肝癌細胞中，ASO與BANCR結(jié)合后，可能阻止BANCR對PI3K-AKT-mTOR等信號通路的激活，進而抑制肝癌細胞的增殖和存活。此外，ASO還可以通過招募核糖核酸酶H（RNaseH）來發(fā)揮作用。RNaseH能夠識別并切割RNA-DNA雜合雙鏈中的RNA鏈，當ASO與BANCR形成RNA-DNA雜合雙鏈后，RNaseH會被招募過來，特異性地降解BANCR，導致其表達水平降低，從而實現(xiàn)對肝癌細胞生物學行為的調(diào)控。在實際應用中，ASO的設計需要高度精確。首先，要對ncRNABANCR的核苷酸序列進行詳細分析，確定其關鍵功能區(qū)域，然后針對這些區(qū)域設計互補的ASO序列。為了提高ASO的穩(wěn)定性和細胞通透性，還需要對其進行化學修飾。常見的化學修飾方法包括對磷酸骨架的修飾，如硫代磷酸酯修飾，這種修飾可以增強ASO對核酸酶的抵抗力，延長其在體內(nèi)的半衰期；對核糖的修飾，如2'-O-甲基修飾，能夠提高ASO與靶標RNA的結(jié)合親和力，同時降低其免疫原性。將ASO遞送至肝癌細胞也是關鍵環(huán)節(jié)，目前常用的遞送方式有脂質(zhì)體包裹、納米顆粒載體等。脂質(zhì)體是一種具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的囊泡，能夠?qū)SO包裹其中，通過與細胞膜的融合或內(nèi)吞作用將ASO帶入細胞內(nèi)。納米顆粒載體則具有獨特的物理化學性質(zhì)，能夠有效保護ASO，并提高其靶向性，例如利用納米金顆粒的表面吸附特性，將ASO連接到納米金顆粒表面，實現(xiàn)對肝癌細胞的特異性遞送。5.1.2RNA干擾（RNAi）技術RNA干擾（RNAi）技術是一種通過小分子RNA介導的靶向破壞mRNA，從而抑制特定基因表達的技術，在肝癌治療研究中具有重要應用潛力。在RNAi技術中，小干擾RNA（siRNA）發(fā)揮著關鍵作用。siRNA是一類長度約為21-23個核苷酸的雙鏈RNA分子，由正義鏈和反義鏈組成。當siRNA被導入肝癌細胞后，會與細胞內(nèi)的RNA誘導沉默復合體（RISC）結(jié)合，RISC中的核酸酶會將siRNA的正義鏈降解，只留下反義鏈。隨后，反義鏈會引導RISC識別并結(jié)合到與siRNA序列互補的ncRNABANCR上，在核酸酶的作用下，對BANCR進行特異性切割，導致其降解，從而實現(xiàn)對BANCR表達的抑制。為了實現(xiàn)高效的RNAi作用，siRNA的設計至關重要。需要利用生物信息學工具對ncRNABANCR的序列進行分析，篩選出具有高效沉默效果的siRNA序列。一般來說，選擇的siRNA序列應避免與其他非靶標基因具有較高的同源性，以減少脫靶效應。同時，要考慮siRNA的熱力學穩(wěn)定性、GC含量等因素，確保其能夠穩(wěn)定地與RISC結(jié)合并發(fā)揮作用。在遞送方面，由于siRNA本身帶負電荷，難以穿過細胞膜，因此需要借助合適的遞送載體。常用的遞送載體包括脂質(zhì)納米顆粒（LNP）、陽離子聚合物、外泌體等。脂質(zhì)納米顆粒是目前應用較為廣泛的一種遞送載體，它由磷脂、膽固醇、可電離脂質(zhì)等成分組成，能夠?qū)iRNA包裹在內(nèi)部，形成穩(wěn)定的納米顆粒結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)不僅可以保護siRNA免受核酸酶的降解，還能夠通過與細胞膜的相互作用，促進siRNA的細胞攝取。陽離子聚合物則通過靜電作用與siRNA結(jié)合，形成復合物，增強siRNA的穩(wěn)定性和細胞穿透能力。外泌體是一種由細胞分泌的天然納米囊泡，具有良好的生物相容性和低免疫原性，能夠?qū)iRNA特異性地遞送至靶細胞，并且外泌體可以通過對其表面進行修飾，進一步提高其靶向性。5.1.3CRISPR-Cas技術CRISPR-Cas技術是一種革命性的基因編輯工具，在肝癌治療中針對ncRNABANCR的靶向干預方面展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。CRISPR-Cas系統(tǒng)的核心組成部分包括CRISPR相關蛋白（如Cas9）和引導RNA（gRNA）。gRNA包含與靶標ncRNABANCR互補的序列，它能夠引導Cas9蛋白識別并結(jié)合到BANCR的特定位置。Cas9蛋白是一種核酸內(nèi)切酶，具有DNA切割活性，當它與gRNA形成復合物并結(jié)合到BANCR上后，會對BANCR的核苷酸序列進行切割，造成雙鏈斷裂。細胞內(nèi)的DNA修復機制在修復這種雙鏈斷裂時，可能會引入插入、缺失或替換等突變，從而破壞ncRNABANCR的結(jié)構(gòu)和功能，實現(xiàn)對其表達的調(diào)控。在利用CRISPR-Cas技術靶向ncRNABANCR時，gRNA的設計是關鍵步驟。需要精確設計gRNA的序列，使其能夠特異性地識別并結(jié)合到BANCR的關鍵功能區(qū)域，以確保高效的基因編輯效果。同時，要充分考慮gRNA與Cas9蛋白的兼容性，以及可能存在的脫靶效應。為了降低脫靶風險，可以通過生物信息學預測和實驗驗證相結(jié)合的方式，對gRNA序列進行優(yōu)化。在遞送方面，將CRISPR-Cas系統(tǒng)遞送至肝癌細胞是實現(xiàn)基因編輯的前提。目前常用的遞送方式包括病毒載體和非病毒載體。病毒載體如慢病毒載體、腺病毒載體等，具有高效的轉(zhuǎn)染效率，能夠?qū)RISPR-Cas系統(tǒng)穩(wěn)定地整合到肝癌細胞的基因組中。然而，病毒載體存在潛在的免疫原性和致癌風險。非病毒載體如脂質(zhì)體、納米顆粒等，具有較低的免疫原性和安全性，但其轉(zhuǎn)染效率相對較低。為了提高非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率，研究人員正在探索各種改進策略，如對載體進行表面修飾，增加其與細胞的親和力；利用物理方法如電穿孔、超聲介導等輔助轉(zhuǎn)染，提高CRISPR-Cas系統(tǒng)的細胞攝取效率。5.2治療效果的預測和評估在預測基于ncRNABANCR治療策略對肝癌治療效果時，體外細胞實驗是常用的初步研究方法。通過細胞增殖實驗如CCK-8法和EdU法，可直觀地觀察到在采用反義寡核苷酸（ASO）、RNA干擾（RNAi）或CRISPR-Cas技術等抑制ncRNABANCR表達后，肝癌細胞增殖能力的變化。在CCK-8實驗中，若實驗組（采用治療策略抑制BANCR表達）細胞在450nm波長處的吸光度值顯著低于對照組（未抑制BANCR表達），表明細胞增殖受到抑制，提示該治療策略可能具有抑制肝癌細胞生長的效果。EdU實驗中，實驗組EdU陽性細胞比例降低，也進一步證實了這一點。細胞凋亡實驗如AnnexinV-FITC/PI雙染法可檢測細胞凋亡情況，若實驗組早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞比例顯著增加，說明抑制BANCR表達能誘導肝癌細胞凋亡，從側(cè)面反映出治療策略可能促進肝癌細胞死亡，達到治療目的。此外，Transwell實驗和劃痕實驗用于評估細胞遷移和侵襲能力，當實驗組細胞遷移和侵襲到下室的細胞數(shù)量減少，劃痕愈合速度減慢，表明抑制BANCR表達可降低肝癌細胞的遷移和侵襲能力，提示治療策略可能抑制肝癌細胞的轉(zhuǎn)移。體內(nèi)動物實驗能更真實地模擬肝癌在體內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移情況，對治療效果的預測和評估具有重要意義。構(gòu)建肝癌小鼠模型后，通過給予針對ncRNABANCR的治療干預，定期測量腫瘤體積和重量，可動態(tài)觀察腫瘤生長情況。若實驗組腫瘤體積和重量增長速度明顯低于對照組，說明治療策略在體內(nèi)能有效抑制腫瘤生長。在檢測腫瘤組織中增殖相關蛋白Ki-67的表達水平時，若實驗組Ki-67陽性細胞比例降低，進一步證實治療策略抑制了腫瘤細胞的增殖。對于遠處轉(zhuǎn)移的評估，可通過尾靜脈注射實驗結(jié)合活體成像系統(tǒng)觀察肝癌細胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移情況，若實驗組遠處器官的熒光信號減弱，轉(zhuǎn)移灶數(shù)量減少，表明治療策略能抑制肝癌細胞的遠處轉(zhuǎn)移。對轉(zhuǎn)移灶進行病理切片分析和免疫組織化學染色，觀察到實驗組轉(zhuǎn)移灶中癌細胞浸潤程度減輕，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關蛋白表達改變，也進一步驗證了治療策略對肝癌細胞轉(zhuǎn)移的抑制作用。臨床前研究是連接實驗室研究和臨床應用的關鍵環(huán)節(jié)，通過對臨床樣本的分析和小規(guī)模臨床試驗，能更準確地評估基于ncRNABANCR治療策略的治療效果。收集肝癌患者的腫瘤組織和血液樣本，檢測BANCR的表達水平，并與患者的臨床病理特征和預后進行關聯(lián)分析。若治療后患者腫瘤組織中BANCR表達水平降低，且患者的腫瘤大小、分期等得到改善，生存率提高，說明治療策略在臨床前研究中展現(xiàn)出了一定的治療效果。在小規(guī)模臨床試驗中，觀察采用基于ncRNABANCR治療策略的患者的不良反應和治療反應，若患者能耐受治療，且腫瘤標志物水平下降，影像學檢查顯示腫瘤縮小或穩(wěn)定，進一步證明治療策略具有潛在的臨床應用價值。5.3可能面臨的挑戰(zhàn)和解決方案在將基于ncRNABANCR的治療策略轉(zhuǎn)化為臨床應用的過程中，可能會面臨諸多挑戰(zhàn)。藥物遞送是一個關鍵難題。ncRNABANCR本身穩(wěn)定性較差，在體內(nèi)易被核酸酶降解，且其分子較大，難以有效穿透細胞膜進入細胞內(nèi)發(fā)揮作用。目前常用的遞送載體，如脂質(zhì)體、納米顆粒等，雖然在一定程度上能夠保護ncRNA并促進其細胞攝取，但仍然存在一些問題。脂質(zhì)體可能會引起免疫反應，導致機體對其產(chǎn)生排斥，影響治療效果。納米顆粒的制備工藝復雜，成本較高，且其在體內(nèi)的分布和代謝情況尚不完全清楚，可能存在潛在的毒性。此外，藥物遞送的靶向性也是一個重要問題，如何將治療藥物精準地遞送至肝癌細胞，而避免對正常細胞造成損傷，是需要解決的關鍵問題。脫靶效應也是不容忽視的挑戰(zhàn)。無論是反義寡核苷酸（ASO）、RNA干擾（RNAi）還是CRISPR-Cas技術，都存在一定的脫靶風險。ASO可能會與非靶標RNA序列結(jié)合，導致非特異性的基因表達調(diào)控，從而引發(fā)一系列不良反應。RNAi技術中，siRNA可能會與其他具有相似序列的mRNA結(jié)合，造成非預期的基因沉默。CRISPR-Cas系統(tǒng)中，gRNA可能會識別并結(jié)合到與靶標序列相似的非靶標位點，導致非靶標基因的編輯，影響細胞的正常生理功能。脫靶效應不僅會降低治療效果，還可能帶來嚴重的副作用，如細胞毒性、免疫反應等，限制了基于ncRNABANCR治療策略的臨床應用。針對藥物遞送問題，可以從載體優(yōu)化和靶向策略兩方面入手。在載體優(yōu)化方面，研發(fā)新型的遞送載體，提高其穩(wěn)定性和生物相容性。例如，開發(fā)基于多肽的遞送載體，多肽具有良好的生物降解性和低免疫原性，能夠有效保護ncRNA并促進其細胞攝取。對現(xiàn)有載體進行表面修飾，增加其靶向性和穩(wěn)定性