微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用第一課時(shí)第2節(jié)人教版選擇性必修31.能闡明無(wú)菌技術(shù)的類型、適用范圍和操作方法。2.能概述不同類型培養(yǎng)基的特點(diǎn)及適用場(chǎng)景。3.能?chē)L試完成微生物的純培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的操作。向經(jīng)過(guò)殺菌處理的牛奶中添加某些對(duì)人體有益的細(xì)菌，再經(jīng)過(guò)發(fā)酵就可以制成酸奶，由于制作工藝并不復(fù)雜，一些人會(huì)在家里自制酸奶，自制酸奶雖然方便，但是食用自制酸奶導(dǎo)致腸胃不適的事件屢見(jiàn)不鮮，主要原因是在制作過(guò)程中有雜菌混入。那么，怎樣才能保證無(wú)處不在的雜菌不混入發(fā)酵物中呢？應(yīng)該先對(duì)制作用具和原料進(jìn)行滅菌處理，再接種純的菌種，并控制發(fā)酵條件，避免雜菌進(jìn)入。微生物：難以用肉眼觀察的微小生物的統(tǒng)稱。無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)生物原核生物真核生物病毒：SARS病毒、新冠病毒等RNA病毒；T2噬菌體等DNA病毒。細(xì)菌：藍(lán)細(xì)菌、大腸桿菌、乳酸菌等；放線菌：衣氏放線菌等。真菌：酵母菌、毛霉等；原生生物：草履蟲(chóng)、變形蟲(chóng)等。

微生物結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、形體微小，眼睛看不到，若想看某種純凈的微生物。我們?cè)撛趺醋?？若想通過(guò)肉眼能看到細(xì)菌，我們又該如何？

必須對(duì)其進(jìn)行分離純化；

對(duì)微生物進(jìn)行大量培養(yǎng)，致使其在培養(yǎng)基表面或內(nèi)部形成菌落。不同的細(xì)菌具有不同的菌落。

分散的微生物在適宜的瓊脂固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長(zhǎng)，可以形成肉眼可見(jiàn)的菌落。微生物的結(jié)構(gòu)直徑在30～200nm之間

直徑在0.5～5μm之間直徑3～6μm之間實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)微生物：1.為微生物提供合適的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件；2.要確保其他微生物無(wú)法混入；3.將需要的微生物分離出來(lái)。培養(yǎng)基無(wú)菌技術(shù)微生物的純培養(yǎng)、分離技術(shù)1.培養(yǎng)基的概念和類型（1）概念：人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，即培養(yǎng)基。（2）培養(yǎng)基的作用：用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存微生物或積累其代謝物。培養(yǎng)基的配置（3）培養(yǎng)基的類型標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基種類培養(yǎng)基特點(diǎn)作用物理性質(zhì)固體培養(yǎng)基加凝固劑，如瓊脂微生物的分離與鑒定，活菌計(jì)數(shù)，保藏菌種半固體培養(yǎng)基容器放倒不致流出，劇烈震動(dòng)則破散觀察微生物的運(yùn)動(dòng)、分類鑒定液體培養(yǎng)基不加凝固劑常用于工業(yè)生產(chǎn)功能選擇培養(yǎng)基根據(jù)某種微生物的特殊營(yíng)養(yǎng)要求配置選擇分離鑒別培養(yǎng)基加入能與目的菌的代謝產(chǎn)物發(fā)生顯色反應(yīng)的指示劑鑒定成分來(lái)源天然培養(yǎng)基含化學(xué)成分不明確的天然物質(zhì)工業(yè)生產(chǎn)合成培養(yǎng)基用已知的化學(xué)物質(zhì)配制分類鑒定2.培養(yǎng)基的配制（1）基本成分：水、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽。碳源無(wú)機(jī)碳源：CO2、CO32-、HCO3-。有機(jī)碳源：葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等。氮源無(wú)機(jī)氮源：NH4＋、NO3-、NH3等。有機(jī)氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等。注意：含C、H、O、N的有機(jī)物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源。如氨基酸等。

為什么培養(yǎng)基需要氮源？培養(yǎng)基中的氮元素是微生物合成蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)所必需的。（2）特殊需求：某些微生物對(duì)pH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及O2的需求。特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）①培養(yǎng)乳酸桿菌時(shí)，需要在培養(yǎng)基中添加維生素；②培養(yǎng)霉菌時(shí)，需要將培養(yǎng)基調(diào)至酸性；③培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，需要將培養(yǎng)基調(diào)至中性或弱堿性；④培養(yǎng)厭氧微生物時(shí)，需要提供無(wú)氧的條件。下列有關(guān)微生物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是（）A.是碳源的物質(zhì)不可能同時(shí)是氮源

B.凡碳源都提供能量C.除水以外的無(wú)機(jī)物只提供無(wú)機(jī)鹽

D.無(wú)機(jī)氮源也能提供能量D獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止雜菌污染。

無(wú)菌技術(shù)應(yīng)圍繞著如何避免雜菌的污染展開(kāi)，主要包括消毒和滅菌。

消毒和滅菌工作的兩個(gè)方面：

(1)對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手，進(jìn)行清潔和消毒。

(2)將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進(jìn)行滅菌。注意：避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周?chē)奈锲方佑|。為了避免周?chē)h(huán)境中微生物的污染，操作都應(yīng)在超凈工作臺(tái)并在酒精燈火焰附近進(jìn)行。無(wú)菌技術(shù)無(wú)菌技術(shù)除用來(lái)防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來(lái)微生物污染外，還有什么作用？

無(wú)菌技術(shù)還能有效避免操作者被微生物感染。1.消毒（1）概念：指使用較為溫和的物理、化學(xué)或生物等方法殺死物體表面或內(nèi)部一部分微生物。（2）常用的消毒方法①煮沸消毒法：100℃煮沸5～6min，可以殺死微生物的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和一部分芽孢。②巴氏消毒法：62～65℃下消毒30min或80～90℃處理30s～1min，適合一些不耐高溫的液體，如牛奶。可以殺死牛奶中的絕大多數(shù)微生物，并且不破壞牛奶的營(yíng)養(yǎng)成分。③化學(xué)藥劑消毒法：用70%酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源等。④紫外線消毒法：接種室、接種箱或超凈工作臺(tái)在使用前可用紫外線照射30min。在照射前，適量噴灑石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加強(qiáng)消毒效果。2.滅菌：

芽孢

有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個(gè)橢圓形的休眠體，叫做芽孢。

芽孢壁很厚，對(duì)干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。例如，有的細(xì)菌的芽孢，煮沸3小時(shí)以后才死亡。孢子

細(xì)菌、原生動(dòng)物、真菌和植物等產(chǎn)生的一種有繁殖作用的無(wú)性生殖細(xì)胞。能直接發(fā)育成新個(gè)體。細(xì)菌芽孢的結(jié)構(gòu)模式圖滅菌對(duì)象：培養(yǎng)基等①濕熱滅菌：利用沸水、流通蒸汽或高壓蒸汽進(jìn)行滅菌的方法。效果最好的是高壓蒸汽滅菌。滅菌的方法：高壓蒸汽滅菌鍋：

內(nèi)100kPa、121℃下維持15-30min，通過(guò)高溫蒸汽破壞蛋白質(zhì)、核酸等結(jié)構(gòu)使其變性，可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體?；颈３峙囵B(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分不被破壞。滅菌對(duì)象：耐高溫和需保持干燥的物品，如

玻璃器皿(如試管、培養(yǎng)皿、吸管、注射器)金屬器具(如針頭、鑷子、剪刀等)的滅菌②干熱滅菌：將滅菌物品放入密閉容器如干熱滅菌箱內(nèi)，在160-170℃的熱空氣中維持2-3h，使微生物細(xì)胞膜破壞、蛋白質(zhì)變性和原生質(zhì)干燥等而達(dá)到滅菌目的。

干熱滅菌箱

③灼燒滅菌：將滅菌對(duì)象直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒，使微生物燃燒，可以迅速地徹底地滅菌。滅菌對(duì)象：接種工具如接種環(huán)、接種針，以及接種過(guò)程中的試管口或瓶口等易被污染部位下列關(guān)于滅菌和消毒的說(shuō)法不正確的是()A.滅菌是指殺死環(huán)境中的所有微生物，包括芽孢和孢子B.滅菌和消毒實(shí)質(zhì)上是相同的C.接種環(huán)用灼燒法滅菌D.常用的滅菌方法有灼燒滅菌、干熱滅菌、濕熱滅菌等B

在微生物學(xué)中，將接種于培養(yǎng)基內(nèi)，在合適條件下形成的含特定種類微生物的群體稱為培養(yǎng)物。2.微生物的純培養(yǎng)步驟：（1）配置培養(yǎng)基；（2）滅菌；（3）接種；（4）分離和培養(yǎng)。1.微生物的純培養(yǎng)的概念：由單一個(gè)體繁殖所獲得的微生物群體稱為純培養(yǎng)物，獲得純培養(yǎng)物的過(guò)程就是純培養(yǎng)。微生物的純培養(yǎng)1.培養(yǎng)原理

菌落：分散的微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部可以繁殖形成肉眼可見(jiàn)的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，這就是菌落。微生物群分散或稀釋單個(gè)細(xì)胞單個(gè)菌落繁殖2.獲得單菌落的方法：采用平板劃線法和稀釋涂布平板法將單個(gè)微生物分散在固體培養(yǎng)基上，之后得到的單菌落一般是由單個(gè)微生物形成的純培養(yǎng)物。3.方法步驟（1）制備培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基滅菌倒平板稱取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水1000ml，加熱煮沸至馬鈴薯軟爛，用紗布過(guò)濾。向?yàn)V液中加入20g葡萄糖、15～20g瓊脂，用蒸餾水定容至1000ml。將配制好的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到錐形瓶中，加棉塞，包上牛皮紙，并用皮筋勒緊，再放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在壓力為100kPa、溫度為121℃的條件下，滅菌15～30min。將5～8套培養(yǎng)皿包成一包，用幾層牛皮紙包緊，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160～170℃滅菌2h。待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時(shí)，在酒精燈火焰附近倒平板。倒平板的具體操作步驟1①拔出錐形瓶的棉塞2②將瓶口迅速通過(guò)火焰③用拇指和食指將培養(yǎng)皿打開(kāi)一條稍大于瓶口的縫隙，將培養(yǎng)基（10～20mL）倒入培養(yǎng)皿，立即蓋上皿蓋3④等待培養(yǎng)基冷卻凝固后，將培養(yǎng)皿倒轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)放置4既可以防止培養(yǎng)基表面的水分揮發(fā)；又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。（2）接種和分離酵母菌

通過(guò)接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面。經(jīng)數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離得到單菌落。平板劃線法的具體劃法注意：①接種環(huán)只蘸一次菌液,但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次；②劃線首尾不能相接；③每次劃線前接種環(huán)進(jìn)行滅菌；④劃線后,培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)。平板劃線法的具體操作①灼燒接種環(huán)，直至接種環(huán)金屬絲燒紅②在火焰旁冷卻接種環(huán)，拔出酵母菌培養(yǎng)液試管的棉塞③試管口通過(guò)火焰④在火焰附近用接種環(huán)蘸取一環(huán)菌液⑤試管口通過(guò)火焰，并塞上棉塞⑥將皿蓋打開(kāi)一條縫隙，用接種環(huán)在培養(yǎng)基表面迅速劃三至五條平行線，蓋上皿蓋⑦灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一次劃線的末端開(kāi)始作第二次劃線。重復(fù)以上操作，作第三、四、五次劃線

為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí),仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？灼燒時(shí)期目的取菌種前每次劃線前接種結(jié)束后殺死接種環(huán)上原有微生物殺死上次劃線時(shí)殘留菌種，使下一次劃線的菌種直接來(lái)源上次劃線的末端，從而使每次劃線時(shí)菌種數(shù)目逐漸減少，直至得到單個(gè)細(xì)胞殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者（3）培養(yǎng)酵母菌

完成平板劃線后，待菌液被培養(yǎng)基吸收，將接種后的平板和一個(gè)未接種的平板倒置，放入28℃左右（培養(yǎng)溫度因酵母菌種類的不同而稍有差異）的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h。4.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1.在未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長(zhǎng)？如果有，說(shuō)明了什么？2.在接種酵母菌的培養(yǎng)基上，你是否觀察到了單菌落？這些菌落的顏色、形狀和大小是否一致？如果你觀察到了不同形態(tài)的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的嗎？

在未接種的培養(yǎng)基表面應(yīng)該沒(méi)有菌落生長(zhǎng)，如果有，說(shuō)明培養(yǎng)基

被雜菌污染。

如果觀察到了不同形態(tài)的菌落，可能是接種的菌種不純或者無(wú)菌操作不規(guī)范等原因引起的。無(wú)菌技術(shù)類型適用范圍操作方法消毒滅菌較為溫和理化方法，殺死部分微生物（不包括芽孢、孢子）強(qiáng)烈的理化方法，殺死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法日常生活100℃煮沸5～6min巴氏消毒法不耐高溫的液體62～65℃煮30min或80-90℃30s-1min