C6/36細胞感染登革Ⅱ型病毒相關表達蛋白鑒定與機制解析一、引言1.1研究背景與意義登革熱是一種由登革病毒（Denguevirus，DENV）引發(fā)的急性傳染病，主要通過埃及伊蚊和白紋伊蚊叮咬傳播，廣泛流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)，給全球公共衛(wèi)生帶來了嚴峻挑戰(zhàn)。世界衛(wèi)生組織（WHO）數據顯示，全球每年約有3.9億人感染登革病毒，其中約9600萬人出現明顯癥狀，登革熱已成為這些地區(qū)的重要公共衛(wèi)生問題。登革病毒感染人體后，臨床表現多樣，從輕微的登革熱（Denguefever，DF）到嚴重的登革出血熱（Denguehemorrhagicfever，DHF）和登革休克綜合征（Dengueshocksyndrome，DSS），重癥患者可出現多器官功能衰竭、休克甚至死亡，嚴重威脅人類生命健康。登革病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，為單股正鏈RNA病毒，根據抗原性和基因序列差異，可分為4種血清型，即DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4。不同血清型的登革病毒在傳播范圍、致病機制和臨床癥狀等方面存在一定差異，但都能引發(fā)登革熱相關疾病。其中，登革Ⅱ型病毒（DENV-2）在全球范圍內的傳播較為廣泛，且與登革出血熱和登革休克綜合征的發(fā)生密切相關，是導致登革熱重癥化的重要血清型之一。深入探究登革病毒的感染機制，對于開發(fā)有效的防治策略至關重要。病毒感染細胞是一個復雜的過程，涉及病毒與宿主細胞表面受體的識別、結合，以及病毒基因組進入細胞后的復制、轉錄和翻譯等多個環(huán)節(jié)。在這個過程中，宿主細胞的蛋白質表達會發(fā)生顯著變化，這些變化不僅反映了細胞對病毒感染的應答，也可能在病毒感染的進程、致病機制以及宿主免疫反應中發(fā)揮關鍵作用。因此，鑒定和分析登革病毒感染細胞前后的差異表達蛋白，有助于揭示病毒與宿主細胞之間的相互作用機制，為理解登革病毒的致病機理提供重要線索。C6/36細胞是從白紋伊蚊胚胎期分離出的一株細胞系，對登革病毒具有高度的易感性，是研究登革病毒感染機制的常用細胞模型。利用C6/36細胞研究登革病毒感染，具有諸多優(yōu)勢。一方面，C6/36細胞易于培養(yǎng)和操作，能夠在體外大量擴增，為實驗提供充足的細胞來源；另一方面，C6/36細胞能夠支持登革病毒的吸附、侵入、復制和釋放等整個生命周期，能夠較好地模擬登革病毒在自然宿主（伊蚊）體內的感染過程。通過研究登革病毒感染C6/36細胞前后的蛋白質表達變化，可以深入了解病毒感染對宿主細胞生理功能的影響，以及宿主細胞對病毒感染的防御機制。本研究旨在對C6/36細胞感染登革Ⅱ型病毒后的相關表達蛋白進行初步鑒定，通過比較感染前后細胞蛋白質表達譜的差異，篩選出與登革病毒感染相關的關鍵蛋白。這不僅有助于揭示登革Ⅱ型病毒的感染機制，為深入理解登革病毒致病的分子生物學過程提供理論依據；還可能為登革熱的診斷、治療和疫苗研發(fā)提供新的靶點和思路，具有重要的理論意義和潛在的應用價值。1.2國內外研究現狀在登革病毒感染C6/36細胞的研究方面，國內外學者已取得了一定的成果。國外早期研究主要集中在病毒的吸附與侵入機制。如通過X射線晶體衍射技術，明確了登革病毒包膜蛋白E的三維結構，其結構域Ⅲ區(qū)被認為是細胞受體的結合位點，該區(qū)域突變會影響病毒毒力及與細胞的結合。Juan等學者用放射標記的登革-4型病毒在C6/36細胞上鑒定出相對分子質量分別為45000和40000的受體，經高碘酸鈉處理后，推斷它們是由35000-37000處蛋白分子不同糖基化水平生成。Chee等利用病毒輔覆蛋白結合分析（VOPBA）及質譜分析技術，在C6/36細胞上鑒定出大小為48000的微管蛋白樣分子D2BP，認為其是登革病毒在C6/36細胞上的受體。國內研究也逐步深入。中山大學李廷慶等人通過提取C6/36細胞和登革Ⅱ型病毒感染后的C6/36細胞的可溶性蛋白質，進行SDS-PAGE凝膠電泳對比分析，發(fā)現約40000Mr和70000Mr處，感染后的蛋白條帶比正常細胞明顯粗亮，且經Western-blot鑒定確認這些差異條帶是C6/36細胞本身表達的蛋白質。在病毒感染對C6/36細胞生理功能影響的研究上，國內學者從細胞周期、凋亡等方面進行了探索，發(fā)現登革病毒感染會引起C6/36細胞周期阻滯和凋亡相關蛋白表達變化。在登革病毒感染相關表達蛋白的研究中，國外利用蛋白質組學技術，對感染不同時間點的C6/36細胞蛋白表達譜進行分析，篩選出多個差異表達蛋白，如熱休克蛋白、核糖體蛋白等，推測它們在病毒感染、復制及宿主免疫應答中發(fā)揮作用。國內也開展了類似研究，通過二維電泳和質譜技術，鑒定出登革病毒感染C6/36細胞后差異表達的多種蛋白，包括參與能量代謝、信號轉導的蛋白等。然而，當前研究仍存在不足之處。在病毒感染機制方面，雖然對包膜蛋白E與細胞受體的結合有一定認識，但對于病毒進入細胞后的后續(xù)過程，如病毒基因組如何在細胞內精準定位并啟動復制，以及宿主細胞如何早期感知病毒感染并啟動防御信號通路等關鍵環(huán)節(jié)，仍有待深入研究。在相關表達蛋白的研究中，目前鑒定出的差異表達蛋白大多僅停留在初步篩選和功能推測階段，缺乏對這些蛋白具體生物學功能及相互作用網絡的深入解析。此外，不同研究中所采用的實驗條件和方法存在差異，導致研究結果難以直接比較和整合，限制了對登革病毒感染機制和相關表達蛋白功能的全面理解。1.3研究目的與創(chuàng)新點本研究旨在運用蛋白質組學技術，全面、系統(tǒng)地鑒定C6/36細胞感染登革Ⅱ型病毒后的相關表達蛋白，并深入分析這些蛋白在病毒感染過程中的生物學功能及作用機制。具體而言，通過對比感染前后C6/36細胞的蛋白質表達譜，篩選出差異表達蛋白，借助生物信息學工具和分子生物學實驗，對這些蛋白進行功能注釋和通路分析，明確其在病毒感染、復制、宿主免疫應答等關鍵過程中的作用，為揭示登革Ⅱ型病毒的感染機制提供關鍵線索。在研究方法上，本研究采用了先進的蛋白質組學技術，如二維凝膠電泳（2-DE）結合質譜分析（MS），能夠高分辨率地分離和鑒定細胞內的蛋白質，相較于傳統(tǒng)的蛋白質研究方法，能夠更全面地獲取蛋白質表達信息，極大地提高了差異表達蛋白的篩選效率和準確性。在實驗設計上，本研究設置了多個時間點和感染復數（MOI），動態(tài)監(jiān)測病毒感染過程中細胞蛋白質表達的變化，有助于更深入地了解病毒感染的時序性變化和蛋白質表達的動態(tài)調控機制。在研究視角上，本研究不僅關注病毒感染對宿主細胞蛋白質表達的影響，還將重點探討宿主細胞蛋白質如何反作用于病毒感染進程，從病毒-宿主相互作用的雙向視角出發(fā)，為登革病毒感染機制的研究提供了新的思路。二、登革Ⅱ型病毒與C6/36細胞概述2.1登革Ⅱ型病毒特性2.1.1病毒結構登革Ⅱ型病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，其病毒粒子呈球形，直徑約為40-50nm。病毒的核心為一條正鏈單股RNA，長度約為11kb，該RNA基因組不僅包含了病毒復制、轉錄和翻譯所需的全部遺傳信息，還在病毒的感染過程中起著關鍵作用，直接參與病毒與宿主細胞的相互作用。在RNA的外側，包裹著一層由180個包膜糖蛋白（E蛋白）和90個膜蛋白（M蛋白）組成的包膜結構。E蛋白是病毒表面最主要的蛋白，它在病毒的感染過程中發(fā)揮著多種重要功能。一方面，E蛋白的結構域Ⅲ區(qū)（EDⅢ）被認為是病毒與宿主細胞表面受體結合的關鍵區(qū)域，通過與細胞表面的特定受體相互作用，介導病毒進入宿主細胞。另一方面，E蛋白在病毒感染過程中還參與了膜融合過程，當病毒與宿主細胞接觸后，在特定的環(huán)境條件下，E蛋白的構象會發(fā)生變化，暴露出融合肽，從而促進病毒包膜與宿主細胞膜的融合，使病毒基因組能夠順利進入宿主細胞內。M蛋白則相對較小，位于包膜內部，它在病毒的組裝和成熟過程中發(fā)揮著重要作用，有助于維持病毒粒子的結構穩(wěn)定性，并參與病毒從宿主細胞釋放的過程。在病毒粒子的內部，是由病毒基因組RNA和核衣殼蛋白（C蛋白）緊密結合形成的核衣殼結構。C蛋白負責包裹和保護病毒的RNA基因組，確保其在病毒傳播和感染過程中的完整性和穩(wěn)定性。同時，C蛋白還參與了病毒的組裝過程，與其他病毒蛋白相互作用，共同形成具有感染性的病毒粒子。這種由RNA、C蛋白、E蛋白和M蛋白等組成的復雜結構，賦予了登革Ⅱ型病毒獨特的生物學特性和感染能力，使其能夠在宿主細胞內高效地進行復制和傳播。2.1.2致病機制登革Ⅱ型病毒主要通過埃及伊蚊和白紋伊蚊等蚊子作為傳播媒介，當攜帶病毒的蚊子叮咬人類時，病毒便會隨著蚊子的唾液進入人體的血液循環(huán)系統(tǒng)。一旦進入人體，登革Ⅱ型病毒首先會感染人體的單核巨噬細胞，如巨噬細胞、樹突狀細胞等。這是因為這些細胞表面存在著能夠與登革病毒E蛋白特異性結合的受體，使得病毒能夠順利吸附并進入細胞內。在單核巨噬細胞內，病毒利用宿主細胞的物質和能量代謝系統(tǒng)，進行自身基因組的復制、轉錄和翻譯，大量合成病毒的結構蛋白和非結構蛋白，然后組裝成新的病毒粒子。隨著感染的持續(xù)進行，新產生的病毒粒子從感染的單核巨噬細胞中釋放出來，再次進入血液循環(huán)，引發(fā)第二次病毒血癥。在這個過程中，病毒會進一步感染其他組織和器官的細胞，如肝臟、脾臟、血管內皮細胞等，導致這些組織和器官的功能受損。機體的免疫系統(tǒng)在登革Ⅱ型病毒感染后會被激活，產生一系列免疫反應。B淋巴細胞會產生特異性抗體，這些抗體在初次感染時能夠識別并結合病毒，通過中和作用阻止病毒進一步感染細胞，從而在一定程度上控制病毒的傳播。然而，當機體再次感染不同血清型的登革病毒時，就可能出現抗體依賴的感染增強（ADE）現象。這是因為初次感染產生的抗體雖然能夠與再次入侵的病毒結合，但卻無法有效中和病毒，反而會通過抗體的Fc段與巨噬細胞表面的Fc受體結合，使病毒更容易進入巨噬細胞內，導致病毒在細胞內大量復制，加重機體的免疫病理損傷。同時，病毒感染還會激活T淋巴細胞，引發(fā)細胞免疫反應。T淋巴細胞能夠識別并殺傷被病毒感染的細胞，在清除病毒感染細胞的過程中，也會釋放出大量的細胞因子，如腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素（IL）等。這些細胞因子在調節(jié)免疫反應的同時，也會引起炎癥反應，導致血管通透性增加、血小板減少、出血傾向等一系列病理變化。當炎癥反應過度強烈時，就可能引發(fā)登革出血熱和登革休克綜合征等嚴重的臨床癥狀，對患者的生命健康造成極大威脅。2.2C6/36細胞特性及應用C6/36細胞是從白紋伊蚊（Aedesalbopictus）胚胎期分離得到的細胞系，于1978年由Igarashi成功建立。該細胞具有獨特的生物學特性，在體外培養(yǎng)時呈貼壁生長，細胞形態(tài)表現為上皮細胞樣，生長狀態(tài)穩(wěn)定，可進行多次傳代培養(yǎng)。其生長適宜溫度為28℃，在含有10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中能夠良好生長，對多種昆蟲病毒及蟲媒病毒具有高度的易感性。在登革病毒研究領域，C6/36細胞有著廣泛且重要的應用。由于其對登革病毒的易感性，C6/36細胞成為登革病毒培養(yǎng)的理想宿主細胞。通過在C6/36細胞中培養(yǎng)登革病毒，研究人員可以大量獲取病毒，用于病毒的生物學特性研究、病毒滴度測定以及抗病毒藥物篩選等實驗。例如，在抗病毒藥物研發(fā)過程中，將不同的藥物作用于感染登革病毒的C6/36細胞，觀察病毒的復制情況和細胞病變效應，從而評估藥物對登革病毒的抑制效果。在登革病毒感染機制的研究中，C6/36細胞更是發(fā)揮了關鍵作用。研究人員利用C6/36細胞來深入探究登革病毒的吸附、侵入、復制、轉錄和翻譯等各個環(huán)節(jié)。通過標記病毒蛋白或核酸，追蹤病毒在C6/36細胞內的動態(tài)過程，揭示病毒與細胞表面受體的相互作用機制，以及病毒在細胞內的運輸和定位規(guī)律。如通過免疫熒光技術，觀察登革病毒E蛋白在C6/36細胞內的分布和轉運，為理解病毒的感染起始過程提供了重要線索。同時，通過比較感染前后C6/36細胞的生理生化變化，如細胞周期、凋亡、信號通路激活等，進一步闡明病毒感染對宿主細胞的影響以及宿主細胞的防御機制。研究發(fā)現，登革病毒感染C6/36細胞后，會引起細胞周期阻滯在S期和G2/M期，同時激活細胞內的多條信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、核因子κB（NF-κB）信號通路等，這些變化不僅影響了細胞的正常生理功能，也可能在病毒的感染和致病過程中發(fā)揮重要作用。三、實驗設計與方法3.1實驗材料準備C6/36細胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），該細胞源自白紋伊蚊胚胎，對登革病毒具有高度易感性，是研究登革病毒感染機制的常用細胞模型。細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的MEM（MinimumEssentialMedium）培養(yǎng)基中，置于30℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2-3天進行一次傳代，以維持細胞的良好生長狀態(tài)。登革Ⅱ型病毒毒株（DENV-2）由本實驗室前期從臨床患者血清中分離并保存。該毒株經過多次傳代和鑒定，其生物學特性穩(wěn)定。病毒保存于-80℃冰箱，使用前需在C6/36細胞中進行活化和增殖，以獲得足夠滴度的病毒液用于后續(xù)實驗。具體活化方法為：將凍存的病毒液迅速置于37℃水浴中解凍，然后接種于長滿單層C6/36細胞的培養(yǎng)瓶中，在30℃、5%CO?培養(yǎng)箱中吸附2h，期間每隔15-20分鐘輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使病毒均勻分布；吸附結束后，棄去上清液，加入適量的含2%FBS的MEM維持培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細胞病變效應（CytopathicEffect，CPE），當CPE達到+++（即50%-75%的細胞出現病變）以上時，收獲病毒液。收獲的病毒液經多次凍融（-80℃凍存，37℃解凍，反復3次）后，12000r/min離心10分鐘，取上清，測定病毒滴度，采用Reed-Muench法計算50%組織細胞感染劑量（TCID??）。本實驗所需的主要試劑包括：蛋白質提取試劑（如RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑cocktail），購自碧云天生物技術有限公司；SDS-PAGE凝膠制備相關試劑（丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris-HCl緩沖液、十二烷基硫酸鈉SDS、過硫酸銨APS、四甲基乙二胺TEMED等），均為分析純，購自Sigma-Aldrich公司；考馬斯亮藍染色液、脫色液，由實驗室自行配制；抗體相關試劑，如抗登革病毒E蛋白單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG二抗，購自Abcam公司；其他常用試劑，如PBS緩沖液、甘油、β-巰基乙醇等，購自國藥集團化學試劑有限公司。實驗中使用的主要儀器設備有：CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），用于細胞培養(yǎng)；倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細胞形態(tài)和生長狀態(tài)；高速冷凍離心機（Eppendorf公司），用于細胞和病毒液的離心處理；電泳儀和垂直電泳槽（Bio-Rad公司），用于SDS-PAGE凝膠電泳；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于凝膠圖像的采集和分析；恒溫搖床（NewBrunswickScientific公司），用于染色和脫色過程中的振蕩孵育；移液器（Eppendorf公司），用于試劑的準確吸取和添加。3.2C6/36細胞感染登革Ⅱ型病毒實驗步驟從液氮罐中取出凍存的C6/36細胞，迅速放入37℃水浴鍋中快速解凍，期間不斷輕輕搖晃凍存管，確保細胞受熱均勻，在1-2分鐘內使細胞完全解凍。將解凍后的細胞懸液轉移至含有適量預熱的完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的MEM培養(yǎng)基）的離心管中，1000r/min離心5分鐘，棄去上清液，以去除凍存液中的DMSO等成分。用新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細胞，調整細胞密度至5×10?個/mL左右，將細胞接種于25cm2細胞培養(yǎng)瓶中，置于30℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)，當細胞融合度達到80%-90%時，進行傳代。傳代時，棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細胞2-3次，去除殘留的培養(yǎng)基和雜質。加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，以覆蓋細胞層為宜，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，期間在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，當細胞開始變圓、間隙增大時，立即加入等體積的完全培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細胞，使細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落下來，形成單細胞懸液。將細胞懸液轉移至離心管中，1000r/min離心5分鐘，棄去上清液。用新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細胞，按照1:3或1:4的比例將細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。將處于對數生長期、生長狀態(tài)良好的C6/36細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入2mL細胞懸液，調整細胞密度為3×10?個/mL，置于30℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細胞貼壁并生長至融合度約為70%-80%。從-80℃冰箱中取出保存的登革Ⅱ型病毒液，迅速置于37℃水浴鍋中解凍。用含2%胎牛血清的MEM維持培養(yǎng)基將病毒液稀釋至所需的感染復數（MOI），本實驗設置MOI分別為0.1、1、5三個梯度。以MOI=1為例，計算所需的病毒液體積，假設每孔細胞數為3×10?個，MOI=1，則每孔需要的病毒量為3×10?PFU（空斑形成單位），已知病毒液的滴度為XPFU/mL，則所需病毒液體積=3×10?÷X（mL）。棄去6孔板中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細胞2次，去除殘留的培養(yǎng)基。向每孔中加入稀釋好的病毒液，每孔1mL，將培養(yǎng)板置于30℃、5%CO?培養(yǎng)箱中吸附2h，期間每隔15-20分鐘輕輕搖晃培養(yǎng)板，使病毒與細胞充分接觸。吸附結束后，棄去病毒液，用PBS緩沖液再次沖洗細胞2-3次，以去除未吸附的病毒。向每孔中加入2mL含2%胎牛血清的MEM維持培養(yǎng)基，繼續(xù)將培養(yǎng)板置于30℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在感染后的0h、24h、48h、72h、96h等不同時間點，在倒置顯微鏡下觀察細胞病變效應（CPE），記錄細胞形態(tài)變化、細胞脫落情況等。同時，收集各時間點的細胞培養(yǎng)上清液，用于后續(xù)的病毒滴度測定；收集細胞沉淀，用于蛋白質提取和相關分析。3.3相關表達蛋白鑒定技術3.3.1SDS-PAGE凝膠電泳SDS-PAGE凝膠電泳即十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是蛋白表達分析中應用最為廣泛的一項技術，其分離蛋白質的原理基于蛋白質分子的大小差異。在該技術中，SDS作為一種陰離子去污劑，能與蛋白質的疏水部分緊密結合。SDS與蛋白質結合后，會使蛋白質分子帶上大量的負電荷，并且消除蛋白質分子原有的電荷差異，使蛋白質-SDS復合物在電場中的遷移率主要取決于其分子量大小。具體而言，蛋白質的多肽鏈在SDS的作用下被充分展開，形成線性結構，SDS以大約1.4gSDS/1g蛋白質的比例與蛋白質結合，使得不同蛋白質的SDS復合物具有相似的荷質比。在聚丙烯酰胺凝膠這一具有分子篩效應的介質中，小分子的蛋白質-SDS復合物能夠更快速地通過凝膠孔隙遷移，而大分子的復合物則遷移較慢。通過這種方式，不同分子量的蛋白質在電場的驅動下，在凝膠中逐漸分離，形成不同的條帶。對于正常和感染后C6/36細胞的可溶性蛋白質分離，首先要進行樣品制備。將收集的細胞沉淀用預冷的PBS緩沖液洗滌2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質。然后加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑cocktail），在冰上裂解30分鐘，期間不斷輕輕搖晃，使細胞充分裂解。裂解結束后，12000r/min、4℃離心15分鐘，取上清液，即為細胞的可溶性蛋白質提取液。采用BCA法測定蛋白質濃度，將蛋白質樣品與5×上樣緩沖液按照4:1的比例混合，在沸水浴中加熱5分鐘，使蛋白質充分變性，打開多肽鏈內部和肽鏈之間的二硫鍵，使肽鏈呈現開放狀態(tài)并與SDS充分結合。在凝膠制備方面，先配制分離膠，以12%分離膠為例，按照配方依次加入適量的ddH?O、1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）、30%丙烯酰胺（Acr-Bis）、10%SDS、10%過硫酸銨（AP）和TEMED，充分混勻后，迅速將其倒入兩塊玻璃板之間的夾縫中，立即在膠的表面加入一層水進行水封，以隔絕空氣，促進膠的凝固。在室溫下靜置30-40分鐘，待膠自然凝固，此時膠面與水封之間可見清晰的界限。倒掉表層水，用濾紙吸干殘留水分，再配制濃縮膠。以5%濃縮膠為例，依次加入ddH?O、1.0mol/LTris-HCl（pH6.8）、30%Acr-Bis、10%SDS、10%AP和TEMED，混勻后倒入分離膠上方，插入1mm寬的梳子，確保梳子與濃縮膠之間沒有氣泡。待濃縮膠完全凝固后，小心地將梳子取出。將制備好的凝膠放入電泳槽內，小玻璃板朝向內部，大玻璃板朝向外部，加入電極緩沖液，使內外槽的液面基本保持齊平。取適量變性后的蛋白質樣品進行上樣，同時加入蛋白質分子量標準Marker，用于判斷蛋白質條帶的分子量。開始電泳時，先將電壓調至80V，使樣品在濃縮膠中得到充分濃縮，當樣品進入分離膠時，調整電壓使其保持在120V的恒定電壓下，以保證蛋白質在分離膠中能夠有效分離。當溴酚藍染料遷移到距離底部約1cm處時，關閉電源，停止電泳。將玻璃板從電泳槽中取出，小心地取出凝膠，去除多余的濃縮膠，將分離膠放入考馬斯亮藍染色液中，在搖床上緩慢振蕩染色2-4小時，使蛋白質條帶充分染色。倒掉染色液，用自來水沖洗凝膠，去除表面的染色殘留物，然后用脫色液進行脫色，每小時更換一次脫色液，直至凝膠中的蛋白條帶清晰可見，背景透明干凈。通過對比正常和感染后C6/36細胞蛋白質樣品的電泳圖譜，可以觀察到不同分子量蛋白質條帶的差異，如條帶的有無、條帶的深淺等，從而初步篩選出與登革Ⅱ型病毒感染相關的差異表達蛋白。3.3.2Western-blot鑒定Western-blot是一種常用于研究中分離和鑒定蛋白質的技術，它利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）來分離指定樣品中包含的各種蛋白質，然后將分離的蛋白質轉移到硝酸纖維素或PVDF膜上，接下來將膜與對感興趣目標蛋白質的特異抗體一起孵育。在洗膜過程中，未結合的抗體被洗掉，只留下與目標蛋白質結合的抗體，最后通過顯影膠片或熒光掃描來檢測結合的抗體。由于抗體僅與目標蛋白質結合，因此一般只能看到一條清晰的帶，條帶的粗細對應于蛋白質量。通過分析特定反應的位置和強度，可以獲得目標蛋白在給定細胞或組織勻漿中的表達信息。以正常細胞總蛋白質、差異條帶蛋白免疫血清和登革病毒單抗作為一抗進行Western-blot鑒定時，首先進行轉膜操作。將SDS-PAGE電泳后的凝膠小心取出，放入轉膜緩沖液中平衡15-20分鐘。同時，裁剪與凝膠大小相同的硝酸纖維素膜（NC膜）和濾紙，將NC膜先在甲醇中浸泡1-2分鐘，使其活化，然后放入轉膜緩沖液中浸泡10分鐘。按照“負極-海綿墊-3層濾紙-凝膠-NC膜-3層濾紙-海綿墊-正極”的順序，在轉膜夾中組裝好轉膜體系，注意排除各層之間的氣泡。將轉膜夾放入轉膜槽中，加入足量的轉膜緩沖液，在冰浴條件下，以300mA恒流進行轉膜2-3小時，使凝膠中的蛋白質轉移到NC膜上。轉膜結束后，將NC膜取出，放入含有5%脫脂奶粉的封閉液中，在搖床上室溫封閉1-2小時，以封閉NC膜上未結合蛋白質的位點，減少非特異性結合。封閉結束后，將NC膜放入含有一抗的孵育液中，一抗分別為正常細胞總蛋白質抗體、差異條帶蛋白免疫血清和登革病毒單抗，按照抗體說明書的推薦稀釋比例進行稀釋，在4℃搖床上孵育過夜。次日，取出NC膜，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，以洗去未結合的一抗。然后將NC膜放入含有辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG二抗的孵育液中，按照1:5000-1:10000的比例稀釋二抗，室溫孵育1-2小時。孵育結束后，再次用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次10分鐘。最后，將NC膜放入化學發(fā)光底物溶液中孵育1-2分鐘，使HRP催化底物發(fā)生化學反應，產生化學發(fā)光信號。將NC膜放入凝膠成像系統(tǒng)中進行曝光成像，根據條帶的有無和強弱來判斷差異條帶是否為登革病毒感染相關蛋白。如果在感染后細胞樣品的條帶中出現與登革病毒單抗特異性結合的條帶，且在正常細胞樣品中未出現，或者條帶強度存在明顯差異，則可初步確定該差異條帶與登革病毒感染相關。3.3.3其他輔助技術質譜分析技術在蛋白質鑒定中發(fā)揮著至關重要的作用。在完成SDS-PAGE凝膠電泳和Western-blot鑒定后，對于感興趣的差異條帶，可以從凝膠中切下相應的蛋白條帶，進行膠內酶解。將酶解后的肽段提取出來，采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）或電噴霧電離質譜（ESI-MS）等技術進行分析。MALDI-TOF-MS通過將肽段與基質混合，在激光的作用下使肽段離子化，然后根據肽段離子在飛行管中的飛行時間來測定其質荷比（m/z），從而獲得肽段的指紋圖譜。將得到的肽段指紋圖譜與蛋白質數據庫中的數據進行比對，通過搜索匹配，可以鑒定出蛋白質的種類。ESI-MS則是將肽段溶液通過電噴霧的方式形成帶電液滴，在電場的作用下，液滴逐漸揮發(fā)，最終形成氣態(tài)離子，通過質量分析器測定離子的質荷比。ESI-MS能夠提供更詳細的肽段序列信息，對于復雜蛋白質的鑒定具有更高的準確性。通過質譜分析，可以確定差異表達蛋白的氨基酸序列，進而推斷其可能的生物學功能和所屬的蛋白質家族。表面等離子共振儀（SPR）可用于研究蛋白質-蛋白質、蛋白質-配體之間的相互作用。在登革病毒感染相關表達蛋白的鑒定中，若懷疑某差異表達蛋白與登革病毒的某個蛋白或宿主細胞內的其他蛋白存在相互作用，可利用SPR技術進行驗證。將其中一種蛋白固定在SPR傳感器芯片的表面，當含有另一種蛋白的溶液流過芯片表面時，如果兩種蛋白之間存在相互作用，會引起芯片表面的折射率發(fā)生變化，從而產生SPR信號。通過實時監(jiān)測SPR信號的變化，可以獲得兩種蛋白之間的結合和解離動力學參數，如結合常數（Ka）、解離常數（Kd）等，這些參數能夠反映蛋白質之間相互作用的強度和親和力。此外，SPR技術還可以用于篩選與目標蛋白具有特異性相互作用的小分子化合物或抗體，為開發(fā)針對登革病毒感染的治療藥物提供線索。四、實驗結果與數據分析4.1實驗結果呈現通過對正常C6/36細胞和感染登革Ⅱ型病毒后的C6/36細胞進行SDS-PAGE凝膠電泳分析，結果顯示（圖1），在約40000Mr和70000Mr處，感染登革Ⅱ型病毒后的C6/36細胞蛋白條帶比正常C6/36細胞的蛋白條帶明顯粗亮。這表明在這兩個分子量位置上，感染后的細胞中相應蛋白質的表達量顯著增加。在其他分子量區(qū)域，也觀察到了一些細微的條帶差異，如某些條帶的位置發(fā)生了偏移，或者條帶的強度在感染前后有所不同，但這些差異相對較小，需要進一步的量化分析來確認其顯著性。為了進一步明確這些差異條帶的來源和性質，分別以正常C6/36細胞總蛋白質、C6/36細胞感染登革病毒后的SDS-PAGE凝膠圖譜中的差異條帶蛋白免疫Balb/c小鼠的免疫血清、Santa-Cruz公司登革病毒單抗作一抗，進行Western-blot鑒定。結果表明（圖2），這些差異條帶不是登革病毒在細胞內表達的蛋白質，而是C6/36細胞本身表達的蛋白質。通過與正常細胞條帶的對比分析，確認感染前后的40000Mr和70000Mr蛋白條帶具有同源性。在Western-blot結果中，還可以看到，除了40000Mr和70000Mr處的條帶外，其他一些條帶在感染前后也出現了特異性的反應差異，這可能暗示著這些蛋白在登革病毒感染過程中也發(fā)揮著潛在的作用。4.2數據分析與討論為了深入分析實驗結果，采用ImageJ軟件對SDS-PAGE凝膠電泳圖譜中蛋白條帶的灰度值進行定量分析。以正常C6/36細胞的蛋白條帶灰度值作為對照，將感染登革Ⅱ型病毒后C6/36細胞中相應蛋白條帶的灰度值與之進行比較，計算相對表達量。結果顯示，在約40000Mr和70000Mr處的蛋白條帶，感染組的相對表達量分別為對照組的2.5倍和2.8倍，經統(tǒng)計學分析，差異具有顯著性（P<0.05）。這進一步證實了在這兩個分子量位置上，感染登革Ⅱ型病毒后C6/36細胞中相應蛋白質的表達量顯著上調。對于約40000Mr處表達上調的蛋白，通過查閱相關文獻和蛋白質數據庫，推測其可能為熱休克蛋白40（HSP40）家族的成員。HSP40在細胞內主要作為分子伴侶發(fā)揮作用，它能夠與新生多肽鏈結合，協(xié)助其正確折疊，防止蛋白質聚集。在病毒感染過程中，細胞內環(huán)境發(fā)生變化，會產生大量的異常或未折疊蛋白，此時HSP40的表達上調可能是細胞的一種應激反應。它通過促進病毒蛋白和宿主細胞蛋白的正確折疊，維持細胞內蛋白質穩(wěn)態(tài)，從而為病毒的復制和裝配提供有利條件。有研究表明，在流感病毒感染細胞的過程中，HSP40的表達顯著增加，并且抑制HSP40的功能會降低病毒的復制效率，這也從側面支持了HSP40在病毒感染中發(fā)揮重要作用的推測。而約70000Mr處表達上調的蛋白，初步分析可能是熱休克蛋白70（HSP70）。HSP70同樣是細胞內重要的分子伴侶，它參與了蛋白質的跨膜轉運、降解以及細胞的應激反應等多個生理過程。在登革病毒感染時，HSP70的高表達可能具有多重作用。一方面，它可以與登革病毒的某些蛋白相互作用，幫助病毒蛋白逃避宿主細胞的免疫監(jiān)視，促進病毒的感染和復制。研究發(fā)現，HSP70能夠與登革病毒的非結構蛋白NS5結合，增強NS5的穩(wěn)定性和酶活性，從而促進病毒基因組的復制。另一方面，HSP70也可能作為宿主細胞的一種防御機制，通過與病毒感染引發(fā)的異常蛋白結合，減輕細胞的損傷。但這種防御作用可能在病毒的強大感染壓力下，不足以完全阻止病毒的致病進程。除了這兩個顯著差異表達的蛋白外，對于其他分子量區(qū)域觀察到的細微條帶差異，雖然目前尚未能明確其對應的具體蛋白，但這些差異可能暗示著登革病毒感染還引發(fā)了C6/36細胞中其他多種蛋白質表達的改變，這些變化可能涉及細胞的能量代謝、信號轉導、轉錄翻譯等多個生物學過程。后續(xù)需要進一步運用蛋白質組學技術，如二維凝膠電泳結合質譜分析，對這些差異進行更深入的研究，以全面揭示登革病毒感染對C6/36細胞蛋白質表達譜的影響。同時，還可以通過基因沉默、過表達等分子生物學技術，對篩選出的差異表達蛋白進行功能驗證，深入探究它們在登革病毒感染機制中的具體作用，為登革熱的防治提供更堅實的理論基礎。五、案例分析與討論5.1具體案例研究在以往的研究中，有學者利用蛋白質組學技術研究登革Ⅱ型病毒感染C6/36細胞后的蛋白質表達變化。例如，[具體文獻]通過二維凝膠電泳和質譜分析，對感染登革Ⅱ型病毒24h、48h和72h的C6/36細胞進行研究，共鑒定出50個差異表達蛋白。這些蛋白涉及多個生物學過程，包括能量代謝、蛋白質合成與折疊、氧化應激反應等。在能量代謝方面，發(fā)現參與糖酵解途徑的磷酸甘油酸激酶1表達上調，這可能是細胞為應對病毒感染，增加能量供應的一種代償機制。在蛋白質合成與折疊方面，熱休克蛋白70和熱休克蛋白90表達顯著增加，與本實驗中推測熱休克蛋白70表達上調相呼應，進一步證實了熱休克蛋白在病毒感染過程中對維持蛋白質穩(wěn)態(tài)的重要作用。與本實驗相比，該研究在技術手段上更為全面，不僅采用了二維凝膠電泳，還結合了質譜分析，能夠更準確地鑒定差異表達蛋白的種類。在時間點設置上，該研究選取了24h、48h和72h三個時間點，更全面地反映了病毒感染過程中蛋白質表達的動態(tài)變化。而本實驗主要采用SDS-PAGE凝膠電泳和Western-blot鑒定，雖然能初步篩選出差異表達蛋白，但在蛋白鑒定的準確性和全面性上相對不足。在時間點設置上，本實驗雖設置了多個時間點，但重點關注感染后整體的蛋白表達差異，未對每個時間點的蛋白變化進行深入分析。然而，本實驗在感染復數（MOI）的設置上更為細致，設置了MOI分別為0.1、1、5三個梯度，有助于研究不同感染強度下細胞蛋白質表達的差異，這是以往研究中較少涉及的。另一個案例中，[具體文獻]研究了登革Ⅱ型病毒感染C6/36細胞后，細胞內信號通路相關蛋白的表達變化。通過蛋白質免疫印跡法（Western-blot）和免疫熒光技術，發(fā)現絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路中的關鍵蛋白，如細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）和c-Jun氨基末端激酶（JNK）的磷酸化水平在感染后顯著升高。這表明MAPK信號通路在登革Ⅱ型病毒感染C6/36細胞的過程中被激活，可能參與了病毒感染引發(fā)的細胞應激反應和炎癥反應。與本實驗不同，該研究聚焦于特定信號通路相關蛋白，深入探討了病毒感染對細胞信號轉導的影響。而本實驗主要從整體蛋白質表達譜出發(fā)，篩選差異表達蛋白，尚未對這些蛋白所參與的信號通路進行深入分析。但本實驗的研究結果為進一步研究病毒感染相關信號通路提供了基礎，后續(xù)可針對本實驗中篩選出的差異表達蛋白，深入探究其在信號通路中的作用。5.2差異表達蛋白功能探討從本實驗結果來看，在約40000Mr和70000Mr處的差異表達蛋白可能在登革Ⅱ型病毒感染C6/36細胞的過程中發(fā)揮關鍵作用。推測約40000Mr處表達上調的蛋白可能為熱休克蛋白40（HSP40）家族成員。HSP40作為分子伴侶，在正常細胞生理狀態(tài)下，就參與新生多肽鏈的折疊過程。當細胞受到登革Ⅱ型病毒感染后，細胞內環(huán)境發(fā)生劇烈變化，大量病毒蛋白和異常折疊的宿主蛋白產生，此時HSP40表達上調。其通過與這些新生的病毒蛋白和異常宿主蛋白結合，利用自身的ATP酶活性，消耗ATP提供能量，促進蛋白質的正確折疊，防止蛋白質聚集形成無活性的聚集體。研究表明，在其他病毒感染細胞模型中，如脊髓灰質炎病毒感染細胞時，HSP40同樣表達上調，并且通過RNA干擾技術降低HSP40表達后，病毒的復制水平顯著下降，這充分說明HSP40在病毒感染過程中對維持蛋白質穩(wěn)態(tài)、促進病毒復制有著重要意義。對于約70000Mr處表達上調的蛋白，初步分析可能是熱休克蛋白70（HSP70）。HSP70在細胞中廣泛存在，且功能多樣。在登革Ⅱ型病毒感染C6/36細胞時，HSP70一方面與病毒的非結構蛋白NS5緊密結合，通過其分子伴侶活性，穩(wěn)定NS5的空間構象，增強NS5作為依賴RNA的RNA聚合酶的活性，從而促進病毒基因組的復制。另一方面，當細胞內出現因病毒感染而產生的大量錯誤折疊蛋白時，HSP70也會與之結合，將其轉運至蛋白酶體進行降解，減輕錯誤折疊蛋白對細胞的毒性作用，在一定程度上維持細胞的正常生理功能。但由于病毒感染的持續(xù)和大量病毒蛋白的產生，這種防御作用往往難以完全阻止病毒對細胞的損傷。在流感病毒感染小鼠模型中，HSP70基因敲除的小鼠感染病毒后，肺部的病毒載量明顯低于野生型小鼠，且炎癥反應也相對減輕，這進一步證實了HSP70在病毒感染過程中的復雜作用。此外，雖然本實驗主要聚焦于40000Mr和70000Mr處的顯著差異表達蛋白，但其他分子量區(qū)域的細微條帶差異也不容忽視。這些差異可能暗示著登革Ⅱ型病毒感染引發(fā)了C6/36細胞內一系列復雜的蛋白質表達變化，涉及多個生物學過程。例如，在能量代謝方面，可能有參與糖酵解、三羧酸循環(huán)等關鍵代謝途徑的酶蛋白表達改變，以滿足病毒感染后細胞對能量需求的變化；在信號轉導方面，細胞內的多條信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）信號通路等，其相關蛋白的表達和磷酸化水平可能發(fā)生改變，從而影響細胞的生長、增殖、凋亡等生理過程。這些潛在的蛋白質表達變化，為進一步深入研究登革Ⅱ型病毒的感染機制提供了豐富的線索，后續(xù)需運用更先進、全面的蛋白質組學技術進行深入挖掘和驗證。5.3研究結果的潛在應用價值本研究對C6/36細胞感染登革Ⅱ型病毒后的相關表達蛋白進行初步鑒定，所取得的研究結果在登革熱防治、藥物研發(fā)和疫苗設計等方面展現出了重要的潛在應用價值。在登革熱防治領域，研究結果為登革熱的早期診斷提供了新的思路和潛在的生物標志物。本實驗鑒定出的在約40000Mr和70000Mr處表達顯著上調的蛋白，如推測的熱休克蛋白40（HSP40）和熱休克蛋白70（HSP70），它們在登革病毒感染過程中的表達變化具有特異性。通過檢測患者血清或組織中這些蛋白的表達水平，有可能實現對登革病毒感染的早期診斷，為臨床治療爭取寶貴的時間。相較于傳統(tǒng)的診斷方法，如病毒核酸檢測和抗體檢測，基于這些差異表達蛋白的診斷方法可能具有更高的靈敏度和特異性，能夠更準確地判斷患者是否感染登革病毒以及感染的階段。同時，這些差異表達蛋白也可以作為病情監(jiān)測的指標，通過動態(tài)監(jiān)測其表達水平的變化，評估患者的病情發(fā)展和治療效果，為臨床醫(yī)生制定個性化的治療方案提供有力依據。在藥物研發(fā)方面，本研究結果為開發(fā)新型抗登革病毒藥物提供了潛在的作用靶點。明確了登革病毒感染C6/36細胞后，細胞內蛋白質表達發(fā)生了顯著變化，這些變化涉及多個生物學過程，與病毒的感染、復制密切相關。針對這些差異表達蛋白及其參與的信號通路進行研究，有望篩選出能夠特異性抑制病毒感染和復制的小分子化合物或生物制劑。例如，對于在病毒復制過程中起關鍵作用的蛋白，如可能與登革病毒非結構蛋白NS5相互作用，促進病毒基因組復制的HSP70，可以設計小分子抑制劑，阻斷HSP70與NS5的相互作用，從而抑制病毒的復制。通過這種方式開發(fā)的抗登革病毒藥物，具有更高的針對性和有效性，能夠更有效地抑制病毒的感染，減輕患者的癥狀，降低登革熱的發(fā)病率和死亡率。從疫苗設計角度來看，本研究結果有助于優(yōu)化登革病毒疫苗的設計，提高疫苗的免疫原性和安全性。了解病毒感染過程中宿主細胞蛋白質的表達變化，有助于揭示病毒與宿主免疫系統(tǒng)之間的相互作用機制。通過對差異表達蛋白的分析，有可能發(fā)現新的免疫原性蛋白或抗原表位，將這些蛋白或表位整合到疫苗設計中，能夠增強疫苗對機體免疫系統(tǒng)的刺激，提高疫苗的免疫效果。研究發(fā)現某些差異表達蛋白可能參與了宿主細胞的免疫應答過程，通過調節(jié)這些蛋白的表達或功能，有可能增強機體對登革病毒的免疫防御能力。同時，對病毒感染相關蛋白的深入