Ⅰ型鴨肝炎病毒E53株在鴨胚成纖維細胞上的適應性研究摘要本研究旨在探究Ⅰ型鴨肝炎病毒E53株在鴨胚成纖維細胞上的適應性。通過將DHV-E53雞胚致弱株接種于鴨胚成纖維細胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)。結果顯示，傳代至第16代時出現(xiàn)明顯細胞病變，第21代時細胞病變呈現(xiàn)規(guī)律性，接毒后72h細胞病變達到80％，病變特征為細胞間隙增寬、細胞崩解死亡、脫落。經(jīng)RT-PCR鑒定各代次均能得到目的條帶，表明該病毒株可在鴨胚成纖維細胞上增殖。間接免疫熒光法（IFA）鑒定顯示接種DHV-ED16株的鴨胚成纖維細胞有明顯特異性綠色熒光，證實病毒能夠感染細胞。遺傳特性分析發(fā)現(xiàn)，DHV-ED16和DHV-ED30的VP1基因與參考序列核苷酸、氨基酸均無差異，VP0、VP3基因與參考序列核苷酸、氨基酸同源性均在99％以上。安全性試驗表明，接種DHV-ED16細胞適應株的雛鴨生長良好，剖檢未見異常；免疫DHV-ED16弱毒株和親本毒DHV-E53株雞胚尿囊液的成年母鴨抗體水平上升，第5周達最高峰后緩慢下降，DHV-ED16株免疫組抗體水平略低于親本毒免疫組，但無明顯差異。本研究為深入了解Ⅰ型鴨肝炎病毒的生物學特性及防控提供了重要依據(jù)。關鍵詞Ⅰ型鴨肝炎病毒；鴨胚成纖維細胞；適應性；細胞病變；遺傳特性一、引言鴨病毒性肝炎（DuckViralHepatitis，DVH）是嚴重危害雛鴨的一種高度致死性急性傳染病，其主要特征為肝臟炎癥，對養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。鴨肝炎病毒（DuckHepatitisVirus，DHV）作為該病的病原體，其中Ⅰ型鴨肝炎病毒因其較強的致病性受到廣泛關注。深入研究Ⅰ型鴨肝炎病毒在細胞水平的感染機制和適應性，對于揭示其致病機理、開發(fā)有效的防控措施具有重要意義。鴨胚成纖維細胞是研究鴨肝炎病毒常用的細胞模型，本研究旨在探究Ⅰ型鴨肝炎病毒E53株在鴨胚成纖維細胞上的適應性，為后續(xù)相關研究奠定基礎。二、材料與方法2.1材料2.1.1病毒與細胞Ⅰ型鴨肝炎病毒E53雞胚致弱株（DHV-E53）由本實驗室保存。鴨胚購自健康種鴨場，用于制備鴨胚成纖維細胞。2.1.2主要試劑DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗、TRIzol試劑、逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒、熒光素標記的二抗等均購自正規(guī)生物試劑公司。2.2方法2.2.1鴨胚成纖維細胞的制備取9-11日齡鴨胚，無菌操作取出胚胎，去除頭、四肢及內(nèi)臟，用PBS沖洗干凈。將胚胎組織剪碎至1mm3左右的小塊，加入0.25%胰蛋白酶溶液，37℃消化15-20min，期間輕輕振蕩。待組織塊分散后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打，使細胞充分分散，然后將細胞懸液經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，收集濾液于離心管中，1000r/min離心5min，棄上清。用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為1×10?個/mL，接種于細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長至80%-90%融合時，用0.25%胰蛋白酶溶液消化傳代。2.2.2病毒接種與傳代將DHV-E53雞胚致弱株接種于生長良好的鴨胚成纖維細胞，接種量為細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基體積的1%。接種后，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中吸附1h，期間每隔15min輕輕搖動培養(yǎng)瓶。吸附結束后，棄去接種液，用PBS沖洗細胞3次，加入含2%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM維持培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察細胞病變情況，當細胞病變達到75%-80%時，收集細胞培養(yǎng)物，反復凍融3次，12000r/min離心10min，取上清作為第一代病毒液。將第一代病毒液以同樣的方法接種于新的鴨胚成纖維細胞，進行連續(xù)傳代培養(yǎng)。2.2.3RT-PCR鑒定按照TRIzol試劑說明書提取各代次病毒感染細胞后的總RNA。以提取的RNA為模板，利用逆轉錄試劑盒合成cDNA。根據(jù)Ⅰ型鴨肝炎病毒的保守序列設計特異性引物，進行PCR擴增。PCR反應體系為25μL，包括10×PCRBuffer2.5μL，dNTPMix（2.5mmol/L）2μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，cDNA模板2μL，ddH?O16μL。PCR反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃終延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否出現(xiàn)目的條帶。2.2.4間接免疫熒光法（IFA）鑒定將接種DHV-ED16株的鴨胚成纖維細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞生長至50%-60%融合時，棄去培養(yǎng)基，用PBS沖洗細胞3次。用4%多聚甲醛固定細胞15min，PBS沖洗3次。加入0.1%TritonX-100破膜10min，PBS沖洗3次。用5%BSA封閉30min，棄去封閉液，不洗。加入Ⅰ型鴨肝炎病毒特異性一抗，4℃孵育過夜。PBS沖洗3次，每次5min。加入熒光素標記的二抗，37℃孵育1h。PBS沖洗3次，每次5min。用DAPI染核5min，PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)是否出現(xiàn)特異性綠色熒光。2.2.5適應株遺傳特性分析利用RT-PCR分別擴增DHV-ED16和DHV-ED30代的VP0、VP1及VP3基因。PCR反應體系和條件同2.2.3。擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后，送測序公司進行測序。將測序結果與參考序列進行比對，分析核苷酸和氨基酸的同源性。2.2.6安全性試驗選取10只1日齡健康雛鴨，隨機分為兩組，每組5只。試驗組每只雛鴨肌肉注射0.5mLDHV-ED16細胞適應株，對照組每只雛鴨肌肉注射0.5mL無菌PBS。觀察雛鴨的生長狀況，在接種后第7天對雛鴨進行剖檢，觀察各組織器官是否有病變。選取20只成年健康母鴨，隨機分為兩組，每組10只。免疫組每只母鴨肌肉注射0.5mLDHV-ED16弱毒株雞胚尿囊液，對照組每只母鴨肌肉注射0.5mLDHV-E53株雞胚尿囊液。分別在免疫后第1、2、3、4、5、6周采集母鴨血液，分離血清，用ELISA方法檢測抗體水平。三、結果3.1細胞病變觀察將DHV-E53雞胚致弱株接種于鴨胚成纖維細胞后，隨著傳代次數(shù)的增加，細胞病變逐漸明顯。在第16代時，可見部分細胞變圓、皺縮，細胞間隙增寬；隨著培養(yǎng)時間的延長，病變細胞數(shù)量逐漸增多，部分細胞開始崩解死亡、脫落。第21代時，細胞病變呈現(xiàn)規(guī)律性，接毒后24h，約20%的細胞出現(xiàn)病變；48h時，病變細胞達到50%左右；72h時，細胞病變達到80%，病變特征為細胞間隙明顯增寬，大量細胞崩解死亡、脫落，細胞單層出現(xiàn)大面積破壞（圖1）。[此處插入細胞病變圖片，圖片說明：圖1DHV-E53株在鴨胚成纖維細胞上的細胞病變，A為正常鴨胚成纖維細胞；B為接毒后24h細胞病變情況；C為接毒后48h細胞病變情況；D為接毒后72h細胞病變情況]3.2RT-PCR鑒定結果對各代次病毒感染細胞后的總RNA進行RT-PCR擴增，均得到與預期大小相符的目的條帶（圖2）。表明DHV-E53株能夠在鴨胚成纖維細胞上增殖，并穩(wěn)定存在。[此處插入RT-PCR鑒定結果圖片，圖片說明：圖2RT-PCR鑒定結果，M為DNAMarker；1-5為不同代次病毒感染細胞后的PCR擴增產(chǎn)物]3.3間接免疫熒光法（IFA）鑒定結果在熒光顯微鏡下觀察，接種DHV-ED16株的鴨胚成纖維細胞可見明顯的特異性綠色熒光，主要分布在細胞核周圍的細胞質中（圖3）。而未接種病毒的正常細胞未見綠色熒光。說明DHV-ED16株病毒能夠感染鴨胚成纖維細胞，并在細胞內(nèi)進行復制表達。[此處插入IFA鑒定結果圖片，圖片說明：圖3IFA鑒定結果，A為接種DHV-ED16株的鴨胚成纖維細胞，可見特異性綠色熒光；B為未接種病毒的正常鴨胚成纖維細胞，未見綠色熒光]3.4適應株遺傳特性分析結果對DHV-ED16和DHV-ED30代的VP0、VP1及VP3基因測序結果與參考序列比對顯示，DHV-ED16和DHV-ED30的VP1基因與參考序列之間核苷酸、氨基酸均無差異；DHV-ED16和DHV-ED30的VP0基因與參考序列核苷酸同源性分別為99.5%和99.2%，氨基酸同源性分別為99.1%和98.8%；DHV-ED16和DHV-ED30的VP3基因與參考序列核苷酸同源性分別為99.3%和99.0%，氨基酸同源性分別為99.0%和98.7%（表1）。表明在連續(xù)傳代過程中，該病毒株的主要結構蛋白基因相對穩(wěn)定。[此處插入遺傳特性分析結果表格，表格說明：表1DHV-ED16和DHV-ED30代VP0、VP1、VP3基因與參考序列同源性比較]3.5安全性試驗結果接種DHV-ED16細胞適應株的雛鴨在觀察期內(nèi)生長狀況良好，精神、采食、飲水均正常，未出現(xiàn)死亡情況。剖檢結果顯示，各組織器官（肝臟、脾臟、腎臟、心臟等）外觀及色澤正常，未見明顯病理變化。表明DHV-ED16細胞適應株對雛鴨具有較好的安全性。免疫DHV-ED16弱毒株和親本毒DHV-E53株雞胚尿囊液的成年母鴨抗體水平均不斷上升，并在第5周達到最高峰，隨后緩慢下降。其中，DHV-ED16株免疫組的抗體水平在各時間點均略低于親本毒DHV-E53株免疫組，但經(jīng)統(tǒng)計學分析，兩組之間無明顯差異（P>0.05）（圖4）。說明DHV-ED16弱毒株能夠刺激成年母鴨產(chǎn)生較好的免疫應答。[此處插入抗體水平檢測結果圖片，圖片說明：圖4成年母鴨免疫后抗體水平變化，A為DHV-ED16株免疫組；B為DHV-E53株免疫組]四、討論本研究成功將Ⅰ型鴨肝炎病毒E53雞胚致弱株適應于鴨胚成纖維細胞，并對其適應性進行了系統(tǒng)研究。通過連續(xù)傳代培養(yǎng)，觀察到隨著傳代次數(shù)的增加，細胞病變逐漸明顯且呈現(xiàn)規(guī)律性，這與其他相關病毒在細胞上的適應性變化相似。在病毒增殖鑒定方面，RT-PCR結果表明該病毒株能夠在鴨胚成纖維細胞上穩(wěn)定增殖，為后續(xù)研究病毒的生物學特性提供了材料基礎。間接免疫熒光法直觀地證實了病毒能夠感染鴨胚成纖維細胞，并在細胞內(nèi)表達特異性蛋白。遺傳特性分析顯示，在連續(xù)傳代過程中，病毒的主要結構蛋白基因VP1相對穩(wěn)定，VP0和VP3基因雖有少量變異，但同源性仍在99%以上，這表明該病毒株在鴨胚成纖維細胞上適應過程中遺傳特性相對穩(wěn)定，為進一步研究病毒的致病機制和疫苗研發(fā)提供了重要依據(jù)。安全性試驗結果令人滿意，接種DHV-ED16細胞適應株的雛鴨生長正常且剖檢無異常，免疫該弱毒株的成年母鴨能夠產(chǎn)生較好的免疫應答，抗體水平與親本毒免疫組無明顯差異。這提示DHV-ED16弱毒株具有潛在的應用價值，有望進一步開發(fā)為安全有效的疫苗用于鴨病毒性肝炎的防控。然而，本研究僅在實驗室條件下對病毒的適應性及相關特性進行了初步探究，后續(xù)還需要開展更多