熒光定量PCR的原理及使用熒光定量PCR(FQ-PCR)是新近出現(xiàn)的一種定量PCR檢測方法。其基本特點是：1、用產(chǎn)生熒光信號的指示劑顯示擴增產(chǎn)物的量。2、熒光信號通過熒光染料嵌入雙鏈DNA，或雙重標記的序列特異性熒光探針或能量信號轉(zhuǎn)移探針等方法獲得，大大提高了檢測的靈敏度、特異性和精確性。3、動態(tài)實時連續(xù)熒光檢測，免除了標本和產(chǎn)物的污染，且無復雜的產(chǎn)物后續(xù)處理過程，高效、快速。下面介紹常用的幾種檢測方法：雙鏈DNA內(nèi)插染料某些染料如SYBRGreenⅠ能選擇性地與雙鏈DNA結(jié)合，同時產(chǎn)生強烈熒光。在PCR過程中SYBRGreenⅠ可與新合成的雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生的熒光信號與雙鏈DNA成正比。SYBRGreenI熒光染料技術原理SYBRGreenI是一種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料。當它與DNA雙鏈結(jié)合時，發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。因此，在一個體系內(nèi)，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。SYBRGreen熒光染料法定量PCR的基本過程是：1、開始反應，當SYBRGreen染料與DNA雙鏈結(jié)合時發(fā)出熒光。2、DNA變性時，SYBRGreen染料釋放出來，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR產(chǎn)物。4、聚合完成后，SYBRGreen染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大。SYBRGreenI熒光染料與DNA雙鏈的結(jié)合

SYBRGreenI熒光染料能與所有的DNA雙鏈相結(jié)合，對DNA模板沒有選擇性，所以特異性不如TaqMan探針。要想用熒光染料法得到比較好的定量結(jié)果，對PCR引物設計的特異性和PCR反應的質(zhì)量要求就比較高。在此前提下，本法是一種成本低廉的選擇。TaqMan探針技術原理TaqMan探針法是高度特異的定量PCR技術，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號。由于探針與模板是特異性結(jié)合，所以熒光信號的強弱就代表了模板的數(shù)量。在TaqMan探針法的定量PCR反應體系中，包括一對PCR引物和一條探針。探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點在兩條引物之間。探針的5′端標記有報告基團(Reporter,R)，如FAM、VIC等，3′端標記有熒光淬滅基團(Quencher,Q)，如TAMRA等。當探針完整的時候，報告基團所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其5′→3′外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團遠離淬滅基團，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號。所以，每經(jīng)過一個PCR循環(huán)，熒光信號也和目的片段一樣，有一個同步Ct值的含義是:每個反應管內(nèi)的熒光信號達到設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明,每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系,起始拷貝數(shù)越多,Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線,因此只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。1、雙鏈DNA內(nèi)插染料常用的是SYBRGreenI熒光染料，其技術原理：SYBRGreenI是一種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料。當它與DNA雙鏈結(jié)合時，發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。因此，在一個體系內(nèi)，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。SYBRGreen熒光染料法定量PCR的基本過程是：1、開始反應，當SYBRGreen染料與DNA雙鏈結(jié)合時發(fā)出熒光。2、DNA變性時，SYBRGreen染料釋放出來，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR產(chǎn)物。4、聚合完成后，SYBRGreen染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大。熒光染料檢測法一般主要是利用熒光染料(如SYBRGreenI)與雙鏈DNA分子結(jié)合發(fā)光的特性來指示擴增產(chǎn)物的增加，優(yōu)點是：無需另外設計熒光探針，無需特別優(yōu)化條件，簡便易行，成本較低，能適用于任何一款定量PCR儀。熒光染料法實質(zhì)上是常規(guī)的PCR反應中添加了熒光染料，借助染料和雙鏈DNA的結(jié)合所發(fā)出的熒光實時監(jiān)控反應的進程。由于不需要設計序列特異性探針和優(yōu)化反應條件，價格低廉，通用性強，而且熒光染料法可用于任何一種型號的定量PCR儀，因而同樣得到廣泛采用。在PCR反應體系中，加入過量SYBRGreenI熒光染料，SYBR熒光染料摻入DNA雙鏈后熒光信號顯著增強；當DNA變性時SYBRGreenI染料釋放出來，熒光急劇減少；隨后在聚合延伸過程中引物退火并形成PCR產(chǎn)物，SYBRGreen染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，經(jīng)檢測獲得熒光的凈增量。熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。熒光染料可以在反應末尾對擴增產(chǎn)物進行溶解，稱為溶解曲線分析。在溶解曲線分析過程中，隨著溫度從低于產(chǎn)物溶解點緩慢升到高于產(chǎn)物溶解點，定量PCR儀連續(xù)監(jiān)測每個樣品的熒光值。基于產(chǎn)物長度和G/C含量的不同，擴增產(chǎn)物會在不同的溫度點解鏈。隨著產(chǎn)物的解鏈就可以看到熒光值的降低并被儀器所測量。對溶解曲線進行微分可以計算出溶解峰。溶解峰可以反映反應中擴增到的產(chǎn)物，因此用溶解曲線數(shù)據(jù)就可以進行定量檢測了。將強毒株H2的RNA模板做10倍倍比稀釋后，用紫外分光光度計測定其濃度，然后按下面的公式轉(zhuǎn)換成模板的拷貝數(shù)：拷貝數(shù)=NDV模板濃度×阿氏常數(shù)／(一個堿基的平均分子量×NDV模板的總長度)其中，阿氏常數(shù)為6.02×1023，一個堿基的平均分子量為324.5，ND