序號：編碼：“挑戰(zhàn)杯”大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽決賽作品申報(bào)書作品名稱：用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RTLAMP）新技術(shù)快速檢測H5亞型鴨流感病毒學(xué)院名稱：動物科學(xué)學(xué)院申報(bào)者姓名（集體名稱）：謝義涵吳永鋒周穗婷甘燕貞李寶紅冀君類別：√自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文 □哲學(xué)社會科學(xué)類社會調(diào)查報(bào)告和學(xué)術(shù)論文□科技發(fā)明制作A類□科技發(fā)明制作B類

A2申報(bào)者情況（集體項(xiàng)目）說明：1．必須由申報(bào)者本人按要求填寫；2．申報(bào)者代表必須是作者中學(xué)歷最高者，其余作者按學(xué)歷高低排列；3．本表中的學(xué)籍管理部門簽章視為申報(bào)者情況的確認(rèn)。申報(bào)者代表情況姓名謝義涵性別男出生年月1986年12月學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院系別、專業(yè)、年級05級動物科學(xué)(生物工程方向)學(xué)歷本科學(xué)制4年入學(xué)時(shí)間2005年9月作品名稱用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RTLAMP）新技術(shù)快速檢測H5亞型鴨流感病毒畢業(yè)論文題目通訊地址華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院郵政編碼510640辦公電話常住地通訊地址華南農(nóng)業(yè)大學(xué)華山宿舍24棟206郵政編碼510640住宅電他作者情況姓名性別年齡學(xué)歷所在單位吳永鋒男23本科華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院周穗婷女23本科華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院甘燕貞女22本科華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院李寶紅女21本科華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院冀君男24碩士研究生華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院資格認(rèn)定學(xué)院學(xué)籍管理部門意見以上作者是否為2009√是□否（部門簽章）2009年院系負(fù)責(zé)人或?qū)熞庖姳咀髌肥欠駷檎n外學(xué)術(shù)科技或社會實(shí)踐活動成果√是□否負(fù)責(zé)人簽名：2009年

B1．申報(bào)作品情況（自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文）說明：1．必須由申報(bào)者本人填寫；2．本部分中的科研管理部門簽章視為對申報(bào)者所填內(nèi)容的確認(rèn)；3．作品分類請按作品的學(xué)術(shù)方向或所涉及的主要學(xué)科領(lǐng)域填寫；4．碩士研究生、博士研究生作品不在此列。作品全稱作品分類（D）A．機(jī)械與控制（包括機(jī)械、儀器儀表、自動化控制、工程、交通、建筑等）B．信息技術(shù)（包括計(jì)算機(jī)、電信、通訊、電子等）C．?dāng)?shù)理（包括數(shù)學(xué)、物理、地球與空間科學(xué)等）D．生命科學(xué)（包括生物、農(nóng)學(xué)、藥學(xué)、醫(yī)學(xué)、健康、衛(wèi)生、食品等）E．能源化工（包括能源、材料、石油、化學(xué)、化工、生態(tài)、環(huán)保等）作品撰寫的目的和基本思路目的是建立一種快速、簡便、特異、靈敏的適合于基層實(shí)驗(yàn)室使用的H5N1亞型鴨流感病毒的檢測方法?；舅悸?根據(jù)Genbank中注冊的H5N1亞型流感病毒HA基因保守區(qū)的序列，設(shè)計(jì)一組對應(yīng)HA序列6個(gè)區(qū)域的4條特異性引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增，建立RTLAMP反應(yīng)體系，優(yōu)化LAMP反應(yīng)條件,擴(kuò)增產(chǎn)物加入核酸染色劑SYBRgreenⅠ，根據(jù)顏色反應(yīng)判斷結(jié)果（檢測結(jié)果：橙黃色為陰性，偏綠色為陽性）；還可以加入焦磷酸離子和溶液中的鎂離子結(jié)合而形成焦磷酸鎂沉淀，根據(jù)反應(yīng)管中濁度的變化判斷結(jié)果，從而建立一種新型的結(jié)果肉眼可視的鑒別鴨流感病毒的方法。作品的科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處近兩年來，LAMP方法已廣泛使用與各種病毒的快速檢測。本項(xiàng)目的指導(dǎo)老師謝青梅已建立了鴨瘟的LAMP檢測方法，研究論文發(fā)表在“ResearchinVeterinaryScience”上，該研究具有科學(xué)性和先進(jìn)性。該研究建立的LAMP方法的優(yōu)點(diǎn):(1)只需一恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)。不需要特殊試劑,不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變性；(2)特異性高；(3)快速、高效擴(kuò)增；(4)步驟簡單（5）設(shè)備要求簡單，不需要昂貴的PCR儀和凝膠成像系統(tǒng)；(6)鑒定結(jié)果可用肉眼觀察，適用于基層簡單實(shí)驗(yàn)室使用。這也是本項(xiàng)目的獨(dú)特之處。作品的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義為廣大基層養(yǎng)殖戶、畜禽場實(shí)驗(yàn)室建立一種快速、準(zhǔn)確、簡便的鴨流感病毒的鑒別診斷新方法，快速、及時(shí)地完成該疫病的檢測工作。學(xué)術(shù)論文文摘鴨流感的暴發(fā)和流行給畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，對人類健康造成了嚴(yán)重威脅?？焖僭\斷和及時(shí)監(jiān)測是控制流感的首要步驟。本研究建立一種新型、簡便、靈敏且特異的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LoopmediatedIsothermalAmplificationMethod，RTLAMP）用于H5亞型鴨流感病毒的檢測。根據(jù)Genbank中注冊的H5N1亞型鴨流感病毒HA基因保守區(qū)的序列，設(shè)計(jì)一組對應(yīng)HA序列6個(gè)區(qū)域的4條特異性引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增，建立RTLAMP反應(yīng)體系，優(yōu)化LAMP反應(yīng)條件，等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件為65℃保溫60min。反應(yīng)結(jié)果肉眼可見。在擴(kuò)增產(chǎn)物加入焦磷酸離子和溶液中鎂離子結(jié)合而形成焦磷酸鎂沉淀，可見反應(yīng)管中濁度的變化；或者在擴(kuò)增后產(chǎn)物加入核酸染色劑SYBRgreenⅠ，檢測結(jié)果陽性呈綠色，陰性為橙黃色；同時(shí)用特異性內(nèi)切酶KpnⅠ進(jìn)行酶切鑒定。用已建立的RT－LAMP技術(shù)檢測臨床樣品，檢測結(jié)果與RT－PCR方法符合率均達(dá)到100％。RTLAMP技術(shù)整個(gè)檢測過程只需1－2h，不需要貴重的PCR儀和成像系統(tǒng)，僅需要一恒溫水浴鍋即可完成試驗(yàn)。通過特異性、敏感性試驗(yàn)，作品在何時(shí)、何地、何種機(jī)構(gòu)舉行的會議上或報(bào)刊上發(fā)表及所獲獎勵鑒定結(jié)果請?zhí)峁τ诶斫?、審查、評價(jià)所申報(bào)作品具有參考價(jià)值的現(xiàn)有技術(shù)及技術(shù)文獻(xiàn)的檢索目錄甘孟侯,鄭世軍.近年來鴨流感發(fā)生和流行特點(diǎn)、動態(tài)及防控對策[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào),2006，8(5)：1926.曾冰冰，肖凱軍，石磊等.LAMP方法在食品微生物檢測中的應(yīng)用.現(xiàn)代食品與藥品雜志，2007，17（1）：22－25申報(bào)材料清單（申報(bào)論文一篇，相關(guān)資料名稱及數(shù)量）《用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RTLAMP）新技術(shù)快速檢測H5亞型鴨流感病毒》科研管理部門簽章情況屬實(shí)2009年

C.當(dāng)前國內(nèi)外同類課題研究水平概述說明：1.申報(bào)者可根據(jù)作品類別和情況填寫；2.填寫此欄有助于評審。鴨流感是由禽流感病毒引起的一種烈性傳染病,鴨流感不僅嚴(yán)重影響?zhàn)B鴨業(yè)的發(fā)展,而且會影響人類健康。建立快速，敏感，特異的檢測鴨流感病毒的方法對于防控鴨流感有著重要意義。NotomiT等(2000)開發(fā)了一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)。其特點(diǎn)是針對靶基因的6個(gè)區(qū)域,設(shè)計(jì)4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(BstDNApolymerase)在恒溫(65℃國外有報(bào)道用RT－LAMP技術(shù)檢測人流感H1、H2和H3亞型流感病毒（Leoetal，2005），還用于鑒定流感A、B型的診斷（Masahiroetal，2006）。國內(nèi)還未見用于該方法用于鴨流感病毒的檢測。D.推薦者情況及對作品的說明說明：1．由推薦者本人填寫；2．推薦者必須具有高級專業(yè)技術(shù)職稱，并是與申報(bào)作品相同或相關(guān)領(lǐng)域的專家學(xué)者或?qū)I(yè)技術(shù)人員（教研組集體推薦亦可）；3．推薦者填寫此部分，即視為同意推薦；4．推薦者所在單位簽章僅被視為對推薦者身份的確認(rèn)。推薦者情況姓名畢英佐性別男年齡62職稱教授、博導(dǎo)工作單位華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院通訊地址廣州天河五山483號華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院郵政編碼510642單位電話02085280283住宅電話推薦者所在單位簽章畢英佐老師是我校教授、博士生導(dǎo)師。（簽章）2009年請對申報(bào)者申報(bào)情況的真實(shí)性作出闡述該作品是由謝義涵同學(xué)為主的六位同學(xué)共同完成，作品內(nèi)容真實(shí)，數(shù)據(jù)可靠，結(jié)論正確。請對作品的意義、技術(shù)水平、適用范圍及推廣前景作出您的評價(jià)該作品建立的鴨流感病毒RTLAMP技術(shù)操作簡單、靈敏性好、特異性高，該方法的檢測靈敏度與熒光定量PCR方法相當(dāng)，適合于檢驗(yàn)設(shè)備簡陋的生產(chǎn)廠場、基層檢驗(yàn)檢疫單位和防疫部門使用，技術(shù)水平高，具有很好的使用價(jià)值和推廣應(yīng)用前景。其它說明推薦者情況姓名馬靜云性別女年齡34職稱副教授工作單位華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院通訊地址廣州天河五山483號華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院郵編510642單位電話02085280283住宅電話推薦者所在單位簽章馬靜云副教授是我學(xué)院碩士生導(dǎo)師、副教授。（簽章）日期2009年請對申報(bào)者申報(bào)情況的真實(shí)性作出闡述本作品是華南農(nóng)業(yè)大學(xué)本科課外科技創(chuàng)新論文，在動物科學(xué)學(xué)院基因工程實(shí)驗(yàn)室完成，利用了本實(shí)驗(yàn)室成熟的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和已有研究材料，選題具有實(shí)踐指導(dǎo)意義。謝義涵等六位同學(xué)利用課余時(shí)間積極參與本研究室的科研工作，熟悉和掌握了各項(xiàng)基因工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)。內(nèi)容真實(shí)，數(shù)據(jù)可靠，結(jié)論正確。請對作品的意義、技術(shù)水平、適用范圍及推廣前景作出您的評價(jià)本作品選題具有實(shí)踐指導(dǎo)意義，特別對現(xiàn)有鴨流感的快速診斷防治提供了新思路，為基層實(shí)驗(yàn)室提供了一種簡便可靠的檢測鴨流感病毒的新方法。該項(xiàng)目的完成體現(xiàn)了六位同學(xué)具有一定的基因工程實(shí)驗(yàn)技能，對RTLAMP方法的原理和方法的建立也能較好的掌握。本研究成果對生產(chǎn)實(shí)踐具有很好的理論和實(shí)踐指導(dǎo)作用，有推廣應(yīng)用前景。其它說明用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RTLAMP）新技術(shù)快速檢測H5亞型鴨流感病毒謝義涵吳永鋒周穗婷甘燕貞李寶紅冀君指導(dǎo)老師：謝青梅摘要：鴨流感的暴發(fā)和流行給畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，對人類健康造成了嚴(yán)重威脅?？焖僭\斷和及時(shí)監(jiān)測是控制流感的首要步驟。本研究建立一種新型、簡便、靈敏且特異的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LoopmediatedIsothermalAmplificationMethod，RTLAMP）用于H5亞型鴨流感病毒的檢測。根據(jù)Genbank中注冊的H5N1亞型鴨流感病毒HA基因保守區(qū)的序列，設(shè)計(jì)一組對應(yīng)HA序列6個(gè)區(qū)域的4條特異性引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增，建立RTLAMP反應(yīng)體系，優(yōu)化LAMP反應(yīng)條件，等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件為65℃保溫60min。反應(yīng)結(jié)果肉眼可見。在擴(kuò)增產(chǎn)物加入焦磷酸離子和溶液中鎂離子結(jié)合而形成焦磷酸鎂沉淀，可見反應(yīng)管中濁度的變化；或者在擴(kuò)增后產(chǎn)物加入核酸染色劑SYBRgreenⅠ，檢測結(jié)果陽性呈綠色，陰性為橙黃色；同時(shí)用特異性內(nèi)切酶KpnⅠ進(jìn)行酶切鑒定。用已建立的RT－LAMP技術(shù)檢測臨床樣品，檢測結(jié)果與RT－PCR方法符合率均達(dá)到100％。RTLAMP技術(shù)整個(gè)檢測過程只需1－2h，不需要貴重的PCR儀和成像系統(tǒng)，僅需要一恒溫水浴鍋即可完成試驗(yàn)。通過特異性、敏感性試驗(yàn)，驗(yàn)證了建立RTLAMP技術(shù)可以作為一種操作簡單，靈敏性、特異性高的檢測H5亞型鴨流感病毒的技術(shù)，適合于檢驗(yàn)設(shè)備簡陋的生產(chǎn)廠場、基層檢驗(yàn)檢疫單位和防疫部門使用。關(guān)鍵詞：H5亞型鴨流感病毒HARTLAMP鴨流感是由禽流感病毒引起的一種烈性傳染病,鴨流感不僅嚴(yán)重影響?zhàn)B鴨業(yè)的發(fā)展,而且會影響人類健康。建立快速，敏感，特異的檢測鴨流感病毒的方法對于防控鴨流感有著重要意義。NotomiT等(2000)開發(fā)了一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)。其特點(diǎn)是針對靶基因的6個(gè)區(qū)域,設(shè)計(jì)4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(BstDNApolymerase)在恒溫(65℃左右)中反應(yīng)1h，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果直接靠擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂的沉淀濁度進(jìn)行判斷，日本已利用這種特性研制出專門用于LAMP檢測的實(shí)時(shí)監(jiān)控濁度儀,可以實(shí)現(xiàn)對LAMP擴(kuò)增過程的全程實(shí)時(shí)監(jiān)控(Manmohanetal，2004；Yasuyoshietal，2004；Dukesetal，2006)。也有研究者通過在終產(chǎn)物中加入染料的方法直接用肉眼觀察結(jié)果（Dukesetal，2006)。而不需模板熱變性(Nagamineetal，2001)、長時(shí)間溫度循環(huán)、凝膠電泳、紫外觀察等過程。目前，國外已有較多的此類報(bào)道，并建立了專門的官方網(wǎng)站。而國內(nèi)起步較晚，2002年和2003年北京奶牛中心2次引進(jìn)LAMP法檢測胚胎的性別(王海浪等，2003)。國內(nèi)外有許多文獻(xiàn)報(bào)道該技術(shù)在不同細(xì)菌（Hungetal，2005）及病毒檢測中成功應(yīng)用的實(shí)例，如對西尼羅病毒、SARS病毒、麻疹病毒、口蹄疫病毒、山藥嵌紋病毒的檢測以及登革病毒的分型等（Hongetal，2004；Manmohanetal，2004；Shiroetal，2004；Manmohanetal，2005；Motokoetal,2005；J.P.Dukesetal，2006）。同時(shí)，人們還在不斷對LAMP技術(shù)進(jìn)行改良，使其能在疾病基因診斷、食品分析(曾冰冰等，2007)和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域更好地發(fā)揮作用。國內(nèi)還未見用于流感病毒的檢測。國外有報(bào)道用RT－LAMP技術(shù)檢測人流感H1、H2和H3亞型流感病毒（Leoetal，2005），還用于鑒定流感A、B型的診斷（Masahiroetal，2006）。LAMP法具有許多迄今為止的擴(kuò)增方法無法比擬的優(yōu)點(diǎn)：（1）只需一恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)。不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變性。（2）高特異性:應(yīng)用六個(gè)區(qū)段，四條引物，并且這六個(gè)區(qū)段的順序也有規(guī)定。原理上LAMP法擴(kuò)增的特異性很高，因此可以根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷目標(biāo)基因的存在與否,即能夠進(jìn)行細(xì)菌或病毒的定性檢測。（3）快速、高效擴(kuò)增:整個(gè)擴(kuò)增在不到1h即可完成，且產(chǎn)率可達(dá)到0.15mg/ml。為提高LAMP反應(yīng)的速度，Nagamine等（2002）通過2條環(huán)狀引物加快LAMP的反應(yīng)，使反應(yīng)時(shí)間比原來縮短近一半，提高了檢測效率。（4）靈敏度高：擴(kuò)增模板可達(dá)10拷貝。（5）步驟簡單：擴(kuò)增RNA只要在DNA基因擴(kuò)增試劑的基礎(chǔ)上加上逆轉(zhuǎn)錄酶，就能夠完全像DNA基因擴(kuò)增那樣，一步實(shí)現(xiàn)RNA擴(kuò)增（Hirokoetal，2006；H.Solimanetal，2006；Kazuyaetal，2007），反應(yīng)不需PCR儀和特殊試劑。（6）鑒定簡便：在核酸大量合成時(shí)，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀它有極高的特異性,只要用肉眼觀察或濁度儀檢測沉淀濁度就能夠判斷擴(kuò)增與否本文優(yōu)化了RTLAMP技術(shù)檢測鴨流感病毒的反應(yīng)條件，并驗(yàn)證了準(zhǔn)確性獲得一種檢測H5亞型鴨流感病毒的有效快速的可靠方法。1、材料和方法1.1環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)(LAMP)的實(shí)驗(yàn)原理環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)(LAMP)是對靶基因的6個(gè)特異部位設(shè)定4種引物，利用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，從而使靶基因高效擴(kuò)增。LAMP反應(yīng)所用到的引物，設(shè)計(jì)起來比較復(fù)雜，而且是實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增的關(guān)鍵所在。引物總共有四條，內(nèi)外引物各兩條。如圖1所示，上游的內(nèi)引物FIP(ForwardInnerPrimer)由F1c（F1的互補(bǔ)序列）、F2和TTTT連接子組成；下游的內(nèi)引物BIP（BackwardInnerPrimer）由B1c（B1的互補(bǔ)序列）、B2和TTTT連接子組成；上游的外引物F3（ForwardOuterPrimer）和下游的外引物B3（BackwardOuterPrime）分別為F3c和B3c的互補(bǔ)序列。圖1靶序列上的6段區(qū)域及四種特異性引物各區(qū)段的引物設(shè)計(jì)規(guī)則與PCR相同。設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)注意堿基的構(gòu)成、GC含量、二聚體結(jié)構(gòu)、引物序列的長度、引物與引物間的距離、Tm值（用毗鄰法求得）、3’末端不可出現(xiàn)富AT結(jié)構(gòu)等，此外擴(kuò)增的區(qū)段最好控制在300bp以內(nèi)。每條引物的長度控制在17－26nt之間；GC含量最好控制在40％－50％之間；F1c和B1c的Tm值大約為64℃－66℃，F(xiàn)2、B2、F3、B3的Tm值大約為59℃LAMP反應(yīng)原理:（1）內(nèi)引物FIP首先和F2c結(jié)合，具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶將一條單鏈的DNA置換下來。結(jié)合到DNA鏈上的FIP引物啟動互補(bǔ)鏈的合成，形成雙鏈結(jié)構(gòu)。F3再和F3c結(jié)合，啟動鏈置換反應(yīng)，釋放出1條FIP連接的互補(bǔ)鏈，在其一端能夠形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。F3引物結(jié)合到靶DNA上形成雙鏈DNA。（5）釋放出的1條FIP連接的互補(bǔ)鏈，在其一端能夠形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。（6）在步驟（5）中形成的具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的單鏈可作為模板，在另一端結(jié)合BIP和B3合成1條雙鏈。（7）B3引物結(jié)合到步驟（5）形成的具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的單鏈中，形成雙鏈DNA，并置換出1條FIP和BIP連接的互補(bǔ)鏈。（8）在步驟（6）中置換出的互補(bǔ)鏈，在其兩端均形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，形成啞鈴狀的DNA。不過啞鈴結(jié)構(gòu)很快與其一端F1c和F1互補(bǔ)，而由自我引物延伸機(jī)制合成1種雙鏈的莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA，這種莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙鏈DNA是循環(huán)反應(yīng)的原料。循環(huán)反應(yīng)中(911)，首先FIP和雙鏈莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA中的環(huán)狀結(jié)構(gòu)結(jié)合成1種有缺口的過渡性莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA，該結(jié)構(gòu)在莖上含有靶序列的1個(gè)額外反向復(fù)制序列，在對面的末端，通過BIP形成1個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在隨后的自我引物置換延伸合成過程中，在內(nèi)引物作用下，開始循環(huán)反應(yīng)，莖的長度和環(huán)的個(gè)數(shù)都逐漸增加，最后的產(chǎn)物為莖環(huán)DNA組成的混合物，即含有若干倍莖長度莖環(huán)結(jié)構(gòu)和類似花椰菜的結(jié)構(gòu)(含有在同一鏈上由退火形成的，在靶序列的交替反向重復(fù)序列之間的多重環(huán)狀結(jié)構(gòu))。其結(jié)果可以利用加SYBRGreenⅠ熒光染料后顏色變化或焦磷酸鎂濁度變化來判斷，可以直接通過肉眼觀察來判斷擴(kuò)增與否。1.2病毒鴨流感病毒株（A/duck/PT/2008(H5N1)；所有與病毒有關(guān)的試驗(yàn)均在廣東溫氏食品集團(tuán)P3實(shí)驗(yàn)室完成。1.3常用試劑AMV反轉(zhuǎn)錄酶（5U/ul）、HRPRNA酶抑制劑（40U/ul）及相應(yīng)緩沖液，dNTPs（2.5mMeach）、DNAMarkerDL2000為TaKaRa產(chǎn)品。BstDNA聚合酶為NEB公司產(chǎn)品。RNA提取試劑TRIzolReagent為Invitrogen公司產(chǎn)品。DEPC和飽和酚購自上海生工生物工程公司；氨芐青霉素、鏈霉素、溴化乙錠（EB）購自寶泰克生物科技；瓊脂糖購自基因。1.4主要儀器及設(shè)備PCRExpressGradientPCR儀，法國HYBAID公司水浴鍋，上海一恒科技。1.5引物的設(shè)計(jì)和合成根據(jù)GenBank上公布的H5亞型鴨AIVHA基因序列，比對后選取保守區(qū)域，用PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)兩條外引物（F3、B3）和兩條內(nèi)引物（FIP、BIP，引物FIP由F1c、F2和TTTT連接子組成，引物BIP由B1c、B2和TTTT連接子組成）。引物序列：F3：5’GCCATTCCACAACATACACCCFIP：5’CTGAGTCCAGTCGCAAGGACTAATCTGTTTTTCTCACCATCGGGGAATGCCBIP：5’GGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTTTGTATCCACTCCCCTGCTCATTGCB3：5’TGGTGACTCCATCTATTGCCT引物在靶序列H5亞型鴨AIVHA基因保守區(qū)序列中的對應(yīng)位置：（下劃線加粗部分為各引物序列，加粗邊框部分為KpnⅠ酶切位點(diǎn)）：F3F2F3F25’GCCATTCCACAACATACACCCTCTCACCATCGGGGAATGCCCCAAATATGTGAAATCAAACAGA3’CGGTAAGGTGTTGTATGTGGGAGAGTGGTAGCCCCTTACGGGGTTTATACACTTTAGTTTGTCT5’TTAGTCCTTGCGACTGGACTCAGAAATACCCCTCAAAGAGAGAGAAGAAGAAAAAAGAGAGGAC3’AATCAGGAACGCTGACCTGAGTCTTTATGGGGAGTTTCTCTCTCTTCTTCTTTTTTCTCTCCTGB1cFB1cF1c5’TATTTGGAGCTATAGCAGGGTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGG3’ATAAACCTCGATATCGTCCCAAATATCTCCCTCCTACCGTCCCTTACCATCTACCAACCATACC5’GTACCACCATAGCAATGAGCAGGGGAGTGGATACGCTGCAGACAAAGAATCCACTCAAAAGGC3’CATGGTGGTATCGTTACTCGTCCCCTCACCTATGCGACGTCTGTTTCTTAGGTGAGTTTTCCGTB2B25’ATAGATGGAGTCACCA3’TATCTACCTCAGTGGTB3B31.6RTLAMP方法的建立1.6.1病毒的繁殖將H5N1亞型鴨流感病毒用滅菌的生理鹽水分別以500倍稀釋后，以尿囊腔途徑接種11日齡SPF雞胚，0.2ml/胚，在37℃恒溫箱繼續(xù)孵育，棄去24h內(nèi)死亡雞胚，無菌收獲2472h內(nèi)感染胚尿囊液，用雞紅細(xì)胞測定其血凝效價(jià)，-801.6按Invitrogen公司TRIzolLSReagentRNA提取試劑盒的使用說明書進(jìn)行。在1.5mL微量離心管中加入250μL病毒尿囊液和750μLTRIzol，充分混勻，室溫放置10min；加入200μL氯仿，激烈搖動15sec，室溫靜置5min后，4℃12000r/m離心15min；取上清液于一新的滅菌1.5mL微量離心管，加500μL異丙醇，充分混勻，室溫放置10min，4℃12000r/m離心10min；棄去上清液，沉淀用70%乙醇750μL，輕輕混勻，洗滌1次，4℃12000r/m離心10min；棄去上清，風(fēng)干；用10μL經(jīng)DEPC處理的無RNA酶的三蒸水溶解沉淀，直接用于RTLAMP或1.6.3H5N1亞型鴨流感病毒HA基因保守區(qū)的LAMP擴(kuò)增分別用Lamp引物以抽提的RNA為模板，擴(kuò)增H5N1亞型病毒的HA基因片段，25μLLAMP反應(yīng)體系的組成為（設(shè)陰性對照）：10×buffer2.5μLdNTPs（2.5mM）4μLRNA1μLFIP（10μM）2μLBIP（10μM）2μLF3（10μM）0.5μLB3（10μM）0.5μLBstDNA聚合酶1μLddH2O12.5μL環(huán)介導(dǎo)等溫反應(yīng)在水浴中進(jìn)行。反應(yīng)條件為：65℃1h，80℃10min終止反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠（含0.5μg/mL的溴化乙錠）電泳檢測，電泳條件為80V、301.6.4LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切鑒定在25μL反應(yīng)體系中加入以下組分：10×buffer2μLKpnⅠ酶1μLH5的擴(kuò)增產(chǎn)物5μLddH2O12μL總體積25μL將上述反應(yīng)物混勻離心后，37℃反應(yīng)2h。反應(yīng)后取5μL反應(yīng)液，用2%瓊脂糖凝膠（含0.5μg/mLEB）電泳對酶切反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測。1.7LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化不同反應(yīng)時(shí)間在25μL反應(yīng)體系中加入同1.6.3步驟的混合物，設(shè)陰性對照，混勻離心后，將反應(yīng)物放在65℃水浴鍋中，分別在反應(yīng)后10min、30min、40min、60min后取出。待反應(yīng)產(chǎn)物全部取出后，取5μL反應(yīng)液，用2不同反應(yīng)溫度同樣，在25μL反應(yīng)體系中加入反應(yīng)混合物，設(shè)陰性對照，混勻離心后，將反應(yīng)物分別放在55℃、60℃、65℃水浴鍋中反應(yīng)1h，80℃10min。反應(yīng)后取51.8特異性試驗(yàn)分別提取NDV（雞新城疫病毒）、IBV（雞傳染性支氣管炎病毒）、H5亞型AIV的核酸，用H5lamp引物進(jìn)行RT－LAMP檢測。1.9靈敏度試驗(yàn)將抽提出的病毒RNA進(jìn)行10倍遞進(jìn)稀釋后作為RT－LAMP反應(yīng)的模板，反應(yīng)后產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測。1.10陽性樣品的RT－LAMP檢測對3份H5亞型鴨AIV陽性樣品進(jìn)行了RT－LAMP檢測。1.11酶切鑒定和可視化結(jié)果在20μL反應(yīng)體系中加入以下組分：10×buffer2μL,KpnⅠ酶1μL,H5AIV的擴(kuò)增產(chǎn)物5μL,ddH2O12μL,上述反應(yīng)物混勻離心后，37℃反應(yīng)4h。反應(yīng)后取5μL反應(yīng)液，用KpnⅠ對H5亞型病毒LAMP產(chǎn)物進(jìn)行消化，用2%瓊脂糖凝膠（含0.5μ選擇一陽性管在反應(yīng)前另加入SYBRGreenI染料或4mMMg2+，反應(yīng)結(jié)束后觀察陽性管與對照管的差異。1.12H5亞型鴨AIV待測樣品的RTLAMP與RT－PCR檢測方法比較用本研究建立的RT－LAMP技術(shù)檢測臨床樣品6份，RT－PCR方法按傳統(tǒng)步驟進(jìn)行。結(jié)果與分析2.1最佳反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化本試驗(yàn)設(shè)定了55℃、60℃、65℃三個(gè)反應(yīng)溫度；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這三種溫度條件下均能進(jìn)行LAMP反應(yīng)，但是，不同溫度條件下，擴(kuò)增產(chǎn)物的含量有差異；這表明，BstDNA聚合酶在不同溫度下活性大小不同，在65℃下，活性最大，而在55℃時(shí)，反應(yīng)活性較小。因此，反應(yīng)在50℃－65℃圖1不同反應(yīng)溫度條件下H5亞型鴨AIVRTLAMP擴(kuò)增結(jié)果M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1－3分別為在65℃、60℃、圖2不同反應(yīng)時(shí)間下H5亞型鴨AIVRTLAMP擴(kuò)增結(jié)果M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；，1－4分別為反應(yīng)60min、40min、30min、20min后的LAMP擴(kuò)增結(jié)果，5為陰性對照2．2RTLAMP的靈敏性、特異性測定用H5lamp引物分別對H5鴨AIV、NDV、IBDV、IBV和H9AIV進(jìn)行RT－LAMP檢測，結(jié)果顯示：本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的H5lamp引物具有高度的特異性，只有針對H5亞型鴨AIV才出現(xiàn)目的條帶，其它病毒均不擴(kuò)增，如圖3。將抽提出來的RNA產(chǎn)物進(jìn)行10倍遞進(jìn)稀釋至107，進(jìn)行RT－LAMP反應(yīng)，即使在很低拷貝的模板RNA存在時(shí)（107），仍有微弱的產(chǎn)物帶，并且可以在紫外燈下進(jìn)行對比（圖4），可檢測到的濃度最低為1ng/ml。圖3H5亞型RTLAMP檢測的特異性試驗(yàn)M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；4為H5亞型AIV的陽性結(jié)果，1，2、3，5分別為H9亞型AIV，NDV，IBDV及IBV的陰性結(jié)果；6為陰性對照圖4H5亞型RTLAMP檢測的靈敏度試驗(yàn)上圖M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；下圖為加入核酸染料SYBRgreenⅠ后在紫外燈照射下的可視結(jié)果。1為陰性對照，2－7為產(chǎn)物稀釋至107、106、105、104、103、102倍的結(jié)果；2．3RTLAMP反應(yīng)產(chǎn)物的酶切鑒定和可視鑒別理論計(jì)算中，H5亞型擴(kuò)增終產(chǎn)物經(jīng)內(nèi)切酶KpnⅠ消化后，應(yīng)成為兩條大小分別為76bp和140bp的主帶以及少量其它大小不同的條帶，圖5結(jié)果與理論值完全相符。圖6顯示了在自然光下LAMP的擴(kuò)增結(jié)果，可見陽性管的反應(yīng)液已明顯混濁，這是因?yàn)閿U(kuò)增后形成的焦磷酸離子和溶液中的鎂離子結(jié)合而形成焦磷酸鎂沉淀所致。圖7顯示RTLAMP陽性擴(kuò)增產(chǎn)物加入SYBRGreenI染料可見綠色熒光（管2）。圖5RTLAMP反應(yīng)產(chǎn)物的酶切鑒定M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1為LAMP擴(kuò)增后產(chǎn)物經(jīng)內(nèi)切酶KpnⅠ消化后的結(jié)果；2為LAMP擴(kuò)增后產(chǎn)物；圖6為H5亞型AIVRTLAMP產(chǎn)物形成焦磷酸鎂沉淀的可視結(jié)果1為陰性對照管，2為RTLAMP陽性擴(kuò)增管，有白色沉淀出現(xiàn)。1212B圖7為H5亞型AIVRTLAMP產(chǎn)物加入SYBRGreenI染料可視結(jié)果1為陰性結(jié)果，2為陽性結(jié)果。2.4H5亞型AIV待測樣品的RTLAMP與RT－PCR檢測方法比較用已建立的RT－LAMP技術(shù)檢測臨床樣品，檢測臨床樣品結(jié)果與RT－PCR方法結(jié)果一致，如圖8。12123456陰性對照圖8待測樣品的RTLAMP和RTPCR檢測M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；2、3、5樣品經(jīng)RTLAMP和RTPCR檢測均為陽性；1、4、6為陰性。3討論世界上最早于1952年由Walker等從加拿大商品鴨中分離到鴨流感（AIV），但未鑒定其亞型。水禽不僅是鴨流感病毒的巨大貯存庫，且其本身已成為對鴨流感病毒高度易感的自然感染發(fā)病、死亡的禽類。檢測水禽群體中是否存在流感病毒存在，采取相應(yīng)預(yù)防與干預(yù)措施，對整體控制鴨流感病毒有著重要的意義。根據(jù)上述結(jié)果，本研究建立的H5亞型鴨流感病毒RTLAMP快速檢測技術(shù)具有靈敏、簡便、特異性高及結(jié)果可視鑒別的優(yōu)點(diǎn)，有利于診斷與控制此病。由于RNA酶在環(huán)境中的廣泛存在，RNA很容易降解。這在核酸檢測中，使得RNA比DNA在靈敏性上有所限制，傳統(tǒng)RTPCR中，反轉(zhuǎn)錄過程需要將近一小時(shí)時(shí)間，有文獻(xiàn)證明LAMP比PCR更靈敏(Gunimaladevietal.,2005;Konoetal.,2005;Savanetal.,2004)，只需要很低的拷貝數(shù)就可進(jìn)行擴(kuò)增，所以在RTLAMP反應(yīng)過程中，反轉(zhuǎn)錄的時(shí)間只設(shè)定為10min就已經(jīng)足夠，這又縮短了檢測時(shí)間，在保證高靈敏度的同時(shí)，能夠快速獲得診斷結(jié)果。RTLAMP反應(yīng)過程中有副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀的產(chǎn)生，使陽性反應(yīng)管有明顯的變渾濁現(xiàn)象，同時(shí)大量的擴(kuò)增產(chǎn)物在結(jié)合核酸染色劑SYBRⅠ的情況下，有肉眼可見的顏色變化(Soliman,etal.,2005)（陰性為橙黃色，陽性偏綠色），雖然僅靠這些判斷并不準(zhǔn)確，不能排除非特異性擴(kuò)增，但結(jié)果的可視觀察，可以脫離凝膠成像的操作要求和儀器限制，加上擴(kuò)增是等溫進(jìn)行，不用依賴PCR儀復(fù)雜的循環(huán)溫度變化，在水浴鍋中就能進(jìn)行，這些都使該技術(shù)在小型研究所、衛(wèi)生站有更廣闊的應(yīng)用前景。LAMP的高靈敏性同時(shí)會增大反應(yīng)假陽性的幾率，在檢測過程中要進(jìn)行物理分區(qū)，核酸抽提、核酸擴(kuò)增以及產(chǎn)物電泳都應(yīng)分別在獨(dú)立的環(huán)境中進(jìn)行，因?yàn)楫a(chǎn)物電泳圖為梯狀拖帶圖樣，一旦出現(xiàn)非特異應(yīng)擴(kuò)增不易察覺，所以用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行鑒定就十分必要。今年來，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)LAMP擴(kuò)增反應(yīng)所需要的BST聚合酶對血液、細(xì)胞培養(yǎng)液等各種物質(zhì)表現(xiàn)出比Taq聚合酶更高的耐受性（Kaneko,etal.,2007），對于DNA的檢測來說，核酸抽提或許能省略就能達(dá)到檢測的目的，這是一個(gè)很閃光的優(yōu)點(diǎn)?？傊琑TLAMP作為一種便捷、高特異性、高靈敏度的新型核酸擴(kuò)增方法，隨著方法的不斷發(fā)展與改進(jìn)，必將會在分子生物學(xué)特別是傳染病的病原診斷方面發(fā)揮重要作用[參考文獻(xiàn)]：[1]甘孟侯,鄭世軍.近年來鴨流感發(fā)生和流行特點(diǎn)、動態(tài)及防控對策[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào),2006，8(5)：1926.[2]曾冰冰，肖凱軍，石磊等.LAMP方法在食品微生物檢測中的應(yīng)用.現(xiàn)代食品與藥品雜志，2007，17（1）：22－25[3]Notomi,T.,Okayama,H.,Masubuchi,H.,Yonekawa,T.,Watanabe,K.,Amino,N.,Hase,T.,2000.LoopmediatedisothermalamplificationofDNA.NucleicAcidsResearch.12,E63e63.[4]Nagamine,K.,Watanabe,K.,Ohtsuka,K.,Hase,T.,Notomi,T.Loopmediatedisothermalamplificationreactionusinganondenaturedtemplate.ClinicalChemistry.2001，47,1742–1743.[5]Mori,Y.,Nagamine,K.,Tomita,N.,Notomi,T.,2001.DetectionofLoopMediatedIsothermalAmplificationReactionbyTurbidityDerivedfromMagnesiumPyrophosphateFormation.BiochemicalandBiophysicalResearchmunications289,150154.[6]Gunimaladevi,I.,Kono,T.,Venugopal,M.N.,Sakai,M.,2004,Detectionofkoiherpesvirusinmoncarp,CyprinuscarpioL.,byloopmediatedisothermalamplification.JournalofFishDiseases10,583–593.[7]Gunimaladevi,I.,Kono,T.,Lapatra,S.E.,Sakai,M.,2005,Aloopmediatedisothermalamplification(LAMP)methodfordetectionofinfectioushematopoieticnecrosisvirus(IHNV)inrainbowtrout(Oncorhynchusmykiss).ArchivesofVirology150,899909.[8]Kono,T.,Savan,R.,Sakai,M.,Itami,T.,2004.Detectionofwhitespotsyndromevirusinshrimpbyloopmediatedisothermalamplification.JournalofVirologicalMethods115,59–65.[9]Savan,R.,Kono,.T,Itami,T.Sakai,M.,2005.Loopmediatedisothermalamplification:anemergingtechnologyfordetectionoffishandshellfishpathogens.JournalofFishDiseases28,573–581.[10]Soliman,H.,ElMatbouli,M.,2005.AninexpensiveandrapiddiagnosticmethodofKoiHerpesvirus(KHV)infectionbyloopmediatedisothermalamplification.JournalofVirology2,8390.[11]Kaneko,H.,TakashiKawana,T.,Fukushima,E.,Suzuta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