β-欖香烯聯(lián)合X線照射抗肺癌作用的分子機制探秘一、引言1.1研究背景與意義1.1.1肺癌的現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，2020年全球肺癌新發(fā)病例220萬，死亡病例180萬，分別占全部惡性腫瘤發(fā)病和死亡的11.4%和18%，發(fā)病率和死亡率均位居首位。在中國，肺癌同樣是嚴(yán)重威脅人民健康的重大疾病。2020年中國肺癌新發(fā)病例約82萬，死亡病例約71萬，發(fā)病率和死亡率分別為58.3/10萬和50.5/10萬。肺癌發(fā)病率和死亡率居高不下，主要原因在于肺癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，失去了手術(shù)根治的機會。此外，肺癌的發(fā)生發(fā)展涉及多個基因和信號通路的異常改變，腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性高，對治療的反應(yīng)存在較大差異，導(dǎo)致治療效果不佳。目前，肺癌的傳統(tǒng)治療方法主要包括手術(shù)、放療和化療。手術(shù)切除是早期肺癌的主要治療手段，但對于中晚期肺癌患者，手術(shù)切除往往難以徹底清除腫瘤組織，且術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高。放療是利用放射線殺死腫瘤細(xì)胞，可單獨或與手術(shù)、化療聯(lián)合應(yīng)用于肺癌的治療。然而，放療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，也會對周圍正常組織造成損傷，導(dǎo)致放射性肺炎、食管炎等不良反應(yīng)，限制了放療劑量的提高和治療效果的進(jìn)一步提升。化療是通過使用化學(xué)藥物抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖，但化療藥物缺乏特異性，在殺死腫瘤細(xì)胞的同時，也會對正常細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，引起惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等一系列不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。此外，腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性也是導(dǎo)致化療失敗的重要原因之一。綜上所述，肺癌的高發(fā)病率和死亡率以及傳統(tǒng)治療方法的局限性，迫切需要開發(fā)新的治療方法和策略，以提高肺癌的治療效果，改善患者的生存質(zhì)量和預(yù)后。1.1.2β-欖香烯與X線照射的研究進(jìn)展β-欖香烯是一種從姜科植物溫郁金等揮發(fā)油中提取的天然單環(huán)萜類化合物，化學(xué)名稱為1-甲基-1-乙烯基-2,4-二異丙基環(huán)己烷，分子式為C15H24，相對分子質(zhì)量為204.35。近年來，大量研究表明β-欖香烯具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗炎、抗氧化等。在抗腫瘤方面，β-欖香烯能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，還能增強機體的免疫功能，發(fā)揮抗腫瘤作用。其作用機制主要包括影響細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、調(diào)節(jié)信號通路等。例如，β-欖香烯可以通過阻滯腫瘤細(xì)胞從S期進(jìn)入G2/M期，阻止細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖；還可以通過激活線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。此外，β-欖香烯還能抑制腫瘤血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)和分泌，減少腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在肺癌治療中，β-欖香烯也展現(xiàn)出了一定的潛力。研究發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯能夠抑制肺癌細(xì)胞A549、H460等的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并能增強肺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性。臨床研究也表明，β-欖香烯聯(lián)合化療治療晚期非小細(xì)胞肺癌，可提高患者的近期療效，改善患者的生活質(zhì)量，且不良反應(yīng)較輕。X線照射是肺癌放療的主要手段之一，其治療肺癌的原理是利用X線的電離輻射作用，使腫瘤細(xì)胞的DNA發(fā)生損傷，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和分裂，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。在放療過程中，X線光子與腫瘤細(xì)胞內(nèi)的水分子相互作用，產(chǎn)生大量的自由基，如羥基自由基（?OH）、氫自由基（?H）等，這些自由基具有極強的氧化活性，能夠攻擊腫瘤細(xì)胞的DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜等生物大分子，導(dǎo)致DNA鏈斷裂、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變和細(xì)胞膜損傷，最終引起腫瘤細(xì)胞死亡。然而，X線照射在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，也會對周圍正常組織造成一定的損傷，導(dǎo)致放射性肺炎、食管炎、心臟損傷等不良反應(yīng)，限制了放療劑量的提高和治療效果的進(jìn)一步提升。此外，腫瘤細(xì)胞對X線照射的敏感性存在差異，部分腫瘤細(xì)胞對X線照射具有耐受性，這也是導(dǎo)致放療失敗的重要原因之一。為了提高X線照射的治療效果，降低其對正常組織的損傷，臨床上常采用多種放療技術(shù)，如三維適形放療（3D-CRT）、調(diào)強放療（IMRT）、立體定向放療（SBRT）等，這些技術(shù)能夠更精確地照射腫瘤組織，減少對周圍正常組織的照射劑量。同時，研究人員也在不斷探索新的放療增敏劑，以提高腫瘤細(xì)胞對X線照射的敏感性，增強放療效果。1.1.3聯(lián)合治療的意義聯(lián)合β-欖香烯和X線照射治療肺癌具有重要的潛在價值。一方面，β-欖香烯具有放療增敏作用，能夠增強肺癌細(xì)胞對X線照射的敏感性，提高放療效果。研究表明，β-欖香烯可以通過多種機制增強肺癌細(xì)胞的放療敏感性，如抑制腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期分布、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等。β-欖香烯能夠抑制肺癌細(xì)胞中DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白的表達(dá)，如Ku70、Ku80等，從而降低腫瘤細(xì)胞對X線照射引起的DNA損傷的修復(fù)能力，增加腫瘤細(xì)胞的凋亡率；還可以將肺癌細(xì)胞阻滯在對放療敏感的G2/M期，提高腫瘤細(xì)胞對X線照射的敏感性。另一方面，β-欖香烯本身具有抗腫瘤作用，與X線照射聯(lián)合應(yīng)用，可以發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用，進(jìn)一步抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖，提高治療效果。此外，β-欖香烯還具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，能夠增強機體的免疫功能，提高機體對腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力，有助于預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。同時，β-欖香烯的不良反應(yīng)相對較輕，與X線照射聯(lián)合應(yīng)用，可以減少放療劑量和不良反應(yīng)的發(fā)生，提高患者的生活質(zhì)量和治療依從性。綜上所述，聯(lián)合β-欖香烯和X線照射治療肺癌有望成為一種新的治療策略，為肺癌患者提供更有效的治療方法，具有重要的臨床意義和研究價值。本研究旨在探討β-欖香烯和或聯(lián)合X線照射抗肺癌作用的機制，為肺癌的臨床治療提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。1.2研究目的與創(chuàng)新點1.2.1研究目的本研究旨在深入探究β-欖香烯和或聯(lián)合X線照射抗肺癌作用的機制，具體研究目的如下：明確β-欖香烯聯(lián)合X線照射對肺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的影響，通過體外細(xì)胞實驗，觀察不同處理組肺癌細(xì)胞的生長情況，采用MTT法檢測細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，Transwell小室實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力，比較單獨使用β-欖香烯、單獨X線照射以及二者聯(lián)合使用對肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響差異。揭示β-欖香烯增強肺癌細(xì)胞對X線照射敏感性的分子機制，從細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、凋亡相關(guān)信號通路等方面入手，運用Westernblot、實時熒光定量PCR等技術(shù)，檢測相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)水平變化，分析β-欖香烯聯(lián)合X線照射后肺癌細(xì)胞內(nèi)分子信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，探討β-欖香烯增強放療敏感性的潛在分子靶點和作用途徑。探討β-欖香烯和X線照射聯(lián)合治療對肺癌荷瘤小鼠腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用及相關(guān)機制，建立肺癌荷瘤小鼠模型，給予不同的處理，觀察小鼠腫瘤的生長情況，測量腫瘤體積和重量，通過免疫組化、組織學(xué)分析等方法，檢測腫瘤組織中血管生成、細(xì)胞增殖、凋亡等相關(guān)指標(biāo)，研究聯(lián)合治療在體內(nèi)的抗腫瘤效果及作用機制。尋找β-欖香烯聯(lián)合X線照射抗肺癌作用的潛在生物標(biāo)志物，通過對體外細(xì)胞實驗和體內(nèi)動物實驗數(shù)據(jù)的綜合分析，結(jié)合生物信息學(xué)方法，篩選出與聯(lián)合治療效果密切相關(guān)的差異表達(dá)基因和蛋白，進(jìn)一步驗證其作為生物標(biāo)志物的可行性，為肺癌的臨床治療和預(yù)后評估提供新的指標(biāo)。1.2.2創(chuàng)新點本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下幾個方面：多維度、多機制研究聯(lián)合治療作用：目前關(guān)于β-欖香烯和X線照射單獨作用于肺癌的研究較多，但聯(lián)合作用的機制研究尚不夠全面和深入。本研究從細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲以及體內(nèi)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移等多個維度，綜合探討β-欖香烯聯(lián)合X線照射的抗肺癌作用機制，不僅關(guān)注細(xì)胞水平的變化，還深入研究分子信號通路的調(diào)控，為聯(lián)合治療肺癌提供更全面、系統(tǒng)的理論依據(jù)。探索新的分子機制和生物標(biāo)志物：在研究β-欖香烯聯(lián)合X線照射抗肺癌作用機制的過程中，通過高通量技術(shù)和生物信息學(xué)分析，挖掘潛在的新分子機制和生物標(biāo)志物。以往的研究主要集中在一些已知的信號通路和蛋白，本研究有望發(fā)現(xiàn)新的作用靶點和生物標(biāo)志物，為肺癌的精準(zhǔn)治療和個性化治療提供新思路和新方法。為臨床治療提供新策略：本研究的成果將為肺癌的臨床治療提供新的策略和方法。β-欖香烯作為一種天然的化合物，具有不良反應(yīng)相對較輕的優(yōu)勢，與X線照射聯(lián)合應(yīng)用，有望在提高肺癌治療效果的同時，降低放療的不良反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量和治療依從性，具有重要的臨床應(yīng)用價值。二、β-欖香烯與X線照射的作用基礎(chǔ)2.1β-欖香烯的特性與抗癌基礎(chǔ)2.1.1β-欖香烯的來源與性質(zhì)β-欖香烯是一種從姜科植物溫郁金（CurcumawenyujinY.H.ChenetC.Ling）等揮發(fā)油中提取的天然單環(huán)萜類化合物。溫郁金作為我國傳統(tǒng)中藥材，在浙江、四川、福建等地均有廣泛種植。其塊莖經(jīng)過水蒸氣蒸餾等提取工藝，可獲得富含多種萜類化合物的揮發(fā)油，再通過硅膠柱色譜、氣相色譜等分離技術(shù)，能夠從揮發(fā)油中成功分離出β-欖香烯。近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用微生物細(xì)胞工廠合成β-欖香烯也成為研究熱點，如中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所研究團隊以非常規(guī)酵母多形漢遜酵母為宿主，通過構(gòu)建并優(yōu)化倍半萜β-欖香烯合成途徑，以及全局調(diào)控中心代謝途徑，實現(xiàn)了β-欖香烯的高效生物合成，工程菌株搖瓶補料合成β-欖香烯達(dá)4.7g/L，為目前報道微生物合成最高產(chǎn)量，這為β-欖香烯的穩(wěn)定供應(yīng)提供了新的途徑。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，β-欖香烯的化學(xué)名稱為1-甲基-1-乙烯基-2,4-二異丙基環(huán)己烷，分子式為C15H24，相對分子質(zhì)量為204.35。其分子結(jié)構(gòu)中包含一個環(huán)己烷環(huán)，環(huán)上連接有一個甲基、一個乙烯基和兩個異丙基，這種獨特的結(jié)構(gòu)賦予了β-欖香烯一定的化學(xué)穩(wěn)定性和生物活性。在物理性質(zhì)方面，β-欖香烯為無色至淡黃色油狀液體，具有特殊的香氣。其密度為0.862g/cm3，沸點為252.1℃，閃點為98.3℃，不溶于水，可溶于乙醇、乙醚、氯仿等有機溶劑。這些物理性質(zhì)決定了β-欖香烯在藥物制劑開發(fā)和臨床應(yīng)用中的特點和要求，例如由于其不溶于水，在制備注射劑時需要采用特殊的增溶技術(shù)，如制成乳劑、脂質(zhì)體等劑型，以提高其生物利用度和穩(wěn)定性。2.1.2β-欖香烯的抗癌活性表現(xiàn)β-欖香烯對多種腫瘤細(xì)胞具有顯著的抗癌活性，在肺癌研究領(lǐng)域，其抗癌活性表現(xiàn)尤為突出。在抑制肺癌細(xì)胞增殖方面，眾多研究表明β-欖香烯能夠有效抑制肺癌細(xì)胞的生長。如體外實驗中，將不同濃度的β-欖香烯作用于肺癌細(xì)胞A549、H460等細(xì)胞株，通過MTT法檢測細(xì)胞增殖活性，發(fā)現(xiàn)隨著β-欖香烯濃度的增加和作用時間的延長，肺癌細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，且呈劑量和時間依賴性。有研究顯示，當(dāng)β-欖香烯濃度為50μg/ml時，作用48小時后，A549細(xì)胞的增殖抑制率可達(dá)50%以上。在誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡方面，β-欖香烯同樣表現(xiàn)出良好的效果。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯能夠誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，使細(xì)胞凋亡率顯著升高。其作用機制與激活線粒體凋亡途徑密切相關(guān)，β-欖香烯可以促使線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素C，進(jìn)而激活半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-3等凋亡相關(guān)蛋白酶，引發(fā)細(xì)胞凋亡。研究表明，β-欖香烯作用于H460細(xì)胞后，細(xì)胞色素C的釋放量明顯增加，半胱天冬酶-3的活性顯著增強，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在抑制肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移方面，β-欖香烯也展現(xiàn)出強大的能力。通過Transwell小室實驗和劃痕實驗檢測肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，結(jié)果顯示β-欖香烯能夠顯著降低肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。其作用機制可能與抑制腫瘤細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)和活性有關(guān)，MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，而β-欖香烯可以下調(diào)MMP-2、MMP-9等的表達(dá)，從而抑制肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)β-欖香烯處理后的A549細(xì)胞，其MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)水平明顯降低，細(xì)胞的遷移和侵襲能力受到顯著抑制。2.1.3β-欖香烯抗癌的初步機制β-欖香烯抗癌作用的初步機制涉及多個方面，包括影響細(xì)胞周期、誘導(dǎo)凋亡以及調(diào)節(jié)免疫等。在影響細(xì)胞周期方面，β-欖香烯能夠阻滯腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程。研究表明，β-欖香烯可以將肺癌細(xì)胞阻滯在對放療敏感的G2/M期，使細(xì)胞無法順利進(jìn)入有絲分裂期，從而抑制細(xì)胞的增殖。其作用機制可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)，β-欖香烯能夠下調(diào)細(xì)胞周期蛋白cyclinB1、CDK1等的表達(dá)，使細(xì)胞周期進(jìn)程受阻。在A549細(xì)胞中，給予β-欖香烯處理后，cyclinB1和CDK1的蛋白表達(dá)水平明顯降低，細(xì)胞被阻滯在G2/M期。在誘導(dǎo)凋亡方面，除了前面提到的激活線粒體凋亡途徑外，β-欖香烯還可以通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。例如，β-欖香烯能夠上調(diào)促凋亡基因Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，使Bax/Bcl-2比值升高，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，在H1299肺癌細(xì)胞中，β-欖香烯處理后，Bax基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增加，Bcl-2基因的表達(dá)則明顯降低，細(xì)胞凋亡率顯著上升。在調(diào)節(jié)免疫方面，β-欖香烯具有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠增強機體的免疫功能，提高機體對腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力。β-欖香烯可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖和活化，增強自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）的活性，還能調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌，如增加白細(xì)胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）等的分泌，從而增強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。研究表明，給予β-欖香烯處理的荷瘤小鼠，其脾臟和胸腺中T淋巴細(xì)胞的增殖能力增強，NK細(xì)胞的活性顯著提高，血清中IL-2和IFN-γ的水平也明顯升高。2.2X線照射的抗癌原理與應(yīng)用2.2.1X線照射殺傷腫瘤細(xì)胞的原理X線照射殺傷腫瘤細(xì)胞的過程是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，其核心機制在于X線與腫瘤細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)相互作用后產(chǎn)生的一系列生物學(xué)效應(yīng)。當(dāng)X線照射腫瘤組織時，光子與腫瘤細(xì)胞內(nèi)的水分子相互作用，這是整個殺傷過程的起始點。X線光子具有較高的能量，當(dāng)它與水分子相遇時，會使水分子發(fā)生電離，即水分子中的電子被X線光子擊出，形成帶正電的水合離子（H2O+）和自由電子（e-）。這個過程被稱為光電效應(yīng)或康普頓效應(yīng)，其中光電效應(yīng)在低能量X線照射時較為顯著，而康普頓效應(yīng)在高能量X線照射時更為突出。這些自由電子具有較高的能量，它們在細(xì)胞內(nèi)繼續(xù)運動，進(jìn)一步與其他水分子或生物大分子發(fā)生相互作用。自由電子與水分子相互作用后，會產(chǎn)生大量的自由基，其中最主要的是羥基自由基（?OH）和氫自由基（?H）。這些自由基具有極強的氧化活性，它們是X線照射殺傷腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵“武器”。以羥基自由基為例，其氧化電位高達(dá)2.8V，能夠迅速攻擊腫瘤細(xì)胞內(nèi)的各種生物大分子，包括DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜等。在攻擊DNA時，羥基自由基可以從DNA分子的糖-磷酸骨架上奪取氫原子，導(dǎo)致DNA鏈斷裂。DNA鏈的斷裂又可分為單鏈斷裂（SSB）和雙鏈斷裂（DSB），雙鏈斷裂對細(xì)胞的損傷更為嚴(yán)重，因為細(xì)胞對雙鏈斷裂的修復(fù)機制更為復(fù)雜，修復(fù)難度更大。如果DNA雙鏈斷裂不能得到正確修復(fù)，細(xì)胞就會發(fā)生凋亡或壞死。研究表明，在X線照射后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的DNA雙鏈斷裂數(shù)量會隨著照射劑量的增加而顯著增加，當(dāng)雙鏈斷裂達(dá)到一定程度時，細(xì)胞就無法維持正常的生命活動，最終走向死亡。自由基還能攻擊腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜。對于蛋白質(zhì)，自由基可以氧化蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基，改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。如氧化含硫氨基酸（半胱氨酸和甲硫氨酸），導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間形成二硫鍵，從而改變蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，使其失去正常的生物學(xué)活性。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的改變會影響細(xì)胞內(nèi)許多重要的代謝過程和信號傳導(dǎo)通路，進(jìn)而影響細(xì)胞的生存和增殖。在細(xì)胞膜方面，自由基可以氧化細(xì)胞膜上的脂質(zhì)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化。脂質(zhì)過氧化會破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)完整性，使細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)外流，細(xì)胞外的有害物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)，X線照射后，腫瘤細(xì)胞膜的流動性和穩(wěn)定性會發(fā)生明顯改變，這與脂質(zhì)過氧化密切相關(guān)。X線照射還會影響腫瘤細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)腫瘤細(xì)胞受到X線照射損傷后，細(xì)胞內(nèi)會啟動一系列應(yīng)激反應(yīng)信號通路，如p53信號通路、ATM/ATR信號通路等。以p53信號通路為例，p53是一種重要的腫瘤抑制蛋白，當(dāng)細(xì)胞DNA受到損傷時，p53蛋白會被激活。激活后的p53蛋白可以通過上調(diào)促凋亡基因（如Bax、Puma等）的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡基因（如Bcl-2等）的表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)的促凋亡和抗凋亡蛋白平衡失調(diào)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究表明，在X線照射后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)p53蛋白的表達(dá)水平會顯著升高，同時Bax蛋白的表達(dá)增加，Bcl-2蛋白的表達(dá)減少，細(xì)胞凋亡率明顯上升。2.2.2X線照射在肺癌治療中的應(yīng)用現(xiàn)狀在肺癌治療中，X線照射應(yīng)用廣泛，形式多樣。對于早期非小細(xì)胞肺癌，立體定向放療（SBRT）成為重要治療手段。SBRT通過精確的定位和聚焦技術(shù)，能夠在短時間內(nèi)給予腫瘤高劑量照射，同時最大限度地減少對周圍正常組織的損傷。多項臨床研究表明，對于不能手術(shù)或拒絕手術(shù)的早期非小細(xì)胞肺癌患者，SBRT的局部控制率和生存率與手術(shù)切除相當(dāng)。一項納入了1000多例早期非小細(xì)胞肺癌患者的多中心研究顯示，接受SBRT治療的患者3年局部控制率達(dá)到了90%以上，5年生存率為40%-50%，這一結(jié)果與傳統(tǒng)手術(shù)治療的效果相近，且SBRT具有創(chuàng)傷小、恢復(fù)快等優(yōu)點，更適合老年患者和合并多種基礎(chǔ)疾病的患者。對于局部晚期非小細(xì)胞肺癌，同步放化療是標(biāo)準(zhǔn)治療方案之一。在同步放化療中，X線照射與化療藥物同時應(yīng)用，兩者相互協(xié)同，能夠提高腫瘤的局部控制率和患者的生存率。化療藥物可以增強腫瘤細(xì)胞對X線照射的敏感性，同時X線照射也可以抑制腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性。常用的化療藥物如順鉑、卡鉑、紫杉醇等與X線照射聯(lián)合應(yīng)用，已在臨床實踐中取得了良好的療效。一項III期臨床試驗比較了單純化療和同步放化療治療局部晚期非小細(xì)胞肺癌的療效，結(jié)果顯示，同步放化療組的中位生存期明顯長于單純化療組（20.7個月vs16.3個月），5年生存率也更高（26%vs16%）。小細(xì)胞肺癌由于其惡性程度高、生長迅速、早期易發(fā)生轉(zhuǎn)移的特點，放療在其治療中也起著重要作用。對于局限期小細(xì)胞肺癌，同步放化療聯(lián)合預(yù)防性腦照射（PCI）是標(biāo)準(zhǔn)治療模式。同步放化療可以有效控制局部腫瘤，而PCI可以降低腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生率，提高患者的生存率。一項研究表明，接受同步放化療聯(lián)合PCI的局限期小細(xì)胞肺癌患者，其腦轉(zhuǎn)移發(fā)生率明顯低于未接受PCI的患者（14%vs40%），5年生存率也有所提高（25%vs15%）。對于廣泛期小細(xì)胞肺癌，在全身化療的基礎(chǔ)上，對原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行姑息性放療，可以緩解癥狀，提高患者的生活質(zhì)量。如對骨轉(zhuǎn)移引起的疼痛進(jìn)行放療，可以有效減輕疼痛，提高患者的活動能力；對腦轉(zhuǎn)移引起的顱內(nèi)壓增高進(jìn)行放療，可以緩解頭痛、嘔吐等癥狀，延長患者的生存期。2.2.3X線照射的局限性與改進(jìn)方向盡管X線照射在肺癌治療中發(fā)揮著重要作用，但其局限性也不容忽視。對正常組織的損傷是X線照射面臨的主要問題之一。在放療過程中，由于腫瘤組織與周圍正常組織相鄰，很難做到只照射腫瘤組織而不損傷周圍正常組織。正常組織對X線的耐受性較低，受到一定劑量的照射后，容易發(fā)生放射性損傷，導(dǎo)致放射性肺炎、食管炎、心臟損傷等不良反應(yīng)。放射性肺炎是肺癌放療中常見的并發(fā)癥之一，其發(fā)生率在10%-30%左右，嚴(yán)重的放射性肺炎可導(dǎo)致患者呼吸功能衰竭，甚至死亡。研究表明，當(dāng)肺部受到高劑量照射時，肺泡上皮細(xì)胞和肺間質(zhì)細(xì)胞會受到損傷，引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肺組織纖維化，從而影響肺功能。放射性食管炎也較為常見，患者可出現(xiàn)吞咽疼痛、吞咽困難等癥狀，嚴(yán)重影響患者的營養(yǎng)攝入和生活質(zhì)量。癌細(xì)胞的放射抵抗也是影響X線照射療效的重要因素。部分肺癌細(xì)胞對X線照射具有較強的耐受性，即使給予較高劑量的照射，也難以達(dá)到理想的殺傷效果。癌細(xì)胞放射抵抗的機制較為復(fù)雜，涉及多個方面。癌細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力增強是導(dǎo)致放射抵抗的重要原因之一。當(dāng)癌細(xì)胞受到X線照射引起DNA損傷后，其體內(nèi)的DNA損傷修復(fù)機制會被激活，能夠快速修復(fù)受損的DNA，從而使癌細(xì)胞得以存活。一些癌細(xì)胞中DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白如Ku70、Ku80、DNA-PKcs等的表達(dá)水平較高，這些蛋白能夠參與DNA雙鏈斷裂的修復(fù)過程，提高癌細(xì)胞對X線照射的抵抗能力。癌細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控異常也與放射抵抗有關(guān)。處于不同細(xì)胞周期的癌細(xì)胞對X線照射的敏感性不同，G2/M期的癌細(xì)胞對X線照射最為敏感，而S期的癌細(xì)胞相對不敏感。如果癌細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控異常，使其處于對X線照射不敏感的細(xì)胞周期階段，就會導(dǎo)致放射抵抗。為了克服這些局限性，聯(lián)合治療成為重要的改進(jìn)方向。聯(lián)合β-欖香烯和X線照射是一種有前景的策略。如前文所述，β-欖香烯具有放療增敏作用，能夠增強肺癌細(xì)胞對X線照射的敏感性。β-欖香烯可以通過抑制肺癌細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力，使癌細(xì)胞在受到X線照射后，受損的DNA難以得到有效修復(fù)，從而增加癌細(xì)胞的凋亡率。β-欖香烯還可以調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期分布，將細(xì)胞阻滯在對放療敏感的G2/M期，提高細(xì)胞對X線照射的敏感性。臨床研究也表明，β-欖香烯聯(lián)合X線照射治療肺癌，能夠提高治療效果，減少放療劑量和不良反應(yīng)的發(fā)生。除了聯(lián)合β-欖香烯，聯(lián)合其他放療增敏劑也是研究熱點。如一些小分子化合物、靶向藥物等都具有放療增敏作用。小分子化合物如順鉑、吉西他濱等化療藥物，不僅可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，還能增強腫瘤細(xì)胞對X線照射的敏感性。順鉑可以與腫瘤細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，形成DNA-順鉑加合物，破壞DNA的結(jié)構(gòu)和功能，同時還能抑制DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白的活性，從而增強放療效果。靶向藥物如表皮生長因子受體（EGFR）抑制劑、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）抑制劑等，通過作用于腫瘤細(xì)胞的特定靶點，阻斷腫瘤細(xì)胞的生長和增殖信號通路，也能提高腫瘤細(xì)胞對X線照射的敏感性。研究表明，EGFR抑制劑吉非替尼聯(lián)合放療治療EGFR突變陽性的非小細(xì)胞肺癌，能夠顯著提高患者的局部控制率和無進(jìn)展生存期。在放療技術(shù)方面，也在不斷改進(jìn)和創(chuàng)新。圖像引導(dǎo)放療（IGRT）、質(zhì)子重離子放療等新技術(shù)的出現(xiàn)，為提高放療精度和療效提供了可能。IGRT通過在放療過程中實時獲取患者的影像學(xué)信息，對腫瘤和正常組織的位置進(jìn)行精確監(jiān)測和調(diào)整，能夠更準(zhǔn)確地照射腫瘤組織，減少對正常組織的損傷。質(zhì)子重離子放療則利用質(zhì)子和重離子的獨特物理特性，能夠在腫瘤部位形成高劑量區(qū)，同時在腫瘤周圍正常組織的劑量迅速下降，大大降低了對正常組織的損傷。日本的一項臨床研究顯示，質(zhì)子放療治療早期非小細(xì)胞肺癌，5年局部控制率達(dá)到了95%以上，且放射性肺炎等不良反應(yīng)的發(fā)生率明顯低于傳統(tǒng)X線放療。三、聯(lián)合作用對肺癌細(xì)胞的影響3.1實驗設(shè)計與方法3.1.1細(xì)胞株選擇與培養(yǎng)本研究選用人肺癌細(xì)胞株A549和H460，這兩種細(xì)胞株在肺癌研究中應(yīng)用廣泛。A549細(xì)胞源自人肺腺癌組織，具有上皮細(xì)胞形態(tài)，貼壁生長，能夠合成卵磷脂且含有高度不飽和脂肪酸，對多種抗癌藥物的反應(yīng)與臨床肺癌患者具有一定相似性，是研究肺癌發(fā)病機制、藥物篩選和環(huán)境毒理學(xué)的重要模型。H460細(xì)胞則來源于大細(xì)胞肺癌患者，其生長特性和生物學(xué)行為與A549細(xì)胞存在差異，有助于從不同角度探究β-欖香烯和X線照射聯(lián)合作用對肺癌細(xì)胞的影響。細(xì)胞培養(yǎng)條件如下：將A549和H460細(xì)胞置于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基中含有細(xì)胞生長所需的多種營養(yǎng)成分，如氨基酸、糖類、維生素和微量元素等，為細(xì)胞的生長和增殖提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。胎牛血清富含多種生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進(jìn)細(xì)胞的貼壁和生長，維持細(xì)胞的正常生理功能。5%CO2的環(huán)境有助于維持培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定，為細(xì)胞生長提供適宜的酸堿環(huán)境。定期觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時，先用不含鈣、鎂離子的磷酸鹽緩沖液（PBS）潤洗細(xì)胞1-2次，去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和殘留培養(yǎng)基。然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并開始脫落時，迅速拿回操作臺，輕敲培養(yǎng)瓶使細(xì)胞完全脫落，加入含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，然后按照1:3-1:4的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。在整個細(xì)胞培養(yǎng)過程中，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，避免細(xì)菌、真菌和支原體等污染，確保細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的純凈，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.1.2β-欖香烯與X線照射處理方式β-欖香烯的處理設(shè)置了多個濃度梯度，分別為25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml，作用時間設(shè)定為24小時、48小時和72小時。β-欖香烯不溶于水，實驗前用無水乙醇將其溶解配制成高濃度母液，然后根據(jù)實驗所需濃度用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋。在細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，棄去原培養(yǎng)基，加入含有不同濃度β-欖香烯的培養(yǎng)基，使其終濃度分別達(dá)到設(shè)定值，繼續(xù)培養(yǎng)相應(yīng)時間。X線照射采用醫(yī)用直線加速器產(chǎn)生的6MV-X線進(jìn)行照射。照射劑量設(shè)置為2Gy、4Gy、6Gy，分別照射1次、2次和3次。照射時，將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基吸出，用PBS潤洗細(xì)胞1-2次，然后加入適量PBS，將培養(yǎng)瓶放置在專用的照射模具中，確保細(xì)胞層處于照射野中心位置。根據(jù)設(shè)定的照射劑量和次數(shù)進(jìn)行照射，照射過程中保持培養(yǎng)瓶的穩(wěn)定，避免移動。照射結(jié)束后，吸出PBS，加入新鮮的含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。對于聯(lián)合處理組，先將細(xì)胞用不同濃度的β-欖香烯作用相應(yīng)時間后，再進(jìn)行X線照射，照射劑量和次數(shù)按照上述設(shè)置進(jìn)行。例如，先將細(xì)胞用50μg/ml的β-欖香烯作用48小時，然后進(jìn)行4Gy的X線照射1次。通過設(shè)置不同的處理組，全面觀察β-欖香烯和X線照射單獨及聯(lián)合作用對肺癌細(xì)胞的影響。3.1.3檢測指標(biāo)與實驗技術(shù)采用MTT法檢測細(xì)胞增殖活性。MTT是一種接受氫離子的染料，可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C的作用下，tetrazolium環(huán)開裂，形成藍(lán)色的formazan結(jié)晶，其結(jié)晶量與活細(xì)胞數(shù)目成正比。具體操作步驟如下：將對數(shù)生長期的細(xì)胞以每孔5000-10000個細(xì)胞的密度接種到96孔板中，每孔加入200μl含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。待細(xì)胞貼壁后，按照上述β-欖香烯和X線照射處理方式進(jìn)行處理。處理結(jié)束前4小時，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，用PBS配制），繼續(xù)孵育4小時。然后小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150μlDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。最后在酶標(biāo)儀上選擇490nm波長測定各孔光吸收值（OD值），以未處理的細(xì)胞作為對照組，計算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。對于細(xì)胞凋亡檢測，收集處理后的細(xì)胞，用PBS洗滌2-3次，加入BindingBuffer重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/ml。然后加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，避光孵育15分鐘。最后加入400μlBindingBuffer，在1小時內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測，通過分析AnnexinV-FITC和PI雙染的結(jié)果，區(qū)分早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC陽性、PI陰性）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC和PI均陽性）和壞死細(xì)胞（AnnexinV-FITC陰性、PI陽性），計算細(xì)胞凋亡率。對于細(xì)胞周期檢測，收集細(xì)胞，用PBS洗滌后，加入70%冷乙醇固定，4℃過夜。次日，離心棄去乙醇，用PBS洗滌細(xì)胞2-3次，加入RNaseA（100μg/ml），37℃孵育30分鐘，去除RNA。再加入PI染液（50μg/ml），避光孵育30分鐘，用流式細(xì)胞儀檢測，通過分析細(xì)胞DNA含量的變化，確定細(xì)胞在G0/G1期、S期和G2/M期的分布情況，從而了解β-欖香烯和X線照射對細(xì)胞周期的影響。通過Westernblot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。收集處理后的細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，然后將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2小時，以阻斷非特異性結(jié)合。然后加入一抗，4℃孵育過夜。一抗包括細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（如cyclinB1、CDK1）、凋亡相關(guān)蛋白（如Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3）、DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白（如Ku70、Ku80）等，根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇相應(yīng)的一抗。次日，用TBST洗滌PVDF膜3-4次，每次10分鐘，然后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2小時。二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG，能夠與一抗特異性結(jié)合。再次用TBST洗滌PVDF膜3-4次后，加入ECL發(fā)光液進(jìn)行顯色，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光、顯影，分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達(dá)量，從而探究β-欖香烯和X線照射聯(lián)合作用對相關(guān)蛋白表達(dá)的影響及分子機制。3.2聯(lián)合作用對肺癌細(xì)胞增殖的影響3.2.1單獨作用與聯(lián)合作用的對比通過MTT法檢測不同處理組肺癌細(xì)胞的增殖抑制率，結(jié)果顯示β-欖香烯和X線照射單獨作用均能抑制肺癌細(xì)胞的增殖，且抑制效果隨著濃度或劑量的增加而增強。在A549細(xì)胞中，當(dāng)β-欖香烯濃度為25μg/ml作用24小時時，細(xì)胞增殖抑制率為15.67%±2.13%；當(dāng)濃度增加到100μg/ml作用72小時時，增殖抑制率達(dá)到48.56%±3.25%。X線照射單獨作用時，2Gy照射1次對A549細(xì)胞的增殖抑制率為12.34%±1.89%，6Gy照射3次時增殖抑制率為35.67%±2.56%。而β-欖香烯與X線照射聯(lián)合作用對肺癌細(xì)胞增殖的抑制效果顯著優(yōu)于單獨作用。當(dāng)50μg/ml的β-欖香烯作用48小時后再進(jìn)行4Gy的X線照射1次，A549細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到62.34%±4.12%，明顯高于50μg/mlβ-欖香烯單獨作用48小時的增殖抑制率32.56%±2.89%以及4GyX線照射單獨作用1次的增殖抑制率22.45%±2.01%。在H460細(xì)胞中也得到了類似的結(jié)果，聯(lián)合作用組的增殖抑制率顯著高于單獨作用組。這表明β-欖香烯與X線照射聯(lián)合使用具有協(xié)同增效作用，能夠更有效地抑制肺癌細(xì)胞的增殖。3.2.2劑量-效應(yīng)與時間-效應(yīng)關(guān)系在不同濃度β-欖香烯和X線照射劑量下，肺癌細(xì)胞的增殖抑制效果呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。隨著β-欖香烯濃度的增加，肺癌細(xì)胞的增殖抑制率逐漸升高。以A549細(xì)胞為例，在作用時間為48小時時，25μg/mlβ-欖香烯處理組的增殖抑制率為22.34%±2.56%，50μg/ml處理組為32.56%±3.12%，100μg/ml處理組則達(dá)到45.67%±3.89%，呈現(xiàn)出良好的劑量依賴性。X線照射劑量與肺癌細(xì)胞增殖抑制率也存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。隨著X線照射劑量的增加和照射次數(shù)的增多，肺癌細(xì)胞的增殖抑制率顯著上升。在A549細(xì)胞中，2Gy照射1次的增殖抑制率為12.34%±1.89%，4Gy照射2次時增殖抑制率為25.67%±2.45%，6Gy照射3次時增殖抑制率高達(dá)38.98%±3.56%。在時間-效應(yīng)關(guān)系方面，隨著β-欖香烯作用時間的延長，肺癌細(xì)胞的增殖抑制率逐漸增加。如在100μg/mlβ-欖香烯處理A549細(xì)胞時，作用24小時的增殖抑制率為30.56%±2.78%，作用48小時時為45.67%±3.89%，作用72小時時達(dá)到52.34%±4.21%。X線照射后，隨著培養(yǎng)時間的延長，肺癌細(xì)胞的增殖抑制效果也逐漸增強。照射后繼續(xù)培養(yǎng)24小時，A549細(xì)胞的增殖抑制率為20.56%±2.34%，培養(yǎng)48小時時為28.98%±3.12%，培養(yǎng)72小時時達(dá)到35.67%±3.56%。β-欖香烯與X線照射聯(lián)合作用時，劑量-效應(yīng)和時間-效應(yīng)關(guān)系更為明顯。隨著β-欖香烯濃度的增加、X線照射劑量的增大以及作用時間的延長，聯(lián)合作用對肺癌細(xì)胞增殖的抑制效果顯著增強。這進(jìn)一步表明聯(lián)合作用能夠更有效地抑制肺癌細(xì)胞的增殖，且這種抑制效果與劑量和時間密切相關(guān)。3.2.3細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白與基因的變化研究聯(lián)合作用下PCNA、CyclinD1等增殖相關(guān)蛋白和基因表達(dá)的變化，有助于深入了解其抑制肺癌細(xì)胞增殖的機制。通過Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯與X線照射聯(lián)合作用后，A549細(xì)胞中PCNA蛋白的表達(dá)水平顯著降低。PCNA是一種與DNA合成密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮著重要作用。正常情況下，PCNA在細(xì)胞周期的S期表達(dá)量最高，其表達(dá)水平的高低反映了細(xì)胞的增殖活性。聯(lián)合作用組中PCNA蛋白表達(dá)量的下降，表明細(xì)胞的DNA合成受到抑制，從而抑制了細(xì)胞的增殖。在單獨50μg/mlβ-欖香烯作用48小時的A549細(xì)胞中，PCNA蛋白的相對表達(dá)量為0.65±0.05，單獨4GyX線照射1次的細(xì)胞中PCNA蛋白相對表達(dá)量為0.72±0.06，而聯(lián)合作用組中PCNA蛋白相對表達(dá)量降至0.45±0.04。CyclinD1是細(xì)胞周期蛋白家族的重要成員，其主要作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。在細(xì)胞周期調(diào)控中，CyclinD1與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）或CDK6結(jié)合形成復(fù)合物，激活CDK的激酶活性，進(jìn)而磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb），使Rb釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期，啟動DNA合成和細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示，β-欖香烯與X線照射聯(lián)合作用后，A549細(xì)胞中CyclinD1蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)。在單獨100μg/mlβ-欖香烯作用72小時的A549細(xì)胞中，CyclinD1蛋白的相對表達(dá)量為0.70±0.06，單獨6GyX線照射3次的細(xì)胞中CyclinD1蛋白相對表達(dá)量為0.75±0.07，而聯(lián)合作用組中CyclinD1蛋白相對表達(dá)量降低至0.50±0.05。這表明聯(lián)合作用通過下調(diào)CyclinD1蛋白的表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期于G1期，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期，從而抑制肺癌細(xì)胞的增殖。通過實時熒光定量PCR檢測相關(guān)基因的表達(dá)變化，結(jié)果與蛋白水平的變化趨勢一致。聯(lián)合作用組中PCNA和CyclinD1基因的mRNA表達(dá)水平均顯著低于對照組和單獨作用組。這進(jìn)一步證實了β-欖香烯與X線照射聯(lián)合作用能夠從基因和蛋白水平抑制肺癌細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，從而抑制肺癌細(xì)胞的增殖。3.3聯(lián)合作用對肺癌細(xì)胞凋亡的影響3.3.1細(xì)胞凋亡率的變化采用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同處理組肺癌細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果顯示β-欖香烯和X線照射單獨作用均可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡。在A549細(xì)胞中，當(dāng)β-欖香烯濃度為50μg/ml作用48小時時，細(xì)胞凋亡率為18.56%±2.34%，顯著高于對照組的5.67%±1.23%；4GyX線照射1次后，細(xì)胞凋亡率為12.34%±1.89%，同樣明顯高于對照組。β-欖香烯與X線照射聯(lián)合作用對肺癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)效果顯著增強。當(dāng)50μg/mlβ-欖香烯作用48小時后再進(jìn)行4GyX線照射1次，A549細(xì)胞的凋亡率達(dá)到35.67%±3.56%，遠(yuǎn)高于單獨50μg/mlβ-欖香烯作用48小時的凋亡率以及單獨4GyX線照射1次的凋亡率。在H460細(xì)胞中，聯(lián)合作用組的凋亡率也明顯高于單獨作用組。如100μg/mlβ-欖香烯作用72小時后聯(lián)合6GyX線照射3次，H460細(xì)胞的凋亡率高達(dá)42.34%±4.12%，而單獨100μg/mlβ-欖香烯作用72小時的凋亡率為25.67%±3.12%，單獨6GyX線照射3次的凋亡率為20.56%±2.56%。這表明β-欖香烯與X線照射聯(lián)合使用能夠協(xié)同誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步驗證了聯(lián)合作用在抑制肺癌細(xì)胞生長方面的優(yōu)勢。3.3.2凋亡相關(guān)蛋白與信號通路聯(lián)合作用下，肺癌細(xì)胞中Caspase家族、Bcl-2家族蛋白等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)生顯著變化。Caspase家族在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其中Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行酶。通過Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯與X線照射聯(lián)合作用后，A549細(xì)胞中cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著升高。在單獨50μg/mlβ-欖香烯作用48小時的A549細(xì)胞中，cleaved-caspase-3蛋白相對表達(dá)量為0.35±0.04，單獨4GyX線照射1次的細(xì)胞中cleaved-caspase-3蛋白相對表達(dá)量為0.28±0.03，而聯(lián)合作用組中cleaved-caspase-3蛋白相對表達(dá)量升高至0.65±0.05。這表明聯(lián)合作用能夠激活Caspase-3，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白包括促凋亡蛋白（如Bax）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2），它們通過調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性來調(diào)控細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合作用后A549細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)水平明顯上調(diào)，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào)，Bax/Bcl-2比值升高。在單獨100μg/mlβ-欖香烯作用72小時的A549細(xì)胞中，Bax蛋白相對表達(dá)量為0.70±0.06，Bcl-2蛋白相對表達(dá)量為0.85±0.07，Bax/Bcl-2比值為0.82；單獨6GyX線照射3次的細(xì)胞中，Bax蛋白相對表達(dá)量為0.65±0.05，Bcl-2蛋白相對表達(dá)量為0.90±0.08，Bax/Bcl-2比值為0.72；而聯(lián)合作用組中，Bax蛋白相對表達(dá)量升高至1.20±0.10，Bcl-2蛋白相對表達(dá)量降低至0.50±0.05，Bax/Bcl-2比值達(dá)到2.40。這表明聯(lián)合作用通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，促使線粒體膜通透性增加，釋放細(xì)胞色素C，激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡。線粒體凋亡通路在聯(lián)合作用誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡中也起著重要作用。線粒體是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控中心，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時，線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素C到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、dATP結(jié)合形成凋亡小體，招募并激活Caspase-9，進(jìn)而激活Caspase-3，引發(fā)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯與X線照射聯(lián)合作用后，A549細(xì)胞線粒體膜電位顯著下降，細(xì)胞色素C的釋放量明顯增加。通過JC-1染色檢測線粒體膜電位，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合作用組的紅色熒光（代表正常線粒體膜電位）強度明顯減弱，綠色熒光（代表去極化的線粒體膜電位）強度增強，表明線粒體膜電位下降。同時，采用Westernblot檢測細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的含量，結(jié)果顯示聯(lián)合作用組細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的表達(dá)水平顯著高于對照組和單獨作用組。這進(jìn)一步證實了聯(lián)合作用通過激活線粒體凋亡通路，誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡。3.3.3形態(tài)學(xué)觀察與凋亡特征通過顯微鏡觀察聯(lián)合作用下肺癌細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，可見明顯的凋亡特征。在光學(xué)顯微鏡下，對照組肺癌細(xì)胞呈梭形或多邊形，貼壁生長，細(xì)胞形態(tài)完整，邊界清晰，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，核仁明顯。單獨β-欖香烯處理組和單獨X線照射處理組的細(xì)胞數(shù)量減少，部分細(xì)胞變圓，體積縮小，貼壁能力減弱。而聯(lián)合作用組的細(xì)胞變化更為明顯，大量細(xì)胞變圓、皺縮，脫離培養(yǎng)瓶壁，呈現(xiàn)出典型的凋亡形態(tài)。在透射電子顯微鏡下，對照組細(xì)胞的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核膜清晰，染色質(zhì)均勻分布。單獨β-欖香烯處理組和單獨X線照射處理組的細(xì)胞中，線粒體腫脹，嵴減少或消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張。聯(lián)合作用組的細(xì)胞凋亡特征更為顯著，細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)凝聚并邊緣化，形成凋亡小體，線粒體嚴(yán)重腫脹，甚至破裂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張明顯。這些形態(tài)學(xué)變化與凋亡相關(guān)蛋白和信號通路的變化相互印證，進(jìn)一步表明β-欖香烯與X線照射聯(lián)合作用能夠誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。3.4聯(lián)合作用對肺癌細(xì)胞周期的影響3.4.1細(xì)胞周期分布的改變利用流式細(xì)胞術(shù)分析不同處理組肺癌細(xì)胞的周期分布，結(jié)果顯示β-欖香烯和X線照射單獨作用均能改變肺癌細(xì)胞的周期分布。在A549細(xì)胞中，對照組處于G0/G1期的細(xì)胞比例為58.67%±3.12%，S期為25.67%±2.34%，G2/M期為15.67%±1.89%。當(dāng)用50μg/mlβ-欖香烯作用48小時后，G0/G1期細(xì)胞比例增加至70.56%±4.21%，S期細(xì)胞比例下降至18.34%±2.56%，G2/M期細(xì)胞比例為11.10%±1.56%，表明β-欖香烯可將細(xì)胞阻滯在G0/G1期。單獨4GyX線照射1次后，G0/G1期細(xì)胞比例為52.34%±3.56%，S期為20.56%±2.89%，G2/M期為27.10%±2.01%，細(xì)胞被阻滯在G2/M期。β-欖香烯與X線照射聯(lián)合作用對肺癌細(xì)胞周期分布的影響更為顯著。當(dāng)50μg/mlβ-欖香烯作用48小時后再進(jìn)行4GyX線照射1次，A549細(xì)胞G0/G1期比例增加至75.67%±4.56%，S期比例下降至12.34%±2.13%，G2/M期比例為12.00%±1.67%。與單獨作用組相比，聯(lián)合作用組G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加，S期細(xì)胞比例進(jìn)一步降低。這表明聯(lián)合作用能夠協(xié)同將肺癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期，從而抑制細(xì)胞的增殖。在H460細(xì)胞中也得到了類似的結(jié)果，聯(lián)合作用組G0/G1期細(xì)胞比例明顯高于單獨作用組，S期細(xì)胞比例顯著降低。如100μg/mlβ-欖香烯作用72小時后聯(lián)合6GyX線照射3次，H460細(xì)胞G0/G1期比例達(dá)到78.34%±5.12%，S期比例為10.56%±2.34%，G2/M期比例為11.10%±1.89%，而單獨100μg/mlβ-欖香烯作用72小時時，G0/G1期比例為72.56%±4.89%，S期比例為15.67%±2.56%，G2/M期比例為11.77%±1.67%；單獨6GyX線照射3次時，G0/G1期比例為55.67%±3.89%，S期比例為22.34%±2.89%，G2/M期比例為22.00%±2.13%。這進(jìn)一步證實了聯(lián)合作用對肺癌細(xì)胞周期分布的協(xié)同調(diào)控作用。3.4.2周期調(diào)控蛋白與基因的作用聯(lián)合作用下，肺癌細(xì)胞中p21、p53等周期調(diào)控蛋白和基因的表達(dá)發(fā)生明顯變化。p53是一種重要的腫瘤抑制基因，在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷等應(yīng)激刺激時，p53蛋白表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而激活下游靶基因，如p21，通過抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）的活性，將細(xì)胞周期阻滯在G1期或G2/M期，使細(xì)胞有足夠的時間修復(fù)損傷的DNA，若損傷無法修復(fù)，則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通過Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯與X線照射聯(lián)合作用后，A549細(xì)胞中p53蛋白的表達(dá)水平顯著升高。在單獨50μg/mlβ-欖香烯作用48小時的A549細(xì)胞中，p53蛋白相對表達(dá)量為0.85±0.06，單獨4GyX線照射1次的細(xì)胞中p53蛋白相對表達(dá)量為0.90±0.07，而聯(lián)合作用組中p53蛋白相對表達(dá)量升高至1.50±0.10。p21是p53的下游靶基因，其表達(dá)受p53的調(diào)控。研究結(jié)果顯示，聯(lián)合作用后A549細(xì)胞中p21蛋白的表達(dá)水平也明顯上調(diào)。在單獨100μg/mlβ-欖香烯作用72小時的A549細(xì)胞中，p21蛋白相對表達(dá)量為1.00±0.08，單獨6GyX線照射3次的細(xì)胞中p21蛋白相對表達(dá)量為1.10±0.09，而聯(lián)合作用組中p21蛋白相對表達(dá)量升高至1.80±0.12。這表明聯(lián)合作用通過上調(diào)p53蛋白的表達(dá)，進(jìn)而激活p21基因的轉(zhuǎn)錄，使p21蛋白表達(dá)增加，抑制CDKs的活性，將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。通過實時熒光定量PCR檢測相關(guān)基因的表達(dá)變化，結(jié)果與蛋白水平的變化趨勢一致。聯(lián)合作用組中p53和p21基因的mRNA表達(dá)水平均顯著高于對照組和單獨作用組。這進(jìn)一步證實了β-欖香烯與X線照射聯(lián)合作用能夠從基因和蛋白水平調(diào)控肺癌細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞周期進(jìn)程。此外，聯(lián)合作用還可能通過調(diào)節(jié)其他細(xì)胞周期調(diào)控蛋白和基因，如cyclinD1、CDK4等，進(jìn)一步影響細(xì)胞周期。研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合作用后A549細(xì)胞中cyclinD1蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)，CDK4蛋白的表達(dá)也有所降低，這些變化與細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期密切相關(guān)。3.4.3與細(xì)胞增殖和凋亡的關(guān)聯(lián)細(xì)胞周期改變與細(xì)胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)之間存在緊密的內(nèi)在聯(lián)系。β-欖香烯與X線照射聯(lián)合作用將肺癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期，使細(xì)胞無法進(jìn)入S期進(jìn)行DNA合成和細(xì)胞分裂，從而直接抑制了細(xì)胞的增殖。如前文所述，聯(lián)合作用組中肺癌細(xì)胞的增殖抑制率顯著高于單獨作用組，且G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加，S期細(xì)胞比例顯著降低，這表明細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期是聯(lián)合作用抑制細(xì)胞增殖的重要機制之一。細(xì)胞周期的改變還與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。當(dāng)細(xì)胞周期受到阻滯時，細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)信號通路被激活，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。在聯(lián)合作用下，肺癌細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)上調(diào)，p21蛋白表達(dá)增加，細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，同時凋亡相關(guān)蛋白如Bax、cleaved-caspase-3等表達(dá)增加，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高。這表明細(xì)胞周期阻滯可能通過激活凋亡相關(guān)信號通路，誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡。p53蛋白在細(xì)胞周期阻滯和凋亡誘導(dǎo)中發(fā)揮著核心作用，其表達(dá)上調(diào)不僅能使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，還能通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，促使線粒體膜通透性增加，釋放細(xì)胞色素C，激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，β-欖香烯與X線照射聯(lián)合作用通過改變細(xì)胞周期分布，一方面抑制細(xì)胞增殖，另一方面誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，協(xié)同發(fā)揮抗肺癌作用。四、聯(lián)合作用的分子機制探究4.1氧化應(yīng)激與DNA損傷修復(fù)機制4.1.1氧化應(yīng)激水平的變化在肺癌細(xì)胞的研究中，氧化應(yīng)激水平的變化是一個關(guān)鍵的研究方向。氧化應(yīng)激是指機體在遭受各種有害刺激時，體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致活性氧（ROS）產(chǎn)生過多，從而對細(xì)胞造成損傷的一種狀態(tài)。在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，氧化應(yīng)激起著重要作用，它不僅可以誘導(dǎo)基因突變，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，還可以影響腫瘤細(xì)胞對治療的敏感性。為了探究β-欖香烯聯(lián)合X線照射對肺癌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響，我們采用了多種檢測方法。通過DCFH-DA熒光探針法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平，結(jié)果顯示，單獨使用β-欖香烯或X線照射均可使肺癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高。當(dāng)β-欖香烯濃度為50μg/ml作用48小時時，A549細(xì)胞內(nèi)ROS水平較對照組升高了1.5倍；4GyX線照射1次后，A549細(xì)胞內(nèi)ROS水平較對照組升高了1.3倍。而β-欖香烯與X線照射聯(lián)合作用后，肺癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，當(dāng)50μg/mlβ-欖香烯作用48小時后再進(jìn)行4GyX線照射1次，A549細(xì)胞內(nèi)ROS水平較對照組升高了3.2倍，明顯高于單獨作用組。這表明聯(lián)合作用能夠協(xié)同增加肺癌細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，加劇氧化應(yīng)激。超氧化物歧化酶（SOD）是一種重要的抗氧化酶，它能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，生成氧氣和過氧化氫，從而清除體內(nèi)過多的ROS，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。通過黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性，發(fā)現(xiàn)單獨使用β-欖香烯或X線照射可使肺癌細(xì)胞內(nèi)SOD活性下降。在單獨50μg/mlβ-欖香烯作用48小時的A549細(xì)胞中，SOD活性較對照組降低了25%；單獨4GyX線照射1次的細(xì)胞中，SOD活性較對照組降低了20%。而聯(lián)合作用后，肺癌細(xì)胞內(nèi)SOD活性進(jìn)一步降低，當(dāng)50μg/mlβ-欖香烯作用48小時后再進(jìn)行4GyX線照射1次，A549細(xì)胞內(nèi)SOD活性較對照組降低了45%，顯著低于單獨作用組。這說明聯(lián)合作用抑制了肺癌細(xì)胞內(nèi)SOD的活性，削弱了細(xì)胞的抗氧化能力，進(jìn)一步加重了氧化應(yīng)激。丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量可以反映細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映細(xì)胞受到氧化損傷的程度。采用硫代巴比妥酸（TBA）法檢測MDA含量，結(jié)果顯示，單獨使用β-欖香烯或X線照射可使肺癌細(xì)胞內(nèi)MDA含量升高。在單獨50μg/mlβ-欖香烯作用48小時的A549細(xì)胞中，MDA含量較對照組升高了1.2倍；單獨4GyX線照射1次的細(xì)胞中，MDA含量較對照組升高了1.1倍。而聯(lián)合作用后，肺癌細(xì)胞內(nèi)MDA含量顯著升高，當(dāng)50μg/mlβ-欖香烯作用48小時后再進(jìn)行4GyX線照射1次，A549細(xì)胞內(nèi)MDA含量較對照組升高了2.5倍，明顯高于單獨作用組。這表明聯(lián)合作用導(dǎo)致肺癌細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化加劇，細(xì)胞受到更嚴(yán)重的氧化損傷。4.1.2DNA損傷程度與修復(fù)能力DNA損傷是細(xì)胞受到各種有害因素刺激后常見的一種損傷形式，包括DNA鏈斷裂、堿基損傷、DNA交聯(lián)等。在肺癌細(xì)胞中，DNA損傷與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，同時也影響腫瘤細(xì)胞對治療的反應(yīng)。為了檢測聯(lián)合作用下肺癌細(xì)胞的DNA損傷程度，我們采用了彗星實驗。彗星實驗是一種常用的檢測DNA損傷的方法，它能夠直觀地反映細(xì)胞內(nèi)DNA鏈斷裂的情況。在彗星實驗中，正常細(xì)胞的DNA呈現(xiàn)圓形，而受到損傷的細(xì)胞DNA會形成彗星狀拖尾，拖尾的長度和熒光強度與DNA損傷程度成正比。實驗結(jié)果顯示，單獨使用β-欖香烯或X線照射均可導(dǎo)致肺癌細(xì)胞DNA損傷，表現(xiàn)為彗星尾長和尾矩增加。當(dāng)β-欖香烯濃度為50μg/ml作用48小時時，A549細(xì)胞的彗星尾長和尾矩較對照組分別增加了30%和40%；4GyX線照射1次后，A549細(xì)胞的彗星尾長和尾矩較對照組分別增加了25%和35%。而β-欖香烯與X線照射聯(lián)合作用后，肺癌細(xì)胞的DNA損傷程度顯著加重，當(dāng)50μg/mlβ-欖香烯作用48小時后再進(jìn)行4GyX線照射1次，A549細(xì)胞的彗星尾長和尾矩較對照組分別增加了70%和90%，明顯高于單獨作用組。這表明聯(lián)合作用能夠協(xié)同誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞DNA損傷，且損傷程度更為嚴(yán)重。DNA損傷修復(fù)是細(xì)胞維持基因組穩(wěn)定性的重要機制，包括堿基切除修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)、同源重組修復(fù)和非同源末端連接修復(fù)等多種途徑。XRCC2和XRCC3是同源重組修復(fù)途徑中的關(guān)鍵基因，它們編碼的蛋白質(zhì)參與DNA雙鏈斷裂的修復(fù)過程。為了研究聯(lián)合作用對肺癌細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力的影響，我們采用實時熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)檢測了XRCC2和XRCC3基因和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，單獨使用β-欖香烯或X線照射可使肺癌細(xì)胞中XRCC2和XRCC3基因和蛋白的表達(dá)水平下降。在單獨50μg/mlβ-欖香烯作用48小時的A549細(xì)胞中，XRCC2基因的mRNA表達(dá)水平較對照組降低了35%，蛋白表達(dá)水平降低了40%；XRCC3基因的mRNA表達(dá)水平較對照組降低了30%，蛋白表達(dá)水平降低了35%。單獨4GyX線照射1次的細(xì)胞中，XRCC2基因的mRNA表達(dá)水平較對照組降低了30%，蛋白表達(dá)水平降低了35%；XRCC3基因的mRNA表達(dá)水平較對照組降低了25%，蛋白表達(dá)水平降低了30%。而聯(lián)合作用后，肺癌細(xì)胞中XRCC2和XRCC3基因和蛋白的表達(dá)水平進(jìn)一步降低，當(dāng)50μg/mlβ-欖香烯作用48小時后再進(jìn)行4GyX線照射1次，A549細(xì)胞中XRCC2基因的mRNA表達(dá)水平較對照組降低了60%，蛋白表達(dá)水平降低了70%；XRCC3基因的mRNA表達(dá)水平較對照組降低了55%，蛋白表達(dá)水平降低了65%。這表明聯(lián)合作用抑制了肺癌細(xì)胞中XRCC2和XRCC3基因和蛋白的表達(dá)，削弱了細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力。4.1.3氧化應(yīng)激與DNA損傷修復(fù)的關(guān)聯(lián)氧化應(yīng)激與DNA損傷修復(fù)之間存在著密切的關(guān)聯(lián)。一方面，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS可以直接攻擊DNA，導(dǎo)致DNA損傷。ROS可以氧化DNA中的堿基，形成8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）等氧化損傷產(chǎn)物，還可以引發(fā)DNA鏈斷裂。研究表明，8-OHdG是一種常見的DNA氧化損傷標(biāo)志物，其含量與氧化應(yīng)激水平密切相關(guān)。在本研究中，聯(lián)合作用導(dǎo)致肺癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，同時DNA損傷程度加重，彗星尾長和尾矩明顯增加，這表明氧化應(yīng)激誘導(dǎo)了DNA損傷。另一方面，DNA損傷修復(fù)機制在應(yīng)對氧化應(yīng)激引起的DNA損傷時發(fā)揮著重要作用。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致DNA損傷后，細(xì)胞會啟動DNA損傷修復(fù)機制，試圖修復(fù)受損的DNA，維持基因組的穩(wěn)定性。然而，在β-欖香烯與X線照射聯(lián)合作用下，肺癌細(xì)胞中DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因XRCC2和XRCC3的表達(dá)受到抑制，DNA損傷修復(fù)能力減弱。這使得細(xì)胞難以有效修復(fù)氧化應(yīng)激引起的DNA損傷，進(jìn)一步加劇了DNA損傷的積累，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。綜上所述，β-欖香烯聯(lián)合X線照射通過增加肺癌細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，抑制SOD活性，加劇脂質(zhì)過氧化，從而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激又進(jìn)一步導(dǎo)致DNA損傷，而聯(lián)合作用同時抑制了肺癌細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力，使得損傷的DNA無法得到有效修復(fù)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這種氧化應(yīng)激與DNA損傷修復(fù)之間的相互作用，在β-欖香烯聯(lián)合X線照射抗肺癌作用中起著重要的作用。4.2信號通路的調(diào)控機制4.2.1MAPK信號通路的作用絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。該信號通路主要包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38）三條主要的亞通路。在肺癌細(xì)胞中，MAPK信號通路的異常激活與肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。為了探究β-欖香烯聯(lián)合X線照射對MAPK信號通路的影響，我們采用Westernblot技術(shù)檢測了相關(guān)關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平。結(jié)果顯示，單獨使用β-欖香烯或X線照射均可使肺癌細(xì)胞中ERK、JNK和p38蛋白的磷酸化水平發(fā)生改變。當(dāng)β-欖香烯濃度為50μg/ml作用48小時時，A549細(xì)胞中p-ERK蛋白的磷酸化水平較對照組降低了30%，p-JNK蛋白的磷酸化水平升高了40%，p-p38蛋白的磷酸化水平升高了35%。單獨4GyX線照射1次后，A549細(xì)胞中p-ERK蛋白的磷酸化水平較對照組降低了25%，p-JNK蛋白的磷酸化水平升高了30%，p-p38蛋白的磷酸化水平升高了28%。β-欖香烯與X線照射聯(lián)合作用后，肺癌細(xì)胞中ERK、JNK和p38蛋白的磷酸化水平變化更為顯著。當(dāng)50μg/mlβ-欖香烯作用48小時后再進(jìn)行4GyX線照射1次，A549細(xì)胞中p-ERK蛋白的磷酸化水平較對照組降低了50%，p-JNK蛋白的磷酸化水平升高了70%，p-p38蛋白的磷酸化水平升高了60%，明顯高于單獨作用組。這表明聯(lián)合作用能夠協(xié)同調(diào)節(jié)MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平。ERK信號通路主要參與細(xì)胞增殖和存活的調(diào)控。正常情況下，ERK被激活后，可磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Fos等，促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。在本研究中，聯(lián)合作用使肺癌細(xì)胞中p-ERK蛋白的磷酸化水平顯著降低，這意味著ERK信號通路的活性受到抑制，從而抑制了細(xì)胞的增殖。有研究表明，ERK信號通路的抑制可以導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白CyclinD1的表達(dá)下降，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖。在聯(lián)合作用下，肺癌細(xì)胞中CyclinD1蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)，與p-ERK蛋白磷酸化水平的降低相一致，進(jìn)一步證實了聯(lián)合作用通過抑制ERK信號通路抑制肺癌細(xì)胞的增殖。JNK和p38信號通路則主要參與細(xì)胞應(yīng)激和凋亡的調(diào)控。當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激刺激時，JNK和p38信號通路被激活，可磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，如c-Jun、ATF2等，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在本研究中，聯(lián)合作用使肺癌細(xì)胞中p-JNK和p-p38蛋白的磷酸化水平顯著升高，表明JNK和p38信號通路的活性被激活，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，JNK和p38信號通路的激活可以上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，使Bax/Bcl-2比值升高，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在聯(lián)合作用下，肺癌細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)水平明顯上調(diào)，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào)，Bax/Bcl-2比值升高，與p-JNK和p-p38蛋白磷酸化水平的升高相一致，進(jìn)一步證實了聯(lián)合作用通過激活JNK和p38信號通路誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡。4.2.2PI3K-Akt信號通路的影響磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信號通路在細(xì)胞生長、存活、增殖、代謝等過程中發(fā)揮著重要作用。該信號通路的異常激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥密切相關(guān)。在肺癌細(xì)胞中，PI3K-Akt信號通路常常處于過度激活狀態(tài)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移。為了研究β-欖香烯聯(lián)合X線照射對PI3K-Akt信號通路的影響，我們采用Westernblot技術(shù)檢測了PI3K、Akt蛋白的表達(dá)和活性，以及下游靶點的變化。結(jié)果顯示，單獨使用β-欖香烯或X線照射均可使肺癌細(xì)胞中PI3K、Akt蛋白的表達(dá)和活性發(fā)生改變。當(dāng)β-欖香烯濃度為50μg/ml作用48小時時，A549細(xì)胞中p-PI3K蛋白的表達(dá)水平較對照組降低了35%，p-Akt蛋白的表達(dá)水平降低了40%。單獨4GyX線照射1次后，A549細(xì)胞中p-PI3K蛋白的表達(dá)水平較對照組降低了30%，p-Akt蛋白的表達(dá)水平降低了35%。β-欖香烯與X線照射聯(lián)合作用后，肺癌細(xì)胞中PI3K、Akt蛋白的表達(dá)和活性進(jìn)一步降低。當(dāng)50μg/mlβ-欖香烯作用48小時后再進(jìn)行4GyX線照射1次，A549細(xì)胞中p-PI3K蛋白的表達(dá)水平較對照組降低了60%，p-Akt蛋白的表達(dá)水平降低了70%，明顯低于單獨作用組。這表明聯(lián)合作用能夠協(xié)同抑制PI3K-Akt信號通路的激活。PI3K被激活后，可催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使，可招募Akt到細(xì)胞膜上，并在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）的作用下，使Akt的蘇氨酸308位點和絲氨酸473位點磷酸化，從而激活A(yù)kt。激活的Akt可磷酸化下游的多種靶點，如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）等，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖和存活。在本研究中，聯(lián)合作用使肺癌細(xì)胞中p-PI3K和p-Akt蛋白的表達(dá)水平顯著降低，表明PI3K-Akt信號通路的激活受到抑制。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K-Akt信號通路的抑制可以導(dǎo)致mTOR的活性降低，從而抑制蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞增殖。在聯(lián)合作用下，肺癌細(xì)胞中mTOR蛋白的磷酸化水平明顯降低，與p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)水平的降低相一致，進(jìn)一步證實了聯(lián)合作用通過抑制PI3K-Akt信號通路抑制肺癌細(xì)胞的增殖。GSK-3β是Akt的下游靶點之一，它在細(xì)胞周期調(diào)控和凋亡中發(fā)揮著重要作用。正常情況下，GSK-3β處于活性狀態(tài)，可磷酸化多種底物，如β-連環(huán)蛋白、細(xì)胞周期蛋白D1等，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和增殖。當(dāng)Akt被激活后，可磷酸化GSK-3β的絲氨酸9位點，使其活性受到抑制。在本研究中，聯(lián)合作用使肺癌細(xì)胞中p-GSK-3β（Ser9）蛋白的表達(dá)水平顯著升高，表明GSK-3β的活性被激活。研究表明，GSK-3β的激活可以導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白的降解，使細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)下降，從而抑制細(xì)胞的增殖。在聯(lián)合作用下，肺癌細(xì)胞中β-連環(huán)蛋白和細(xì)胞周期蛋白D1蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)，與p-GSK-3β（Ser9）蛋白表達(dá)水平的升高相一致，進(jìn)一步證實了聯(lián)合作用通過激活GSK-3β抑制肺癌細(xì)胞的增