RR介導(dǎo)MANF激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)的機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的核心議題之一，其對(duì)于生物體的感知、認(rèn)知、行為等諸多生理功能的正常運(yùn)行起著決定性作用。神經(jīng)突，作為神經(jīng)元的重要組成部分，其生長(zhǎng)過(guò)程涵蓋了軸突的延伸、分支以及樹(shù)突的發(fā)育和成熟，是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)。神經(jīng)突的正確生長(zhǎng)對(duì)于神經(jīng)元之間建立精確的連接模式、形成有序的神經(jīng)環(huán)路至關(guān)重要。在胚胎發(fā)育階段，神經(jīng)突的生長(zhǎng)引導(dǎo)神經(jīng)元遷移至特定位置，并與其他神經(jīng)元建立功能性突觸連接，這些連接的形成構(gòu)建了神經(jīng)系統(tǒng)的基本架構(gòu)，為后續(xù)的神經(jīng)信號(hào)傳遞和處理奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。從簡(jiǎn)單的反射弧到復(fù)雜的大腦皮層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，神經(jīng)突的生長(zhǎng)和連接模式?jīng)Q定了信息在神經(jīng)系統(tǒng)中的傳遞路徑和處理方式，進(jìn)而影響著生物體的各種行為和認(rèn)知能力。然而，盡管過(guò)去幾十年的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)十種導(dǎo)向信號(hào)分子，它們能夠作用于生長(zhǎng)錐表面受體，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)來(lái)控制神經(jīng)突的靶向性延伸，但神經(jīng)元在生長(zhǎng)和延伸過(guò)程中往往同時(shí)暴露于多種導(dǎo)向信號(hào)之下，如何同時(shí)解讀這些不同信號(hào)，并做出最終的單一性選擇，其分子機(jī)制仍未完全闡明。深入探究神經(jīng)突生長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)制，不僅有助于我們理解神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的基本過(guò)程，還為治療神經(jīng)損傷和神經(jīng)退行性疾病提供了新的理論基礎(chǔ)和治療靶點(diǎn)。在眾多與神經(jīng)突生長(zhǎng)相關(guān)的信號(hào)通路中，AKT/mTOR信號(hào)通路近年來(lái)備受關(guān)注。AKT，又稱蛋白激酶B（PKB），是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、存活和代謝等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。mTOR，即哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白，是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)整合器，mTOR能夠感知細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、能量水平、生長(zhǎng)因子信號(hào)以及環(huán)境應(yīng)激等多種信號(hào)，通過(guò)調(diào)控下游一系列靶蛋白的活性，來(lái)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞周期進(jìn)程、自噬等生物學(xué)過(guò)程。在神經(jīng)突生長(zhǎng)過(guò)程中，AKT/mTOR信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，為神經(jīng)突的生長(zhǎng)提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)；同時(shí)，該通路還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化，影響神經(jīng)突的延伸和分支。研究表明，在神經(jīng)元受到神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子刺激時(shí)，AKT會(huì)被激活并磷酸化下游的mTOR，進(jìn)而激活mTOR的下游靶蛋白，如核糖體S6激酶（p70S6K）和真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1），這些靶蛋白的激活能夠啟動(dòng)蛋白質(zhì)的翻譯和促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，為神經(jīng)突的生長(zhǎng)提供所需的蛋白質(zhì)。AKT/mTOR信號(hào)通路還可以通過(guò)調(diào)節(jié)微管和肌動(dòng)蛋白等細(xì)胞骨架蛋白的組裝和解聚，來(lái)影響神經(jīng)突的形態(tài)和生長(zhǎng)方向。最近的研究發(fā)現(xiàn)，一種名為中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（MANF）的蛋白質(zhì)在神經(jīng)突生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。MANF最初被發(fā)現(xiàn)是一種在中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞中高度表達(dá)，并對(duì)多巴胺能神經(jīng)元具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用的因子。隨后的研究表明，MANF不僅在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中表達(dá)上調(diào)，還在神經(jīng)損傷和神經(jīng)退行性疾病模型中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。然而，MANF促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)的具體分子機(jī)制尚不完全清楚。本研究聚焦于探究RR介導(dǎo)MANF通過(guò)AKT/mTOR促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)的機(jī)制，具有重要的理論和實(shí)踐意義。在理論層面，深入解析這一機(jī)制有助于填補(bǔ)神經(jīng)突生長(zhǎng)調(diào)控領(lǐng)域的知識(shí)空白，進(jìn)一步完善我們對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成過(guò)程中分子機(jī)制的理解。通過(guò)揭示RR、MANF以及AKT/mTOR信號(hào)通路之間的相互作用關(guān)系，能夠?yàn)樯窠?jīng)科學(xué)領(lǐng)域提供新的研究視角和理論框架，推動(dòng)該領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究向更深層次發(fā)展。在實(shí)踐方面，本研究的成果有望為神經(jīng)損傷和神經(jīng)退行性疾病的治療提供新的策略和靶點(diǎn)。神經(jīng)損傷和神經(jīng)退行性疾病，如脊髓損傷、阿爾茨海默病、帕金森病等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。目前，這些疾病的治療手段仍然有限，缺乏有效的根治方法。通過(guò)明確RR介導(dǎo)MANF通過(guò)AKT/mTOR促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)的機(jī)制，我們可以開(kāi)發(fā)出針對(duì)這一信號(hào)通路的特異性藥物或治療方法，促進(jìn)神經(jīng)突的再生和修復(fù)，為這些疾病的治療帶來(lái)新的希望。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，對(duì)于神經(jīng)突生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制的研究一直是熱點(diǎn)話題。國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者圍繞RR、MANF、AKT/mTOR信號(hào)通路以及它們與神經(jīng)突生長(zhǎng)的關(guān)系展開(kāi)了廣泛而深入的研究，取得了一系列重要成果，但仍存在一些尚未完全闡明的問(wèn)題。關(guān)于RR（ReceptorReceptor，暫譯：受體受體）的研究，國(guó)外起步相對(duì)較早。早期研究主要集中在RR的結(jié)構(gòu)鑒定與初步功能探索，發(fā)現(xiàn)RR在多種細(xì)胞表面均有表達(dá)，且在神經(jīng)系統(tǒng)中呈現(xiàn)出特定的分布模式。隨著研究的深入，學(xué)者們逐漸關(guān)注RR在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用。例如，美國(guó)某研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)基因敲除和過(guò)表達(dá)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)RR能夠與多種配體結(jié)合，激活下游的一系列信號(hào)分子，參與細(xì)胞的增殖、分化和遷移等過(guò)程。在神經(jīng)突生長(zhǎng)方面，已有研究表明RR可能作為一種輔助受體，與其他神經(jīng)導(dǎo)向分子的受體相互作用，共同調(diào)節(jié)神經(jīng)突的生長(zhǎng)方向和延伸速率。然而，RR在神經(jīng)突生長(zhǎng)過(guò)程中具體的分子作用機(jī)制，以及它與其他信號(hào)通路之間的交叉對(duì)話，仍有待進(jìn)一步深入研究。國(guó)內(nèi)對(duì)于RR的研究近年來(lái)也逐漸增多，主要聚焦于RR在神經(jīng)發(fā)育相關(guān)疾病中的表達(dá)變化及潛在作用。一些研究通過(guò)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型的分析，發(fā)現(xiàn)RR的表達(dá)異常與神經(jīng)突發(fā)育障礙密切相關(guān)，為揭示RR在神經(jīng)突生長(zhǎng)調(diào)控中的作用提供了新的線索，但目前仍缺乏對(duì)RR作用機(jī)制的系統(tǒng)性研究。MANF（MesencephalicAstrocyte-DerivedNeurotrophicFactor，中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子）的研究也取得了一定進(jìn)展。國(guó)外研究率先發(fā)現(xiàn)MANF對(duì)多巴胺能神經(jīng)元具有顯著的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，能夠促進(jìn)其存活和分化。后續(xù)研究進(jìn)一步揭示了MANF在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育早期，MANF在神經(jīng)嵴細(xì)胞和神經(jīng)管中高表達(dá)，隨著發(fā)育的進(jìn)行，其表達(dá)逐漸局限于特定的神經(jīng)核團(tuán)和腦區(qū)。在神經(jīng)突生長(zhǎng)方面，已有實(shí)驗(yàn)表明，外源性給予MANF能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的神經(jīng)元神經(jīng)突的生長(zhǎng)和分支，并且這種促進(jìn)作用具有劑量依賴性。然而，MANF促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚未完全明確。國(guó)內(nèi)學(xué)者在MANF的研究中，不僅驗(yàn)證了國(guó)外的部分研究成果，還從中醫(yī)中藥的角度探索了調(diào)節(jié)MANF表達(dá)的新方法。例如，通過(guò)中藥復(fù)方干預(yù)神經(jīng)損傷模型，發(fā)現(xiàn)能夠上調(diào)MANF的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，但對(duì)于其中的分子機(jī)制研究還相對(duì)較少。AKT/mTOR信號(hào)通路作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在神經(jīng)突生長(zhǎng)中的作用備受關(guān)注。國(guó)外大量研究表明，生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等多種刺激均可激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路。當(dāng)該通路被激活時(shí)，AKT通過(guò)磷酸化激活下游的mTOR，mTOR進(jìn)一步調(diào)控其下游靶蛋白p70S6K和4E-BP1的活性，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，為神經(jīng)突的生長(zhǎng)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。同時(shí)，AKT/mTOR信號(hào)通路還能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的表達(dá)和修飾，影響微管和肌動(dòng)蛋白的組裝與動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)而調(diào)控神經(jīng)突的延伸和分支。國(guó)內(nèi)研究在驗(yàn)證AKT/mTOR信號(hào)通路在神經(jīng)突生長(zhǎng)中作用的基礎(chǔ)上，還深入探討了該通路與其他信號(hào)通路（如MAPK信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路等）之間的相互作用關(guān)系，發(fā)現(xiàn)這些信號(hào)通路之間存在復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制，共同參與神經(jīng)突生長(zhǎng)的調(diào)控。盡管國(guó)內(nèi)外在RR、MANF、AKT/mTOR信號(hào)通路以及它們與神經(jīng)突生長(zhǎng)關(guān)系的研究方面取得了上述成果，但仍存在一些不足之處。目前對(duì)于RR介導(dǎo)MANF通過(guò)AKT/mTOR促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)的具體分子機(jī)制研究還相對(duì)薄弱，三者之間的上下游關(guān)系以及如何協(xié)同作用來(lái)調(diào)控神經(jīng)突生長(zhǎng)的細(xì)節(jié)尚不清楚。在以往的研究中，多集中于單一因素對(duì)神經(jīng)突生長(zhǎng)的影響，而對(duì)于多個(gè)因素在體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境下的相互作用研究較少，缺乏對(duì)神經(jīng)突生長(zhǎng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的全面認(rèn)識(shí)。在研究方法上，雖然細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型為我們提供了重要的研究手段，但如何將這些研究成果更好地轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用，還需要進(jìn)一步探索更加有效的研究方法和技術(shù)手段。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入探究RR介導(dǎo)MANF通過(guò)AKT/mTOR促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)的詳細(xì)分子機(jī)制，具體研究目標(biāo)和內(nèi)容如下：1.3.1研究目標(biāo)明確RR、MANF與AKT/mTOR信號(hào)通路在神經(jīng)突生長(zhǎng)過(guò)程中的相互作用關(guān)系，揭示RR介導(dǎo)MANF激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路以促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)的具體分子機(jī)制，為神經(jīng)損傷修復(fù)和神經(jīng)退行性疾病的治療提供新的理論基礎(chǔ)和潛在治療靶點(diǎn)。1.3.2研究?jī)?nèi)容從分子、細(xì)胞和動(dòng)物模型等多個(gè)層面展開(kāi)研究，具體內(nèi)容包括：分子層面：通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）、免疫共沉淀（Co-IP）等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，檢測(cè)在給予外源性MANF刺激后，細(xì)胞內(nèi)RR、AKT、mTOR以及它們的磷酸化形式的表達(dá)水平變化，明確RR與MANF的結(jié)合特性，以及RR是否能夠通過(guò)與MANF結(jié)合，激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路。利用定點(diǎn)突變技術(shù)，構(gòu)建RR、AKT、mTOR等關(guān)鍵蛋白的突變體，研究這些突變體對(duì)信號(hào)通路激活和神經(jīng)突生長(zhǎng)的影響，進(jìn)一步確定RR介導(dǎo)MANF激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路的關(guān)鍵位點(diǎn)和分子機(jī)制。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，檢測(cè)AKT/mTOR信號(hào)通路下游靶基因，如p70S6K、4E-BP1等的mRNA表達(dá)水平變化，分析MANF通過(guò)RR激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路后，對(duì)下游靶基因表達(dá)的調(diào)控作用。細(xì)胞層面：在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞系中，如PC12細(xì)胞、原代神經(jīng)元等，分別進(jìn)行RR基因敲低、MANF過(guò)表達(dá)或干擾、以及AKT/mTOR信號(hào)通路抑制劑處理等實(shí)驗(yàn)，觀察神經(jīng)突的生長(zhǎng)情況，包括神經(jīng)突的長(zhǎng)度、分支數(shù)、生長(zhǎng)速度等指標(biāo)，明確RR、MANF以及AKT/mTOR信號(hào)通路在神經(jīng)突生長(zhǎng)中的作用。利用免疫熒光染色技術(shù)，觀察RR、MANF、AKT、mTOR等蛋白在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的定位和分布情況，以及它們?cè)谏窠?jīng)突生長(zhǎng)過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)一步了解它們?cè)谏窠?jīng)突生長(zhǎng)中的作用機(jī)制。通過(guò)細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，研究RR介導(dǎo)MANF通過(guò)AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，探討其在神經(jīng)損傷修復(fù)過(guò)程中的潛在作用。動(dòng)物模型層面：構(gòu)建神經(jīng)損傷動(dòng)物模型，如坐骨神經(jīng)損傷模型、腦缺血模型等，通過(guò)體內(nèi)注射重組MANF蛋白、RR激動(dòng)劑或抑制劑、以及AKT/mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)劑等，觀察動(dòng)物的神經(jīng)功能恢復(fù)情況，如運(yùn)動(dòng)功能、感覺(jué)功能等，評(píng)估RR介導(dǎo)MANF通過(guò)AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)損傷修復(fù)的促進(jìn)作用。利用免疫組織化學(xué)（IHC）、原位雜交（ISH）等技術(shù)，檢測(cè)在神經(jīng)損傷動(dòng)物模型中，RR、MANF、AKT、mTOR等蛋白和基因的表達(dá)水平和分布情況，分析它們?cè)谏窠?jīng)損傷修復(fù)過(guò)程中的作用機(jī)制。通過(guò)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，如Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)等，研究RR介導(dǎo)MANF通過(guò)AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力和行為學(xué)的影響，探討其在神經(jīng)退行性疾病治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等多學(xué)科的研究方法，從多個(gè)層面深入探究RR介導(dǎo)MANF通過(guò)AKT/mTOR促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)的機(jī)制。具體研究方法如下：細(xì)胞培養(yǎng)：選用PC12細(xì)胞系作為研究對(duì)象，該細(xì)胞系來(lái)源于大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤，在神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）的誘導(dǎo)下可以分化為具有神經(jīng)元特性的細(xì)胞，長(zhǎng)出神經(jīng)突，是研究神經(jīng)突生長(zhǎng)的常用細(xì)胞模型。將PC12細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素-鏈霉素）的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn)處理。對(duì)于原代神經(jīng)元的培養(yǎng)，選取新生24小時(shí)內(nèi)的SD大鼠，無(wú)菌條件下取大腦皮層組織，采用胰蛋白酶消化法分離神經(jīng)元，將分離得到的神經(jīng)元接種于預(yù)先包被有多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿中，使用含有B27添加劑、谷氨酰胺、青霉素-鏈霉素的Neurobasal培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，同樣置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)并進(jìn)行換液?；蚓庉嫾夹g(shù)：利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建RR基因敲低的PC12細(xì)胞株和原代神經(jīng)元。設(shè)計(jì)針對(duì)RR基因的sgRNA，通過(guò)基因轉(zhuǎn)染的方法將sgRNA和Cas9蛋白導(dǎo)入細(xì)胞中，使Cas9蛋白在sgRNA的引導(dǎo)下切割RR基因，從而實(shí)現(xiàn)RR基因的敲低。通過(guò)嘌呤霉素篩選和單細(xì)胞克隆技術(shù)，獲得穩(wěn)定敲低RR基因的細(xì)胞株。利用慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建MANF過(guò)表達(dá)和干擾的細(xì)胞模型。將MANF的cDNA序列克隆到慢病毒表達(dá)載體中，通過(guò)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝慢病毒，然后將慢病毒感染PC12細(xì)胞或原代神經(jīng)元，實(shí)現(xiàn)MANF的過(guò)表達(dá)。對(duì)于MANF干擾，設(shè)計(jì)合成針對(duì)MANF的shRNA序列，同樣克隆到慢病毒載體中，包裝慢病毒并感染細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)MANF的干擾表達(dá)。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)基因編輯和過(guò)表達(dá)、干擾的效果。蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）：收集不同處理組的細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，進(jìn)行SDS凝膠電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1-2小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。分別加入RR、MANF、AKT、mTOR、p-AKT、p-mTOR、p70S6K、4E-BP1等一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10分鐘，然后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。再次用TBST洗膜3次，每次10分鐘，最后用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶的表達(dá)水平，并使用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析，以定量比較不同組之間蛋白表達(dá)的差異。免疫共沉淀（Co-IP）：將細(xì)胞裂解液與RR抗體或MANF抗體在4℃下孵育過(guò)夜，使抗體與相應(yīng)的抗原結(jié)合。次日，加入ProteinA/G磁珠，繼續(xù)孵育2-4小時(shí)，使抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合到磁珠上。用預(yù)冷的PBS洗滌磁珠3-5次，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)。向磁珠中加入適量的SDS上樣緩沖液，煮沸5分鐘，使抗原-抗體復(fù)合物從磁珠上解離下來(lái)。將解離后的樣品進(jìn)行SDS凝膠電泳和WesternBlot檢測(cè)，以驗(yàn)證RR與MANF是否存在相互作用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）：使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，設(shè)計(jì)針對(duì)AKT/mTOR信號(hào)通路下游靶基因（如p70S6K、4E-BP1等）以及內(nèi)參基因（如GAPDH）的特異性引物，采用SYBRGreen熒光染料法進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix和ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5秒、60℃退火30秒。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)分析Ct值，采用2?ΔΔCt法計(jì)算靶基因的相對(duì)表達(dá)量，以評(píng)估MANF通過(guò)RR激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路后對(duì)下游靶基因mRNA表達(dá)水平的影響。免疫熒光染色：將細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行相應(yīng)處理。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20分鐘，然后用0.1%TritonX-100通透細(xì)胞10分鐘，以增加細(xì)胞膜的通透性，便于抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。用5%BSA封閉30分鐘，以減少非特異性染色。分別加入RR、MANF、AKT、mTOR等一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS洗3次，每次5分鐘，加入相應(yīng)的熒光二抗，室溫避光孵育1小時(shí)。再次用PBS洗3次，每次5分鐘，最后用DAPI染核5分鐘，以標(biāo)記細(xì)胞核。將蓋玻片取出，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)蛋白的定位和分布情況，以及它們?cè)谏窠?jīng)突生長(zhǎng)過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化。細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)：采用Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。對(duì)于遷移實(shí)驗(yàn)，在上室中加入無(wú)血清培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞，下室中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。將Transwell小室置于培養(yǎng)箱中孵育一定時(shí)間后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，然后用4%多聚甲醛固定下室遷移到膜表面的細(xì)胞，用結(jié)晶紫染色15分鐘，在顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞的數(shù)量。對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn)，在上室的聚碳酸酯膜上預(yù)先包被Matrigel基質(zhì)膠，使細(xì)胞需要降解基質(zhì)膠才能穿過(guò)膜到達(dá)下室，其他操作步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同，通過(guò)計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞的數(shù)量來(lái)評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力，以研究RR介導(dǎo)MANF通過(guò)AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。動(dòng)物模型構(gòu)建與實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建坐骨神經(jīng)損傷模型，選用成年SD大鼠，采用坐骨神經(jīng)夾傷法進(jìn)行造模。在無(wú)菌條件下暴露大鼠坐骨神經(jīng)，使用血管夾夾傷坐骨神經(jīng)，造成神經(jīng)損傷。術(shù)后將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、MANF治療組、RR激動(dòng)劑組、RR抑制劑組、AKT/mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)劑組等。通過(guò)尾靜脈注射或局部注射的方式給予相應(yīng)的藥物或試劑，定期觀察大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)情況，如通過(guò)行為學(xué)測(cè)試（如坐骨神經(jīng)功能指數(shù)測(cè)定）評(píng)估大鼠的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況，通過(guò)熱痛敏實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠的感覺(jué)功能恢復(fù)情況。構(gòu)建腦缺血模型，采用線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）模型。將尼龍線經(jīng)頸外動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈，阻塞大腦中動(dòng)脈，造成腦缺血。術(shù)后同樣分組并給予相應(yīng)處理，通過(guò)神經(jīng)功能評(píng)分（如Longa評(píng)分）評(píng)估大鼠的神經(jīng)功能缺損情況，通過(guò)TTC染色觀察腦梗死面積，以評(píng)估RR介導(dǎo)MANF通過(guò)AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)腦缺血損傷修復(fù)的促進(jìn)作用。免疫組織化學(xué)（IHC）和原位雜交（ISH）：在神經(jīng)損傷動(dòng)物模型處死后，取損傷部位的神經(jīng)組織或腦組織，進(jìn)行石蠟包埋和切片。對(duì)于IHC實(shí)驗(yàn)，將切片脫蠟至水，用3%過(guò)氧化氫孵育10-15分鐘，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。用檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，然后用5%BSA封閉30分鐘。加入RR、MANF、AKT、mTOR等一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS洗3次，每次5分鐘，加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30分鐘。再次用PBS洗3次，每次5分鐘，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，室溫孵育30分鐘。最后用DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封片后在顯微鏡下觀察蛋白的表達(dá)水平和分布情況。對(duì)于ISH實(shí)驗(yàn)，將切片進(jìn)行預(yù)處理后，與地高辛標(biāo)記的針對(duì)RR、MANF、AKT、mTOR等基因的探針進(jìn)行雜交，雜交后依次進(jìn)行洗膜、封閉、加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體孵育、顯色等步驟，在顯微鏡下觀察基因的表達(dá)和分布情況。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)：采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。實(shí)驗(yàn)分為定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩個(gè)階段。在定位航行實(shí)驗(yàn)中，將大鼠從不同象限放入水中，記錄其找到隱藏平臺(tái)的潛伏期，連續(xù)訓(xùn)練5天，以評(píng)估大鼠的學(xué)習(xí)能力。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，撤去平臺(tái)，記錄大鼠在原平臺(tái)象限的停留時(shí)間和穿越原平臺(tái)的次數(shù)，以評(píng)估大鼠的記憶能力。采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠的自發(fā)活動(dòng)和探索行為。將大鼠放入曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱中，記錄其在一定時(shí)間內(nèi)的活動(dòng)距離、中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間、直立次數(shù)等指標(biāo)，以評(píng)估大鼠的行為學(xué)變化，探討RR介導(dǎo)MANF通過(guò)AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)動(dòng)物行為學(xué)的影響。基于上述研究方法，本研究的技術(shù)路線如圖1所示：首先在體外細(xì)胞水平，通過(guò)基因編輯和過(guò)表達(dá)、干擾技術(shù)，構(gòu)建RR基因敲低、MANF過(guò)表達(dá)和干擾的PC12細(xì)胞及原代神經(jīng)元模型，利用WesternBlot、Co-IP、qRT-PCR、免疫熒光染色等技術(shù)，研究RR、MANF與AKT/mTOR信號(hào)通路的相互作用關(guān)系以及對(duì)神經(jīng)突生長(zhǎng)相關(guān)指標(biāo)的影響；然后在動(dòng)物模型水平，構(gòu)建坐骨神經(jīng)損傷和腦缺血模型，通過(guò)體內(nèi)給藥和行為學(xué)實(shí)驗(yàn)、IHC、ISH等技術(shù)，評(píng)估RR介導(dǎo)MANF通過(guò)AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)損傷修復(fù)和動(dòng)物行為學(xué)的影響；最后綜合分析細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，揭示RR介導(dǎo)MANF通過(guò)AKT/mTOR促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)的機(jī)制。[此處插入技術(shù)路線圖，技術(shù)路線圖以清晰的流程圖形式展示，包括細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的各個(gè)環(huán)節(jié)及所用技術(shù)和預(yù)期結(jié)果等內(nèi)容]二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1神經(jīng)突生長(zhǎng)的基本概念與過(guò)程神經(jīng)突生長(zhǎng)是神經(jīng)元發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵事件，對(duì)于構(gòu)建復(fù)雜而有序的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)起著基礎(chǔ)性作用。在胚胎發(fā)育早期，神經(jīng)元從神經(jīng)干細(xì)胞分化產(chǎn)生后，便開(kāi)始了神經(jīng)突的生長(zhǎng)過(guò)程。這一過(guò)程起始于神經(jīng)元胞體表面的局部區(qū)域，細(xì)胞膜向外突出形成微小的突起，這些突起便是神經(jīng)突的雛形。神經(jīng)突生長(zhǎng)的起始階段，受到多種細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外信號(hào)的精確調(diào)控。細(xì)胞內(nèi)，基因表達(dá)程序的啟動(dòng)促使一系列與神經(jīng)突生長(zhǎng)相關(guān)的蛋白質(zhì)合成，如微管蛋白、肌動(dòng)蛋白等細(xì)胞骨架蛋白，它們?yōu)樯窠?jīng)突的形成提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。細(xì)胞外，周圍環(huán)境中的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)成分以及與相鄰細(xì)胞的相互作用等信號(hào)，也會(huì)通過(guò)細(xì)胞膜上的受體傳遞到細(xì)胞內(nèi)，激活下游的信號(hào)通路，從而促進(jìn)神經(jīng)突的起始生長(zhǎng)。例如，神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）與神經(jīng)元表面的TrkA受體結(jié)合后，能夠激活Ras/MAPK、PI3K/AKT等信號(hào)通路，這些信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)突的起始。隨著神經(jīng)突的起始，其進(jìn)入延伸階段。在這一階段，神經(jīng)突的長(zhǎng)度不斷增加，其延伸的動(dòng)力主要來(lái)源于細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)組裝和解聚。微管作為細(xì)胞骨架的重要組成部分，在神經(jīng)突延伸中發(fā)揮著核心作用。微管由α-和β-微管蛋白二聚體聚合而成，具有極性，其正端（+端）在神經(jīng)突延伸過(guò)程中不斷添加微管蛋白二聚體，從而實(shí)現(xiàn)微管的延長(zhǎng)，為神經(jīng)突的延伸提供了結(jié)構(gòu)支撐。微管的動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定性使得其能夠在延伸過(guò)程中不斷探索周圍環(huán)境，當(dāng)遇到合適的信號(hào)時(shí)，微管會(huì)穩(wěn)定下來(lái)，進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)突的延伸。研究表明，在神經(jīng)突延伸過(guò)程中，微管相關(guān)蛋白（MAPs）能夠調(diào)節(jié)微管的穩(wěn)定性和動(dòng)態(tài)性。例如，MAP2可以與微管結(jié)合，增加微管的穩(wěn)定性，促進(jìn)神經(jīng)突的延伸；而stathmin則可以與微管蛋白二聚體結(jié)合，抑制微管的聚合，調(diào)節(jié)微管的動(dòng)態(tài)平衡，影響神經(jīng)突的延伸速度。除了微管，肌動(dòng)蛋白微絲也在神經(jīng)突延伸中發(fā)揮著重要作用。肌動(dòng)蛋白微絲主要分布在神經(jīng)突的前端，即生長(zhǎng)錐區(qū)域。生長(zhǎng)錐是神經(jīng)突末端高度動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)，具有豐富的肌動(dòng)蛋白微絲網(wǎng)絡(luò)。肌動(dòng)蛋白微絲的聚合和解聚驅(qū)動(dòng)著生長(zhǎng)錐的運(yùn)動(dòng)，使其能夠感知周圍環(huán)境中的信號(hào)，并引導(dǎo)神經(jīng)突向特定方向延伸。當(dāng)生長(zhǎng)錐接收到吸引性信號(hào)時(shí)，如Netrin等導(dǎo)向分子，會(huì)引起生長(zhǎng)錐局部區(qū)域的肌動(dòng)蛋白微絲聚合增加，導(dǎo)致生長(zhǎng)錐向信號(hào)源方向伸展，從而促進(jìn)神經(jīng)突的延伸；相反，當(dāng)接收到排斥性信號(hào)時(shí)，如Slit等，會(huì)導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白微絲解聚增加，生長(zhǎng)錐回縮，神經(jīng)突改變生長(zhǎng)方向。在神經(jīng)突生長(zhǎng)過(guò)程中，分支的形成進(jìn)一步增加了神經(jīng)突的復(fù)雜性和功能性。神經(jīng)突分支的形成可以分為兩種主要方式：頂端分支和側(cè)支分支。頂端分支是指神經(jīng)突的生長(zhǎng)錐在延伸過(guò)程中直接分裂為兩個(gè)或多個(gè)分支，這種分支方式常見(jiàn)于早期神經(jīng)突的生長(zhǎng)，有助于神經(jīng)突快速擴(kuò)展其探索范圍。側(cè)支分支則是在神經(jīng)突的主干上，從側(cè)面伸出新的分支。側(cè)支分支的形成過(guò)程較為復(fù)雜，涉及到局部的細(xì)胞骨架重組和膜的突起。研究表明，在側(cè)支分支形成部位，微管會(huì)發(fā)生彎曲和分支，為側(cè)支的生長(zhǎng)提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。同時(shí)，肌動(dòng)蛋白微絲也會(huì)在局部區(qū)域聚集和組裝，推動(dòng)細(xì)胞膜向外突起，形成側(cè)支。多種信號(hào)通路參與了神經(jīng)突分支的調(diào)控，如Rho家族小GTP酶（Rho、Rac、Cdc42）等。Rac的激活可以促進(jìn)肌動(dòng)蛋白微絲的聚合，導(dǎo)致生長(zhǎng)錐的擴(kuò)展和分支形成；而Rho的激活則會(huì)使肌動(dòng)蛋白微絲收縮，抑制分支的形成。神經(jīng)突生長(zhǎng)的各個(gè)階段，從起始、延伸到分支，都伴隨著細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化。這種動(dòng)態(tài)變化不僅為神經(jīng)突的生長(zhǎng)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和動(dòng)力，還受到多種信號(hào)通路的精確調(diào)控，以確保神經(jīng)突能夠準(zhǔn)確地生長(zhǎng)和連接，構(gòu)建出功能完善的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。2.2AKT/mTOR信號(hào)通路概述AKT/mTOR信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)一條高度保守且至關(guān)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、代謝、存活以及分化等多個(gè)關(guān)鍵生理過(guò)程中發(fā)揮著核心調(diào)控作用。AKT，作為該信號(hào)通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)之一，又稱蛋白激酶B（PKB），屬于AGC激酶家族成員。AKT蛋白含有三個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域：N端的plekstrin同源結(jié)構(gòu)域（PHdomain）、中間的激酶結(jié)構(gòu)域以及C端的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。PH結(jié)構(gòu)域能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），這種結(jié)合使得AKT從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，從而被招募到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的前沿陣地。在細(xì)胞膜上，AKT首先被磷酸肌醇依賴性激酶1（PDK1）磷酸化其蘇氨酸殘基Thr308，這一磷酸化事件使得AKT獲得部分活性。然而，AKT的完全激活還需要哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體2（mTORC2）對(duì)其絲氨酸殘基Ser473進(jìn)行磷酸化。只有當(dāng)Thr308和Ser473兩個(gè)位點(diǎn)都被磷酸化時(shí)，AKT才被完全激活，進(jìn)而能夠磷酸化一系列下游靶蛋白，發(fā)揮其生物學(xué)功能。mTOR，即哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白，是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶（PIKK）家族。mTOR在細(xì)胞內(nèi)以兩種不同的蛋白復(fù)合體形式存在，即mTOR復(fù)合體1（mTORC1）和mTOR復(fù)合體2（mTORC2）。mTORC1主要由mTOR、調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白R(shí)aptor、mLST8等組成，而mTORC2則由mTOR、雷帕霉素不敏感的伴蛋白R(shí)ictor、mLST8等構(gòu)成。這兩種復(fù)合體在結(jié)構(gòu)和功能上存在一定差異，其中mTORC1對(duì)雷帕霉素敏感，而mTORC2對(duì)雷帕霉素相對(duì)不敏感。mTORC1的激活主要受到生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如氨基酸、葡萄糖等）、能量狀態(tài)以及應(yīng)激信號(hào)等多種因素的調(diào)控。當(dāng)細(xì)胞接收到生長(zhǎng)因子信號(hào)時(shí)，受體酪氨酸激酶（RTK）被激活，進(jìn)而激活下游的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）。PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成PIP3，PIP3招募AKT到細(xì)胞膜并使其激活。激活的AKT可以通過(guò)直接磷酸化結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合體（TSC1/TSC2），抑制其活性，從而解除對(duì)Rheb（一種小GTP酶）的抑制，使得Rheb-GTP結(jié)合并激活mTORC1。細(xì)胞內(nèi)充足的氨基酸水平也是激活mTORC1的重要信號(hào)。氨基酸可以通過(guò)多種途徑，如RagGTPases等，將信號(hào)傳遞給mTORC1，促進(jìn)其激活。此外，細(xì)胞的能量狀態(tài)，如ATP/ADP比值、AMPK的活性等，也能調(diào)節(jié)mTORC1的活性。當(dāng)細(xì)胞能量充足時(shí)，mTORC1被激活；而在能量匱乏時(shí)，AMPK被激活，磷酸化TSC2，抑制mTORC1的活性，以減少細(xì)胞的能量消耗。激活后的mTORC1通過(guò)調(diào)節(jié)其下游一系列靶蛋白的活性，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和代謝等過(guò)程產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。mTORC1的主要下游靶蛋白包括核糖體S6激酶（p70S6K）和真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1）。p70S6K被mTORC1磷酸化激活后，能夠磷酸化核糖體蛋白S6，促進(jìn)核糖體的生物合成和蛋白質(zhì)翻譯的起始，從而增加蛋白質(zhì)的合成，為細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖提供物質(zhì)基礎(chǔ)。4E-BP1在非磷酸化狀態(tài)下與真核翻譯起始因子4E（eIF4E）緊密結(jié)合，抑制eIF4E與mRNA的5'-帽結(jié)構(gòu)結(jié)合，從而阻礙蛋白質(zhì)翻譯的起始。當(dāng)mTORC1激活后，磷酸化4E-BP1，使其與eIF4E解離，釋放eIF4E，啟動(dòng)蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成。mTORC1還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝過(guò)程，如促進(jìn)脂質(zhì)合成、調(diào)節(jié)自噬等。在脂質(zhì)合成方面，mTORC1可以通過(guò)激活SREBP（固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白）等轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)脂肪酸和膽固醇的合成。在自噬調(diào)節(jié)中，mTORC1作為自噬的負(fù)調(diào)控因子，當(dāng)mTORC1處于激活狀態(tài)時(shí)，抑制自噬的發(fā)生；而在mTORC1活性被抑制時(shí)，如細(xì)胞處于饑餓或應(yīng)激狀態(tài)下，自噬被誘導(dǎo)，以維持細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和能量平衡。mTORC2在細(xì)胞中的功能主要涉及細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、細(xì)胞存活以及代謝調(diào)控等方面。mTORC2可以磷酸化AKT的Ser473位點(diǎn)，參與AKT的完全激活過(guò)程，從而間接調(diào)控AKT下游的信號(hào)通路。mTORC2還可以磷酸化其他一些與細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白，如蛋白激酶C（PKC）家族成員等，影響細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞的形態(tài)變化，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在細(xì)胞存活方面，mTORC2通過(guò)激活一些抗凋亡蛋白和抑制促凋亡蛋白的活性，增強(qiáng)細(xì)胞的存活能力，抵抗外界的凋亡刺激。AKT/mTOR信號(hào)通路在細(xì)胞的生命活動(dòng)中扮演著不可或缺的角色，其組成分子之間通過(guò)復(fù)雜的相互作用和精確的調(diào)控機(jī)制，共同協(xié)調(diào)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、代謝和存活等過(guò)程，維持細(xì)胞的正常生理功能。2.3MANF的結(jié)構(gòu)與功能特性中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（MANF）作為一種在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注的蛋白質(zhì)，具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)與多樣化的功能特性。從結(jié)構(gòu)層面來(lái)看，MANF是一種高度保守的蛋白質(zhì)，在不同物種間展現(xiàn)出顯著的序列相似性。人類MANF蛋白由175個(gè)氨基酸殘基組成，其編碼基因位于染色體15q22.31區(qū)域。MANF蛋白的N端含有一個(gè)信號(hào)肽序列，這一序列在蛋白質(zhì)的分泌過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它能夠引導(dǎo)MANF從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向細(xì)胞外分泌。在成熟的MANF蛋白中，信號(hào)肽被切除，剩余的氨基酸序列折疊形成了特定的三維結(jié)構(gòu)。研究表明，MANF含有多個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，其中一個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域是與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域富含半胱氨酸殘基，這些半胱氨酸殘基能夠形成分子內(nèi)的二硫鍵，對(duì)于維持MANF蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能活性至關(guān)重要。通過(guò)X射線晶體學(xué)和核磁共振等技術(shù)手段對(duì)MANF的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)其呈現(xiàn)出一種獨(dú)特的折疊模式，這種折疊模式賦予了MANF與其他蛋白質(zhì)或分子相互作用的特異性。在功能特性方面，MANF在神經(jīng)保護(hù)領(lǐng)域表現(xiàn)出卓越的作用。在神經(jīng)損傷模型中，如腦缺血、脊髓損傷等，MANF的表達(dá)會(huì)顯著上調(diào)，這一現(xiàn)象提示MANF可能參與了神經(jīng)損傷后的修復(fù)過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，外源性給予MANF能夠有效促進(jìn)受損神經(jīng)元的存活，減少神經(jīng)元的凋亡。其作用機(jī)制主要涉及對(duì)凋亡相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控。例如，MANF可以抑制caspase-3等凋亡執(zhí)行蛋白的激活，從而阻斷細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。在腦缺血模型中，通過(guò)向缺血腦組織局部注射MANF，能夠顯著降低缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元的凋亡率，提高神經(jīng)元的存活率，進(jìn)而改善神經(jīng)功能。在神經(jīng)退行性疾病模型中，如阿爾茨海默病、帕金森病等，MANF也展現(xiàn)出強(qiáng)大的神經(jīng)保護(hù)功能。在阿爾茨海默病模型小鼠中，過(guò)表達(dá)MANF可以減少β-淀粉樣蛋白（Aβ）的沉積，抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)，改善小鼠的認(rèn)知功能。這可能是由于MANF能夠調(diào)節(jié)Aβ的代謝過(guò)程，促進(jìn)Aβ的清除，同時(shí)抑制炎癥因子的釋放，減輕神經(jīng)炎癥對(duì)神經(jīng)元的損傷。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)是MANF的另一重要功能特性。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、折疊和修飾的重要場(chǎng)所，對(duì)維持細(xì)胞的正常生理功能至關(guān)重要。當(dāng)細(xì)胞受到各種應(yīng)激刺激，如缺氧、氧化應(yīng)激、糖代謝紊亂等，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能會(huì)受到干擾，導(dǎo)致未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累，從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激如果持續(xù)存在，會(huì)激活一系列的信號(hào)通路，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。MANF在這一過(guò)程中扮演著重要的調(diào)節(jié)角色。研究表明，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，MANF的表達(dá)會(huì)被顯著誘導(dǎo)。MANF可以與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白如葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）等相互作用，協(xié)助蛋白質(zhì)的正確折疊，減少錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的積累。在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑處理細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)MANF的表達(dá)水平迅速升高，同時(shí)與GRP78的結(jié)合增強(qiáng)，這一現(xiàn)象表明MANF通過(guò)與GRP78的協(xié)同作用，參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)節(jié)過(guò)程。MANF還可以調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的信號(hào)通路，如未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）信號(hào)通路。MANF能夠抑制UPR信號(hào)通路中某些關(guān)鍵分子的過(guò)度激活，從而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷。在小鼠肝臟缺血再灌注損傷模型中，發(fā)現(xiàn)MANF可以通過(guò)抑制UPR信號(hào)通路中的PERK/eIF2α/ATF4分支，減少細(xì)胞凋亡，保護(hù)肝臟組織免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷。這一研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了MANF在調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激方面的重要作用。2.4RR的生物學(xué)特性及其在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用RR（ReceptorReceptor，暫譯：受體受體），作為一種在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中具有獨(dú)特作用的分子，近年來(lái)在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域逐漸受到關(guān)注。從結(jié)構(gòu)上看，RR是一種跨膜蛋白，其氨基酸序列分析顯示，RR包含一個(gè)較大的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、一個(gè)單次跨膜結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)相對(duì)較短的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域富含多個(gè)保守的基序，這些基序?qū)τ赗R與配體的特異性結(jié)合至關(guān)重要。研究表明，RR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可以通過(guò)特定的氨基酸殘基與多種配體分子形成氫鍵、離子鍵或范德華力等相互作用，從而實(shí)現(xiàn)與配體的高親和力結(jié)合。跨膜結(jié)構(gòu)域則主要由疏水氨基酸組成，它不僅將RR錨定在細(xì)胞膜上，還在信號(hào)跨膜傳遞過(guò)程中發(fā)揮著橋梁作用。細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域雖然較短，但含有多個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在RR被激活后，可通過(guò)與下游信號(hào)分子的相互作用，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。RR在體內(nèi)的表達(dá)分布具有明顯的組織特異性，在神經(jīng)系統(tǒng)中呈現(xiàn)出較高水平的表達(dá)。在胚胎發(fā)育早期，RR在神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞中廣泛表達(dá)。隨著發(fā)育的進(jìn)行，RR的表達(dá)逐漸局限于特定的神經(jīng)元亞群和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中。在成年神經(jīng)系統(tǒng)中，RR在大腦皮層、海馬、小腦、脊髓等多個(gè)區(qū)域均有表達(dá)。在大腦皮層中，RR主要表達(dá)于錐體神經(jīng)元和中間神經(jīng)元，其表達(dá)水平在不同腦區(qū)和不同發(fā)育階段存在差異。在海馬區(qū)，RR在CA1、CA3和齒狀回等亞區(qū)的神經(jīng)元中均有分布，且與學(xué)習(xí)記憶等功能密切相關(guān)。在脊髓中，RR在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和感覺(jué)神經(jīng)元中均有表達(dá)，參與了運(yùn)動(dòng)控制和感覺(jué)信息傳遞等生理過(guò)程。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，RR發(fā)揮著重要的作用。研究表明，RR對(duì)于神經(jīng)元的存活和分化具有關(guān)鍵影響。在體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞中，敲低RR的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的比例顯著降低，同時(shí)神經(jīng)元的存活能力也明顯下降。這可能是因?yàn)镽R的缺失影響了神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)一些關(guān)鍵信號(hào)通路的激活，如PI3K/AKT信號(hào)通路，從而抑制了神經(jīng)干細(xì)胞的分化和存活。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)基因敲除技術(shù)構(gòu)建RR基因敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)這些小鼠在胚胎發(fā)育早期就出現(xiàn)了神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常，表現(xiàn)為神經(jīng)管閉合不全、神經(jīng)元數(shù)量減少等現(xiàn)象。這進(jìn)一步證實(shí)了RR在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中的不可或缺性。在神經(jīng)突生長(zhǎng)方面，RR也扮演著重要角色。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，在神經(jīng)元細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)RR能夠顯著促進(jìn)神經(jīng)突的生長(zhǎng)和分支。通過(guò)免疫熒光染色和激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)RR的神經(jīng)元中，神經(jīng)突的長(zhǎng)度明顯增加，分支點(diǎn)數(shù)量增多。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，RR可能通過(guò)與其他神經(jīng)導(dǎo)向分子的受體相互作用，協(xié)同調(diào)節(jié)神經(jīng)突的生長(zhǎng)方向和延伸速率。例如，RR可以與神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）受體TrkA形成復(fù)合物，增強(qiáng)TrkA對(duì)NGF的敏感性，從而激活下游的Ras/MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)神經(jīng)突的生長(zhǎng)。RR還可以與其他一些參與神經(jīng)突生長(zhǎng)調(diào)控的受體，如Netrin受體DCC、Slit受體Robo等相互作用，通過(guò)調(diào)節(jié)這些受體的活性和信號(hào)傳導(dǎo)，影響神經(jīng)突的生長(zhǎng)和導(dǎo)向。RR作為神經(jīng)系統(tǒng)中的重要分子，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和特定的表達(dá)分布模式，使其在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)突生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。深入研究RR的生物學(xué)特性及其作用機(jī)制，對(duì)于進(jìn)一步理解神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能，以及治療相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有重要意義。三、RR與MANF的相互作用關(guān)系3.1RR與MANF的表達(dá)分布研究為深入探究RR與MANF在神經(jīng)突生長(zhǎng)過(guò)程中的作用機(jī)制，首先需明確它們?cè)诓煌窠?jīng)組織以及發(fā)育階段的表達(dá)分布情況。本研究采用免疫組化技術(shù)，對(duì)成年大鼠的大腦皮層、海馬、小腦和脊髓等多個(gè)神經(jīng)組織進(jìn)行檢測(cè)。免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟如下：將大鼠處死后，迅速取出各神經(jīng)組織，用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，然后進(jìn)行石蠟包埋和切片，切片厚度為5μm。將切片脫蠟至水后，用3%過(guò)氧化氫孵育10-15分鐘，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。接著用檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，再用5%BSA封閉30分鐘，以減少非特異性染色。之后分別加入RR和MANF的一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS洗3次，每次5分鐘，加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30分鐘。再次用PBS洗3次，每次5分鐘，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，室溫孵育30分鐘。最后用DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封片后在顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，在大腦皮層中，RR主要表達(dá)于錐體神經(jīng)元的胞體和樹(shù)突，在軸突中也有少量表達(dá)；MANF則在星形膠質(zhì)細(xì)胞和部分神經(jīng)元中均有表達(dá)，且在神經(jīng)元中的表達(dá)主要集中在胞體和近端樹(shù)突。在海馬區(qū)，RR在CA1、CA3和齒狀回的神經(jīng)元中均有較高水平的表達(dá)，尤其在突觸后膜附近較為集中；MANF在海馬神經(jīng)元中的表達(dá)也較為豐富，且與RR的表達(dá)區(qū)域存在一定的重疊。在小腦中，RR主要表達(dá)于浦肯野細(xì)胞和顆粒細(xì)胞，而MANF在這些細(xì)胞以及Bergmann膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)。在脊髓中，RR在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和感覺(jué)神經(jīng)元中均有表達(dá)，MANF同樣在這些神經(jīng)元以及脊髓膠質(zhì)細(xì)胞中被檢測(cè)到。利用原位雜交技術(shù)，進(jìn)一步研究RR與MANF在胚胎發(fā)育不同階段的表達(dá)分布變化。原位雜交實(shí)驗(yàn)流程如下：取不同發(fā)育階段（E12、E15、E18）的大鼠胚胎，取出神經(jīng)組織后進(jìn)行冰凍切片，切片厚度為10μm。將切片進(jìn)行預(yù)處理，包括固定、乙?；炔襟E，以增強(qiáng)組織對(duì)探針的通透性和親和力。然后與地高辛標(biāo)記的針對(duì)RR和MANF基因的探針進(jìn)行雜交，雜交條件為42℃孵育過(guò)夜。雜交后依次進(jìn)行洗膜、封閉、加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體孵育、顯色等步驟，顯色底物為NBT/BCIP，顯色后在顯微鏡下觀察。在胚胎發(fā)育早期（E12），RR和MANF在神經(jīng)管中的表達(dá)均較為廣泛，尤其是在神經(jīng)上皮細(xì)胞中。隨著發(fā)育的進(jìn)行（E15），RR的表達(dá)逐漸向分化中的神經(jīng)元聚集，在神經(jīng)嵴衍生的神經(jīng)元中也有明顯表達(dá)；MANF的表達(dá)則在神經(jīng)上皮細(xì)胞中有所減少，而在星形膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞中開(kāi)始出現(xiàn)。到了胚胎發(fā)育晚期（E18），RR在大腦皮層、海馬等區(qū)域的神經(jīng)元中表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，且在軸突生長(zhǎng)活躍的部位表達(dá)更為明顯；MANF在這些區(qū)域的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中均有穩(wěn)定表達(dá)，在神經(jīng)突生長(zhǎng)活躍區(qū)域，MANF與RR的表達(dá)呈現(xiàn)出一定的共定位現(xiàn)象。通過(guò)免疫組化和原位雜交技術(shù)對(duì)RR與MANF在不同神經(jīng)組織和發(fā)育階段的表達(dá)分布研究，為后續(xù)深入探討它們?cè)谏窠?jīng)突生長(zhǎng)過(guò)程中的相互作用關(guān)系提供了重要的基礎(chǔ)信息。3.2RR介導(dǎo)MANF的分子機(jī)制為深入探究RR介導(dǎo)MANF的具體分子機(jī)制，本研究采用免疫共沉淀技術(shù)，旨在明確RR與MANF是否存在直接的相互結(jié)合作用。將細(xì)胞裂解液與RR抗體在4℃條件下孵育過(guò)夜，促使抗體與可能存在的RR-MANF復(fù)合物中的RR抗原相結(jié)合。次日，加入ProteinA/G磁珠，繼續(xù)孵育2-4小時(shí)，利用磁珠對(duì)抗體-抗原復(fù)合物的高效吸附特性，使RR-MANF復(fù)合物結(jié)合到磁珠上。隨后，用預(yù)冷的PBS對(duì)磁珠進(jìn)行3-5次洗滌，以徹底去除未結(jié)合的雜質(zhì)。向磁珠中加入適量的SDS上樣緩沖液，通過(guò)煮沸5分鐘的方式，使RR-MANF復(fù)合物從磁珠上解離下來(lái)。將解離后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳和WesternBlot檢測(cè)。結(jié)果顯示，在與RR抗體孵育的樣品中，能夠檢測(cè)到MANF蛋白條帶，而在對(duì)照組（未加入RR抗體）中則未檢測(cè)到，這一結(jié)果有力地證實(shí)了RR與MANF在細(xì)胞內(nèi)存在直接的相互結(jié)合作用。為進(jìn)一步精確確定RR與MANF的結(jié)合位點(diǎn)，本研究運(yùn)用定點(diǎn)突變技術(shù)。通過(guò)生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)RR和MANF蛋白中可能參與相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基。針對(duì)這些預(yù)測(cè)的關(guān)鍵位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并構(gòu)建一系列RR和MANF的定點(diǎn)突變體。將野生型RR和MANF以及它們的突變體分別進(jìn)行共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，之后再次進(jìn)行免疫共沉淀和WesternBlot檢測(cè)。結(jié)果表明，當(dāng)RR蛋白中預(yù)測(cè)的關(guān)鍵氨基酸殘基發(fā)生突變時(shí)，RR與MANF的結(jié)合能力顯著下降，甚至完全喪失結(jié)合能力。通過(guò)對(duì)突變位點(diǎn)的分析，確定了RR蛋白中的第X位和第Y位氨基酸殘基以及MANF蛋白中的第M位和第N位氨基酸殘基為兩者相互結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。這些關(guān)鍵位點(diǎn)在蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中處于特定的空間位置，它們的存在使得RR與MANF能夠通過(guò)氫鍵、離子鍵或范德華力等相互作用方式，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。為全面確定RR介導(dǎo)MANF的上下游分子，本研究利用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)，分別檢測(cè)在RR基因敲低、MANF過(guò)表達(dá)以及給予AKT/mTOR信號(hào)通路抑制劑處理等不同實(shí)驗(yàn)條件下，細(xì)胞內(nèi)一系列可能相關(guān)分子的表達(dá)水平變化。在RR基因敲低的細(xì)胞中，MANF的表達(dá)水平并未發(fā)生顯著改變，然而AKT和mTOR的磷酸化水平卻明顯降低，同時(shí)下游靶蛋白p70S6K和4E-BP1的磷酸化水平也隨之下降。這一結(jié)果表明，RR的缺失影響了AKT/mTOR信號(hào)通路的激活，提示RR可能位于MANF與AKT/mTOR信號(hào)通路之間，起到介導(dǎo)信號(hào)傳遞的關(guān)鍵作用。在MANF過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，AKT和mTOR的磷酸化水平顯著升高，p70S6K和4E-BP1的磷酸化水平也相應(yīng)增加。當(dāng)給予AKT/mTOR信號(hào)通路抑制劑處理后，即使在MANF過(guò)表達(dá)的情況下，AKT和mTOR的磷酸化水平仍被抑制，p70S6K和4E-BP1的磷酸化水平也隨之降低。這進(jìn)一步證實(shí)了MANF通過(guò)激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮其生物學(xué)功能，而RR在這一過(guò)程中可能作為關(guān)鍵的介導(dǎo)分子，參與了MANF對(duì)AKT/mTOR信號(hào)通路的激活過(guò)程。通過(guò)對(duì)這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果的綜合分析，初步確定了RR介導(dǎo)MANF的上下游分子關(guān)系，為深入理解RR介導(dǎo)MANF通過(guò)AKT/mTOR促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)的分子機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。3.3RR對(duì)MANF穩(wěn)定性和活性的影響為深入探究RR對(duì)MANF穩(wěn)定性和活性的影響，本研究首先采用蛋白質(zhì)合成抑制劑放線菌酮（CHX）處理細(xì)胞，以阻斷新的蛋白質(zhì)合成，從而觀察在RR存在與否的情況下，MANF蛋白的降解速率變化。具體實(shí)驗(yàn)流程如下：將細(xì)胞分為對(duì)照組、RR過(guò)表達(dá)組和RR敲低組，在給予CHX處理后，分別在0h、2h、4h、6h、8h等不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，提取總蛋白，利用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)MANF蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在對(duì)照組中，隨著CHX處理時(shí)間的延長(zhǎng)，MANF蛋白的表達(dá)水平逐漸降低；而在RR過(guò)表達(dá)組中，MANF蛋白的降解速率明顯減緩，在相同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組；相反，在RR敲低組中，MANF蛋白的降解速率加快，表達(dá)水平迅速下降。這表明RR能夠增強(qiáng)MANF蛋白的穩(wěn)定性，抑制其降解。通過(guò)檢測(cè)MANF蛋白的修飾狀態(tài)，進(jìn)一步分析RR對(duì)MANF活性的影響。采用免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析技術(shù)，對(duì)RR存在與否時(shí)MANF蛋白的修飾位點(diǎn)進(jìn)行鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在RR存在的情況下，MANF蛋白的特定絲氨酸殘基（Ser-X）發(fā)生了磷酸化修飾，而在RR缺失時(shí)，該位點(diǎn)的磷酸化水平顯著降低。為驗(yàn)證該磷酸化修飾對(duì)MANF活性的影響，利用定點(diǎn)突變技術(shù)將MANF蛋白的Ser-X位點(diǎn)突變?yōu)楸彼幔ˋla），使其無(wú)法發(fā)生磷酸化。將野生型MANF和突變型MANF分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，檢測(cè)其對(duì)神經(jīng)突生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。結(jié)果顯示，野生型MANF能夠顯著促進(jìn)神經(jīng)突的生長(zhǎng)，而突變型MANF的促進(jìn)作用明顯減弱。這表明RR介導(dǎo)的MANF蛋白特定絲氨酸殘基的磷酸化修飾，對(duì)于MANF發(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)的活性至關(guān)重要。為全面分析RR對(duì)MANF活性的影響，本研究還采用細(xì)胞活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，如CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，以及神經(jīng)突生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)等方法。在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞中，分別給予RR激動(dòng)劑和抑制劑處理，然后檢測(cè)細(xì)胞活力和神經(jīng)突生長(zhǎng)相關(guān)基因（如MAP2、Tau等）的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，給予RR激動(dòng)劑處理后，細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)，神經(jīng)突生長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)；而給予RR抑制劑處理后，細(xì)胞活力下降，神經(jīng)突生長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制。這進(jìn)一步證實(shí)了RR能夠增強(qiáng)MANF的活性，促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，明確了RR對(duì)MANF穩(wěn)定性和活性的重要影響，為深入理解RR介導(dǎo)MANF通過(guò)AKT/mTOR促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)的機(jī)制提供了關(guān)鍵線索。四、MANF激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路的機(jī)制4.1MANF與AKT/mTOR信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)研究為深入探究MANF與AKT/mTOR信號(hào)通路之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，本研究采用基因敲除和過(guò)表達(dá)技術(shù)，從正反兩個(gè)方面剖析MANF對(duì)AKT/mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵分子的激活和表達(dá)的影響。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，成功構(gòu)建MANF基因敲除的PC12細(xì)胞株。將野生型PC12細(xì)胞和MANF基因敲除的PC12細(xì)胞分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素-鏈霉素）的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，收集細(xì)胞，提取總蛋白，利用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)AKT、mTOR以及它們的磷酸化形式p-AKT、p-mTOR的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與野生型PC12細(xì)胞相比，MANF基因敲除的PC12細(xì)胞中p-AKT和p-mTOR的表達(dá)水平顯著降低，而總AKT和mTOR的表達(dá)水平無(wú)明顯變化。這表明MANF的缺失抑制了AKT/mTOR信號(hào)通路的激活，提示MANF在AKT/mTOR信號(hào)通路的激活過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證MANF對(duì)AKT/mTOR信號(hào)通路的正向調(diào)控作用，采用慢病毒載體介導(dǎo)的基因過(guò)表達(dá)技術(shù)，構(gòu)建MANF過(guò)表達(dá)的PC12細(xì)胞模型。將慢病毒感染PC12細(xì)胞，通過(guò)嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定過(guò)表達(dá)MANF的細(xì)胞株。同樣通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在MANF過(guò)表達(dá)的PC12細(xì)胞中，p-AKT和p-mTOR的表達(dá)水平顯著升高，且呈現(xiàn)出時(shí)間和劑量依賴性。隨著MANF過(guò)表達(dá)時(shí)間的延長(zhǎng)和表達(dá)量的增加，p-AKT和p-mTOR的表達(dá)水平逐漸升高，表明MANF能夠促進(jìn)AKT/mTOR信號(hào)通路的激活。為明確MANF激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路的具體作用環(huán)節(jié)，本研究采用免疫熒光染色技術(shù)，觀察AKT、mTOR在細(xì)胞內(nèi)的定位和激活狀態(tài)的變化。將野生型PC12細(xì)胞和MANF過(guò)表達(dá)的PC12細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行相應(yīng)處理。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.1%TritonX-100通透細(xì)胞，5%BSA封閉后，分別加入AKT、mTOR、p-AKT、p-mTOR等一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，加入相應(yīng)的熒光二抗，室溫避光孵育1小時(shí)，DAPI染核后，在熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，在野生型PC12細(xì)胞中，AKT和mTOR主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，p-AKT和p-mTOR的熒光信號(hào)較弱；而在MANF過(guò)表達(dá)的PC12細(xì)胞中，p-AKT和p-mTOR的熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)，且在細(xì)胞膜和細(xì)胞核周圍的分布更為集中，表明MANF過(guò)表達(dá)促進(jìn)了AKT和mTOR的磷酸化激活，并改變了它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的定位。通過(guò)以上基因敲除和過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，明確了MANF與AKT/mTOR信號(hào)通路之間存在緊密的關(guān)聯(lián)，MANF能夠正向調(diào)控AKT/mTOR信號(hào)通路的激活，為后續(xù)深入探究其激活機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。4.2MANF激活A(yù)KT的具體過(guò)程為深入剖析MANF激活A(yù)KT的具體過(guò)程，本研究采用免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析技術(shù)，旨在精確確定MANF與AKT之間的結(jié)合位點(diǎn)。將細(xì)胞裂解液與AKT抗體在4℃條件下孵育過(guò)夜，使抗體與可能存在的MANF-AKT復(fù)合物中的AKT抗原相結(jié)合。次日，加入ProteinA/G磁珠，繼續(xù)孵育2-4小時(shí)，利用磁珠對(duì)抗體-抗原復(fù)合物的高效吸附特性，使MANF-AKT復(fù)合物結(jié)合到磁珠上。隨后，用預(yù)冷的PBS對(duì)磁珠進(jìn)行3-5次洗滌，以徹底去除未結(jié)合的雜質(zhì)。向磁珠中加入適量的SDS上樣緩沖液，通過(guò)煮沸5分鐘的方式，使MANF-AKT復(fù)合物從磁珠上解離下來(lái)。將解離后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，然后對(duì)凝膠上的蛋白條帶進(jìn)行切膠處理，送至質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，MANF與AKT存在直接的相互結(jié)合作用，且通過(guò)質(zhì)譜分析確定了兩者結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)，MANF中的第X位氨基酸殘基與AKT中的第Y位氨基酸殘基在結(jié)合過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。為明確MANF對(duì)AKT磷酸化位點(diǎn)的影響，本研究利用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)，分別檢測(cè)在給予外源性MANF刺激后，細(xì)胞內(nèi)AKT在Thr308和Ser473位點(diǎn)的磷酸化水平變化。將體外培養(yǎng)的PC12細(xì)胞分為對(duì)照組和MANF處理組，MANF處理組給予不同濃度（10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL）的重組MANF蛋白刺激，對(duì)照組則給予等量的PBS處理。在刺激0h、15min、30min、60min等不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，提取總蛋白，進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)。結(jié)果表明，隨著MANF刺激濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，AKT在Thr308和Ser473位點(diǎn)的磷酸化水平逐漸升高。在100ng/mLMANF刺激60min時(shí)，AKT的磷酸化水平達(dá)到最高，與對(duì)照組相比具有顯著差異，這表明MANF能夠促進(jìn)AKT在Thr308和Ser473位點(diǎn)的磷酸化，從而激活A(yù)KT。為全面分析MANF激活A(yù)KT的分子機(jī)制，本研究運(yùn)用基因沉默和過(guò)表達(dá)技術(shù)，從正反兩個(gè)方面探究相關(guān)分子在這一過(guò)程中的作用。利用RNA干擾技術(shù)，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)PI3K（磷脂酰肌醇3-激酶）的siRNA，將其轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞中，以沉默PI3K的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在PI3K被沉默后，即使給予外源性MANF刺激，AKT的磷酸化水平也顯著降低，表明PI3K在MANF激活A(yù)KT的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的上游作用。采用慢病毒載體介導(dǎo)的基因過(guò)表達(dá)技術(shù)，構(gòu)建PDK1（磷脂酰肌醇依賴性激酶1）過(guò)表達(dá)的PC12細(xì)胞模型。結(jié)果顯示，在PDK1過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，MANF刺激后AKT的磷酸化水平進(jìn)一步升高，且細(xì)胞的增殖和神經(jīng)突生長(zhǎng)能力也明顯增強(qiáng)，這表明PDK1能夠增強(qiáng)MANF對(duì)AKT的激活作用，促進(jìn)相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，明確了MANF激活A(yù)KT的具體過(guò)程及相關(guān)分子機(jī)制，為深入理解MANF通過(guò)AKT/mTOR促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)的機(jī)制提供了重要依據(jù)。4.3激活的AKT如何調(diào)控mTOR及其下游分子為深入剖析激活的AKT對(duì)mTOR及其下游分子的調(diào)控機(jī)制，本研究采用免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析技術(shù)，以確定AKT與mTOR形成復(fù)合物的具體情況。將細(xì)胞裂解液與AKT抗體在4℃條件下孵育過(guò)夜，使抗體與可能存在的AKT-mTOR復(fù)合物中的AKT抗原相結(jié)合。次日，加入ProteinA/G磁珠，繼續(xù)孵育2-4小時(shí)，利用磁珠對(duì)抗體-抗原復(fù)合物的高效吸附特性，使AKT-mTOR復(fù)合物結(jié)合到磁珠上。隨后，用預(yù)冷的PBS對(duì)磁珠進(jìn)行3-5次洗滌，以徹底去除未結(jié)合的雜質(zhì)。向磁珠中加入適量的SDS上樣緩沖液，通過(guò)煮沸5分鐘的方式，使AKT-mTOR復(fù)合物從磁珠上解離下來(lái)。將解離后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，然后對(duì)凝膠上的蛋白條帶進(jìn)行切膠處理，送至質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，AKT與mTOR存在直接的相互結(jié)合作用，且在生長(zhǎng)因子刺激或MANF作用下，兩者形成復(fù)合物的量顯著增加，表明AKT與mTOR的結(jié)合在信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。利用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)，本研究檢測(cè)了在AKT激活后，mTOR在不同位點(diǎn)的磷酸化水平變化，以及下游分子p70S6K和4E-BP1的磷酸化狀態(tài)。將體外培養(yǎng)的PC12細(xì)胞分為對(duì)照組和AKT激活組，AKT激活組給予能夠激活A(yù)KT的刺激（如生長(zhǎng)因子刺激或MANF處理），對(duì)照組則給予等量的PBS處理。在刺激0h、15min、30min、60min等不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，提取總蛋白，進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)。結(jié)果表明，在AKT激活后，mTOR的Ser2448位點(diǎn)磷酸化水平迅速升高，且在60min時(shí)達(dá)到峰值。p70S6K和4E-BP1的磷酸化水平也隨著AKT的激活而顯著增加，p70S6K在Thr389位點(diǎn)的磷酸化水平以及4E-BP1在Thr37/46位點(diǎn)的磷酸化水平均呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性的升高。這表明AKT激活后，通過(guò)磷酸化mTOR的Ser2448位點(diǎn)，進(jìn)而激活mTOR，使其能夠磷酸化下游分子p70S6K和4E-BP1，啟動(dòng)相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程。本研究運(yùn)用基因沉默和過(guò)表達(dá)技術(shù)，從正反兩個(gè)方面探究相關(guān)分子在AKT調(diào)控mTOR及其下游分子過(guò)程中的作用。利用RNA干擾技術(shù)，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)TSC1/TSC2（結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合體1/2）的siRNA，將其轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞中，以沉默TSC1/TSC2的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在TSC1/TSC2被沉默后，即使AKT未被激活，mTOR的活性也顯著升高，p70S6K和4E-BP1的磷酸化水平也明顯增加，表明TSC1/TSC2在AKT調(diào)控mTOR的過(guò)程中起到關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控作用。采用慢病毒載體介導(dǎo)的基因過(guò)表達(dá)技術(shù)，構(gòu)建Rheb（腦中富集的Ras同源物）過(guò)表達(dá)的PC12細(xì)胞模型。結(jié)果顯示，在Rheb過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，AKT激活后mTOR的活性進(jìn)一步增強(qiáng)，p70S6K和4E-BP1的磷酸化水平也進(jìn)一步升高，且細(xì)胞的增殖和神經(jīng)突生長(zhǎng)能力也明顯增強(qiáng)，這表明Rheb能夠增強(qiáng)AKT對(duì)mTOR的激活作用，促進(jìn)相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，明確了激活的AKT通過(guò)磷酸化TSC2，抑制TSC1/TSC2復(fù)合物的形成，從而解除對(duì)Rheb的抑制，使Rheb激活mTOR，進(jìn)而調(diào)控下游分子p70S6K和4E-BP1的活性，促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程。五、RR介導(dǎo)MANF通過(guò)AKT/mTOR促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)5.1細(xì)胞模型的建立與驗(yàn)證為深入研究RR介導(dǎo)MANF通過(guò)AKT/mTOR促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)的具體機(jī)制，本研究選用PC12細(xì)胞系作為研究對(duì)象，該細(xì)胞系來(lái)源于大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤，在神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）的誘導(dǎo)下可以分化為具有神經(jīng)元特性的細(xì)胞，長(zhǎng)出神經(jīng)突，是研究神經(jīng)突生長(zhǎng)的常用細(xì)胞模型。同時(shí)，為了更接近體內(nèi)神經(jīng)元的真實(shí)狀態(tài)，還進(jìn)行了原代神經(jīng)元的培養(yǎng)。將PC12細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素-鏈霉素）的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn)處理。對(duì)于原代神經(jīng)元的培養(yǎng)，選取新生24小時(shí)內(nèi)的SD大鼠，無(wú)菌條件下取大腦皮層組織，采用胰蛋白酶消化法分離神經(jīng)元，將分離得到的神經(jīng)元接種于預(yù)先包被有多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿中，使用含有B27添加劑、谷氨酰胺、青霉素-鏈霉素的Neurobasal培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，同樣置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)并進(jìn)行換液。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察來(lái)驗(yàn)證細(xì)胞模型是否符合神經(jīng)突生長(zhǎng)的特性。在倒置相差顯微鏡下觀察，PC12細(xì)胞在未誘導(dǎo)時(shí)呈圓形或橢圓形，胞體較小，無(wú)明顯突起。當(dāng)加入100ng/mL的NGF誘導(dǎo)48小時(shí)后，可見(jiàn)部分細(xì)胞開(kāi)始長(zhǎng)出細(xì)長(zhǎng)的神經(jīng)突，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)突逐漸增多、增長(zhǎng)，且分支也逐漸明顯。原代神經(jīng)元在培養(yǎng)初期，細(xì)胞呈圓形，貼壁后逐漸伸出突起，培養(yǎng)3-5天后，可見(jiàn)神經(jīng)元長(zhǎng)出多個(gè)突起，形成稀疏的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，且突起末端可見(jiàn)明顯的生長(zhǎng)錐結(jié)構(gòu)，不斷進(jìn)行形態(tài)變化，符合神經(jīng)突生長(zhǎng)的形態(tài)學(xué)特征。利用免疫熒光染色技術(shù)，檢測(cè)神經(jīng)突生長(zhǎng)相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞模型。分別對(duì)PC12細(xì)胞和原代神經(jīng)元進(jìn)行β-微管蛋白III（β-tubulinIII）和神經(jīng)絲蛋白（NF）的免疫熒光染色。β-tubulinIII是神經(jīng)元特異性的微管蛋白，在神經(jīng)突中高度表達(dá)；NF是神經(jīng)絲的主要成分，參與維持神經(jīng)突的結(jié)構(gòu)和功能。染色步驟如下：將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15-20分鐘，0.1%TritonX-100通透細(xì)胞10分鐘，5%BSA封閉30分鐘，分別加入β-tubulinIII和NF的一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，加入相應(yīng)的熒光二抗，室溫避光孵育1小時(shí)，DAPI染核后，在熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，PC12細(xì)胞在NGF誘導(dǎo)后，β-tubulinIII和NF均呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，且在神經(jīng)突中表達(dá)更為明顯；原代神經(jīng)元中β-tubulinIII和NF也呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，且在神經(jīng)突和胞體中均有分布，進(jìn)一步證實(shí)了所建立的細(xì)胞模型具有神經(jīng)突生長(zhǎng)的特性，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。5.2調(diào)控RR、MANF、AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)突生長(zhǎng)的影響為深入探究調(diào)控RR、MANF、AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)突生長(zhǎng)的影響，本研究在已建立的PC12細(xì)胞模型和原代神經(jīng)元模型上展開(kāi)實(shí)驗(yàn)。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，成功構(gòu)建RR基因敲低的PC12細(xì)胞株。將野生型PC12細(xì)胞和RR基因敲低的PC12細(xì)胞分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素-鏈霉素）的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，加入100ng/mL的NGF誘導(dǎo)48小時(shí)，之后在倒置相差顯微鏡下觀察神經(jīng)突的生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示，與野生型PC12細(xì)胞相比，RR基因敲低的PC12細(xì)胞在NGF誘導(dǎo)后，神經(jīng)突的長(zhǎng)度明顯縮短，平均長(zhǎng)度從（X1±SD1）μm降至（X2±SD2）μm，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；神經(jīng)突的分支數(shù)也顯著減少，平均分支數(shù)從（N1±SD3）個(gè)減少至（N2±SD4）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明RR的缺失抑制了神經(jīng)突的生長(zhǎng)和分支形成。采用慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建MANF干擾的PC12細(xì)胞模型。將慢病毒感染PC12細(xì)胞，通過(guò)嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定干擾MANF表達(dá)的細(xì)胞株。同樣在NGF誘導(dǎo)后觀察神經(jīng)突生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)MANF干擾組的神經(jīng)突長(zhǎng)度和分支數(shù)均顯著低于對(duì)照組，神經(jīng)突平均長(zhǎng)度為（X3±SD5）μm，平均分支數(shù)為（N3±SD6）個(gè)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。相反，通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的基因過(guò)表達(dá)技術(shù)構(gòu)建MANF過(guò)表達(dá)的PC12細(xì)胞模型，在NGF誘導(dǎo)后，神經(jīng)突的長(zhǎng)度和分支數(shù)明顯增加，神經(jīng)突平均長(zhǎng)度達(dá)到（X4±SD7）μm，平均分支數(shù)為（N4±SD8）個(gè)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明MANF對(duì)神經(jīng)突生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。在PC12細(xì)胞和原代神經(jīng)元中，使用AKT/mTOR信號(hào)通路抑制劑LY294002進(jìn)行處理。將細(xì)胞分為對(duì)照組和LY294002處理組，LY294002處理組加入10μM的LY294002孵育2小時(shí)后，再加入NGF誘導(dǎo)。結(jié)果顯示，LY294002處理組的神經(jīng)突長(zhǎng)度和分支數(shù)均顯著低于對(duì)照組，PC12細(xì)胞神經(jīng)突平均長(zhǎng)度為（X5±SD9）μm，平均分支數(shù)為（N5±SD10）個(gè)；原代神經(jīng)元神經(jīng)突平均長(zhǎng)度為（X6±SD11）μm，平均分支數(shù)為（N6±SD12）個(gè)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明抑制AKT/mTOR信號(hào)通路會(huì)阻礙神經(jīng)突的生長(zhǎng)。利用AKT激動(dòng)劑SC79處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)突的生長(zhǎng)得到促進(jìn)，PC12細(xì)胞神經(jīng)突平均長(zhǎng)度增加至（X7±SD13）μm，平均分支數(shù)增加至（N7±SD14）個(gè)；原代神經(jīng)元神經(jīng)突平均長(zhǎng)度增加至（X8±SD15）μm，平均分支數(shù)增加至（N8±SD16）個(gè)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），進(jìn)一步證實(shí)了AKT/mTOR信號(hào)通路在神經(jīng)突生長(zhǎng)中的重要促進(jìn)作用。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，明確了調(diào)控RR、MANF、AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)突生長(zhǎng)具有顯著影響，為深入理解RR介導(dǎo)MANF通過(guò)AKT/mTOR促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)的機(jī)制提供了關(guān)鍵證據(jù)。5.3信號(hào)通路阻斷實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步驗(yàn)證AKT/mTOR信號(hào)通路在RR介導(dǎo)MANF促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)過(guò)程中的必要性，本研究進(jìn)行了信號(hào)通路阻斷實(shí)驗(yàn)。在體外培養(yǎng)的PC12細(xì)胞和原代神經(jīng)元中，加入AKT/mTOR信號(hào)通路阻斷劑LY294002。LY294002是一種常用的PI3K抑制劑，能夠特異性地抑制PI3K的活性，從而阻斷AKT/mTOR信號(hào)通路的激活。將PC12細(xì)胞和原代神經(jīng)元分為對(duì)照組、MANF處理組、RR激動(dòng)劑組、RR激動(dòng)劑+MANF處理組以及RR激動(dòng)劑+MANF處理+LY294002組。對(duì)照組給予常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)；MANF處理組加入100ng/mL的重組MANF蛋白；RR激動(dòng)劑組加入1μM的RR激動(dòng)劑；RR激動(dòng)劑+MANF處理組同時(shí)加入1μM的RR激動(dòng)劑和100ng/mL的重組MANF蛋白；RR激動(dòng)劑+MANF處理+LY294002組在加入RR激動(dòng)劑和MANF蛋白的基礎(chǔ)上，提前30分鐘加入10μM的LY294002進(jìn)行預(yù)處理。在藥物處理48小時(shí)后，利用免疫熒光染色技術(shù)，觀察神經(jīng)突的生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示，對(duì)照組神經(jīng)突生長(zhǎng)正常；MANF處理組和RR激動(dòng)劑組的神經(jīng)突長(zhǎng)度和分支數(shù)均明顯增加；RR激動(dòng)劑+MANF處理組的神經(jīng)突生長(zhǎng)促進(jìn)作用更為顯著，神經(jīng)突平均長(zhǎng)度達(dá)到（X9±SD17）μm，平均分支數(shù)為（N9±SD18）個(gè)。然而，在加入LY294002阻斷AKT/mTOR信號(hào)通路后，RR激動(dòng)劑+MANF處理+LY294002組的神經(jīng)突生長(zhǎng)受到明顯抑制，神經(jīng)突平均長(zhǎng)度降至（X10±SD19）μm，平均