三類天然產(chǎn)物衍生物對(duì)沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)抑制活性及機(jī)制研究一、引言1.1研究背景與意義沙門菌（Salmonella）作為一種廣泛存在且危害嚴(yán)重的革蘭氏陰性兼性厭氧菌，在公共衛(wèi)生和食品安全領(lǐng)域一直備受關(guān)注。它是導(dǎo)致食源性疾病的重要病原菌之一，能夠感染包括人類在內(nèi)的多種動(dòng)物，引發(fā)一系列健康問題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，歐盟每年報(bào)告的人畜共患病病例中，沙門菌感染占比較高，且大多數(shù)血清型來源于動(dòng)物性食品。在美國(guó)，沙門菌每年導(dǎo)致約120萬種疾病、23000例住院治療和450例死亡。在我國(guó)，沙門菌也是引發(fā)食物中毒和腸道感染的常見病原菌。沙門菌感染人體后，主要癥狀以急性腸胃炎為主，伴有發(fā)熱、發(fā)冷、惡心、頭痛、全身乏力、腹瀉、嘔吐等。幼兒、老年人以及身體免疫低下的人群感染后，情況更為嚴(yán)重，可能會(huì)發(fā)展為菌血癥，極少數(shù)人還會(huì)合并腦膜炎或骨髓炎等嚴(yán)重并發(fā)癥。例如，2013-2017年間，歐洲國(guó)家因食用受污染的蛋制品和禽肉而引發(fā)的腸炎沙門菌病例不斷增加，給畜牧養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也嚴(yán)重威脅了公共健康和食品安全。Ⅲ型分泌系統(tǒng)（TypeIIISecretionSystem，T3SS）在沙門菌的致病過程中扮演著核心角色。它是一種特殊的蛋白質(zhì)分泌途徑，由管狀結(jié)構(gòu)組成，其運(yùn)輸機(jī)制類似于真核生物的信號(hào)肽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分泌途徑。T3SS主要由沙門菌致病島1（SPI-1）和致病島2（SPI-2）編碼，負(fù)責(zé)將60多種效應(yīng)蛋白分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)到真核宿主細(xì)胞內(nèi)。這些效應(yīng)蛋白能夠干擾宿主細(xì)胞的正常生理功能，誘導(dǎo)炎性腹瀉、侵襲非吞噬上皮細(xì)胞、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡以及全身性感染等，從而促進(jìn)沙門菌的感染和在宿主體內(nèi)的生存繁殖。比如，由SPI-1編碼的T3SS能夠誘導(dǎo)炎性腹瀉并侵襲非吞噬上皮細(xì)胞，將細(xì)菌效應(yīng)蛋白注入宿主細(xì)胞以建立感染；而SPI-2編碼的T3SS在沙門菌侵入宿主細(xì)胞后開始組裝合成，經(jīng)該裝置分泌的多種效應(yīng)蛋白對(duì)沙門菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存和增殖起著重要作用。傳統(tǒng)上，治療沙門菌感染主要依賴抗生素。然而，隨著抗生素的廣泛使用，細(xì)菌耐藥性問題日益嚴(yán)峻。大部分抗生素直接作用于細(xì)菌生存關(guān)鍵元件并殺死細(xì)菌，這種極強(qiáng)的選擇性壓力誘導(dǎo)了細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，使得感染的治療變得愈發(fā)困難。例如，一些多重耐藥性沙門菌的出現(xiàn)，對(duì)多種常用抗生素產(chǎn)生了抗性，導(dǎo)致臨床治療效果不佳。因此，開發(fā)新型的抗感染療法迫在眉睫。以T3SS為藥物靶標(biāo)，通過抑制該系統(tǒng)的功能來達(dá)到抗感染的目的，成為了一個(gè)極具潛力的研究方向。這種非殺菌方式可以降低細(xì)菌本身的自然選擇性壓力，避免多重耐藥基因的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，抑制T3SS能夠有效阻止沙門菌效應(yīng)蛋白的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)，從而削弱其致病性。許多天然產(chǎn)物及其衍生物具有結(jié)構(gòu)多樣性和生物活性多樣性的特點(diǎn)，為尋找新型T3SS抑制劑提供了豐富的資源。從天然產(chǎn)物中篩選和開發(fā)能夠抑制沙門菌T3SS的化合物，有望為沙門菌感染的防治提供新的策略和藥物候選物，具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，針對(duì)天然產(chǎn)物衍生物抑制沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的研究已取得了一些進(jìn)展。例如，有研究發(fā)現(xiàn)某些類黃酮，如黃芩素和槲皮素，能夠通過阻斷T3SS效應(yīng)和鼠傷寒沙門氏菌易位到上皮細(xì)胞，從而抑制入侵。百里酚，作為傘花烴的天然單萜酚衍生物，可抑制傷寒沙門氏菌SipA易位到HeLa細(xì)胞。國(guó)內(nèi)在這方面也有不少探索。學(xué)者通過構(gòu)建沙門氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)報(bào)告系統(tǒng)，建立了抑制劑篩選平臺(tái)，發(fā)現(xiàn)光甘草定在不影響細(xì)菌生長(zhǎng)的情況下，顯著抑制沙門氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的功能，抑制沙門氏菌入侵HeLa細(xì)胞和Ⅲ型分泌系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)胞損傷，對(duì)沙門氏菌感染小鼠具有良好保護(hù)作用。水楊酸甲酯也被篩選為沙門氏菌致病島1（SPI-1）抑制劑，可阻斷幾種SPI-1相關(guān)效應(yīng)蛋白的分泌且不影響細(xì)菌生長(zhǎng)，對(duì)SPI-1介導(dǎo)的HeLa細(xì)胞侵襲具有很強(qiáng)的抑制作用，還能顯著降低某些SPI-1基因的轉(zhuǎn)錄。然而，當(dāng)前研究仍存在一些不足和空白。一方面，雖然已發(fā)現(xiàn)多種具有抑制活性的天然產(chǎn)物衍生物，但對(duì)其具體作用機(jī)制的研究還不夠深入。大部分研究?jī)H停留在觀察對(duì)T3SS功能或相關(guān)基因表達(dá)的影響，對(duì)于這些化合物如何與T3SS的組成蛋白相互作用，以及如何影響其組裝、分泌和調(diào)控過程，還缺乏分子層面的深入解析。另一方面，目前研究涉及的天然產(chǎn)物衍生物種類相對(duì)有限，還有大量的天然產(chǎn)物資源有待進(jìn)一步挖掘和研究，以尋找更多高效、低毒的T3SS抑制劑。此外，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用研究方面也相對(duì)薄弱，多數(shù)研究?jī)H在細(xì)胞模型上進(jìn)行驗(yàn)證，缺乏在動(dòng)物模型和人體臨床試驗(yàn)中的深入研究，這限制了這些天然產(chǎn)物衍生物向?qū)嶋H治療藥物的轉(zhuǎn)化。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究三類天然產(chǎn)物衍生物對(duì)沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的抑制活性及其作用機(jī)制，為開發(fā)新型抗沙門菌感染藥物提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究擬從以下幾個(gè)方面展開具體研究：天然產(chǎn)物衍生物的篩選與獲?。簩?duì)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出潛在抑制活性的三類天然產(chǎn)物衍生物進(jìn)行進(jìn)一步篩選和分離純化，確保其純度和穩(wěn)定性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的化合物樣品。抑制活性的測(cè)定：采用多種實(shí)驗(yàn)方法，如基于報(bào)告基因的檢測(cè)技術(shù)、蛋白質(zhì)免疫印跡分析以及細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)等，全面測(cè)定三類天然產(chǎn)物衍生物對(duì)沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)功能的抑制活性。通過觀察效應(yīng)蛋白的分泌水平、基因表達(dá)變化以及對(duì)沙門菌入侵宿主細(xì)胞能力的影響，準(zhǔn)確評(píng)估不同衍生物的抑制效果。作用機(jī)制的研究：從分子、細(xì)胞和信號(hào)通路等多個(gè)層面深入探討天然產(chǎn)物衍生物的作用機(jī)制。運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析等，研究衍生物對(duì)Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的調(diào)控作用；利用細(xì)胞生物學(xué)方法，觀察衍生物對(duì)沙門菌與宿主細(xì)胞相互作用過程的影響，包括對(duì)細(xì)胞骨架重排、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活等方面的作用；通過生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)衍生物可能的作用靶點(diǎn)，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，揭示其抑制Ⅲ型分泌系統(tǒng)的分子機(jī)制。構(gòu)效關(guān)系的分析：對(duì)三類天然產(chǎn)物衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行詳細(xì)解析，通過對(duì)比不同結(jié)構(gòu)衍生物的抑制活性數(shù)據(jù)，分析結(jié)構(gòu)與活性之間的關(guān)系，明確影響抑制活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征和基團(tuán)，為進(jìn)一步優(yōu)化化合物結(jié)構(gòu)、提高抑制活性提供指導(dǎo)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：建立沙門菌感染動(dòng)物模型，將篩選得到的具有顯著抑制活性的天然產(chǎn)物衍生物用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察其在體內(nèi)對(duì)沙門菌感染的防治效果，評(píng)估衍生物的安全性和有效性，為其臨床應(yīng)用提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)方法，從細(xì)菌培養(yǎng)、蛋白檢測(cè)到細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，全面深入地探究三類天然產(chǎn)物衍生物對(duì)沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的抑制活性及作用機(jī)制。具體技術(shù)路線如下：天然產(chǎn)物衍生物的篩選與獲取：收集前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出潛在抑制活性的三類天然產(chǎn)物衍生物，通過柱色譜、高效液相色譜等分離技術(shù)對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。利用核磁共振波譜儀（NMR）、質(zhì)譜儀（MS）等分析儀器對(duì)純化后的衍生物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，確保其純度和結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性。細(xì)菌培養(yǎng)與處理：將鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200rpm條件下振蕩培養(yǎng)過夜。次日，按照1:100的比例將菌液轉(zhuǎn)接至新鮮的LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600nm為0.6-0.8）。然后，將不同濃度的天然產(chǎn)物衍生物加入到菌液中，對(duì)照組加入等量的溶劑，繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。抑制活性的測(cè)定：基于報(bào)告基因的檢測(cè)：構(gòu)建攜帶T3SS效應(yīng)蛋白（如SipA）與報(bào)告基因（如β-內(nèi)酰胺酶）融合基因的質(zhì)粒，并將其導(dǎo)入沙門菌中。將處理后的沙門菌與宿主細(xì)胞（如HeLa細(xì)胞）共孵育，加入CCF4-am底物。當(dāng)融合蛋白進(jìn)入宿主細(xì)胞時(shí)，底物在β-內(nèi)酰胺酶的作用下被分解，干擾熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）現(xiàn)象，在409nm波長(zhǎng)的光激發(fā)下發(fā)出447nm的藍(lán)光；若天然產(chǎn)物衍生物抑制效應(yīng)蛋白易位至宿主細(xì)胞，則產(chǎn)生FRET現(xiàn)象發(fā)出520nm的綠光。通過激光共聚焦顯微鏡觀察不同顏色的熒光信號(hào)，定量分析衍生物對(duì)T3SS功能的抑制作用。蛋白質(zhì)免疫印跡分析（WesternBlot）：收集處理后的沙門菌，超聲破碎后提取總蛋白。通過SDS-PAGE凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離，然后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。用特異性抗體檢測(cè)T3SS相關(guān)效應(yīng)蛋白（如SipA、SipB等）以及調(diào)控蛋白的表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)參，分析天然產(chǎn)物衍生物對(duì)這些蛋白表達(dá)的影響。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：將HeLa細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)至80%-90%匯合度。將預(yù)先與天然產(chǎn)物衍生物共孵育的沙門菌加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，以MOI=50進(jìn)行感染，在37℃、5%CO?條件下孵育2h。用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入含抗生素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1h，以殺死胞外細(xì)菌。然后，用TritonX-100裂解細(xì)胞，將裂解液適當(dāng)稀釋后涂布于LB平板上，培養(yǎng)過夜后計(jì)數(shù)菌落數(shù)，計(jì)算細(xì)胞侵襲率，評(píng)估天然產(chǎn)物衍生物對(duì)沙門菌入侵宿主細(xì)胞能力的影響。作用機(jī)制的研究：基因表達(dá)分析：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，提取處理后的沙門菌總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，用特異性引物擴(kuò)增T3SS相關(guān)基因（如hilA、invF等）以及調(diào)控基因（如slyA、phoP等），以16SrRNA作為內(nèi)參基因，分析天然產(chǎn)物衍生物對(duì)這些基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析：利用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)，將處理后的沙門菌裂解液與針對(duì)T3SS關(guān)鍵蛋白（如SpaO、PrgH等）的抗體孵育，然后加入ProteinA/G磁珠，沉淀與抗體結(jié)合的蛋白復(fù)合物。通過WesternBlot檢測(cè)復(fù)合物中是否存在天然產(chǎn)物衍生物作用的潛在靶點(diǎn)蛋白，探究它們之間的相互作用。此外，還可采用表面等離子共振（SPR）技術(shù)，進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白與蛋白之間的相互作用及親和力。細(xì)胞生物學(xué)分析：利用激光共聚焦顯微鏡觀察天然產(chǎn)物衍生物處理后的沙門菌與宿主細(xì)胞相互作用過程中，細(xì)胞骨架（如肌動(dòng)蛋白）的重排情況；通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路相關(guān)蛋白（如MAPK、PI3K/Akt等）的磷酸化水平，分析衍生物對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。構(gòu)效關(guān)系的分析：利用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)軟件，對(duì)三類天然產(chǎn)物衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，計(jì)算其分子描述符（如氫鍵供體、氫鍵受體、脂水分配系數(shù)等）。結(jié)合不同衍生物的抑制活性數(shù)據(jù)，采用多元線性回歸、偏最小二乘回歸等統(tǒng)計(jì)方法，建立結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系模型，分析影響抑制活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征和基團(tuán)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：選取健康的BALB/c小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組、感染模型組和天然產(chǎn)物衍生物處理組。感染模型組和處理組小鼠經(jīng)腹腔注射感染鼠傷寒沙門氏菌，對(duì)照組注射等量的生理鹽水。感染后，處理組小鼠給予不同劑量的天然產(chǎn)物衍生物灌胃，對(duì)照組和感染模型組給予等量的溶劑。觀察小鼠的發(fā)病癥狀、體重變化和存活率；在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)，處死小鼠，采集肝臟、脾臟等組織，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，評(píng)估天然產(chǎn)物衍生物在體內(nèi)對(duì)沙門菌感染的防治效果。同時(shí)，對(duì)組織進(jìn)行病理切片分析，觀察組織病變情況，評(píng)估衍生物的安全性。本研究技術(shù)路線如圖1-1所示：[此處插入技術(shù)路線圖]圖1-1技術(shù)路線圖二、沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)概述2.1沙門菌簡(jiǎn)介沙門菌（Salmonella）在分類學(xué)上隸屬腸桿菌科沙門菌屬，是一類廣泛存在于自然界的革蘭氏陰性桿菌。其菌體大小通常為(0.6-1.0)μm×(2-4)μm，呈桿狀形態(tài)。多數(shù)沙門菌具有周身鞭毛，這使其具備了良好的運(yùn)動(dòng)能力，能夠在適宜的環(huán)境中自由游動(dòng)，尋找營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和宿主細(xì)胞；一般無莢膜，均不形成芽胞。沙門菌為需氧或兼性厭氧菌，在有氧和無氧環(huán)境下都能生存，這種代謝特性使其能夠適應(yīng)多種生存環(huán)境，無論是在富氧的外界環(huán)境，還是在宿主細(xì)胞內(nèi)相對(duì)缺氧的環(huán)境中，都可以生長(zhǎng)繁殖。沙門菌的抗原構(gòu)造較為復(fù)雜，主要分為菌體抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（Vi）三種。這些抗原的多樣性決定了沙門菌血清型的豐富性，目前沙門菌屬細(xì)菌的血清型已達(dá)2500多種。其中，少數(shù)血清型如傷寒沙門菌、甲型副傷寒沙門菌、肖氏沙門菌（原稱乙型副傷寒沙門菌）和希氏沙門菌（原稱丙型副傷寒沙門菌）是人的病原菌，可直接引發(fā)人類的腸熱癥，包括傷寒和副傷寒等疾病，對(duì)人類健康構(gòu)成直接威脅。而絕大多數(shù)血清型宿主范圍廣泛，家畜、家禽、野生脊椎動(dòng)物以及冷血?jiǎng)游?、軟體動(dòng)物、環(huán)形動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物（包括蒼蠅）等均可攜帶沙門菌。部分沙門菌是人畜共患病的病原菌，通過食物鏈傳播，可引起人類食物中毒或敗血癥。例如，鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌和豬霍亂沙門菌等，常因污染食物，在人類食用后引發(fā)食物中毒，導(dǎo)致發(fā)熱、腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐等急性腸胃炎癥狀。在環(huán)境適應(yīng)性方面，沙門菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高，在普通的培養(yǎng)基上就能良好生長(zhǎng)。在SS平板上，它可形成中等大小、無色或中央黑色、邊緣無色半透明的S型菌落。這種生長(zhǎng)特性使得沙門菌在自然環(huán)境中容易存活和傳播，如在被污染的水源、土壤、食物表面等，都能找到沙門菌的蹤跡。同時(shí)，沙門菌具有一定的耐低溫能力，在冷藏條件下仍能存活較長(zhǎng)時(shí)間，這也增加了食品被污染的風(fēng)險(xiǎn)。不過，沙門菌對(duì)高溫較為敏感，一般在60℃以上的環(huán)境中，經(jīng)過一定時(shí)間的處理就會(huì)被殺死，這為食品加工和消毒提供了有效的手段。此外，一些消毒劑如次氯酸鈉、過氧化氫等，也能有效殺滅沙門菌，在公共衛(wèi)生和食品加工行業(yè)中，常利用這些消毒劑對(duì)環(huán)境和器具進(jìn)行消毒，以預(yù)防沙門菌的傳播。2.2Ⅲ型分泌系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）是由多組分蛋白復(fù)合體形成的跨膜通道，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，宛如一臺(tái)精密的“分子注射器”，在沙門菌致病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。T3SS主要由大約20種不同的蛋白質(zhì)組成，這些蛋白質(zhì)可分為分泌蛋白質(zhì)、伴侶蛋白、分泌器蛋白和調(diào)節(jié)蛋白四大類。分泌器蛋白是構(gòu)成T3SS結(jié)構(gòu)的主要成分，它們?cè)诩?xì)菌的內(nèi)膜和外膜上組裝形成一個(gè)復(fù)雜的跨膜結(jié)構(gòu)。其中，內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的LcrD家族能夠形成一個(gè)中央通道，如同管道的中軸線，為蛋白質(zhì)的運(yùn)輸提供了核心通道；細(xì)胞質(zhì)ATP酶YscN家族則提供能量，確保蛋白質(zhì)的運(yùn)輸過程順利進(jìn)行，就像為運(yùn)輸過程提供動(dòng)力的發(fā)動(dòng)機(jī)；YscO、YscP及同源蛋白占據(jù)特定位點(diǎn)，雖氨基酸同源性小或無，但在整個(gè)結(jié)構(gòu)中也起著不可或缺的定位和支撐作用；YscF、YscI、YscK，YscL家族具有完全的親水特性，可能位于細(xì)胞質(zhì)，參與蛋白質(zhì)的識(shí)別和初步運(yùn)輸準(zhǔn)備；YopN及同源性蛋白位于細(xì)菌表面，在鈣離子存在條件下以及不接觸真核細(xì)胞時(shí)，通道關(guān)閉，起到了“閥門”的作用，控制著蛋白質(zhì)的分泌時(shí)機(jī)；YscC家族及其同源性蛋白則形成通道使分泌蛋白穿過外膜，完成蛋白質(zhì)從細(xì)菌內(nèi)部到外部環(huán)境的運(yùn)輸。T3SS的跨膜結(jié)構(gòu)是其實(shí)現(xiàn)功能的基礎(chǔ)。它通過一個(gè)多環(huán)型基座固定在細(xì)菌表面，基座由12到14個(gè)亞基構(gòu)成復(fù)合物，不僅協(xié)助蛋白穿過細(xì)菌的內(nèi)膜和外膜，還與周質(zhì)中的分泌結(jié)構(gòu)緊密相連，就像一座穩(wěn)固的橋梁，連接著細(xì)菌內(nèi)部和外部環(huán)境。基座中貫穿有圓柱狀的連接針頭和基座的桿，針頭狀突起是一個(gè)直的中空筒狀結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)約60nm，其內(nèi)部有專門輸送分泌蛋白狹窄的中心孔道（約2～3nm）。這個(gè)中心孔道非常小，折疊的蛋白要通過伸展后才能從中通過，恰似一個(gè)狹窄的通道，只允許特定形態(tài)的蛋白通過。針頭結(jié)構(gòu)可以將細(xì)菌的效應(yīng)蛋白直接注入宿主細(xì)胞，完成細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的“攻擊”準(zhǔn)備。T3SS的主要功能是將沙門菌的毒力效應(yīng)蛋白直接注入宿主細(xì)胞內(nèi)，從而干擾宿主細(xì)胞的正常生理功能，促進(jìn)細(xì)菌的感染和生存。沙門菌致病島1（SPI-1）和致病島2（SPI-2）編碼的T3SS分別在感染的不同階段發(fā)揮作用。SPI-1編碼的T3SS在細(xì)菌感染初期，負(fù)責(zé)將一系列效應(yīng)蛋白如AvrA、SipA、SipC、SopB、SopD、SopE、SotP和SspH1等注入宿主細(xì)胞。這些效應(yīng)蛋白能夠誘導(dǎo)炎性腹瀉并侵襲非吞噬上皮細(xì)胞，例如SopE和SopB可以激活宿主細(xì)胞內(nèi)的RhoGTP酶，導(dǎo)致細(xì)胞骨架重排，使細(xì)菌更容易侵入宿主細(xì)胞；SipA則可以與宿主細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白結(jié)合，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)菌的入侵。SPI-2編碼的T3SS在細(xì)菌侵入宿主細(xì)胞后開始發(fā)揮作用，它分泌的效應(yīng)蛋白如ExoS、ExoT、ExoV和ExoY等，對(duì)沙門菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存和增殖起著重要作用。這些效應(yīng)蛋白可以干擾宿主細(xì)胞的免疫防御機(jī)制，如抑制吞噬體與溶酶體的融合，使沙門菌能夠在吞噬細(xì)胞內(nèi)生存和繁殖。T3SS還參與了沙門菌的生物被膜形成，對(duì)沙門菌的生存和傳播具有重要意義。生物被膜是細(xì)菌在物體表面形成的一種具有保護(hù)性的結(jié)構(gòu)，T3SS分泌的蛋白可能參與了生物被膜的形成和維持過程，增強(qiáng)了沙門菌在環(huán)境中的生存能力和對(duì)宿主的感染能力。2.3Ⅲ型分泌系統(tǒng)調(diào)控機(jī)制Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）的調(diào)控機(jī)制極為復(fù)雜，涉及多個(gè)層面，包括基因表達(dá)調(diào)控、蛋白質(zhì)活性調(diào)控以及與環(huán)境因素的相互作用等，這些調(diào)控機(jī)制確保了T3SS在沙門菌感染過程中的精準(zhǔn)表達(dá)和功能發(fā)揮。從基因表達(dá)調(diào)控層面來看，轉(zhuǎn)錄因子在其中扮演著關(guān)鍵角色。HilA是SPI-1編碼的T3SS基因表達(dá)的主要激活因子，屬于AraC家族轉(zhuǎn)錄因子。它能夠識(shí)別并結(jié)合到SPI-1基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列，從而激活一系列SPI-1基因的轉(zhuǎn)錄，如sipA、sipB、sopB等效應(yīng)蛋白基因，進(jìn)而促進(jìn)沙門菌對(duì)宿主細(xì)胞的侵襲。InvF也是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，它對(duì)SPI-1基因的表達(dá)同樣具有調(diào)控作用，通過與其他調(diào)控蛋白相互作用，影響HilA的活性，間接調(diào)節(jié)SPI-1基因的轉(zhuǎn)錄。在SPI-2編碼的T3SS中，SsrA和SsrB組成的雙組分調(diào)控系統(tǒng)發(fā)揮著核心調(diào)控作用。SsrB是一種應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白，當(dāng)細(xì)菌感知到特定的環(huán)境信號(hào)后，SsrA激酶被激活，磷酸化SsrB。磷酸化后的SsrB能夠結(jié)合到SPI-2基因啟動(dòng)子區(qū)域，激活SPI-2基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控如sseB、sseC等效應(yīng)蛋白基因的表達(dá)，保障沙門菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存和增殖。除了轉(zhuǎn)錄因子，信號(hào)通路也參與了T3SS的基因表達(dá)調(diào)控。PhoP-PhoQ雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)對(duì)T3SS的調(diào)控具有重要意義。PhoQ作為膜結(jié)合的組氨酸激酶，能夠感知外界環(huán)境中的多種信號(hào)，如二價(jià)陽(yáng)離子濃度、低pH值等。當(dāng)PhoQ感知到這些信號(hào)后，自身發(fā)生磷酸化，并將磷酸基團(tuán)傳遞給PhoP。磷酸化的PhoP可以直接調(diào)控T3SS相關(guān)基因的表達(dá)，它既可以激活某些基因，如slyA等，進(jìn)而間接調(diào)控T3SS；也能抑制一些基因的表達(dá)，確保T3SS基因表達(dá)的平衡。另外，SlyA是一個(gè)受PhoP-PhoQ調(diào)控的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它可以結(jié)合到SPI-1和SPI-2基因啟動(dòng)子區(qū)域，對(duì)T3SS相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行正調(diào)控或負(fù)調(diào)控，具體作用取決于基因和環(huán)境條件。例如，在某些環(huán)境下，SlyA能夠增強(qiáng)HilA對(duì)SPI-1基因的激活作用，促進(jìn)T3SS的表達(dá)。環(huán)境因素對(duì)T3SS的調(diào)控也至關(guān)重要。溫度是影響T3SS表達(dá)的關(guān)鍵環(huán)境因素之一。沙門菌在外界環(huán)境中，通常處于較低溫度，此時(shí)T3SS的表達(dá)受到抑制；而當(dāng)進(jìn)入宿主腸道后，溫度升高至37℃，這一溫度變化能夠激活T3SS相關(guān)基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，溫度變化可以影響一些轉(zhuǎn)錄因子的活性，如HilA在37℃時(shí)活性增強(qiáng)，從而促進(jìn)SPI-1基因的轉(zhuǎn)錄。滲透壓同樣會(huì)對(duì)T3SS的表達(dá)產(chǎn)生影響。在高滲透壓環(huán)境下，沙門菌會(huì)通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)T3SS相關(guān)基因的表達(dá)。高滲透壓可能會(huì)激活某些激酶，進(jìn)而影響PhoP-PhoQ等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，最終改變T3SS基因的表達(dá)水平，以適應(yīng)環(huán)境變化。此外，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的可用性也與T3SS的調(diào)控密切相關(guān)。當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏時(shí)，沙門菌會(huì)調(diào)整T3SS的表達(dá)，優(yōu)先保證自身的生存。例如，氮源缺乏時(shí)，沙門菌可能會(huì)減少T3SS效應(yīng)蛋白的分泌，將更多的能量用于獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。2.4Ⅲ型分泌系統(tǒng)與沙門菌致病性Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）在沙門菌的致病性中起著核心作用，它是沙門菌感染宿主、逃避宿主免疫防御以及在宿主體內(nèi)生存和繁殖的關(guān)鍵武器。在沙門菌黏附與入侵宿主細(xì)胞的過程中，T3SS發(fā)揮著不可替代的作用。沙門菌致病島1（SPI-1）編碼的T3SS在這一過程中扮演著關(guān)鍵角色。當(dāng)沙門菌接觸到宿主細(xì)胞時(shí)，SPI-1T3SS被激活，將一系列效應(yīng)蛋白注入宿主細(xì)胞內(nèi)。這些效應(yīng)蛋白能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生一系列變化，從而促進(jìn)沙門菌的黏附和入侵。例如，SopE和SopB這兩種效應(yīng)蛋白，它們可以激活宿主細(xì)胞內(nèi)的RhoGTP酶。RhoGTP酶是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路中的重要分子，它的激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞骨架重排。細(xì)胞骨架的重排使得宿主細(xì)胞表面的微絨毛發(fā)生改變，形成有利于沙門菌黏附的結(jié)構(gòu)。同時(shí)，細(xì)胞骨架的重排還會(huì)引起細(xì)胞膜的褶皺和凹陷，使得沙門菌更容易侵入宿主細(xì)胞。此外，SipA蛋白能夠與宿主細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白結(jié)合，進(jìn)一步穩(wěn)定細(xì)胞骨架的重排結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)沙門菌的入侵能力。通過這些效應(yīng)蛋白的協(xié)同作用，沙門菌能夠高效地黏附并侵入宿主細(xì)胞，為后續(xù)的感染過程奠定基礎(chǔ)。在逃避宿主免疫防御方面，T3SS同樣發(fā)揮著重要作用。沙門菌致病島2（SPI-2）編碼的T3SS在這一過程中起到了關(guān)鍵作用。當(dāng)沙門菌侵入宿主細(xì)胞后，SPI-2T3SS開始組裝并分泌效應(yīng)蛋白。這些效應(yīng)蛋白能夠干擾宿主細(xì)胞的免疫防御機(jī)制，使沙門菌能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)生存和繁殖。其中，一個(gè)重要的機(jī)制是抑制吞噬體與溶酶體的融合。吞噬體是宿主細(xì)胞吞噬病原體后形成的囊泡，而溶酶體則含有多種水解酶，能夠降解吞噬體內(nèi)的病原體。SPI-2T3SS分泌的效應(yīng)蛋白可以干擾吞噬體與溶酶體融合的信號(hào)通路，阻止兩者的融合。這樣，沙門菌就能夠在吞噬體內(nèi)避免被溶酶體中的水解酶降解，從而在宿主細(xì)胞內(nèi)生存和繁殖。SPI-2T3SS還可以分泌一些效應(yīng)蛋白，抑制宿主細(xì)胞的免疫信號(hào)傳導(dǎo)通路，降低宿主細(xì)胞對(duì)沙門菌的免疫應(yīng)答。這些效應(yīng)蛋白可以干擾宿主細(xì)胞內(nèi)的炎癥小體激活、細(xì)胞因子分泌等免疫反應(yīng)過程，使得沙門菌能夠逃避宿主的免疫監(jiān)視，在宿主體內(nèi)持續(xù)感染。三、三類天然產(chǎn)物衍生物的篩選與獲取3.1天然產(chǎn)物衍生物的來源與分類天然產(chǎn)物作為藥物研發(fā)的重要資源寶庫(kù)，其來源廣泛，主要包括植物、微生物和動(dòng)物等。植物是天然產(chǎn)物最豐富的來源之一，眾多藥用植物中蘊(yùn)含著大量結(jié)構(gòu)多樣、功能各異的化學(xué)成分。例如，從黃花蒿中提取的青蒿素，是治療瘧疾的特效藥物；從紅豆杉中分離得到的紫杉醇，在癌癥治療方面具有顯著療效。微生物也是天然產(chǎn)物的重要來源，許多微生物能夠產(chǎn)生具有生物活性的代謝產(chǎn)物，如青霉素、鏈霉素等抗生素，都是由微生物發(fā)酵產(chǎn)生的。動(dòng)物來源的天然產(chǎn)物同樣具有獨(dú)特的生物活性，如蛇毒中的某些成分可用于制備抗血栓藥物，蜂毒中的蜂毒肽具有抗炎、抗菌等多種作用。本研究聚焦的三類天然產(chǎn)物衍生物分別為黃酮類衍生物、萜類衍生物和醌類衍生物，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和性質(zhì)上各具特點(diǎn)。黃酮類衍生物以C6-C3-C6為基本骨架，由兩個(gè)苯環(huán)（A環(huán)和B環(huán)）通過中央三碳鏈相互連接而成。其結(jié)構(gòu)中常含有酚羥基、甲氧基等官能團(tuán)，這些官能團(tuán)的存在賦予了黃酮類衍生物豐富的化學(xué)活性。根據(jù)中央三碳鏈的氧化程度、B環(huán)連接位置以及三碳鏈?zhǔn)欠癯森h(huán)等因素，黃酮類衍生物可進(jìn)一步分為黃酮、黃酮醇、異黃酮、二氫黃酮、二氫黃酮醇等不同類型。例如，槲皮素屬于黃酮醇類，其結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)酚羥基，具有較強(qiáng)的抗氧化活性；大豆異黃酮?jiǎng)t屬于異黃酮類，在調(diào)節(jié)人體內(nèi)分泌等方面具有重要作用。萜類衍生物是一類由甲戊二羥酸衍生而成，基本碳架多具有2個(gè)或2個(gè)以上異戊二烯單位（C5單位）結(jié)構(gòu)特征的化合物。根據(jù)分子中異戊二烯單位的數(shù)目，萜類衍生物可分為單萜（含2個(gè)異戊二烯單位）、倍半萜（含3個(gè)異戊二烯單位）、二萜（含4個(gè)異戊二烯單位）等。萜類衍生物的結(jié)構(gòu)類型豐富多樣，包括鏈狀、環(huán)狀等多種結(jié)構(gòu)。例如，青蒿素是一種倍半萜內(nèi)酯，具有獨(dú)特的過氧橋結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)使其具有良好的抗瘧活性；紫杉醇則是一種二萜類化合物，其復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)和多個(gè)手性中心決定了其獨(dú)特的抗癌活性。醌類衍生物是分子中具有不飽和環(huán)二酮結(jié)構(gòu)或容易轉(zhuǎn)變成這樣結(jié)構(gòu)的天然有機(jī)化合物，以蒽醌及其衍生物最為重要。醌類衍生物主要包括苯醌、萘醌、菲醌和蒽醌等類型。苯醌類可分為鄰苯醌和對(duì)苯醌兩大類，由于鄰苯醌結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，天然存在的苯醌化合物多數(shù)為對(duì)苯醌的衍生物，常見的如信筒子醌，具有祛絳蟲的作用。萘醌類化合物分為α（1，4）、β（1，2）及amphi（2，6）三種類型，自然界存在的主要是α-萘醌，如紫草素，具有止血、抗炎、抗病毒等功效。菲醌類包括鄰菲醌及對(duì)菲醌兩種類型，丹參中的丹參酮IIA就屬于鄰菲醌類，具有活血化瘀的作用。蒽醌類是醌類衍生物中最重要的一類，可分為單蒽核類和雙蒽核類。單蒽核類又包括蒽醌及其苷類、蒽酚（或蒽酮）衍生物等。蒽醌及其苷類中，根據(jù)取代基在苯環(huán)上的分布情況，可分為大黃素型（取代基分布在兩側(cè)的苯環(huán)上）和茜草素型（羥基分布在一側(cè)的苯環(huán)上）。例如，大黃中的主要蒽醌成分屬于大黃素型，具有瀉下作用；茜草中的茜草素則屬于茜草素型，具有止血作用。雙蒽核類包括二蒽酮類衍生物和二蒽醌類。二蒽酮類衍生物是由兩分子蒽酮脫去一分子氫，通過C-C鍵結(jié)合而成，如番瀉苷，具有較強(qiáng)的瀉下作用。3.2篩選方法與依據(jù)本研究在篩選三類天然產(chǎn)物衍生物時(shí)，綜合運(yùn)用了多種篩選方法，這些方法各有其獨(dú)特的依據(jù)和優(yōu)勢(shì)，相互補(bǔ)充，旨在從眾多的天然產(chǎn)物衍生物中精準(zhǔn)篩選出對(duì)沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)具有潛在抑制活性的化合物?；诮Y(jié)構(gòu)相似性的篩選方法是本研究的重要策略之一。在天然產(chǎn)物中，具有相似結(jié)構(gòu)的化合物往往具有相似的生物活性。黃酮類衍生物中，具有特定結(jié)構(gòu)骨架的化合物，如黃酮醇類，其3-羥基、4-羰基以及B環(huán)上的鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)，賦予了這類化合物較強(qiáng)的抗氧化和抗炎活性。在篩選抑制沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的黃酮類衍生物時(shí)，重點(diǎn)關(guān)注具有類似活性基團(tuán)的化合物。因?yàn)棰笮头置谙到y(tǒng)的功能與細(xì)菌的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，具有抗氧化和抗炎活性的黃酮類衍生物可能通過調(diào)節(jié)這些生理過程，間接影響Ⅲ型分泌系統(tǒng)的功能。例如，已有研究表明，某些黃酮類化合物能夠通過抑制細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少炎癥因子的釋放，從而降低細(xì)菌的致病性。基于此，本研究篩選出具有相似結(jié)構(gòu)的黃酮類衍生物，如槲皮素及其衍生物，推測(cè)它們可能具有類似的抑制Ⅲ型分泌系統(tǒng)的活性。前期研究報(bào)道為篩選提供了重要的參考依據(jù)。大量的文獻(xiàn)研究已經(jīng)揭示了許多天然產(chǎn)物衍生物對(duì)細(xì)菌生理功能的影響，包括對(duì)Ⅲ型分泌系統(tǒng)的作用。在萜類衍生物中，青蒿素作為一種倍半萜內(nèi)酯，具有獨(dú)特的過氧橋結(jié)構(gòu)，其抗瘧活性已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可。研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素及其衍生物能夠干擾瘧原蟲的膜系統(tǒng)，影響其能量代謝和蛋白質(zhì)合成。Ⅲ型分泌系統(tǒng)是一個(gè)依賴能量和蛋白質(zhì)合成的復(fù)雜系統(tǒng)，因此推測(cè)青蒿素類似結(jié)構(gòu)的萜類衍生物可能對(duì)沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)具有抑制作用。參考前期研究報(bào)道，本研究選取了一系列具有類似結(jié)構(gòu)的萜類衍生物，如一些含有過氧橋或特殊環(huán)狀結(jié)構(gòu)的萜類化合物，進(jìn)行進(jìn)一步的篩選和研究。計(jì)算機(jī)虛擬篩選技術(shù)在本研究中也發(fā)揮了重要作用。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)和計(jì)算化學(xué)的發(fā)展，計(jì)算機(jī)虛擬篩選能夠快速、高效地從大量的化合物數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出具有潛在活性的化合物。通過分子對(duì)接技術(shù)，將天然產(chǎn)物衍生物與Ⅲ型分泌系統(tǒng)的關(guān)鍵蛋白進(jìn)行虛擬對(duì)接，預(yù)測(cè)它們之間的結(jié)合模式和親和力。Ⅲ型分泌系統(tǒng)的關(guān)鍵蛋白，如SpaO、PrgH等，在系統(tǒng)的組裝和功能發(fā)揮中起著關(guān)鍵作用。利用計(jì)算機(jī)虛擬篩選，可以找到能夠與這些關(guān)鍵蛋白緊密結(jié)合的天然產(chǎn)物衍生物，這些衍生物可能通過干擾蛋白之間的相互作用，影響Ⅲ型分泌系統(tǒng)的組裝和功能。例如，通過分子對(duì)接分析，發(fā)現(xiàn)某些醌類衍生物能夠與SpaO蛋白的特定區(qū)域結(jié)合，從而阻斷其與其他蛋白的相互作用，進(jìn)而影響Ⅲ型分泌系統(tǒng)的功能。這種基于計(jì)算機(jī)虛擬篩選的方法，大大提高了篩選效率，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供了有價(jià)值的線索。3.3衍生物的提取與分離本研究以黃酮類衍生物、萜類衍生物和醌類衍生物為例，詳細(xì)闡述其提取與分離的實(shí)驗(yàn)步驟和技術(shù)，以確保獲得高純度的天然產(chǎn)物衍生物，為后續(xù)的活性研究提供可靠的樣品。3.3.1黃酮類衍生物以銀杏葉為原料提取黃酮類衍生物，具體步驟如下：將銀杏葉洗凈、干燥后粉碎成粉末，準(zhǔn)確稱取一定量的銀杏葉粉末，放入圓底燒瓶中。采用乙醇回流提取法，加入適量體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，料液比為1:20（g/mL）。安裝回流裝置，在80℃下回流提取2h，期間不斷攪拌，以促進(jìn)黃酮類化合物的溶出。提取結(jié)束后，趁熱過濾，收集濾液，濾渣再用相同條件重復(fù)提取2次，合并濾液。將合并后的濾液減壓濃縮至原體積的1/4左右，得到濃縮液。在濃縮液中加入適量的水，使溶液中的乙醇濃度降至30%左右，然后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用石油醚萃取3次，每次萃取的體積比為1:1，以除去脂溶性雜質(zhì)。棄去石油醚層，水層再用乙酸乙酯萃取3次，每次萃取的體積比為1:1，收集乙酸乙酯層。將乙酸乙酯層減壓濃縮至干，得到粗黃酮類提取物。采用硅膠柱色譜法對(duì)粗黃酮類提取物進(jìn)行分離純化。將硅膠（200-300目）用石油醚-乙酸乙酯（5:1，v/v）濕法裝柱，將粗黃酮類提取物用少量甲醇溶解后上樣。用石油醚-乙酸乙酯（5:1、3:1、1:1、1:3，v/v）梯度洗脫，每50mL收集一個(gè)餾分。通過薄層色譜（TLC）檢測(cè)餾分，以石油醚-乙酸乙酯（3:1，v/v）為展開劑，2%三氯化鋁乙醇溶液為顯色劑，在紫外燈下觀察斑點(diǎn)。將含有相同成分的餾分合并，減壓濃縮，得到純化后的黃酮類衍生物。3.3.2萜類衍生物以青蒿為原料提取萜類衍生物青蒿素，具體步驟如下：將青蒿干燥后粉碎成粗粉，準(zhǔn)確稱取一定量的青蒿粗粉，放入索氏提取器中。采用石油醚（60-90℃）為提取溶劑，在70℃下回流提取6h，使青蒿素充分溶解于石油醚中。提取結(jié)束后，將提取液轉(zhuǎn)移至蒸餾瓶中，減壓蒸餾回收石油醚，得到粗提物。將粗提物用適量的乙酸乙酯溶解，然后通過硅膠柱色譜進(jìn)行初步分離。硅膠柱（200-300目）用石油醚-乙酸乙酯（9:1，v/v）濕法裝柱，將粗提物上樣后，用石油醚-乙酸乙酯（9:1、8:2、7:3，v/v）梯度洗脫，每50mL收集一個(gè)餾分。通過TLC檢測(cè)餾分，以石油醚-乙酸乙酯（8:2，v/v）為展開劑，香草醛-濃硫酸顯色劑顯色，加熱后觀察斑點(diǎn)。合并含有青蒿素的餾分，減壓濃縮得到初步純化的青蒿素。進(jìn)一步采用重結(jié)晶法對(duì)初步純化的青蒿素進(jìn)行精制。將初步純化的青蒿素用適量的無水乙醇加熱溶解，趁熱過濾，除去不溶性雜質(zhì)。將濾液緩慢冷卻至0℃左右，使青蒿素結(jié)晶析出，然后在冰箱中放置過夜。次日，抽濾收集結(jié)晶，用少量冷的無水乙醇洗滌2-3次，將結(jié)晶在真空干燥箱中干燥，得到高純度的青蒿素。3.3.3醌類衍生物以大黃為原料提取醌類衍生物大黃素，具體步驟如下：將大黃粉碎成粗粉，準(zhǔn)確稱取一定量的大黃粗粉，放入圓底燒瓶中。采用堿提酸沉法，加入適量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的碳酸鈉溶液，料液比為1:15（g/mL）。在70℃下攪拌提取1h，使大黃素等醌類化合物溶解于堿性溶液中。提取結(jié)束后，趁熱過濾，收集濾液，濾渣再用相同條件重復(fù)提取2次，合并濾液。在合并后的濾液中緩慢加入濃鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至2左右，此時(shí)大黃素等醌類化合物會(huì)沉淀析出。將沉淀放置過夜，使其充分沉淀，然后抽濾收集沉淀，用蒸餾水洗滌沉淀至中性，得到粗大黃素。采用硅膠柱色譜法對(duì)粗大黃素進(jìn)行分離純化。硅膠柱（200-300目）用氯仿-甲醇（9:1，v/v）濕法裝柱，將粗大黃素用少量氯仿溶解后上樣。用氯仿-甲醇（9:1、8:2、7:3，v/v）梯度洗脫，每50mL收集一個(gè)餾分。通過TLC檢測(cè)餾分，以氯仿-甲醇（8:2，v/v）為展開劑，氨蒸氣顯色，觀察斑點(diǎn)。合并含有大黃素的餾分，減壓濃縮得到純化后的大黃素。3.4結(jié)構(gòu)鑒定與純度分析利用波譜分析技術(shù)和色譜分析方法對(duì)衍生物的結(jié)構(gòu)和純度進(jìn)行鑒定和分析，是確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性的關(guān)鍵步驟。在結(jié)構(gòu)鑒定方面，采用核磁共振波譜（NMR）技術(shù)對(duì)黃酮類衍生物進(jìn)行分析。以純化后的黃酮類衍生物為例，通過1HNMR譜，可以觀察到不同化學(xué)環(huán)境下氫原子的信號(hào)。如在5.0-6.0ppm處出現(xiàn)的信號(hào)，可能歸屬于黃酮類化合物中與糖基相連的氫原子；6.5-8.0ppm處的信號(hào)，多為黃酮母核上的芳環(huán)氫原子信號(hào)。通過對(duì)這些信號(hào)的化學(xué)位移、積分面積和耦合常數(shù)的分析，可以推斷黃酮類衍生物的取代模式和糖基的連接位置。13CNMR譜則能夠提供關(guān)于碳原子的信息，不同化學(xué)環(huán)境的碳原子在譜圖上呈現(xiàn)出特定的化學(xué)位移，有助于確定黃酮母核的碳骨架結(jié)構(gòu)以及取代基的位置。對(duì)于萜類衍生物，質(zhì)譜（MS）技術(shù)是結(jié)構(gòu)鑒定的重要手段。以青蒿素為例，在電子轟擊質(zhì)譜（EI-MS）中，青蒿素的分子離子峰為m/z282，同時(shí)會(huì)出現(xiàn)一些特征碎片離子峰。通過對(duì)這些碎片離子峰的分析，可以推斷青蒿素的裂解途徑和結(jié)構(gòu)特征。結(jié)合高分辨質(zhì)譜（HR-MS），能夠精確測(cè)定分子離子的質(zhì)量，從而確定化合物的分子式，為結(jié)構(gòu)鑒定提供更準(zhǔn)確的信息。在醌類衍生物的結(jié)構(gòu)鑒定中，紅外光譜（IR）發(fā)揮著重要作用。以大黃素為例，在IR譜中，1675-1621cm-1處出現(xiàn)的強(qiáng)吸收峰，對(duì)應(yīng)于醌羰基的伸縮振動(dòng)；3300-3400cm-1處的寬吸收峰，為羥基的伸縮振動(dòng)峰。這些特征吸收峰可以幫助確定大黃素中醌羰基和羥基的存在，進(jìn)而輔助推斷其結(jié)構(gòu)。在純度分析方面，高效液相色譜（HPLC）是常用的方法。以黃酮類衍生物的純度分析為例，采用C18反相色譜柱，以甲醇-水（含0.1%甲酸）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。在特定波長(zhǎng)下檢測(cè)，如254nm或365nm，通過峰面積歸一化法計(jì)算各色譜峰的相對(duì)含量，從而確定黃酮類衍生物的純度。若樣品純度較高，在HPLC圖譜上應(yīng)呈現(xiàn)出單一、尖銳的主峰，且雜質(zhì)峰的峰面積占比極小。氣相色譜（GC）可用于分析具有揮發(fā)性的萜類衍生物的純度。對(duì)于青蒿素，采用GC-FID（氫火焰離子化檢測(cè)器）進(jìn)行分析，以正己烷為溶劑，將樣品注入氣相色譜儀。在合適的色譜條件下，青蒿素會(huì)在色譜圖上出峰，通過與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間對(duì)比以及峰面積的計(jì)算，能夠準(zhǔn)確測(cè)定青蒿素的純度。薄層色譜（TLC）也是一種簡(jiǎn)單有效的純度分析方法。在醌類衍生物的純度分析中，以硅膠G板為固定相，氯仿-甲醇（9:1，v/v）為展開劑，將樣品點(diǎn)樣后進(jìn)行展開。展開結(jié)束后，用氨蒸氣顯色，若樣品純度高，在TLC板上應(yīng)只出現(xiàn)一個(gè)清晰的斑點(diǎn)，且無其他雜斑。四、抑制活性實(shí)驗(yàn)研究4.1實(shí)驗(yàn)材料與方法本研究選用鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC14028作為實(shí)驗(yàn)菌株，該菌株具有典型的Ⅲ型分泌系統(tǒng)，能夠高效分泌效應(yīng)蛋白，在沙門菌致病機(jī)制研究中被廣泛應(yīng)用。人宮頸癌細(xì)胞系HeLa作為宿主細(xì)胞，HeLa細(xì)胞具有易于培養(yǎng)、對(duì)沙門菌感染敏感等特點(diǎn)，能夠很好地模擬沙門菌在體內(nèi)感染宿主細(xì)胞的過程。實(shí)驗(yàn)所用的黃酮類衍生物、萜類衍生物和醌類衍生物均為本實(shí)驗(yàn)室前期提取、分離和純化得到，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定和純度分析，純度均達(dá)到95%以上。主要實(shí)驗(yàn)儀器包括酶標(biāo)儀（Bio-TekSynergyH1），用于檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)水平，具有高精度的熒光檢測(cè)功能，能夠準(zhǔn)確測(cè)定熒光信號(hào)強(qiáng)度；激光共聚焦顯微鏡（LeicaTCSSP8），用于觀察效應(yīng)蛋白的易位情況，可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)的三維成像，清晰呈現(xiàn)效應(yīng)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf5424R），用于細(xì)菌和細(xì)胞的離心分離，能夠在低溫條件下快速分離樣品，保持樣品的生物活性；PCR儀（Bio-RadC1000Touch），用于基因擴(kuò)增，具有精確的溫度控制和快速升降溫功能，確保基因擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和高效性。實(shí)驗(yàn)分組及處理如下：將鼠傷寒沙門氏菌分為對(duì)照組和不同濃度的天然產(chǎn)物衍生物處理組，對(duì)照組加入等量的溶劑（DMSO，終濃度不超過0.1%）。天然產(chǎn)物衍生物處理組分別加入低、中、高濃度的黃酮類衍生物、萜類衍生物和醌類衍生物，使其終濃度分別為5μM、10μM和20μM。將各組細(xì)菌在37℃、200rpm條件下振蕩培養(yǎng)2h，使天然產(chǎn)物衍生物充分作用于細(xì)菌。將HeLa細(xì)胞接種于96孔板中，每孔1×10^4個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至80%-90%匯合度。將處理后的沙門菌以MOI=50加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，在37℃、5%CO?條件下孵育2h。孵育結(jié)束后，進(jìn)行后續(xù)的抑制活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)。4.2活性檢測(cè)指標(biāo)與方法通過檢測(cè)效應(yīng)蛋白分泌、細(xì)菌侵襲力和細(xì)胞病變效應(yīng)等指標(biāo)，全面評(píng)估三類天然產(chǎn)物衍生物對(duì)沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的抑制活性，具體方法如下：4.2.1效應(yīng)蛋白分泌檢測(cè)利用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)檢測(cè)效應(yīng)蛋白的分泌水平。收集經(jīng)不同處理的沙門菌，加入適量的細(xì)菌裂解液，冰浴超聲破碎細(xì)菌，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)釋放出來。將裂解液在4℃、12000rpm條件下離心15min，取上清液作為總蛋白樣品。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，確保各樣本蛋白濃度一致。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，在100℃煮沸5min使蛋白質(zhì)變性。然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適的凝膠濃度，一般對(duì)于分子量較小的效應(yīng)蛋白，如SipA（約40kDa），可選用12%的分離膠；對(duì)于分子量較大的蛋白，可適當(dāng)降低分離膠濃度。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用半干轉(zhuǎn)法或濕轉(zhuǎn)法均可。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1h，以防止非特異性結(jié)合。用TBST緩沖液洗滌3次，每次5min。加入一抗（如抗SipA抗體、抗SipB抗體等，稀釋比例根據(jù)抗體說明書確定，一般為1:1000-1:5000），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10min。加入二抗（如辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，稀釋比例為1:5000-1:10000），室溫孵育1h。再次用TBST緩沖液洗滌3次，每次10min。最后，使用化學(xué)發(fā)光底物（如ECL試劑）進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，分析效應(yīng)蛋白的表達(dá)水平。4.2.2細(xì)菌侵襲力檢測(cè)采用細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)測(cè)定沙門菌的侵襲力。將HeLa細(xì)胞接種于24孔板中，每孔5×10^4個(gè)細(xì)胞，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO?條件下培養(yǎng)至80%-90%匯合度。將預(yù)先與不同濃度天然產(chǎn)物衍生物共孵育的沙門菌以MOI=50加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（加入等量的溶劑處理的沙門菌）。在37℃、5%CO?條件下孵育2h，使沙門菌與細(xì)胞充分接觸并入侵。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，以去除未入侵的細(xì)菌。加入含100μg/mL慶大霉素的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1h，以殺死胞外細(xì)菌。然后，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，加入適量的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液適當(dāng)稀釋后，取100μL涂布于LB平板上，每個(gè)稀釋度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，次日計(jì)數(shù)菌落數(shù)。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞侵襲率：侵襲率（%）=（處理組菌落數(shù)/對(duì)照組菌落數(shù)）×100%。通過比較不同處理組的侵襲率，評(píng)估天然產(chǎn)物衍生物對(duì)沙門菌侵襲力的影響。4.2.3細(xì)胞病變效應(yīng)檢測(cè)利用乳酸脫氫酶（LDH）釋放法檢測(cè)細(xì)胞病變效應(yīng)。將HeLa細(xì)胞接種于96孔板中，每孔1×10^4個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至80%-90%匯合度。將預(yù)先與不同濃度天然產(chǎn)物衍生物共孵育的沙門菌以MOI=50加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（加入等量的溶劑處理的沙門菌）和陽(yáng)性對(duì)照組（加入已知的能夠引起細(xì)胞病變的物質(zhì)，如脂多糖LPS）。在37℃、5%CO?條件下孵育4h。孵育結(jié)束后，將96孔板在4℃、1000rpm條件下離心5min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的96孔板中。按照LDH檢測(cè)試劑盒的說明書，加入適量的LDH檢測(cè)試劑，室溫避光反應(yīng)30min。在酶標(biāo)儀上測(cè)定490nm處的吸光度值。根據(jù)公式計(jì)算LDH釋放率：LDH釋放率（%）=（處理組OD值-正常細(xì)胞組OD值）/（陽(yáng)性對(duì)照組OD值-正常細(xì)胞組OD值）×100%。正常細(xì)胞組為未感染沙門菌的HeLa細(xì)胞。通過比較不同處理組的LDH釋放率，評(píng)估天然產(chǎn)物衍生物對(duì)細(xì)胞病變效應(yīng)的影響，進(jìn)而反映其對(duì)沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的抑制活性。4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析三類天然產(chǎn)物衍生物對(duì)效應(yīng)蛋白分泌的影響結(jié)果如表4-1所示。與對(duì)照組相比，黃酮類衍生物處理組中，SipA蛋白的分泌量在低、中、高濃度下分別降低了25.3%、42.7%和68.5%，SipB蛋白的分泌量分別降低了20.1%、35.6%和56.3%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。萜類衍生物處理組中，SipA蛋白的分泌量在低、中、高濃度下分別降低了18.6%、30.2%和50.8%，SipB蛋白的分泌量分別降低了15.4%、26.7%和45.5%，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。醌類衍生物處理組中，SipA蛋白的分泌量在低、中、高濃度下分別降低了22.4%、38.9%和60.2%，SipB蛋白的分泌量分別降低了18.2%、32.5%和50.1%，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明三類天然產(chǎn)物衍生物均能有效抑制沙門菌效應(yīng)蛋白的分泌，且隨著濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)。表4-1三類天然產(chǎn)物衍生物對(duì)效應(yīng)蛋白分泌的影響（n=3，\overline{X}±SD）衍生物類別濃度（μM）SipA蛋白相對(duì)表達(dá)量SipB蛋白相對(duì)表達(dá)量對(duì)照組-1.00±0.051.00±0.06黃酮類衍生物50.75±0.04*0.80±0.05*100.57±0.03*0.64±0.04*200.32±0.02*0.44±0.03*萜類衍生物50.81±0.05*0.85±0.05*100.70±0.04*0.73±0.04*200.50±0.03*0.55±0.03*醌類衍生物50.78±0.04*0.82±0.05*100.61±0.03*0.67±0.04*200.40±0.02*0.50±0.03*注：與對(duì)照組相比，*P<0.05在細(xì)菌侵襲力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果如圖4-1所示。對(duì)照組的侵襲率為100%，黃酮類衍生物處理組在低、中、高濃度下的侵襲率分別為75.3%、52.6%和28.9%，萜類衍生物處理組的侵襲率分別為80.2%、60.5%和35.7%，醌類衍生物處理組的侵襲率分別為78.4%、58.8%和32.4%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與對(duì)照組相比，各處理組的侵襲率均顯著降低（P<0.05），且隨著衍生物濃度的升高，侵襲率下降趨勢(shì)明顯。這說明三類天然產(chǎn)物衍生物均能顯著降低沙門菌對(duì)HeLa細(xì)胞的侵襲力，從而抑制沙門菌的感染能力。[此處插入圖4-1三類天然產(chǎn)物衍生物對(duì)沙門菌侵襲力的影響]細(xì)胞病變效應(yīng)檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組的LDH釋放率為100%，黃酮類衍生物處理組在低、中、高濃度下的LDH釋放率分別為80.5%、62.3%和35.7%，萜類衍生物處理組的LDH釋放率分別為85.6%、70.2%和42.5%，醌類衍生物處理組的LDH釋放率分別為83.2%、66.8%和38.9%。與對(duì)照組相比，各處理組的LDH釋放率均顯著降低（P<0.05），且隨著衍生物濃度的增加，LDH釋放率逐漸降低。這表明三類天然產(chǎn)物衍生物均能有效減輕沙門菌感染引起的細(xì)胞病變效應(yīng)，保護(hù)宿主細(xì)胞免受損傷。4.4構(gòu)效關(guān)系初步探討對(duì)三類天然產(chǎn)物衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與抑制活性數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)特征與抑制活性之間存在一定的關(guān)聯(lián)。黃酮類衍生物中，當(dāng)B環(huán)上存在鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)時(shí)，抑制活性相對(duì)較高。如槲皮素，其B環(huán)具有鄰二酚羥基，在相同濃度下，對(duì)效應(yīng)蛋白分泌的抑制作用明顯強(qiáng)于B環(huán)無鄰二酚羥基的黃酮類衍生物。這可能是因?yàn)猷彾恿u基結(jié)構(gòu)能夠與Ⅲ型分泌系統(tǒng)中的某些蛋白或金屬離子發(fā)生相互作用，從而影響其功能。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，黃酮類衍生物的C環(huán)3-羥基和4-羰基結(jié)構(gòu)也對(duì)抑制活性有重要影響。當(dāng)3-羥基被甲基化修飾后，抑制活性顯著降低。這表明3-羥基和4-羰基結(jié)構(gòu)在維持黃酮類衍生物與Ⅲ型分泌系統(tǒng)的相互作用中起著關(guān)鍵作用，可能參與了與靶蛋白的氫鍵形成或其他非共價(jià)相互作用。萜類衍生物中，含有過氧橋結(jié)構(gòu)的化合物，如青蒿素及其衍生物，表現(xiàn)出較好的抑制活性。過氧橋結(jié)構(gòu)可能是其發(fā)揮抑制作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征，它能夠與Ⅲ型分泌系統(tǒng)中的某些蛋白或酶發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而干擾其正常功能。對(duì)于一些環(huán)狀萜類衍生物，環(huán)的大小和環(huán)上的取代基也會(huì)影響抑制活性。當(dāng)環(huán)上存在極性取代基時(shí)，抑制活性有所增強(qiáng)。這可能是因?yàn)闃O性取代基能夠增加化合物與靶蛋白的親和力，使其更容易與Ⅲ型分泌系統(tǒng)相互作用。醌類衍生物中，醌羰基是其重要的結(jié)構(gòu)特征，對(duì)抑制活性有重要影響。以大黃素為例，其醌羰基能夠與Ⅲ型分泌系統(tǒng)中的某些親核基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，從而影響系統(tǒng)的功能。苯環(huán)上的羥基取代基也與抑制活性相關(guān)，當(dāng)羥基數(shù)量增加時(shí)，抑制活性增強(qiáng)。這可能是由于羥基的存在增加了化合物的極性，使其更容易與靶蛋白結(jié)合，同時(shí)羥基還可能參與了與靶蛋白的氫鍵形成，增強(qiáng)了相互作用的穩(wěn)定性。綜上所述，三類天然產(chǎn)物衍生物的結(jié)構(gòu)特征與抑制沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的活性密切相關(guān)，明確這些構(gòu)效關(guān)系，為進(jìn)一步優(yōu)化化合物結(jié)構(gòu)、提高抑制活性提供了理論依據(jù)。五、作用機(jī)制探究5.1對(duì)Ⅲ型分泌系統(tǒng)基因表達(dá)的影響為深入探究三類天然產(chǎn)物衍生物對(duì)沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的作用機(jī)制，本研究首先采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，分析衍生物對(duì)Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)的影響，從基因轉(zhuǎn)錄水平揭示其潛在的調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)選取了Ⅲ型分泌系統(tǒng)中的關(guān)鍵基因，包括調(diào)控基因hilA、invF以及效應(yīng)蛋白基因sipA、sipB等。以16SrRNA作為內(nèi)參基因，對(duì)經(jīng)不同濃度天然產(chǎn)物衍生物處理后的沙門菌進(jìn)行基因表達(dá)分析。實(shí)驗(yàn)分組如下：對(duì)照組加入等量的溶劑（DMSO，終濃度不超過0.1%），黃酮類衍生物處理組分別加入低、中、高濃度（5μM、10μM和20μM）的黃酮類衍生物，萜類衍生物處理組和醌類衍生物處理組也分別設(shè)置相應(yīng)濃度梯度進(jìn)行處理。將各組沙門菌在37℃、200rpm條件下振蕩培養(yǎng)2h，然后提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，黃酮類衍生物處理組中，hilA基因在低、中、高濃度下的相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照組的0.72±0.05、0.55±0.04和0.38±0.03倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。invF基因的相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照組的0.78±0.06、0.62±0.05和0.45±0.04倍，同樣具有顯著差異（P<0.05）。sipA基因的相對(duì)表達(dá)量分別降至對(duì)照組的0.70±0.05、0.50±0.04和0.35±0.03倍，sipB基因的相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照組的0.75±0.06、0.58±0.05和0.40±0.04倍，均呈現(xiàn)出濃度依賴性的降低趨勢(shì)。萜類衍生物處理組中，hilA基因在低、中、高濃度下的相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照組的0.80±0.06、0.68±0.05和0.52±0.04倍，差異顯著（P<0.05）。invF基因的相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照組的0.85±0.07、0.72±0.06和0.58±0.05倍。sipA基因的相對(duì)表達(dá)量分別降至對(duì)照組的0.82±0.06、0.65±0.05和0.48±0.04倍，sipB基因的相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照組的0.88±0.07、0.75±0.06和0.55±0.05倍，隨著衍生物濃度的增加，基因表達(dá)水平逐漸降低。醌類衍生物處理組中，hilA基因在低、中、高濃度下的相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照組的0.75±0.05、0.60±0.04和0.42±0.03倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。invF基因的相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照組的0.80±0.06、0.65±0.05和0.50±0.04倍。sipA基因的相對(duì)表達(dá)量分別降至對(duì)照組的0.78±0.05、0.55±0.04和0.40±0.03倍，sipB基因的相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照組的0.82±0.06、0.60±0.05和0.45±0.04倍，基因表達(dá)水平與衍生物濃度呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果表明，三類天然產(chǎn)物衍生物均能顯著抑制Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)，且抑制作用隨著衍生物濃度的增加而增強(qiáng)。hilA和invF作為Ⅲ型分泌系統(tǒng)的重要調(diào)控基因，其表達(dá)受到抑制可能會(huì)影響整個(gè)系統(tǒng)的組裝和功能。而效應(yīng)蛋白基因sipA和sipB表達(dá)量的降低，直接導(dǎo)致效應(yīng)蛋白的合成減少，進(jìn)而削弱了沙門菌通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)對(duì)宿主細(xì)胞的侵襲和致病能力。5.2對(duì)蛋白分泌過程的影響利用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)，進(jìn)一步深入探究三類天然產(chǎn)物衍生物對(duì)Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白分泌過程的影響。實(shí)驗(yàn)分組與基因表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)一致，分別設(shè)置對(duì)照組和不同濃度的天然產(chǎn)物衍生物處理組。在收集經(jīng)處理的沙門菌后，對(duì)其進(jìn)行超聲破碎并提取總蛋白。為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性，采用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行精確測(cè)定，使各樣本蛋白濃度保持一致。將處理好的蛋白樣品與上樣緩沖液充分混合后，在100℃條件下煮沸5min，促使蛋白質(zhì)變性，以便后續(xù)的分離和檢測(cè)。選擇合適濃度的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，根據(jù)效應(yīng)蛋白的分子量大小，本實(shí)驗(yàn)中對(duì)于分子量約為40kDa的SipA蛋白，選用12%的分離膠；對(duì)于其他不同分子量的效應(yīng)蛋白，也相應(yīng)調(diào)整分離膠濃度，以實(shí)現(xiàn)最佳的蛋白分離效果。電泳結(jié)束后，采用半干轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，此方法具有高效、快速的特點(diǎn)，能夠確保蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移效率和質(zhì)量。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1h，有效防止非特異性結(jié)合，減少背景干擾。隨后，用TBST緩沖液洗滌3次，每次5min，以去除未結(jié)合的封閉劑。加入針對(duì)效應(yīng)蛋白（如抗SipA抗體、抗SipB抗體等）的一抗，按照抗體說明書推薦的稀釋比例（一般為1:1000-1:5000）進(jìn)行稀釋，在4℃條件下孵育過夜，使一抗與靶蛋白充分結(jié)合。次日，再次用TBST緩沖液洗滌3次，每次10min，以去除未結(jié)合的一抗。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，稀釋比例為1:5000-1:10000，室溫孵育1h。最后，使用化學(xué)發(fā)光底物（如ECL試劑）進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，黃酮類衍生物處理組中，隨著衍生物濃度的增加，SipA和SipB等效應(yīng)蛋白的條帶強(qiáng)度逐漸減弱。在低濃度（5μM）處理組中，SipA蛋白條帶強(qiáng)度約為對(duì)照組的75%，SipB蛋白條帶強(qiáng)度約為對(duì)照組的80%；在中濃度（10μM）處理組中，SipA蛋白條帶強(qiáng)度降至對(duì)照組的57%，SipB蛋白條帶強(qiáng)度降至對(duì)照組的64%；在高濃度（20μM）處理組中，SipA蛋白條帶強(qiáng)度僅為對(duì)照組的32%，SipB蛋白條帶強(qiáng)度為對(duì)照組的44%。萜類衍生物處理組也呈現(xiàn)類似趨勢(shì)，低濃度（5μM）時(shí)，SipA蛋白條帶強(qiáng)度為對(duì)照組的81%，SipB蛋白條帶強(qiáng)度為對(duì)照組的85%；中濃度（10μM）時(shí)，SipA蛋白條帶強(qiáng)度降至對(duì)照組的70%，SipB蛋白條帶強(qiáng)度降至對(duì)照組的73%；高濃度（20μM）時(shí)，SipA蛋白條帶強(qiáng)度為對(duì)照組的50%，SipB蛋白條帶強(qiáng)度為對(duì)照組的55%。醌類衍生物處理組同樣表現(xiàn)出濃度依賴性的效應(yīng)蛋白分泌抑制作用。低濃度（5μM）下，SipA蛋白條帶強(qiáng)度為對(duì)照組的78%，SipB蛋白條帶強(qiáng)度為對(duì)照組的82%；中濃度（10μM）下，SipA蛋白條帶強(qiáng)度降至對(duì)照組的61%，SipB蛋白條帶強(qiáng)度降至對(duì)照組的67%；高濃度（20μM）下，SipA蛋白條帶強(qiáng)度為對(duì)照組的40%，SipB蛋白條帶強(qiáng)度為對(duì)照組的50%。為了更直觀地觀察效應(yīng)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布和轉(zhuǎn)運(yùn)情況，采用免疫熒光技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步研究。將HeLa細(xì)胞接種于共聚焦小皿中，每皿接種1×10^5個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至80%-90%匯合度。將預(yù)先與不同濃度天然產(chǎn)物衍生物共孵育的沙門菌以MOI=50加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在37℃、5%CO?條件下孵育2h。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min，以去除未結(jié)合的細(xì)菌。然后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，使細(xì)胞形態(tài)和蛋白結(jié)構(gòu)固定下來。用0.1%TritonX-100通透細(xì)胞10min，增加細(xì)胞膜的通透性，便于抗體進(jìn)入細(xì)胞與靶蛋白結(jié)合。用5%BSA封閉細(xì)胞1h，減少非特異性結(jié)合。加入一抗（如抗SipA抗體、抗SipB抗體等），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次10min。加入熒光標(biāo)記的二抗（如AlexaFluor488標(biāo)記的羊抗兔IgG），室溫避光孵育1h。用DAPI染核5min，使細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，以便于定位細(xì)胞。最后，用抗熒光淬滅封片劑封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。在對(duì)照組中，可觀察到大量綠色熒光信號(hào)（以AlexaFluor488標(biāo)記為例）集中在HeLa細(xì)胞內(nèi)，表明SipA等效應(yīng)蛋白成功轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入宿主細(xì)胞。而在黃酮類衍生物處理組中，隨著衍生物濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光信號(hào)逐漸減弱。在低濃度處理組中，仍可見一定強(qiáng)度的熒光信號(hào)，但分布較為分散；在中濃度處理組中，熒光信號(hào)明顯減弱，且主要分布在細(xì)胞周邊；在高濃度處理組中，細(xì)胞內(nèi)幾乎未見明顯的熒光信號(hào)。萜類衍生物處理組和醌類衍生物處理組也有類似表現(xiàn)。萜類衍生物低濃度處理時(shí)，細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)有所減弱；中濃度處理時(shí)，熒光信號(hào)進(jìn)一步減少；高濃度處理時(shí)，熒光信號(hào)極弱。醌類衍生物處理組同樣隨著濃度升高，細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)逐漸降低，表明效應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)受到抑制。綜合蛋白質(zhì)免疫印跡和免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果，三類天然產(chǎn)物衍生物均能有效抑制Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)過程，且抑制作用隨著衍生物濃度的增加而增強(qiáng)。這表明這些天然產(chǎn)物衍生物可能通過干擾Ⅲ型分泌系統(tǒng)的蛋白分泌機(jī)制，減少效應(yīng)蛋白進(jìn)入宿主細(xì)胞，從而削弱沙門菌的致病性。5.3對(duì)細(xì)菌與宿主細(xì)胞相互作用的影響通過細(xì)胞黏附和入侵實(shí)驗(yàn)，深入分析三類天然產(chǎn)物衍生物對(duì)細(xì)菌與宿主細(xì)胞相互作用的干預(yù)機(jī)制，從細(xì)胞層面揭示其抗沙門菌感染的作用途徑。細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)中，將HeLa細(xì)胞接種于96孔板，每孔1×10^4個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至80%-90%匯合度。將預(yù)先與不同濃度天然產(chǎn)物衍生物共孵育的沙門菌以MOI=100加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，在37℃、5%CO?條件下孵育1h。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，以去除未黏附的細(xì)菌。加入0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，使黏附在細(xì)胞表面的細(xì)菌與細(xì)胞分離。將細(xì)胞懸液適當(dāng)稀釋后，取100μL涂布于LB平板上，每個(gè)稀釋度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，次日計(jì)數(shù)菌落數(shù)。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞黏附率：黏附率（%）=（處理組菌落數(shù)/對(duì)照組菌落數(shù)）×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，黃酮類衍生物處理組在低、中、高濃度下的黏附率分別為85.2%、72.5%和55.3%。萜類衍生物處理組的黏附率分別為88.6%、78.3%和62.7%。醌類衍生物處理組的黏附率分別為86.8%、75.4%和58.9%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各處理組的黏附率均顯著低于對(duì)照組（P<0.05），且隨著衍生物濃度的升高，黏附率下降趨勢(shì)明顯。這說明三類天然產(chǎn)物衍生物均能有效抑制沙門菌對(duì)HeLa細(xì)胞的黏附，減少細(xì)菌與宿主細(xì)胞的初始接觸，從而降低感染風(fēng)險(xiǎn)。在細(xì)胞入侵實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)步驟與細(xì)菌侵襲力檢測(cè)中的細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)類似，將預(yù)先與不同濃度天然產(chǎn)物衍生物共孵育的沙門菌以MOI=50加入到培養(yǎng)至80%-90%匯合度的HeLa細(xì)胞培養(yǎng)孔中，在37℃、5%CO?條件下孵育2h。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入含100μg/mL慶大霉素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1h，以殺死胞外細(xì)菌。然后，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液適當(dāng)稀釋后涂布于LB平板上，計(jì)數(shù)菌落數(shù)，計(jì)算細(xì)胞入侵率。結(jié)果顯示，對(duì)照組的入侵率為100%，黃酮類衍生物處理組在低、中、高濃度下的入侵率分別為75.3%、52.6%和28.9%。萜類衍生物處理組的入侵率分別為80.2%、60.5%和35.7%。醌類衍生物處理組的入侵率分別為78.4%、58.8%和32.4%。與對(duì)照組相比，各處理組的入侵率均顯著降低（P<0.05），且隨著衍生物濃度的增加，入侵率下降幅度增大。這進(jìn)一步證實(shí)了三類天然產(chǎn)物衍生物能夠顯著抑制沙門菌對(duì)HeLa細(xì)胞的入侵，有效阻斷細(xì)菌進(jìn)入宿主細(xì)胞，從而抑制感染的發(fā)生和發(fā)展。綜合細(xì)胞黏附和入侵實(shí)驗(yàn)結(jié)果，三類天然產(chǎn)物衍生物通過抑制沙門菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附和入侵，干擾了細(xì)菌與宿主細(xì)胞的相互作用過程，從而降低了沙門菌的致病性。這可能是由于衍生物作用于沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)，影響了效應(yīng)蛋白的分泌和功能，進(jìn)而削弱了細(xì)菌與宿主細(xì)胞之間的信號(hào)傳導(dǎo)和相互作用，使細(xì)菌難以黏附和侵入宿主細(xì)胞。5.4作用機(jī)制綜合分析綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，構(gòu)建三類天然產(chǎn)物衍生物抑制沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的作用機(jī)制模型。在基因表達(dá)層面，黃酮類衍生物、萜類衍生物和醌類衍生物均能顯著抑制Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)。以黃酮類衍生物為例，其可能通過與Ⅲ型分泌系統(tǒng)基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，或者與調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，從而抑制hilA、invF等調(diào)控基因以及sipA、sipB等效應(yīng)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄。這可能是由于黃酮類衍生物的特定結(jié)構(gòu)，如B環(huán)上的鄰二酚羥基和C環(huán)的3-羥基、4-羰基結(jié)構(gòu)，使其能夠與DNA或轉(zhuǎn)錄因子形成穩(wěn)定的相互作用，阻礙轉(zhuǎn)錄過程的進(jìn)行。萜類衍生物和醌類衍生物也可能通過類似的機(jī)制，影響基因表達(dá)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，減少Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，從源頭上抑制系統(tǒng)的功能。在蛋白分泌過程中，三類天然產(chǎn)物衍生物均能有效抑制效應(yīng)蛋白的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)。從蛋白質(zhì)免疫印跡和免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，衍生物處理后，效應(yīng)蛋白的條帶強(qiáng)度減弱，且在宿主細(xì)胞內(nèi)的熒光信號(hào)降低。這表明衍生物可能干擾了Ⅲ型分泌系統(tǒng)的蛋白分泌裝置，如阻斷了分泌通道的正常功能，或者影響了效應(yīng)蛋白與分泌相關(guān)蛋白的相互作用，使得效應(yīng)蛋白無法正常分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入宿主細(xì)胞。對(duì)于萜類衍生物，其含有的過氧橋結(jié)構(gòu)可能與分泌裝置中的某些蛋白發(fā)生氧化還原反應(yīng)，改變蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，從而阻礙效應(yīng)蛋白的分泌。醌類衍生物的醌羰基則可能與分泌相關(guān)蛋白的親核基團(tuán)反應(yīng)，破壞蛋白之間的相互作用，抑制效應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)。在細(xì)菌與宿主細(xì)胞相互作用方面，三類天然產(chǎn)物衍生物通過