基因工程操作中目的基因的獲取和基因表達(dá)載體的構(gòu)建都離不開限制性內(nèi)切核酸酶，只有選取合適的限制酶才能準(zhǔn)確切取目的基因，因此限制酶的選取是基因工程操作的重點(diǎn)也是難點(diǎn)，近年來較難的高考試題大都圍繞限制酶的選取進(jìn)行考查。PCR技術(shù)既可以用于獲取目的基因，又可以用于目的基因的檢測與鑒定，是基因工程中重要技術(shù)之一，其應(yīng)用較強(qiáng)，因此對(duì)PCR技術(shù)的考查也成為命題的熱點(diǎn)。深化提素養(yǎng)1.(2024·山東高考)制備熒光標(biāo)記的DNA探針時(shí),需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大腸桿菌DNA聚合酶、擴(kuò)增緩沖液、H2O和4種脫氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和堿基被熒光標(biāo)記的dATP)的反應(yīng)管①~④中,分別加入如表所示的適量單鏈DNA。已知形成的雙鏈DNA區(qū)遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,且在本實(shí)驗(yàn)的溫度條件下不能產(chǎn)生小于9個(gè)連續(xù)堿基對(duì)的雙鏈DNA區(qū)。能得到帶有熒光標(biāo)記的DNA探針的反應(yīng)管有 (

)A.①②

B.②③

C.①④

D.③④反應(yīng)管加入的單鏈DNA①5'?GCCGATCTTTATA?3'3'?GACCGGCTAGAAA?5'②5'?AGAGCCAATTGGC?3'③5'?ATTTCCCGATCCG?3'3'?AGGGCTAGGCATA?5'④5'?TTCACTGGCCAGT?3'解析:分析反應(yīng)管①~④中分別加入的適量單鏈DNA可知,①中兩條單鏈DNA分子之間具有互補(bǔ)的序列(10個(gè)連續(xù)堿基對(duì)),但雙鏈DNA區(qū)之外的3'端無模板,因此無法進(jìn)行DNA合成,不能得到帶有熒光標(biāo)記的DNA探針;②中單鏈DNA分子內(nèi)具有互補(bǔ)的序列,由于在本實(shí)驗(yàn)的溫度條件下不能產(chǎn)生小于9個(gè)連續(xù)堿基對(duì)的雙鏈DNA區(qū),故該條單鏈DNA分子不發(fā)生自身環(huán)化,但兩條鏈可以形成雙鏈DNA區(qū),由于DNA合成的序列(5'?TCT?3')中不含堿基A,不能得到帶有熒光標(biāo)記的DNA探針;③中兩條單鏈DNA分子之間具有互補(bǔ)的序列(10個(gè)連續(xù)堿基對(duì)),且雙鏈DNA區(qū)之外的5'端有凸出的堿基(含堿基T),因此進(jìn)行DNA合成能得到帶有熒光標(biāo)記的DNA探針;④中單鏈DNA分子內(nèi)具有自身互補(bǔ)的序列,結(jié)合題中信息知該條單鏈DNA分子不發(fā)生自身環(huán)化,兩條鏈可以形成雙鏈DNA區(qū),且雙鏈DNA區(qū)之外的5'端有凸出的堿基(含堿基T),因此進(jìn)行DNA合成能得到帶有熒光標(biāo)記的DNA探針。綜上,能得到帶有熒光標(biāo)記的DNA探針的反應(yīng)管有③④,故選D。答案：D

2.(2024·湖南高考改編)最早的雙脫氧測序法是PCR反應(yīng)體系中,分別再加入一種少量的雙脫氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP),子鏈延伸時(shí),雙脫氧核苷三磷酸也遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。以加入ddATP的體系為例:若配對(duì)的為ddATP,延伸終止;若配對(duì)的為原脫氧核苷三磷酸(dATP),繼續(xù)延伸;PCR產(chǎn)物變性后電泳檢測。通過該方法測序某疾病患者及對(duì)照個(gè)體的一段序列,結(jié)果如圖所示。下列敘述不正確的是 (

)A.上述PCR反應(yīng)體系中只加入一種引物B.電泳時(shí)產(chǎn)物的片段越小,遷移速率越慢C.5'?CTACCCGTGAT?3'為對(duì)照個(gè)體的一段序列D.患者該段序列中某位點(diǎn)的堿基C突變?yōu)門解析:利用雙脫氧測序法時(shí),PCR反應(yīng)體系中加入的模板是待測的單鏈DNA,故只需加入一種引物,A正確。電泳時(shí),產(chǎn)物的片段越大,遷移速率越慢,B錯(cuò)誤。依據(jù)題干信息中雙脫氧測序法的原理,可以確定每個(gè)泳道中條帶(DNA片段)的3'終端的堿基,如+ddATP的泳道中出現(xiàn)的條帶(DNA片段)的3'終端堿基就是A。另外由于每個(gè)片段的起始點(diǎn)相同,但終止點(diǎn)不同,可以通過比較片段的長度來確定DNA序列中每個(gè)位置上的堿基;圖示電泳方向?yàn)閺纳稀?即對(duì)應(yīng)的DNA片段為長→短,則對(duì)應(yīng)的DNA測序結(jié)果為3'→5',如對(duì)照個(gè)體的電泳結(jié)果最短的條帶為+ddCTP泳道組的條帶,則說明該DNA片段5'端第一個(gè)堿基為C。因此對(duì)照個(gè)體的測序結(jié)果為5'?CTACCCGTGAT?3',患者的測序結(jié)果為5'?CTACCTGTGAT?3',C正確。對(duì)比患者和對(duì)照個(gè)體的測序結(jié)果可知,患者該段序列中某位點(diǎn)的堿基C突變?yōu)門,D正確。答案：B

3.(2024·山東高考)研究發(fā)現(xiàn)基因L能夠通過脫落酸信號(hào)途徑調(diào)控大豆的逆境響應(yīng)。利用基因工程技術(shù)編輯基因L,可培育耐鹽堿大豆品系。在載體上的限制酶BsaⅠ切點(diǎn)處插入大豆基因L的向?qū)NA序列,將載體導(dǎo)入大豆細(xì)胞后,其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可引導(dǎo)核酸酶特異性結(jié)合基因組上的目標(biāo)序列并發(fā)揮作用。載體信息、目標(biāo)基因L部分序列及相關(guān)結(jié)果等如圖所示。(1)用PCR技術(shù)從大豆基因組DNA中擴(kuò)增目標(biāo)基因L時(shí),所用的引物越短,引物特異性越

(填“高”或“低”)。限制酶在切開DNA雙鏈時(shí),形成的單鏈突出末端為黏性末端,若用BsaⅠ酶切大豆基因組DNA,理論上可產(chǎn)生的黏性末端最多有

種。載體信息如圖甲所示,經(jīng)BsaⅠ酶切后,載體上保留的黏性末端序列應(yīng)為5'?

?3'和5'?

?3'。

(2)重組載體通過農(nóng)桿菌導(dǎo)入大豆細(xì)胞,使用抗生素

篩選到具有該抗生素抗性的植株①~④。為了鑒定基因編輯是否成功,以上述抗性植株的DNA為模板,通過PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因L,部分序列信息及可選用的酶切位點(diǎn)如圖乙所示,PCR產(chǎn)物完全酶切后的電泳結(jié)果如圖丙所示。據(jù)圖可判斷選用的限制酶是

,其中純合的突變植株是

(填序號(hào))。

(3)實(shí)驗(yàn)中獲得1株基因L成功突變的純合植株,該植株具有抗生素抗性,檢測發(fā)現(xiàn)其體細(xì)胞中只有1條染色體有T?DNA插入。用抗生素篩選這個(gè)植株的自交子代,其中突變位點(diǎn)純合且對(duì)抗生素敏感的植株所占比例為

,篩選出的敏感植株可用于后續(xù)的品種選育。

解析:(1)引物的長短會(huì)影響其在目標(biāo)DNA序列上的結(jié)合能力和特異性。引物過短可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增,即引物可能會(huì)結(jié)合到與目標(biāo)序列不完全匹配或無關(guān)的DNA上,進(jìn)而導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物的形成,影響PCR的特異性和準(zhǔn)確性。結(jié)合BsaⅠ識(shí)別序列可知,BsaⅠ酶切后產(chǎn)生的黏性末端含有4個(gè)堿基,故若用BsaⅠ酶切大豆基因組DNA,理論上可產(chǎn)生的黏性末端最多有4×4×4×4=44(種)。根據(jù)圖甲所示的載體信息,經(jīng)BsaⅠ酶切后,載體上保留的黏性末端序列應(yīng)為5'?GTTT?3'和5'?CAAT?3'。(2)根據(jù)圖甲可知,重組載體通過農(nóng)桿菌導(dǎo)入大豆細(xì)胞當(dāng)中的片段包含了卡那霉素抗性基因,因此可以通過使用卡那霉素篩選到具有該抗生素抗性的植株。根據(jù)圖乙、丙可知,目標(biāo)基因L的目標(biāo)序列跟突變序列之間的差異只有在SacⅠ酶切位點(diǎn)上存在差異,BamHⅠ和EcoRⅠ這兩個(gè)酶切位點(diǎn)完全相同,結(jié)合電泳結(jié)果可知,只能選用限制酶SacⅠ酶切PCR產(chǎn)物;限制酶SacⅠ在突變序列存在酶切位點(diǎn),但是目標(biāo)序列沒有,因此經(jīng)過該酶酶切后突變序列的電泳條帶會(huì)出現(xiàn)兩條,目標(biāo)序列是一條帶,根據(jù)圖丙的電泳結(jié)果可知,只有④為純合突變的植株。(3)設(shè)基因L突變?yōu)榛騆',則該株基因L成功突變的純合植株的基因型為L'L',由題中信息知,一條染色體插入了T?DNA,若其插入了L'所在染色體,其所在染色體記為L'1,則其自交子代的基因型及比例為L'1L'1∶L'1L'∶L'L'=1∶2∶1。若用抗生素篩選這個(gè)植株的自交子代,篩選出來的子代中突變位點(diǎn)純合且對(duì)抗生素敏感的植株(L'L')所占的比例為1/4。若其插入了其他染色體,所得結(jié)果相同。答案:(1)低44

GTTT

CAAT

(2)卡那霉素Sac

Ⅰ

④

(3)1/4知能集成(一)探討基因工程操作中限制酶的選擇方法1．根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點(diǎn)確定限制酶的種類(1)應(yīng)選擇切點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。(2)不能選擇切點(diǎn)位于目的基因和標(biāo)記基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲、乙不能選擇SmaⅠ。(3)為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點(diǎn))。2．根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類3．根據(jù)Ti質(zhì)粒的T-DNA片段選擇限制酶圖中甲、乙、丁Ti質(zhì)粒均不宜選取，而丙Ti質(zhì)粒宜選取(設(shè)切割目的基因的限制酶為XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下：[典例]

(2024·重慶高考)大豆是重要的糧油作物,提高大豆產(chǎn)量是我國農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的重要任務(wù)。我國研究人員發(fā)現(xiàn),基因S在大豆品種DN(種子較大)中的表達(dá)量高于品種TL(種子較小),然后克隆了該基因(兩品種中基因S序列無差異)及其上游的啟動(dòng)子序列,并開展相關(guān)研究。(1)基因S啟動(dòng)子的基本組成單位是

。

(2)通過基因工程方法,將DN克隆的“啟動(dòng)子D+基因S”序列導(dǎo)入無基因S的優(yōu)質(zhì)大豆品種YZ。根據(jù)題圖所示信息(不考慮未標(biāo)明序列)判斷構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí),為保證目標(biāo)序列的完整性,不宜使用的限制酶是

;此外,不宜同時(shí)選用酶SpeⅠ和XbaⅠ,原因是

。

(3)為驗(yàn)證“啟動(dòng)子D+基因S”是否連接在表達(dá)載體上,可用限制酶對(duì)重組表達(dá)載體酶切后進(jìn)行電泳。電泳時(shí),對(duì)照樣品除指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物外,還應(yīng)有

。經(jīng)驗(yàn)證的重組表達(dá)載體需轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌,檢測轉(zhuǎn)入是否成功的技術(shù)是

。

(4)用檢測后的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化品種YZ所得再生植株YZ?1的種子變大。同時(shí)將從TL克隆的“啟動(dòng)子T+基因S”序列成功導(dǎo)入YZ,所得再生植株YZ?2的種子也變大,但小于YZ?1。綜合分析,大豆品種DN較TL種子大的原因是

。

[解析]

(1)啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位,用于啟動(dòng)DNA的轉(zhuǎn)錄,是一段DNA片段,其基本組成單位是四種脫氧核糖核苷酸。(2)根據(jù)圖示信息可知,“啟動(dòng)子D+基因S”的DNA序列上存在EcoR

Ⅰ的識(shí)別序列,若使用限制酶EcoR

Ⅰ,會(huì)使目的基因序列被破壞。根據(jù)圖中限制酶的識(shí)別序列可知,酶Spe

Ⅰ和Xba

Ⅰ切割產(chǎn)生的黏性末端相同,若用這兩種限制酶切割,形成的DNA片段在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí),容易出現(xiàn)自我環(huán)化,以及無法保證目的基因片段與載體片段定向連接,影響目的基因在受體細(xì)胞中的表達(dá)。(3)DNA電泳可以分離不同大小的DNA片段,用限制酶對(duì)重組表達(dá)載體酶切后的產(chǎn)物不僅有“啟動(dòng)子D+基因S”片段,還有酶切后的空載體片段,因此電泳時(shí),對(duì)照樣品除指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物外,還應(yīng)有酶切后的空載體片段和“啟動(dòng)子D+基因S”片段;在分子水平上檢測目的基因是否轉(zhuǎn)入成功可通過PCR等技術(shù)檢測受體細(xì)胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA。(4)根據(jù)題干信息可知,再生植株YZ?1導(dǎo)入的目的基因?yàn)槿∽云贩NDN的“啟動(dòng)子D+基因S”序列,再生植株YZ?2導(dǎo)入的目的基因?yàn)槿∽云贩NTL的“啟動(dòng)子T+基因S”序列,結(jié)合題干信息“兩品種中基因S序列無差異”可推測:品種DN的基因S上游的啟動(dòng)子D的效應(yīng)強(qiáng)于品種TL的啟動(dòng)子T,啟動(dòng)子D使基因S表達(dá)量更高,因而種子更大。[答案]

(1)脫氧核糖核苷酸(或脫氧核苷酸)

(2)EcoRⅠ酶切后形成的黏性末端相同,易自我環(huán)化;不能保證目標(biāo)片段與載體定向連接(3)酶切后的空載體片段,啟動(dòng)子D+基因S片段PCR

(4)品種DN的基因S上游啟動(dòng)子效應(yīng)比TL強(qiáng),使得基因S表達(dá)量更高,種子更大[針對(duì)訓(xùn)練]1．(2023·湖北高考)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒)，并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是(

)A．若用HindⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同B．若用Pvu

Ⅰ酶切，在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因C．若用Sph

Ⅰ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否D．若用Sph

Ⅰ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落解析：若用HindⅢ酶切質(zhì)粒和含有目的基因的DNA片段，用DNA連接酶將兩者連接成重組質(zhì)粒，目的基因和質(zhì)粒有正向連接和反向連接兩種連接形式，因此，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同，A正確；若用PvuⅠ酶切，會(huì)破壞氨芐青霉素抗性基因，四環(huán)素抗性基因不受影響，在含Tet培養(yǎng)基中的菌落可能是含有目的基因的重組質(zhì)粒，也可能是質(zhì)粒自身連接的普通質(zhì)粒，因此，在含Tet培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因，B正確；DNA凝膠電泳技術(shù)可分離大小不同的DNA分子，若用SphⅠ酶切，由于重組質(zhì)粒和普通質(zhì)粒的堿基對(duì)數(shù)不同，因此可通過DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否，C正確；若用SphⅠ酶切，會(huì)破壞四環(huán)素抗性基因，氨芐青霉素抗性基因不受影響，因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp的培養(yǎng)基中能形成菌落，不能在含Tet的培養(yǎng)基中形成菌落，D錯(cuò)誤。答案：D

2．將小菜蛾細(xì)胞的羧酸酯酶基因(CarE)導(dǎo)入水稻細(xì)胞，培育抗農(nóng)藥水稻新品種，過程如圖所示。下列敘述錯(cuò)誤的是

(

)A．必須將含CarE基因的質(zhì)粒導(dǎo)入水稻的受精卵B．構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，應(yīng)選用PstⅠ和SmaⅠ分別切割質(zhì)粒和含CarE基因的DNAC．Tetr的作用是鑒別和篩選含CarE基因的細(xì)胞D．通過檢測表達(dá)產(chǎn)物來判斷CarE基因在水稻細(xì)胞中是否發(fā)揮功能作用解析：不一定要將含CarE基因的質(zhì)粒導(dǎo)入水稻的受精卵，但是導(dǎo)入受精卵效果要好，A錯(cuò)誤；Tetr是標(biāo)記基因，是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來，C正確。答案：A

知能集成(二)

PCR技術(shù)中引物的相關(guān)問題分析1．PCR技術(shù)和DNA復(fù)制的比較項(xiàng)目PCR技術(shù)DNA復(fù)制場所體外(PCR擴(kuò)增儀中)細(xì)胞內(nèi)(主要是細(xì)胞核內(nèi))解旋方式DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化酶耐高溫的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶溫度條件在較高溫度下進(jìn)行需控制溫度細(xì)胞內(nèi)溫和條件合成對(duì)象DNA片段DNA分子相同點(diǎn)均需要模板(DNA雙鏈)、原料(四種脫氧核苷酸)、能量2.與引物相關(guān)的問題歸納概括(1)PCR技術(shù)需要引物的原因DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從3′端延伸DNA鏈，因此，DNA的復(fù)制需要引物。當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈，因此DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。(2)PCR擴(kuò)增中需要引物數(shù)目的計(jì)算規(guī)律若一個(gè)DNA分子在PCR中經(jīng)過n輪循環(huán)，理論上需要消耗引物數(shù)為2n＋1－2，第n輪循環(huán)需要消耗的引物數(shù)為2n個(gè)。[典例]

IKK激酶參與動(dòng)物體內(nèi)免疫細(xì)胞的分化。臨床上發(fā)現(xiàn)某重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)患兒IKK基因編碼區(qū)第1183位堿基T突變?yōu)镃，導(dǎo)致IKK上第395位酪氨酸被組氨酸代替。為研究該患兒發(fā)病機(jī)制，研究人員利用純合野生鼠應(yīng)用大引物PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)培育出SCID模型小鼠(純合)，主要過程如圖1、2。分析回答：(1)在PCR反應(yīng)體系中，除加入引物、IKK基因、緩沖液、Mg2＋等外，還需加入_______________________________________________等。(2)在圖1獲取突變基因過程中，需要以下3種引物：引物A5′--CCCCAACCGGAAAGTGTCA--3′(下劃線字母為突變堿基)引物B5′--TAAGCTTCGAACATCCTA--3′(下劃線部分為限制酶HindⅢ識(shí)別序列)引物C5′--GTGAGCTCGCTGCCCCAA--3′(下劃線部分為限制酶SacⅠ識(shí)別序列)則PCR1中使用的引物有______________，PCR2中使用的引物有__________和圖中大引物的________(填“①”或“②”)鏈。(3)PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃50s,30個(gè)循環(huán)。在循環(huán)之前的94℃3min處理為預(yù)變性；循環(huán)中72℃處理的目的是__________________________________。(4)據(jù)圖2分析代孕母鼠對(duì)移入子宮的胚胎基本不發(fā)生免疫反應(yīng)，這為________________________提供了可能。(5)研究人員經(jīng)鑒定、篩選獲得一只轉(zhuǎn)基因雜合鼠F0，并確認(rèn)突變基因已經(jīng)穩(wěn)定同源替代IKK基因，請(qǐng)你設(shè)計(jì)完成獲得SCID模型鼠的實(shí)驗(yàn)步驟：①雜交親本：______________，雜交得F1；②F1雌雄鼠隨機(jī)交配得F2；③提取F2每只小鼠的基因組DNA，采用分子生物學(xué)方法，利用IKK基因探針和突變基因探針進(jìn)行篩選，則___________________________________為模型鼠。[解析]

(1)在PCR反應(yīng)體系中，除加入引物、IKK基因、緩沖液、Mg2＋等外，還需加入耐高溫DNA聚合酶、4種脫氧核苷酸等。(2)在PCR1中，獲取的是大引物，大引物中含有突變基因，所以應(yīng)含有引物A，在基因的右端有限制酶HindⅢ識(shí)別的序列，所以要用到引物B；在PCR2中，有一個(gè)引物結(jié)合到了基因的左端，在它從5′到3′的序列的開始部位應(yīng)含有限制酶SacⅠ識(shí)別的序列，所以要用到引物C；而另外的一個(gè)引物就是大引物中的一條鏈，它應(yīng)該結(jié)合到基因的右端，且從5′到3′端的序列中開始部位應(yīng)含有HindⅢ識(shí)別的序列，從圖中看，它是大引物的②鏈。(3)在PCR循環(huán)之前的94℃3min處理為預(yù)變性，使DNA雙鏈解開；循環(huán)中72℃處理的目的是使Taq酶從引物起始通過堿基互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行互補(bǔ)鏈合成。(4)代孕母鼠對(duì)移入子宮的胚胎基本不發(fā)生免疫反應(yīng)，這為胚胎在受體內(nèi)存活提供了可能。(5)①研究人員經(jīng)鑒定、篩選獲得一只轉(zhuǎn)基因雜合鼠F0，并確認(rèn)突變基因已經(jīng)穩(wěn)定同源替代IKK基因，若要獲得SCID模型鼠，可讓F0與野生鼠雜交得F1；②F1雌雄鼠隨機(jī)交配得F2；③模型鼠中應(yīng)含有突變基因，但不含IKK基因，故提取F2每只小鼠的基因組DNA，利用IKK基因探針和突變基因探針進(jìn)行篩選，若IKK基因探針檢測未出現(xiàn)雜交帶，突變基因探針檢測出現(xiàn)雜交帶的則為模型鼠。[答案]

(1)Taq酶(或熱穩(wěn)定DNA聚合酶)、4種脫氧核苷酸(2)引物A和引物B引物C

②

(3)使Taq酶從引物起始進(jìn)行互補(bǔ)鏈合成(4)胚胎在受體內(nèi)存活(5)①F0×野生鼠③IKK基因探針檢測未出現(xiàn)雜交帶，突變基因探針檢測出現(xiàn)雜交帶[針對(duì)訓(xùn)練]1.(2025·八省聯(lián)考晉陜寧青卷)科研人員基于合成生物學(xué)原理在大腸桿菌中構(gòu)建了合成產(chǎn)物Z的完整途徑,其基因表達(dá)載體如圖(a),基因1、2和3為該途徑的必需基因,基因大小分別為2650bp、1240bp和3476bp。回答下列問題：(1)圖(a)中,構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)用到的酶是

,片段X是

。

(2)基因表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌前,需要用Ca2+處理大腸桿菌使其處于一種

的生理狀態(tài),導(dǎo)入后在含卡那霉素的培養(yǎng)基上篩選到3個(gè)抗性菌落,分別對(duì)其所含DNA進(jìn)行PCR和瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果如圖(b)。據(jù)圖可知,PCR時(shí)選用的引物對(duì)是圖(a)中的

,選擇該引物對(duì)進(jìn)行鑒定的原因是

;

菌落B中未檢測到目標(biāo)條帶,其原因是

。

(3)工程菌株合成產(chǎn)物Z的產(chǎn)量受到溫度、pH和溶解氧等發(fā)酵條件的影響,請(qǐng)針對(duì)其中任一因素,探究其對(duì)產(chǎn)物Z產(chǎn)量的影響,寫出簡要的實(shí)驗(yàn)思路:_____________________________________________________。

解析:(1)構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)用到的酶是限制酶、DNA連接酶。質(zhì)粒上一般包含啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)、標(biāo)記基因(抗性基因),結(jié)合圖(a)分析,片段X是復(fù)制原點(diǎn)。(2)基因表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌前,需要用Ca2+處理大腸桿菌使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài),這樣有利于重組DNA分子的導(dǎo)入。電泳結(jié)果顯示,菌落A和C相應(yīng)基因大小介于2

000

bp~3

000

bp之間,結(jié)合目的基因上的引物分析,應(yīng)該選擇引物2和引物5,該引物對(duì)擴(kuò)增的區(qū)段包含了完整的基因2和基因1、基因3的部分片段,這樣可以很好的判斷大腸桿菌中是否成功導(dǎo)入了目的基因。菌落B中未檢測到目標(biāo)條帶,即不含目的基因但含抗性基因,其原因是菌落B中導(dǎo)入的是普通質(zhì)粒而非重組質(zhì)粒。(3)本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖翘骄繙囟?、pH和溶解氧等發(fā)酵條件對(duì)產(chǎn)物Z產(chǎn)量的影響,實(shí)驗(yàn)自變量是溫度或pH或溶解氧,檢測指標(biāo)是產(chǎn)物Z的產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)思路見答案。答案:(1)限制酶、DNA連接酶復(fù)制原點(diǎn)(2)能吸收周圍環(huán)境中DNA分子引物2和引物5兩種引物擴(kuò)增的區(qū)段包含了完整的基因2和基因1、基因3的部分片段菌落B中導(dǎo)入的是普通質(zhì)粒而非重組質(zhì)粒(3)將工程菌株隨機(jī)分成若干份,分別培養(yǎng)在一系列不同溫度(或pH或溶解氧)的培養(yǎng)液中,其他環(huán)境條件相同且適宜,一段時(shí)間后測定產(chǎn)物Z的產(chǎn)量2．某科研人員從蘇云金桿菌中獲取Bt基因，并將其導(dǎo)入大豆葉肉細(xì)胞，培育出抗蟲的轉(zhuǎn)基因大豆，主要過程如圖。請(qǐng)回答下列問題：(1)為了正確擴(kuò)增Bt基因，并能與圖中質(zhì)粒正確連接，需根據(jù)__________________________、______________________________________設(shè)計(jì)兩種引物。PCR時(shí)引物的作用是__________________________________。(2)根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物________________________不同，可以用________________________技術(shù)鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有目的基因以外的雜帶存在，分析可能的原因有________(填選項(xiàng))。A．引物特異性不強(qiáng) B．復(fù)性溫度過低C．模板DNA污染

D．引物堿基序列過長解決方案一般是在目的基因的__________(填