3T/HNSPXHXXXX—XXXX肉制品中動物性外源基因最大殘留限量本文件規(guī)定了肉制品中動物性外源基因的最大殘留限量。本標(biāo)準適用于肉制品的動物性（豬牛羊雞鴨）外源成分的最大殘留檢測，不適用于豬牛羊雞鴨外的其他動物性成分檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本標(biāo)準必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本標(biāo)準；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準。GB/T34796水溶液中核酸的濃度和純度檢測紫外分光光度法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1肉制品以畜禽肉或其食用副產(chǎn)品等為主要原料，添加或者不添加輔料，經(jīng)腌、鹵、醬、蒸、煮、黑、烤、烘焙、干燥、油炸、成型、發(fā)酵、調(diào)制等有關(guān)生產(chǎn)工藝加工而成的生或熟的肉類制品。3.2動物性外源成分肉制品標(biāo)簽上未標(biāo)注，即生產(chǎn)中所用原料肉之外的其他動物源成分。3.3動物性內(nèi)源成分肉制品標(biāo)簽上標(biāo)注，即生產(chǎn)中所用原料肉動物源成分。4應(yīng)用原則4.1食品生產(chǎn)時，食品生產(chǎn)者、加工者應(yīng)盡可能避免外源成分的帶入，不允許蓄意加入產(chǎn)品標(biāo)簽之外的原料肉。4.2樣品的采集和處理及檢驗按照附件執(zhí)行。5要求5.1外源成分檢出率要求T/HNSPXHXXXX—XXXX4類別動物性外源成分要求檢測方法肉制品未檢出1，或相對含量≤1%2附件11：成分篩查檢測中未檢出外源性成分（只出現(xiàn)動物性內(nèi)源成分熔解曲線峰，未出現(xiàn)動物性外源成分熔解曲線峰）2：表示被檢動物源性成分占內(nèi)外源動物源性成分的百分比含量。T/HNSPXHXXXX—XXXX5附件1畜禽肉產(chǎn)品、單一型肉制品、混合型肉制品動物性外源成分檢測方法本方法是利用RT-PCR技術(shù)，對樣品中動物源性成分定性篩查和相對定量檢測。其中，源性成分篩查，通過擴增子熱力學(xué)多態(tài)性設(shè)計，構(gòu)建能同步特異性擴增多個具有Tm值顯著差異動物源性成分的多重RT-PCR擴增體系，依據(jù)擴增后熔解曲線峰的個數(shù)和位置，可判定樣品中的動物源性成分組成。相對定量，是利用動物線粒體DNA序列物種多態(tài)性和保守性共存的特點，設(shè)計物種特異性和物種通用性引物/Taqman探針組成共鏈參比擴增體系，依據(jù)?Ct值-百分比含量標(biāo)準曲線，可測定動物源性成分的相對含量（占所有肉種成分的百分比含量）。2.檢測用引物和探針2.1定性篩查表1動物源性成分篩查引物名稱序列豬上游引物：5’-TACTTCTACTATCCCTGCCAGTTC-3’下游引物：5’-TGATAAAGGATAGGGTCTCCACCA-3’牛上游引物：5’-GTTCTTCACGACACATACTACGTT-3’下游引物：5’-GCAAATACAGCTCCTATTGATAAA-3’羊上游引物：5’-AACAAAGCGCCTTAAACCAATT-3’下游引物：5’-CCTTTTCTAGGGCAGGTTTTGT-3’雞上游引物：5’-CCCTAAAAATAGACATATACTCC-3’下游引物：5’-ATGTTATTTGCGATGGTTAGTG-3’鴨上游引物：5’-TCTTAACTGTCTCTCACGGAT-3’下游引物：5’-CGAAAAATATCGGCCATGCTC-3’上游引物：5'-TACGACCTCGATGTTGGATCA-3'下游引物：5'-AGATAGAAACCGACCTGGAT-3'2.2相對定量表2動物源性成分相對定量引物名稱序列上游引物：5'-TACGACCTCGATGTTGGATCA-3'下游引物：5'-AGATAGAAACCGACCTGGAT-3'探針：5'-FAM-CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGA-TAMRA-3'豬上游引物：5'-ATCTGAATCAATGCAACAGTACAT-3'下游引物：5'-TGATAGTGAGTCGGAGAAGAATGT-3'或65'-GAACTAGTAGGGGTGCTGATAGTG-3'或5'-ATTAAGGCTGTTTTCGCCTAGT-3'探針：5'-FAM-TCTCCTCATTAGCCTGATCAGTCTATCCC-TAMERA-3'羊上游引物：5'-ATAATCTGAATCAACACCACACTTC-3'下游引物：5'-TAGATAAGGAGTCGGAGAAAAAAGT-3'探針：5'-FAM-AGCTTGCTAATCAGCCTCACAAGCC-TAMERA-3'牛上游引物：5'-AATATAATTTGGGTTAACTCCACAGC-3'下游引物：5'-GCCATATGGTTAAAATTAGTAGTGGAGTG-3'探針：5'-FAM-CACAGCCTTCTAATTAGCTTTACAAGCCTCC-TAMERA-3'雞上游引物：5'-AGTGCGTCAAAGCTCCCTCAT-3'下游引物：5'-GTGTGGGGGTATAAGTTGAGT-3'探針：5'-FAM-AAATCTAAAACCCTATTTGACTCCCTCAACC-TAMERA-3'鴨上游引物：5'-TCTTAACTGTCTCTCACGGAT-3'下游引物：5'-CGAAAAATATCGGCCATGCTC-3'探針：5'-FAM-TCAGTGAAATTGATCTCCCCGTGCAAAAGC-TAMERA-3'3.試劑苯酚（Tris飽和酚，pH8.0）、三氯甲烷、異戊醇、無水乙醇、異丙醇、70%乙醇。除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純。實驗用水符合GIB/T6682中二級水的要求。4.配制溶液TE緩沖液（Tris-HCl，EDTA緩沖液）：10mmol/LTris-HCl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0，1%CTAB裂解液（0.05mol/LTris-HCl（pH8.00.7mol/LNaC1，0.01mol/LEDTA（pH8.0、CTAB沉淀液（三氯甲烷+異戊醇（24﹕1）。5.儀器5.1實時熒光PCR儀。5.2恒溫水浴鍋。5.3離心機。5.4微量移液器。5.5核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計。5.6渦旋振蕩器。5.7分析天平。6.樣品采集稱取3~50g肉樣至勻漿杯中（根據(jù)樣品量選擇合適的勻漿杯）按照1﹕3.2~5.2的重量比加入去離子雙蒸水，8000~12000r/min攪拌8~15分鐘，用1000μL微量移液器吸取3~5mL離心管中，用渦旋振蕩器震蕩1~3min，用100μL微量移液器吸取50~100μL勻漿液至1.5mL離心管中（取3個平行），待T/HNSPXHXXXX—XXXX7后續(xù)處理。7.試驗步驟7.1DNA提取在取完樣品的1.5mL離心管中，加入600~900μL裂解液，65°C孵育25~50min，期間不時振蕩混勻。11000~13000g離心5~10min，轉(zhuǎn)移600~900μL上清液于潔凈離心管中，加入400~600μLCTAB蛋白沉淀液，振蕩混勻后，11000~13000g離心5~10min，取300~500μL上清液于潔凈離心管中，加200~400μL異丙醇，室溫下沉淀1-2h。11000~13000g離心5min，棄掉上清液，然后用400~600μL70%乙醇洗滌一次（11000~13000g離心5min），棄掉上清液，晾干，加入50~200μLTE緩沖液，溶解沉淀，4°C過夜?；蚴褂玫刃逃肈NA提取試劑盒。7.2DNA提取質(zhì)量控制按照GB/T34796方法測定并計算DNA的濃度，判定DNA的濃度和純度。注：實測熒光PCR擴增試驗前，使用核酸蛋白分析儀檢測DNA濃度及純度，DNA濃度稀釋至5ng/μL~50ng/μL范圍，A260/A280值在1.7~2.1之間。7.3成分篩查7.3.1多重實時熒光PCR擴增檢測過程設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照。用含有目標(biāo)成分的樣品或含有擴增靶序列的質(zhì)粒作為陽性對照，以不含目標(biāo)成分的樣品或不含有擴增靶序列的質(zhì)粒作為陰性對照，用雙蒸水作為空白對照。樣品和對照設(shè)置2個平行的反應(yīng)體系，分別進行多重靶向基因和內(nèi)參基因擴增，以Tm值為作為結(jié)果判定依據(jù)。反應(yīng)體系總體積為25μL，可根據(jù)使用儀器的需要調(diào)整該比例反應(yīng)體系各組分的量，詳見表3多重RT-PCR反應(yīng)體系組分及配比（總體積25μL）PremixExTaqTM預(yù)混液(μL）*引物名稱上游引物（5μM，μL）下游引物（5μM，μL）水(μL）12.5μL豬0.20.2補足25μL牛0.30.3羊0.40.4雞0.20.2鴨4.04.0*：或使用等效試劑或商品試劑盒。7.3.2實時熒光PCR反應(yīng)參數(shù)預(yù)變性：95℃*300秒；T/HNSPXHXXXX—XXXX8變性：95℃*15秒；退火+延伸：57℃*45秒；28個循環(huán)；在每次循環(huán)的退火時收集熒光；熔解曲線：95℃*60秒；65℃*60秒；以0.02℃/s速率升溫至95℃,同時連續(xù)檢測熒光強度；降溫：40℃*60秒。7.3.3結(jié)果判定根據(jù)物種特異性擴增產(chǎn)物Tm值的熔解曲線峰的有/無，判定試樣中是/否含有該物種。其中，Tm值在71.50~73.50℃范圍內(nèi)出現(xiàn)熔解峰為羊源性成分檢出；Tm值在75.50~77.00℃范圍內(nèi)出現(xiàn)熔解峰為牛源性成分檢出；Tm值在80.00~81.50℃范圍內(nèi)出現(xiàn)熔解峰為豬源性成分檢出；Tm值在82.00~83.00℃范圍內(nèi)出現(xiàn)熔解峰為雞源性成分檢出；Tm值在84.50~86.00℃范圍內(nèi)出現(xiàn)熔解峰為鴨源性成分檢出。如果有外源動物源性成分檢出，則進行后續(xù)相對定量檢測。7.4相對定量檢測對7.3篩查出的動物性內(nèi)外源成分進行相對定量檢測。7.4.1實時熒光PCR反應(yīng)設(shè)置3個平行的反應(yīng)體系，實時熒光PCR反應(yīng)體系總體積為25μL，可根據(jù)使用儀器的需要調(diào)整該比例反應(yīng)體系各組分的量，詳見見表4。表4相對定量RT-PCR反應(yīng)體系組分及配比（總體積25μL）體系PremixExTaqTM預(yù)混液(μL）上游引物（5μM，μL）下游引物（5μM，μL）探針?biāo)?μL）豬0.6補足25羊0.6補足25牛0.6補足25雞0.6補足25鴨0.6補足25通用0.6補足257.4.2實時熒光PCR反應(yīng)參數(shù)預(yù)變性：95℃*300秒；變性：95℃*10~15秒；退火+延伸：58~62℃*45~60秒；35個循環(huán)；在每次循環(huán)的退火時收集熒光；降溫：40℃*60秒。7.4.3標(biāo)準曲線標(biāo)準樣品：按照上述樣品處理方法和DNA提取步驟。提取3~50g（根據(jù)待測樣品量而定）純待測動物源性成分肉總DNA（或商品化標(biāo)準樣品），用滅菌雙蒸水稀釋成濃度分別為100%、50%、20%、10%、1%、0.1%的DNA模板標(biāo)準樣品，用于制作標(biāo)準曲線。T/HNSPXHXXXX—XXXX9標(biāo)準曲線設(shè)置方法：用豬特異性反應(yīng)體系對系列濃度DNA模板標(biāo)準樣品和用通用反應(yīng)體系對100%豬肉DNA模板標(biāo)準樣品進行RT-PCR擴增，1g（純豬肉樣品濃度）vs（Ct純緒肉Ct通用）做圖，即制得相對定量法標(biāo)準曲線。標(biāo)準曲線斜率為k2、截距為C2。7.4.4樣品檢測將混合肉樣按前述方法處理和提取DNA模板，按表1的試劑體系加樣到RT-PCR板（每個樣品都分別在平行孔內(nèi)加入括豬反應(yīng)體系和通用反應(yīng)體系兩種反應(yīng)體系同時按照前述的標(biāo)準曲線加樣方法進行加樣。按照上述反應(yīng)條件進行RT-P