單細胞長讀長靶向測序技術(shù)揭示卵巢癌轉(zhuǎn)錄組變異一、研究背景單細胞RNA測序（scRNA-seq）技術(shù)在解析細胞類型、狀態(tài)和動態(tài)變化方面發(fā)揮著重要作用，但傳統(tǒng)的短讀長測序技術(shù)在全面表征RNA異構(gòu)體方面存在不足。為克服限制，研究者們開發(fā)了單細胞靶向異構(gòu)體長讀長測序（scTaILoR-seq）技術(shù)，這是一種基于雜交捕獲的方法，能夠針對超過一千個感興趣的基因進行靶向測序，顯著提高了每個細胞中靶向轉(zhuǎn)錄本的中位數(shù)，為深入研究卵巢癌等疾病的轉(zhuǎn)錄組變異提供了有力工具。二、研究內(nèi)容及相關(guān)結(jié)論（一）scTaILoR-seq技術(shù)的優(yōu)化與性能評估研究者們首先對scTaILoR-seq技術(shù)進行了優(yōu)化，以提高長讀長測序的效率和準確性。通過對比不同的文庫制備方法，包括靶向、靶向+AM（artifactmitigation，偽影減少）和靶向+R2C2（rollingcircleamplification，滾環(huán)擴增）策略，研究者們發(fā)現(xiàn)靶向+AM策略在提高完整讀取比例和降低TSO-TSO（templateswitcholigo，模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸）偽影方面表現(xiàn)最佳（圖1A）。具體而言，靶向+AM策略使完整讀取比例增加了11.8%，同時顯著減少了TSO-TSO偽影，與靶向策略相比，靶向+AM策略在保持較高讀取通量的同時，提高了完整讀取的比例（圖1B）。圖1（二）單細胞水平上的轉(zhuǎn)錄組分析研究者們進一步評估了scTaILoR-seq技術(shù)在單細胞水平上的轉(zhuǎn)錄組分析能力。通過對三種卵巢癌細胞系的混合樣本進行分析，scTaILoR-seq技術(shù)能夠有效區(qū)分不同的卵巢癌細胞系（圖2A）。此外，scTaILoR-seq技術(shù)還能夠檢測到細胞類型特異性的可變剪接事件。例如，在PARP2基因中，研究者們發(fā)現(xiàn)了2號外顯子上5’可變剪接位點的使用，其頻率在三種細胞系中有所不同（圖2B）。在RTKN基因中，研究者們發(fā)現(xiàn)了特定于SK-OV-3細胞系的可變5’-UTR和第一個外顯子的使用事件（圖2C）。這些結(jié)果表明，scTaILoR-seq技術(shù)能夠在單細胞水平上揭示轉(zhuǎn)錄本的異質(zhì)性和細胞類型特異性的轉(zhuǎn)錄本表達模式。圖2（三）卵巢癌腫瘤微環(huán)境的轉(zhuǎn)錄組景觀研究者們還利用scTaILoR-seq技術(shù)對卵巢癌患者的解離腫瘤細胞（DTCs）進行了分析，以探索卵巢癌腫瘤微環(huán)境（TME）中的轉(zhuǎn)錄組變異。通過對2243個基因進行靶向測序，研究者們檢測到了8695個細胞，并識別了多種主要細胞類型，包括B細胞、T/NK細胞、髓系細胞、成纖維細胞和上皮細胞（圖3A）。在這些細胞中，研究者們發(fā)現(xiàn)了細胞類型特異性的轉(zhuǎn)錄本表達模式，例如EPCAM在上皮細胞中的表達、COL3A1和COL1A2在成纖維細胞中的表達、CD3E和CD2在T細胞中的表達以及C1QB在髓系細胞中的表達（圖3B）。此外，scTaILoR-seq技術(shù)還能夠檢測到細胞類型特異性的可變剪接事件。例如，研究者們發(fā)現(xiàn)了IL-32基因的兩種不同異構(gòu)體在CD8+T細胞和PDGFRα-/β+成纖維細胞中的差異表達（圖3C）。IL-32β異構(gòu)體在所有細胞類型中占主導(dǎo)地位，而IL-32θ異構(gòu)體在PDGFRα-/β+成纖維細胞中的表達顯著降低。這些結(jié)果表明，scTaILoR-seq技術(shù)能夠在卵巢癌腫瘤微環(huán)境中揭示細胞類型特異性的轉(zhuǎn)錄本表達和可變剪接事件。圖3（四）T細胞受體（TCR）重建與腫瘤微環(huán)境中的T細胞克隆性scTaILoR-seq技術(shù)還能夠重建T細胞受體（TCR）α/β鏈配對，為研究腫瘤微環(huán)境中的T細胞克隆性提供了新的視角。通過對兩名患者的DTCs進行分析，研究者們發(fā)現(xiàn)scTaILoR-seq技術(shù)能夠成功重建TCRα/β鏈配對，配對率達到了49.7%（圖4A）。在擴增的T細胞群體中，研究者們識別了15個高階克隆型，其中最大的克隆型群體包含7個細胞，具有相同的CDR3序列（圖4B）。這些結(jié)果表明，scTaILoR-seq技術(shù)能夠在卵巢癌腫瘤微環(huán)境中揭示T細胞的克隆性，為研究T細胞與腫瘤抗原的相互作用提供了新的工具。圖4單核苷酸變異（SNVs）的檢測與轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)變異scTaILoR-seq技術(shù)還能夠檢測到表達的單核苷酸變異（SNVs），并揭示這些變異與轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)變異之間的關(guān)聯(lián)。通過對TP53基因的分析，研究者們發(fā)現(xiàn)了一個位于外顯子7的SNV（chr17:7674241G>C），該變異在腫瘤上皮細胞的一個亞群中特異性表達（圖5A）。此外，研究者們還利用SpliceAI模型預(yù)測了與SNVs相關(guān)的隱匿性剪接事件，并通過評估參考堿基（REF）和替代堿基（ALT）匹配讀取的覆蓋度差異來識別轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)變異（圖5B）。在82個預(yù)測的SNVs中，44個顯示了覆蓋率差異，表明REF和ALT等位基因之間的轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)存在差異（圖5C）。這些結(jié)果表明，scTaILoR-seq技術(shù)能夠在單細胞水平上揭示SNVs與轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)變異之間的關(guān)聯(lián)，為理解癌癥中的轉(zhuǎn)錄復(fù)雜性提供了新的視角。圖5三、總結(jié)與展望scTaILoR-seq技術(shù)通過靶向富集和偽影減少策略，顯著提高了轉(zhuǎn)錄本檢測的靈敏度，并能夠在單細胞水平上揭示轉(zhuǎn)錄組變異、等位基因不平衡以及T細胞受體的多樣性。這些發(fā)現(xiàn)不僅為卵巢癌的轉(zhuǎn)錄組研究提供了新的見解，也為其他復(fù)雜疾病的研究提供了新的技術(shù)手段。未來，隨著單細胞全長RNA測序技術(shù)的進一步優(yōu)化和應(yīng)用，有望在更多疾病模型中實現(xiàn)更全面和深入的轉(zhuǎn)錄組分析，為