DB13河北省市場監(jiān)督管理局發(fā)布I本標準按照GB/T1.1-2009給本標準主要起草人：張建宏、田海燕、唐麗媛、張素君、崔瑞敏、張香云、劉存敬、李1棉花雜交種真實性和純度檢測技術(shù)規(guī)程SSR分子標記法本標準規(guī)定了利用簡單重復(fù)序列（simplesequencerepeats，SSR）分子標記進實性和純度檢測的術(shù)語和定義、原理、儀器設(shè)備、試劑及溶液配制、引物、樣品準本標準適用于基于SSR分子標記的棉花雜交種真實性和下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，僅文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程扦樣GB/T3543.4農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程是指由幾個核苷酸（一般為2～6個）為重復(fù)單元的多達幾十至幾百次的串聯(lián)重復(fù)重復(fù)次數(shù)的不同，進而形成SSR座位的多態(tài)性，根據(jù)SSR座位兩側(cè)保守的單拷貝序列設(shè)計2指品種DNA鑒定優(yōu)先選用的一套SSR引物，具有多態(tài)性高、重復(fù)性好等綜合特性，可用于品種DNA得樣品單株的SSR電泳帶型。將受檢樣品與標準樣品的帶型進行差異比較和分析，通過棉花雜交種5儀器設(shè)備、試劑及溶液配制、引物儀器設(shè)備見附錄Ⅰ,試劑及溶液配制見附錄Ⅱ,引物相關(guān)信息見附錄Ⅲ。GB/T3543.2的規(guī)定執(zhí)行，種子發(fā)芽按GB/T35），DNA提取、PCR擴增、PCR產(chǎn)物檢測具體試驗操作步驟見附錄I在36對核心引物中，按照染色體隨機選擇26對引物進行擴增，比較受檢樣品和標準樣品在每8.1.2某核心引物在受檢樣品和標準樣品間擴增出的條帶不完全一致，當表現(xiàn)異類型的單株數(shù)≤28.1.3某核心引物在受檢樣品和標準樣品間擴增出的條帶不完全一致，當表現(xiàn)異類型的單株數(shù)＞239棉花雜交種純度檢測采用品種純度來表示棉花雜交種的純度。利用15對核心引物檢測至少80個受檢樣品，統(tǒng)計每實株；電泳譜帶與標準譜帶不一致的位點數(shù)＞24---電泳檢測系統(tǒng)：電泳儀、電泳槽及配套的）；---單道微量移液器：10L、20L、100L、200L、1000L；5a)-巰基乙醇（C2H6OS）；）；）；）；）；）；m)葡糖糖（C6H12O6）；w)過硫酸銨[(NH4)2S2O8]；）；kPa（121℃)條件下滅菌20min，4℃儲存。6在80mL水中加入16.0g氫氧化鈉，溶B.2.30.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液（EDTA—Na2pH8.0）冷卻至室溫，用4mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至8滅菌20min，4℃儲存。再分別加入100mL1mol/LTris-Hcl（pH8.0）溶液、10mL0.5mol/LEDTA—Na2（pH8.0）溶液，定容至1000mL。在103.4kPa（121℃)條件下滅菌20min，4℃儲存。0.5mol/LEDTA—Na2（pH8.0）溶液，定容至1000m分別量取5mLTris-Hcl（pH8.0）溶液和1mkPa（121℃)條件下滅菌20min，4℃儲存。用超純水分別將正向引物和反向引物配制成濃度為10mol/L的B.2.105×三羥甲基氨基甲烷/硼酸電泳緩沖液（7量取680mL水，加入80mL無水乙醇在1000mL水中加入10g氫氧化鈉和5mL甲醛，根據(jù)膠板數(shù)81NAU20832NAU22723NAU22774NAU10715MUCS101AGCCTTCTCTCTCCTTCAG6NAU12697NAU22748AATTTGTCCAGATTCATTCT9NAU1085NAU1369CTATCACCCTTCTCTAGTTNAU3377AAAAGAAAACAGGGTCAAAANAU2190NAU2343NAU5120AGAATGGCATCTGAAGGCGANAU3948GACAGTCATAAACACCATCNAU2026NAU905AAGCAAGGGAGGTAATCCTTNUA1042NAU3519AAGATAAGGAAGTGAAACGTGACAAGCAGGCCAAGAGAACAGAAGGCACGTTGCAAGTGT9樣品盡快加入600LDNA提取緩沖液（1%-巰基乙醇現(xiàn)用現(xiàn)），D.1.4棄上清，加入65℃左右的裂解緩沖液（1%-巰基乙醇現(xiàn)用現(xiàn)加）600L，并用牙D.1.565℃左右水浴40min（可以延長至幾個小時期間不斷搖晃。利用26對SSR核心引物（見附錄Ⅲ)對標準樣品和受檢樣品DNA進行擴增。--將玻璃板洗凈后，用去離子水沖洗干凈后晾干。玻璃板徹底干燥后，將其組裝成電泳膠板，灌膠槽內(nèi)（槽內(nèi)加入溶解的1%瓊脂糖溶液）進行封底。在50mLH2O中加入30mL30%Acrylamide、20mL5×TBE、80mL酸銨混合后立即灌膠。待膠充滿整個凝膠夾層，然后輕輕的插入梳子。灌膠過程中防止出現(xiàn)氣待膠凝固后，將玻璃板安裝到電泳槽上，在上槽和下槽中分別加入0.5×TBE緩沖液，使凝膠夾層能浸泡在緩沖液中，拔出梳子。每個點樣孔加樣品1.2L，在160V恒電壓下電泳2h5min。電泳結(jié)束后，小心分開兩塊玻璃板，取下凝膠放入盛有固定液固定：將固定液倒入染膠