第三章細(xì)胞生物學(xué)研究辦法顯微技術(shù)生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)放大倍數(shù)：成像大小與原物體大小比值。分辨率（分辨力）：指分辨物體最小間隔的能力。樣品的反差狀況：被觀察構(gòu)造與其背景對(duì)光吸取的差別程度。一、顯微觀察中的幾個(gè)參數(shù)光的干涉分辨率——取決于光源波長(zhǎng)λ、物鏡鏡口角α和介質(zhì)折射率N不同光線的波長(zhǎng)Magnificationandresolution

細(xì)胞大小和觀察人眼0.2mm；光鏡0.2μm；電鏡0.2nm

二、光學(xué)顯微鏡：以可見(jiàn)光（或紫外線）為光源。1.普通光學(xué)顯微鏡構(gòu)成：照明系統(tǒng)：可見(jiàn)光光學(xué)放大系統(tǒng)；光能夠透過(guò)樣品放大倍數(shù)：1000-1400樣品制備固定樣品保持在原始狀態(tài)。包埋石蠟或樹(shù)脂包埋切片制成薄片染色提高對(duì)比度。2.活細(xì)胞觀察相差顯微鏡（P.Zernike，1932）：物鏡后裝有相差板，根據(jù)細(xì)胞內(nèi)容物的折射率不同來(lái)增加樣品反差。微分干涉顯微鏡(1952,nomarski）：平面偏振光，增加樣品反差。將直射光和物體衍射的光分開(kāi)；使兩束光互相干涉，使物體呈現(xiàn)明暗對(duì)比，因而能夠識(shí)別無(wú)色透明物體。

聚光鏡中央有擋光片，照明光不直接進(jìn)入物鏡(散射光），只有標(biāo)本反射或衍射光才干進(jìn)入，視野背景是暗的，樣品是亮的。暗視野顯微鏡Bright-fieldMicroscopyPhase-contrastMicroscopyNomarskidifferential-interference-contrastMicroscopyDark-fieldMicroscopy能夠觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞（顯微錄像技術(shù)）

3熒光顯微鏡

(1941,Coons）

fluorescencemicroscope光源和樣品之間加上激發(fā)濾光片。物鏡和目鏡之間裝有阻斷濾片。用于特定核酸序列在染色體上的定位，使DNA雜交技術(shù)和熒光染色技術(shù)的結(jié)合。

FluorescenceInSituHybridisation免疫熒光染色及熒光放大技術(shù)用于特異蛋白在細(xì)胞中的定位研究；根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合特性。多熒光染色技術(shù)綠色:紡錘體紅色:著絲點(diǎn)藍(lán)色:DNA4激光共聚焦掃描顯微境

Laserconfocalscanningmicroscope用激光作光源；能顯示細(xì)胞樣品的立體構(gòu)造。分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色為微管5倒置顯微鏡物鏡與照明系統(tǒng)顛倒；用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，普通含有相差物鏡。

三、電子顯微鏡

以電子束為光源。用于觀察超微構(gòu)造（不大于0.2μm），又稱(chēng)亞顯微構(gòu)造。

scanningelectronmicroscope,SEM1掃描電子顯微鏡用來(lái)觀察標(biāo)本的表面構(gòu)造；高真空系統(tǒng)；電子束為光源；電磁透鏡聚焦；通過(guò)電子束掃描樣品表面產(chǎn)生二次電子成像；有效放大倍率20000；樣品切片后需金屬鍍膜。系統(tǒng)與SEM相似；實(shí)際放大倍數(shù)可達(dá)幾十萬(wàn)倍；光源穿過(guò)樣品，因此切片規(guī)定非常?。?0-50nm)。用重金屬鹽染色。1.原理2透射電子顯微鏡transmissionelectronmicroscope,TEM光學(xué)顯微鏡照片×1000掃描電鏡照片×4000透射電鏡照片（×20000）三維立體圖像的構(gòu)建樣品在不同的角度切片和觀察拍照，然后通過(guò)電腦重構(gòu)。

UseoftheElectronMicroscopetoproducea3Dimage

第二節(jié)生物化學(xué)與分子

生物學(xué)技術(shù)一、離心技術(shù)涉及細(xì)胞組分分離和生物大分子分離，分離后的成分能夠用于進(jìn)一步的研究1差速離心

Differentialcentrifugation根據(jù)被分離物質(zhì)的體積差別，采用逐步提高離心速度的辦法分離不同大小的細(xì)胞器。介質(zhì)密度均一；速度由低向高，逐級(jí)離心；體積越小，需要離心速度越高，。LowspeedHighspeedDifferentialcentrifugation2密度離心在離心管內(nèi)形成一密度梯度，通過(guò)離心力作用使不同密度的顆粒懸浮到對(duì)應(yīng)的介質(zhì)密度區(qū)。慣用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。速度沉降分離密度相近而大小形狀不同的細(xì)胞組分；密度梯度較??；各細(xì)胞組分在不同速度下沉降，形成不同沉降帶。等密度沉降分離不同密度的細(xì)胞組分；介質(zhì)為高密度持續(xù)梯度；組分在相似離心力下長(zhǎng)時(shí)間沉降到與本身密度相等的位置。Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentation層析法-分離蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)，根據(jù)待分離組分的形態(tài)、大小、電荷的不同進(jìn)行分離辦法。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)和DNA等；根據(jù)樣品大小、形狀、電荷分布不同所引發(fā)在電場(chǎng)中遷移速率不同達(dá)成分開(kāi)的目的。TheFluorescentActivatedCellSorter二、分子雜交技術(shù)

分子雜交（molecularhybridization）指含有一定同源序列的兩條核酸單鏈（DNA或RNA），在一定條件下按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則雜交，形成異質(zhì)雙鏈的過(guò)程。

人類(lèi)染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片1原位雜交（insituhybridization）2Southern雜交3菌落雜交第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)

可獲得大量的細(xì)胞；在離體條件下觀察和研究細(xì)胞生命活動(dòng)的規(guī)律，涉及細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、信號(hào)轉(zhuǎn)到，合成代謝等群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右）

一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)原代細(xì)胞（primaryculture）從有機(jī)體取出后立刻培養(yǎng)的細(xì)胞，普通指1～10代體外培養(yǎng)細(xì)胞。傳代細(xì)胞（subculture）適應(yīng)在體外培養(yǎng)傳代的細(xì)胞。細(xì)胞系（cellline）：可傳代40～50次的傳代細(xì)胞。持續(xù)細(xì)胞系：原代培養(yǎng)細(xì)胞成功傳代即為細(xì)胞系,可能無(wú)限制的傳下去。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程二、植物細(xì)胞培養(yǎng)外植體培養(yǎng)：誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織。

原生質(zhì)體培養(yǎng)：培養(yǎng)脫壁后的細(xì)胞。

單倍體培養(yǎng)：通過(guò)花藥或花粉