miR-155：開啟缺血性心臟病心肌干細(xì)胞治療新時(shí)代一、引言1.1研究背景與意義缺血性心臟?。↖schaemicHeartDisease，IHD），作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的主要疾病之一，一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。其主要病因是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化，導(dǎo)致血管腔狹窄或阻塞，進(jìn)而引發(fā)心肌缺血、缺氧，最終引起心肌損傷和心臟功能障礙。近年來，隨著人口老齡化的加劇以及生活方式的改變，缺血性心臟病的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)出持續(xù)上升的趨勢，給社會和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，每年全球因缺血性心臟病死亡的人數(shù)高達(dá)數(shù)百萬，在各類死因中位居前列。在中國，缺血性心臟病的患病率也逐年增加，嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量和壽命。臨床上，缺血性心臟病的主要表現(xiàn)形式包括心絞痛、心肌梗死、缺血性心肌病和猝死等。其中，心肌梗死是缺血性心臟病中最為嚴(yán)重的類型之一，其發(fā)病急驟，病情兇險(xiǎn)，患者往往在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重的心肌損傷和心功能衰竭，若得不到及時(shí)有效的治療，死亡率極高。即使患者在急性期幸存下來，也可能面臨著心肌重構(gòu)、心力衰竭等長期并發(fā)癥的困擾，生活質(zhì)量大幅下降。目前，臨床上針對缺血性心臟病的治療手段主要包括藥物治療、介入治療和心臟搭橋手術(shù)等。藥物治療如抗血小板藥物、他汀類藥物、β-受體阻滯劑等，雖然能夠在一定程度上緩解癥狀、降低心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，但無法從根本上修復(fù)受損的心肌組織。介入治療（如冠狀動(dòng)脈支架置入術(shù)）和心臟搭橋手術(shù)雖然可以改善心肌供血，但對于已經(jīng)壞死的心肌細(xì)胞卻無能為力。因此，尋找一種能夠有效修復(fù)受損心肌、改善心臟功能的治療方法，成為了心血管領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題。干細(xì)胞治療作為一種新興的治療策略，為缺血性心臟病的治療帶來了新的希望。干細(xì)胞具有自我更新和多向分化的能力，能夠在特定條件下分化為心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，從而替代受損的心肌組織，促進(jìn)血管新生，改善心臟功能。大量的基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了干細(xì)胞治療缺血性心臟病的可行性和有效性。然而，干細(xì)胞治療在臨床應(yīng)用中仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)，其中最為突出的問題之一就是干細(xì)胞的存活率較低。在移植到缺血心肌環(huán)境后，由于受到缺血、缺氧、炎癥等多種不利因素的影響，大部分干細(xì)胞會在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生凋亡或壞死，導(dǎo)致真正能夠參與心肌修復(fù)的干細(xì)胞數(shù)量不足，從而嚴(yán)重影響了治療效果。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，它們通過與靶mRNA的互補(bǔ)配對，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在心臟發(fā)育、心肌缺血損傷修復(fù)等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。其中，微小RNA-155（miR-155）作為一種在心血管系統(tǒng)中廣泛表達(dá)的miRNA，引起了眾多研究者的關(guān)注。越來越多的證據(jù)表明，miR-155在心肌細(xì)胞的存活、增殖、凋亡以及血管生成等方面具有重要的調(diào)節(jié)作用。通過上調(diào)miR-155的表達(dá)，有可能增強(qiáng)心肌干細(xì)胞的抗凋亡能力，提高其在缺血心肌環(huán)境中的存活率，從而為缺血性心臟病的干細(xì)胞治療提供新的策略和方法。本研究旨在深入探討miR-155對心肌干細(xì)胞存活的影響及其分子機(jī)制，并進(jìn)一步驗(yàn)證其在缺血性心臟病治療中的應(yīng)用潛力。通過本研究，有望揭示miR-155調(diào)控心肌干細(xì)胞存活的新機(jī)制，為缺血性心臟病的治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。同時(shí)，本研究的成果也將為開發(fā)基于miR-155的新型治療策略提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2缺血性心臟病概述1.2.1定義與分類缺血性心臟病，通常是指由于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化，致使血管腔狹窄、阻塞，或冠狀動(dòng)脈功能性改變（如痙攣），進(jìn)而引發(fā)心肌缺血、缺氧，最終導(dǎo)致心肌病變的一類心臟病。它涵蓋了多種臨床類型，不同類型在癥狀表現(xiàn)、發(fā)病機(jī)制以及治療策略上均存在一定差異。穩(wěn)定型心絞痛是缺血性心臟病中較為常見的類型之一。其主要特點(diǎn)為發(fā)作性胸痛，多在體力活動(dòng)、情緒激動(dòng)等心肌耗氧量增加的情況下誘發(fā)。疼痛部位多位于胸骨體上段或中段之后，可放射至心前區(qū)、左肩、左臂內(nèi)側(cè)等部位。疼痛性質(zhì)多為壓榨性、悶痛或緊縮感，一般持續(xù)3-5分鐘，休息或含服硝酸甘油后癥狀可在數(shù)分鐘內(nèi)緩解。穩(wěn)定型心絞痛的發(fā)作通常具有一定的規(guī)律性，在數(shù)月甚至數(shù)年內(nèi)，其發(fā)作頻率、誘發(fā)因素、疼痛程度和持續(xù)時(shí)間等相對穩(wěn)定。這主要是因?yàn)楣跔顒?dòng)脈粥樣硬化斑塊相對穩(wěn)定，雖然血管存在一定程度的狹窄，但在心肌耗氧量未超過冠狀動(dòng)脈代償供血能力時(shí)，不會引發(fā)明顯的心肌缺血癥狀。不穩(wěn)定型心絞痛則與穩(wěn)定型心絞痛有所不同。它的發(fā)作往往沒有明顯的誘因，可在休息或睡眠中發(fā)作，疼痛程度較穩(wěn)定型心絞痛更為劇烈，持續(xù)時(shí)間也更長，一般超過15分鐘，且含服硝酸甘油效果欠佳。不穩(wěn)定型心絞痛的發(fā)病機(jī)制主要與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定、破裂，導(dǎo)致血小板聚集、血栓形成，進(jìn)而引起冠狀動(dòng)脈不完全阻塞有關(guān)。由于其病情不穩(wěn)定，容易進(jìn)展為急性心肌梗死，因此需要及時(shí)進(jìn)行積極的治療和干預(yù)。心肌梗死是缺血性心臟病中最為嚴(yán)重的類型之一，具有極高的死亡率和致殘率。它是由于冠狀動(dòng)脈急性閉塞，導(dǎo)致心肌持續(xù)、嚴(yán)重的缺血缺氧，最終引起心肌壞死。心肌梗死發(fā)生時(shí)，患者通常會出現(xiàn)劇烈而持久的胸骨后疼痛，疼痛性質(zhì)多為壓榨性、窒息性或?yàn)l死感，可伴有大汗淋漓、煩躁不安、惡心嘔吐等癥狀。疼痛持續(xù)時(shí)間往往超過30分鐘，甚至可達(dá)數(shù)小時(shí)或更長，含服硝酸甘油不能緩解。心肌梗死的發(fā)生不僅會導(dǎo)致心肌細(xì)胞的大量壞死，還會引發(fā)一系列嚴(yán)重的并發(fā)癥，如心律失常、心力衰竭、心源性休克等，對患者的生命健康構(gòu)成極大威脅。除了上述常見類型外，缺血性心臟病還包括隱匿型冠心病、缺血性心肌病和猝死型冠心病等。隱匿型冠心病患者通常沒有明顯的臨床癥狀，但通過心電圖、動(dòng)態(tài)心電圖監(jiān)測或冠狀動(dòng)脈造影等檢查，可發(fā)現(xiàn)存在心肌缺血的證據(jù)。缺血性心肌病則是由于長期心肌缺血導(dǎo)致心肌纖維化、心臟擴(kuò)大，進(jìn)而出現(xiàn)心力衰竭等癥狀。猝死型冠心病是指由于心臟原因?qū)е碌耐蝗凰劳?，患者在發(fā)病前可能沒有明顯的癥狀，或者僅有一些輕微的不適，但病情突然惡化，在短時(shí)間內(nèi)（通常在1小時(shí)內(nèi)）發(fā)生心臟驟停而死亡。1.2.2發(fā)病機(jī)制與病理生理過程缺血性心臟病的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多個(gè)環(huán)節(jié)和因素。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化是其最主要的病理基礎(chǔ)。在多種危險(xiǎn)因素（如高血壓、高血脂、高血糖、吸煙、肥胖等）的長期作用下，冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜逐漸受損，血液中的脂質(zhì)成分（主要是低密度脂蛋白膽固醇，LDL-C）浸潤到內(nèi)膜下，被巨噬細(xì)胞吞噬后形成泡沫細(xì)胞。隨著病情的發(fā)展，泡沫細(xì)胞不斷堆積，逐漸形成粥樣斑塊。粥樣斑塊會導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈管腔進(jìn)行性狹窄，當(dāng)狹窄程度超過一定限度（通常認(rèn)為超過50%-70%）時(shí)，就會影響冠狀動(dòng)脈的血流灌注，導(dǎo)致心肌供血不足。除了冠狀動(dòng)脈粥樣硬化外，冠狀動(dòng)脈痙攣也是導(dǎo)致心肌缺血的重要原因之一。冠狀動(dòng)脈痙攣可由多種因素誘發(fā)，如寒冷刺激、情緒激動(dòng)、吸煙、某些藥物（如麥角胺、可卡因等）以及冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病變本身等。冠狀動(dòng)脈痙攣時(shí)，血管平滑肌強(qiáng)烈收縮，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈管腔突然狹窄或閉塞，從而引起心肌缺血。雖然冠狀動(dòng)脈痙攣通常是短暫的，但在某些情況下，也可能導(dǎo)致嚴(yán)重的心肌梗死或心律失常。此外，冠狀動(dòng)脈栓塞也是引起心肌缺血的罕見原因。栓子可來源于心臟內(nèi)的附壁血栓、主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊脫落、脂肪栓子、空氣栓子等。當(dāng)栓子隨血流進(jìn)入冠狀動(dòng)脈并阻塞血管時(shí)，就會導(dǎo)致相應(yīng)心肌區(qū)域的缺血、壞死。當(dāng)心肌發(fā)生缺血時(shí)，會引發(fā)一系列復(fù)雜的病理生理變化。在能量代謝方面，由于心肌細(xì)胞的氧供應(yīng)不足，有氧氧化過程受到抑制，細(xì)胞轉(zhuǎn)而依靠無氧糖酵解來產(chǎn)生能量。然而，無氧糖酵解產(chǎn)生的能量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于有氧氧化，且會導(dǎo)致乳酸等酸性代謝產(chǎn)物的大量堆積，引起細(xì)胞內(nèi)酸中毒。這不僅會影響心肌細(xì)胞的正常功能，還會導(dǎo)致心肌細(xì)胞的損傷和死亡。在離子代謝方面，心肌缺血會導(dǎo)致細(xì)胞膜離子泵功能障礙，使細(xì)胞內(nèi)外離子平衡失調(diào)。具體表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)鈉離子和鈣離子濃度升高，鉀離子濃度降低。細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載會激活一系列鈣依賴性酶，如磷脂酶、蛋白酶等，導(dǎo)致細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜的損傷，進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷。同時(shí)，離子平衡失調(diào)還會影響心肌細(xì)胞的電生理特性，導(dǎo)致心律失常的發(fā)生。隨著心肌缺血時(shí)間的延長和程度的加重，心肌細(xì)胞會發(fā)生不可逆的損傷和壞死。壞死的心肌細(xì)胞逐漸被纖維組織替代，形成瘢痕組織。心肌瘢痕組織的存在會影響心臟的正常結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致心肌收縮力減弱、心臟擴(kuò)大，進(jìn)而引發(fā)心力衰竭。此外，心肌缺血還會激活機(jī)體的炎癥反應(yīng)和凝血系統(tǒng)，進(jìn)一步加重病情的發(fā)展。炎癥細(xì)胞浸潤到缺血心肌組織中，釋放大量的炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，這些炎癥介質(zhì)會進(jìn)一步損傷心肌細(xì)胞，促進(jìn)心肌重構(gòu)。同時(shí)，凝血系統(tǒng)的激活會導(dǎo)致血小板聚集、血栓形成，增加冠狀動(dòng)脈再次阻塞的風(fēng)險(xiǎn)。1.2.3治療現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)目前，臨床上針對缺血性心臟病的治療手段主要包括藥物治療、介入治療和手術(shù)治療等。藥物治療是缺血性心臟病治療的基礎(chǔ)，主要目的是緩解癥狀、改善心肌供血、降低心肌耗氧量、預(yù)防血栓形成和心血管事件的發(fā)生。常用的藥物包括抗血小板藥物（如阿司匹林、氯吡格雷等），通過抑制血小板的聚集，防止血栓形成；他汀類藥物（如阿托伐他汀、瑞舒伐他汀等），不僅可以降低血脂，還具有抗炎、穩(wěn)定斑塊的作用；β-受體阻滯劑（如美托洛爾、比索洛爾等），通過降低心率、減弱心肌收縮力，減少心肌耗氧量；硝酸酯類藥物（如硝酸甘油、單硝酸異山梨酯等），可以擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，增加心肌供血；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）或血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB），如依那普利、纈沙坦等，可改善心臟重構(gòu)，降低心力衰竭的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。然而，藥物治療只能緩解癥狀，無法從根本上修復(fù)受損的心肌組織，且長期使用可能會出現(xiàn)各種副作用，如阿司匹林可能導(dǎo)致胃腸道出血，他汀類藥物可能引起肝功能異常、肌肉疼痛等。介入治療是近年來發(fā)展迅速的一種治療方法，主要包括經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI），如冠狀動(dòng)脈球囊擴(kuò)張術(shù)和冠狀動(dòng)脈支架置入術(shù)。PCI通過將球囊或支架置入狹窄的冠狀動(dòng)脈內(nèi)，擴(kuò)張血管，恢復(fù)心肌供血，具有創(chuàng)傷小、恢復(fù)快等優(yōu)點(diǎn)。然而，介入治療也存在一些局限性，如術(shù)后再狹窄的問題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，冠狀動(dòng)脈支架置入術(shù)后1年內(nèi)再狹窄的發(fā)生率約為10%-20%，這主要與血管內(nèi)膜增生、血栓形成等因素有關(guān)。再狹窄的發(fā)生不僅會影響治療效果，還可能導(dǎo)致患者再次出現(xiàn)心肌缺血癥狀，需要再次進(jìn)行介入治療或其他治療。對于一些病情嚴(yán)重、冠狀動(dòng)脈病變廣泛的患者，可能需要進(jìn)行冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)（CABG），也就是俗稱的心臟搭橋手術(shù)。CABG是通過取患者自身的血管（如大隱靜脈、乳內(nèi)動(dòng)脈等），在冠狀動(dòng)脈狹窄部位的近端和遠(yuǎn)端之間建立一條新的通道，使血液繞過狹窄部位，直接供應(yīng)心肌，從而改善心肌供血。雖然CABG在改善心肌供血方面具有較好的效果，但手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)較高，對患者的身體條件要求也較高，且術(shù)后可能會出現(xiàn)感染、心律失常、心功能不全等并發(fā)癥。此外，心臟搭橋手術(shù)并不能解決所有的問題，對于已經(jīng)壞死的心肌組織，仍然無法進(jìn)行修復(fù)。除了上述傳統(tǒng)治療方法外，近年來干細(xì)胞治療、基因治療等新興治療手段也為缺血性心臟病的治療帶來了新的希望。然而，這些新興治療方法目前仍處于研究和臨床試驗(yàn)階段，存在諸多問題和挑戰(zhàn)，如干細(xì)胞的來源、分化調(diào)控、免疫排斥反應(yīng)，以及基因治療的載體選擇、基因表達(dá)調(diào)控等，需要進(jìn)一步深入研究和探索。綜上所述，缺血性心臟病的治療雖然取得了一定的進(jìn)展，但仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)，需要不斷探索新的治療方法和策略，以提高治療效果，改善患者的預(yù)后。二、心肌干細(xì)胞與缺血性心臟病治療2.1心肌干細(xì)胞的特性與來源心肌干細(xì)胞（CardiacStemCells，CSCs）作為一類特殊的干細(xì)胞群體，在心臟的發(fā)育、修復(fù)和再生過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。它們具有自我更新和多向分化的能力，這是其區(qū)別于其他成熟心肌細(xì)胞的顯著特征。自我更新能力使得心肌干細(xì)胞能夠在體內(nèi)或體外條件下不斷增殖，維持自身細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)定。當(dāng)心臟受到損傷時(shí)，心肌干細(xì)胞可以迅速響應(yīng)，通過自我更新產(chǎn)生更多的子代細(xì)胞，為后續(xù)的修復(fù)過程提供充足的細(xì)胞來源。心肌干細(xì)胞還展現(xiàn)出多向分化的潛能，在特定的誘導(dǎo)條件下，能夠分化為心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等多種心臟細(xì)胞類型。這種多向分化的特性為心肌干細(xì)胞在缺血性心臟病治療中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。通過分化為心肌細(xì)胞，心肌干細(xì)胞可以替代受損或死亡的心肌組織，從而改善心臟的收縮功能；分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞則有助于促進(jìn)血管新生，增加心肌的血液供應(yīng)；分化為平滑肌細(xì)胞能夠參與血管壁的構(gòu)建，維持血管的正常結(jié)構(gòu)和功能。關(guān)于心肌干細(xì)胞的來源，目前研究發(fā)現(xiàn)主要存在于心臟組織本身。在心臟的不同區(qū)域，如心房、心室以及心臟血管周圍等，都檢測到了心肌干細(xì)胞的存在。具體而言，根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志物的不同，可將心肌干細(xì)胞分為多個(gè)亞群，包括sidepopulation（SP）細(xì)胞、Sca-1+細(xì)胞、lin-c-kit+細(xì)胞和Islet-1+細(xì)胞等。sidepopulation細(xì)胞最早是通過流式細(xì)胞術(shù)分選出來的，因其能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的熒光染料Hoechst33342外排，在流式細(xì)胞儀檢測時(shí)呈現(xiàn)出一個(gè)獨(dú)特的“側(cè)群”而得名。研究表明，sidepopulation細(xì)胞具有較高的自我更新和分化能力，能夠在體外分化為心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，并且在移植到受損心臟后，能夠改善心臟功能。Sca-1+細(xì)胞是指表達(dá)干細(xì)胞抗原-1（StemCellAntigen-1，Sca-1）的細(xì)胞群體。Sca-1是一種細(xì)胞表面糖蛋白，在多種干細(xì)胞表面均有表達(dá)。心臟中的Sca-1+細(xì)胞具有心肌干細(xì)胞的特性，能夠在適當(dāng)條件下分化為心肌細(xì)胞，參與心臟的修復(fù)和再生過程。研究發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死模型中，將Sca-1+細(xì)胞移植到受損心肌組織后，這些細(xì)胞能夠存活并分化為心肌細(xì)胞，促進(jìn)心肌組織的修復(fù)，改善心臟功能。lin-c-kit+細(xì)胞是指不表達(dá)譜系特異性標(biāo)志物（lineagemarkers，lin-）且表達(dá)c-kit的細(xì)胞群體。c-kit是一種受體酪氨酸激酶，在干細(xì)胞的增殖、分化和存活中發(fā)揮重要作用。心臟中的lin-c-kit+細(xì)胞被認(rèn)為是心肌干細(xì)胞的重要來源之一，它們具有較強(qiáng)的自我更新和分化能力，能夠分化為心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，對心臟損傷后的修復(fù)具有重要意義。Islet-1+細(xì)胞是表達(dá)胰島-1（Islet-1）轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞群體。Islet-1在心臟發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用，參與心臟祖細(xì)胞的分化和心臟的形成。研究發(fā)現(xiàn)，在成體心臟中，也存在一定數(shù)量的Islet-1+細(xì)胞，這些細(xì)胞具有心肌干細(xì)胞的特性，能夠在心臟損傷后被激活，分化為心肌細(xì)胞，參與心臟的修復(fù)過程。除了心臟組織本身外，骨髓也是心肌干細(xì)胞的一個(gè)潛在來源。骨髓中含有多種干細(xì)胞，如造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞等。其中，間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能，在特定條件下可以分化為心肌樣細(xì)胞，并且能夠分泌多種細(xì)胞因子和生長因子，促進(jìn)心臟組織的修復(fù)和再生。一些研究表明，通過骨髓干細(xì)胞移植治療缺血性心臟病，能夠在一定程度上改善心臟功能，但其治療效果仍有待進(jìn)一步提高。2.2心肌干細(xì)胞治療缺血性心臟病的機(jī)制心肌干細(xì)胞治療缺血性心臟病的機(jī)制是多方面的，主要包括分化補(bǔ)充受損心肌細(xì)胞、分泌細(xì)胞因子以及免疫調(diào)節(jié)等作用，這些機(jī)制相互協(xié)同，共同促進(jìn)心臟功能的改善。心肌干細(xì)胞具有多向分化潛能，在適宜的微環(huán)境下，能夠分化為心肌細(xì)胞，這是其治療缺血性心臟病的重要機(jī)制之一。當(dāng)心肌發(fā)生缺血損傷時(shí)，大量心肌細(xì)胞壞死，心臟功能受損。移植的心肌干細(xì)胞可遷移至受損心肌部位，在局部微環(huán)境中多種信號分子的誘導(dǎo)下，逐漸分化為具有收縮功能的心肌細(xì)胞。這些新生的心肌細(xì)胞能夠補(bǔ)充受損的心肌組織，增加心肌細(xì)胞數(shù)量，從而改善心臟的收縮和舒張功能。研究表明，在心肌梗死動(dòng)物模型中，將心肌干細(xì)胞移植到梗死區(qū)域后，可觀察到心肌干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞，并與周圍正常心肌細(xì)胞形成功能性連接，參與心臟的收縮活動(dòng)，使心臟射血分?jǐn)?shù)得到一定程度的提高。心肌干細(xì)胞還能通過旁分泌作用，分泌多種細(xì)胞因子和生長因子，對缺血心肌組織產(chǎn)生積極影響。這些細(xì)胞因子和生長因子包括血管內(nèi)皮生長因子（VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF）、胰島素樣生長因子-1（Insulin-likeGrowthFactor-1，IGF-1）、肝細(xì)胞生長因子（HepatocyteGrowthFactor，HGF）等。VEGF是一種強(qiáng)效的促血管生成因子，它能夠特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化，從而誘導(dǎo)新的血管生成。在缺血心肌環(huán)境中，心肌干細(xì)胞分泌的VEGF可以刺激缺血區(qū)域周圍的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，形成新的毛細(xì)血管，改善心肌的血液供應(yīng)，為心肌細(xì)胞的存活和修復(fù)提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣。IGF-1具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡的作用。它可以通過與心肌細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路，促進(jìn)心肌細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成和DNA合成，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖。同時(shí)，IGF-1還能夠抑制心肌細(xì)胞在缺血、缺氧等應(yīng)激條件下的凋亡，減少心肌細(xì)胞的死亡，保護(hù)心臟功能。HGF不僅具有促進(jìn)血管生成的作用，還能調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移、增殖和分化。在缺血性心臟病中，HGF可以促進(jìn)心肌干細(xì)胞向受損心肌部位遷移，增強(qiáng)心肌干細(xì)胞的存活和分化能力。此外，HGF還可以抑制心肌纖維化，減少瘢痕組織的形成，改善心肌的順應(yīng)性和心臟功能。除了上述細(xì)胞因子外，心肌干細(xì)胞還分泌多種其他生長因子和細(xì)胞因子，如成纖維細(xì)胞生長因子（FibroblastGrowthFactor，F(xiàn)GF）、血小板衍生生長因子（Platelet-DerivedGrowthFactor，PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TransformingGrowthFactor-β，TGF-β）等，它們通過復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)相互作用，共同調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的生長、存活、分化以及血管生成等過程，促進(jìn)缺血心肌的修復(fù)和再生。心肌干細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)方面也發(fā)揮著重要作用，能夠改善心肌微環(huán)境，促進(jìn)心臟修復(fù)。缺血性心臟病發(fā)生后，心肌組織會出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，大量炎癥細(xì)胞浸潤，釋放多種炎癥介質(zhì)，如TNF-α、IL-6等。這些炎癥介質(zhì)會進(jìn)一步損傷心肌細(xì)胞，加重心肌組織的損傷和纖維化，不利于心臟功能的恢復(fù)。心肌干細(xì)胞可以通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性，抑制過度的炎癥反應(yīng)。一方面，心肌干細(xì)胞可以抑制T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞的增殖和活化，減少免疫細(xì)胞對心肌組織的攻擊。另一方面，心肌干細(xì)胞可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)，促使巨噬細(xì)胞從促炎型（M1型）向抗炎型（M2型）轉(zhuǎn)化。M1型巨噬細(xì)胞主要分泌促炎細(xì)胞因子，加劇炎癥反應(yīng)；而M2型巨噬細(xì)胞則分泌抗炎細(xì)胞因子，如IL-10等，具有抗炎、促進(jìn)組織修復(fù)的作用。通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化，心肌干細(xì)胞可以減輕心肌組織的炎癥損傷，為心臟修復(fù)創(chuàng)造有利的微環(huán)境。2.3心肌干細(xì)胞治療面臨的問題與挑戰(zhàn)盡管心肌干細(xì)胞治療缺血性心臟病展現(xiàn)出了一定的潛力，但在實(shí)際應(yīng)用過程中，仍面臨諸多亟待解決的問題與挑戰(zhàn)。心肌干細(xì)胞移植后存活率低是制約其治療效果的關(guān)鍵因素之一。在缺血性心臟病患者體內(nèi)，心肌梗死區(qū)域存在著缺血、缺氧、炎癥以及氧化應(yīng)激等惡劣的微環(huán)境。當(dāng)心肌干細(xì)胞被移植到這樣的環(huán)境中時(shí)，會受到多種不利因素的影響，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死的發(fā)生。研究表明，在移植后的短時(shí)間內(nèi)，大部分心肌干細(xì)胞會因?yàn)闊o法適應(yīng)缺血缺氧環(huán)境，能量代謝障礙，線粒體功能受損，從而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)凋亡信號通路的激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。炎癥反應(yīng)也是影響心肌干細(xì)胞存活的重要因素，炎癥細(xì)胞釋放的大量炎癥介質(zhì)，如TNF-α、IL-1β等，不僅會直接損傷心肌干細(xì)胞，還會抑制其增殖和分化能力。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的大量活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS）會攻擊心肌干細(xì)胞的細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，進(jìn)一步降低心肌干細(xì)胞的存活率。心肌干細(xì)胞分化方向的難以控制，也是其臨床應(yīng)用中面臨的一個(gè)重要問題。雖然心肌干細(xì)胞具有多向分化潛能，但在體內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境下，如何精準(zhǔn)地誘導(dǎo)其分化為心肌細(xì)胞，而避免向其他非期望的細(xì)胞類型分化，仍然是一個(gè)尚未完全解決的難題。心肌干細(xì)胞的分化受到多種因素的調(diào)控，包括細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子、信號通路以及基因表達(dá)等。然而，目前對于這些調(diào)控因素之間的相互作用機(jī)制，以及如何精確地調(diào)控這些因素以實(shí)現(xiàn)心肌干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的定向分化，我們的認(rèn)識還十分有限。如果心肌干細(xì)胞在移植后不能有效地分化為心肌細(xì)胞，而是分化為其他細(xì)胞類型，如成纖維細(xì)胞，那么不僅無法實(shí)現(xiàn)對受損心肌的修復(fù)，反而可能會加重心肌纖維化，進(jìn)一步損害心臟功能。移植細(xì)胞致心律失常風(fēng)險(xiǎn)也是心肌干細(xì)胞治療中不容忽視的問題。當(dāng)心肌干細(xì)胞移植到心臟后，它們與周圍正常心肌細(xì)胞之間的電生理特性可能存在差異，這種差異可能會導(dǎo)致心律失常的發(fā)生。心肌干細(xì)胞分化而來的心肌細(xì)胞在離子通道表達(dá)、動(dòng)作電位時(shí)程以及縫隙連接蛋白表達(dá)等方面，可能與正常心肌細(xì)胞不完全一致。這些差異會影響心肌細(xì)胞之間的電信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致局部心肌的電活動(dòng)異常，增加心律失常的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，在一些心肌干細(xì)胞移植治療的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中，部分動(dòng)物或患者出現(xiàn)了室性心律失常等不良反應(yīng)。此外，移植細(xì)胞在心臟內(nèi)的分布不均勻，也可能導(dǎo)致心肌電生理特性的不一致，從而引發(fā)心律失常。除了上述問題外，心肌干細(xì)胞治療還面臨著細(xì)胞來源有限、免疫排斥反應(yīng)、治療成本高昂以及倫理道德等方面的挑戰(zhàn)。目前，心肌干細(xì)胞的獲取主要依賴于心臟組織活檢或骨髓穿刺等有創(chuàng)操作，這不僅會給患者帶來一定的痛苦，而且獲取的細(xì)胞數(shù)量有限，難以滿足大規(guī)模臨床應(yīng)用的需求。雖然自體心肌干細(xì)胞移植可以在一定程度上避免免疫排斥反應(yīng)，但對于一些病情緊急或無法獲取自體干細(xì)胞的患者，異體干細(xì)胞移植仍然是一種選擇，而異體干細(xì)胞移植則面臨著免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)。此外，心肌干細(xì)胞治療的整個(gè)過程，包括細(xì)胞的采集、分離、培養(yǎng)、儲存以及移植等，都需要耗費(fèi)大量的人力、物力和財(cái)力，這使得治療成本居高不下，限制了其在臨床中的廣泛應(yīng)用。同時(shí)，干細(xì)胞研究和應(yīng)用中涉及的倫理道德問題，如胚胎干細(xì)胞的來源和使用等，也引發(fā)了廣泛的社會關(guān)注和爭議。三、微小RNA155（miR-155）概述3.1miR-155的結(jié)構(gòu)與生成過程miR-155基因在人類基因組中定位于21號染色體的21q21區(qū)域，其基因結(jié)構(gòu)獨(dú)特。該基因由長鏈非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本B細(xì)胞整合簇（B-cellintegrationcluster，bic）編碼。bic基因包含多個(gè)外顯子和內(nèi)含子，miR-155編碼序列位于bic基因的第3個(gè)外顯子內(nèi)，這種基因定位方式使得miR-155的表達(dá)調(diào)控與bic基因的轉(zhuǎn)錄和加工過程密切相關(guān)。miR-155的生成是一個(gè)復(fù)雜且精細(xì)調(diào)控的過程，涉及多個(gè)關(guān)鍵步驟和酶的參與。首先，在細(xì)胞核內(nèi)，miR-155基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉(zhuǎn)錄生成初級轉(zhuǎn)錄本（primarymiRNA，pri-miR-155）。RNA聚合酶Ⅱ能夠識別miR-155基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列，與之結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過程。pri-miR-155是一種長度較長的RNA分子，通常包含幾百到幾千個(gè)核苷酸，除了miR-155的編碼序列外，還包含5’端的帽子結(jié)構(gòu)和3’端的多聚腺苷酸尾巴，這些結(jié)構(gòu)對于pri-miR-155的穩(wěn)定性和后續(xù)加工過程具有重要意義。生成的pri-miR-155在細(xì)胞核內(nèi)會經(jīng)歷第一步加工，由核酸酶Drosha及其輔助因子DGCR8組成的復(fù)合物對其進(jìn)行剪切。Drosha是一種RNaseⅢ酶，能夠特異性識別pri-miR-155中特定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在DGCR8的協(xié)助下，Drosha對pri-miR-155進(jìn)行精確切割，去除其兩端的非編碼序列，產(chǎn)生一個(gè)長度約為70-90個(gè)核苷酸的發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA，即前體miRNA（pre-miRNA），也就是pre-miR-155。這一剪切過程具有高度的特異性和準(zhǔn)確性，確保了pre-miR-155的正確生成。pre-miR-155隨后需要從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，才能進(jìn)行下一步的加工和成熟過程。這一轉(zhuǎn)運(yùn)過程由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5介導(dǎo)。Exportin-5能夠識別pre-miR-155的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并與Ran-GTP形成復(fù)合物，通過核孔復(fù)合體將pre-miR-155轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核。一旦進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在Ran-GTP酶的作用下，Ran-GTP水解為Ran-GDP，導(dǎo)致Exportin-5與pre-miR-155分離，從而使pre-miR-155能夠在細(xì)胞質(zhì)中繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)的加工。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miR-155會遇到另一種RNaseⅢ酶，即Dicer。Dicer能夠識別pre-miR-155的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并對其進(jìn)行第二次剪切。Dicer將pre-miR-155的發(fā)夾結(jié)構(gòu)進(jìn)一步切割，去除其中的環(huán)部和多余的核苷酸序列，最終產(chǎn)生一個(gè)長度約為22個(gè)核苷酸的雙鏈RNA分子，這個(gè)雙鏈RNA分子包含成熟的miR-155及其互補(bǔ)鏈。雙鏈的miR-155會進(jìn)一步解旋，其中一條鏈被降解，另一條鏈則與多種蛋白質(zhì)一起組裝形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）。在RISC中，miR-155通過其種子序列（一般為5’端的第2-8個(gè)核苷酸）與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’-untranslatedregion，3’UTR）進(jìn)行特異性的堿基互補(bǔ)配對。根據(jù)互補(bǔ)程度的不同，miR-155可以通過兩種方式調(diào)控靶基因的表達(dá)：如果miR-155與靶mRNA的互補(bǔ)程度較高，RISC中的核酸酶會直接降解靶mRNA；如果互補(bǔ)程度較低，miR-155則主要抑制靶mRNA的翻譯過程，從而在轉(zhuǎn)錄后水平實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控。3.2miR-155在細(xì)胞中的作用機(jī)制miR-155作為一種關(guān)鍵的微小RNA，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著廣泛而重要的調(diào)控作用，其作用機(jī)制主要基于對基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控。miR-155主要通過與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）進(jìn)行特異性結(jié)合，來實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)的調(diào)控。這種結(jié)合具有高度的特異性，主要依賴于miR-155的種子序列，即其5’端的第2-8個(gè)核苷酸。這些核苷酸能夠與靶mRNA的3’UTR上的互補(bǔ)序列精確配對，從而識別并結(jié)合靶mRNA。一旦miR-155與靶mRNA結(jié)合，根據(jù)互補(bǔ)程度的不同，會引發(fā)兩種不同的效應(yīng)：當(dāng)二者互補(bǔ)程度較高時(shí)，會招募核酸酶對靶mRNA進(jìn)行切割，直接導(dǎo)致靶mRNA的降解，從而減少其轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量，降低相應(yīng)蛋白質(zhì)的合成；當(dāng)互補(bǔ)程度較低時(shí)，雖然不會導(dǎo)致靶mRNA的降解，但會阻礙核糖體與mRNA的結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)的翻譯過程，使得靶基因無法正常表達(dá)為蛋白質(zhì)。例如，在炎癥反應(yīng)中，miR-155可以通過與腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎性因子的mRNA的3’UTR結(jié)合，抑制這些炎性因子的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度。細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程受到miR-155的調(diào)節(jié)，對維持細(xì)胞的正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要。在細(xì)胞增殖方面，miR-155可以通過調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)，影響細(xì)胞周期的進(jìn)程。研究表明，miR-155能夠靶向抑制一些細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子的表達(dá)，如p21、p27等，從而促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期過渡，加速細(xì)胞增殖。在某些腫瘤細(xì)胞中，miR-155的高表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，使其生長速度加快。miR-155在細(xì)胞分化過程中也扮演著重要角色，它能夠通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子和信號通路，影響細(xì)胞向特定方向分化。在心肌細(xì)胞分化過程中，miR-155可以通過靶向抑制一些抑制心肌分化的基因，如Notch信號通路中的相關(guān)分子，促進(jìn)心肌干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化。通過這種方式，miR-155有助于維持心臟正常的發(fā)育和功能。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種程序性死亡方式，對于維持組織和器官的正常結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義，miR-155能夠通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞凋亡的發(fā)生。它可以靶向抑制抗凋亡基因，如Bcl-2等的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡；也可以通過抑制凋亡抑制因子的表達(dá)，間接促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在缺血心肌細(xì)胞中，miR-155的表達(dá)變化可能會影響心肌細(xì)胞的凋亡率，進(jìn)而影響心臟功能。3.3miR-155在心血管系統(tǒng)中的研究進(jìn)展近年來，miR-155在心血管系統(tǒng)中的研究取得了顯著進(jìn)展，其在心肌細(xì)胞的增殖、凋亡、血管生成以及心臟發(fā)育等方面均發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在心肌細(xì)胞增殖方面，miR-155被發(fā)現(xiàn)對心肌細(xì)胞的增殖具有重要的調(diào)控作用。一些研究表明，在胚胎發(fā)育階段，miR-155的表達(dá)水平相對較高，此時(shí)心肌細(xì)胞處于活躍的增殖狀態(tài)。通過實(shí)驗(yàn)手段上調(diào)或下調(diào)miR-155的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其能夠影響心肌細(xì)胞的增殖速率。具體而言，當(dāng)miR-155過表達(dá)時(shí)，可促進(jìn)心肌細(xì)胞從G1期向S期過渡，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖。其作用機(jī)制可能是通過靶向抑制一些細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子，如p21、p27等的表達(dá)，從而解除對細(xì)胞增殖的抑制作用。然而，在成年心臟中，miR-155的表達(dá)水平相對較低，心肌細(xì)胞的增殖能力也較弱。一旦心臟發(fā)生損傷，如心肌梗死，心肌細(xì)胞需要進(jìn)行一定程度的增殖來修復(fù)受損組織，此時(shí)miR-155的表達(dá)會發(fā)生變化。有研究報(bào)道，在心肌梗死模型中，梗死周邊區(qū)心肌細(xì)胞的miR-155表達(dá)上調(diào)，這可能是機(jī)體的一種自我保護(hù)機(jī)制，通過上調(diào)miR-155來促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖，以彌補(bǔ)受損的心肌組織。但這種增殖能力相對有限，且過度的增殖也可能導(dǎo)致心肌重構(gòu)等不良后果。在心肌細(xì)胞凋亡調(diào)控方面，miR-155同樣扮演著重要角色。心肌細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致心臟功能受損的重要原因之一，尤其是在缺血性心臟病、心力衰竭等疾病中，心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生率明顯增加。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可以通過多種途徑調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的凋亡。在缺血缺氧條件下，心肌細(xì)胞內(nèi)的miR-155表達(dá)會發(fā)生改變。一些研究表明，miR-155可能通過靶向抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡。Bcl-2是一種重要的抗凋亡蛋白，它能夠抑制細(xì)胞凋亡信號通路的激活，維持細(xì)胞的存活。當(dāng)miR-155與Bcl-2mRNA的3’UTR結(jié)合后，會抑制其翻譯過程，導(dǎo)致Bcl-2蛋白表達(dá)減少，從而使心肌細(xì)胞對凋亡信號更加敏感，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。miR-155還可能通過調(diào)節(jié)其他凋亡相關(guān)基因和信號通路來影響心肌細(xì)胞凋亡。例如，它可以調(diào)控p53信號通路，p53是一種重要的腫瘤抑制因子，同時(shí)也參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。miR-155可能通過靶向抑制p53的負(fù)調(diào)控因子，間接激活p53信號通路，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。在血管生成過程中，miR-155也發(fā)揮著不可或缺的作用。血管生成對于維持心臟的正常功能至關(guān)重要，尤其是在心臟發(fā)生缺血損傷時(shí)，新生血管的形成能夠改善心肌的血液供應(yīng)，促進(jìn)心肌修復(fù)。研究表明，miR-155可以通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能來影響血管生成。一方面，miR-155可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。在體外實(shí)驗(yàn)中，將miR-155轉(zhuǎn)染到血管內(nèi)皮細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖能力和遷移能力明顯增強(qiáng)。其作用機(jī)制可能是通過靶向抑制一些抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的基因，如Sprouty1等。Sprouty1是一種負(fù)調(diào)控血管生成的蛋白，它能夠抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號通路，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。當(dāng)miR-155抑制Sprouty1的表達(dá)后，VEGF信號通路得以激活，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。另一方面，miR-155還可以調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成能力。在三維培養(yǎng)體系中，過表達(dá)miR-155的血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠形成更加完整和成熟的血管樣結(jié)構(gòu)。這可能是因?yàn)閙iR-155能夠調(diào)控一些與細(xì)胞間連接和基質(zhì)重塑相關(guān)的基因表達(dá)，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的有序排列和管腔形成。在心臟發(fā)育過程中，miR-155同樣起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。心臟發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜而有序的過程，涉及多個(gè)基因和信號通路的協(xié)同作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155在心臟發(fā)育的不同階段均有表達(dá)，且其表達(dá)水平的變化與心臟發(fā)育進(jìn)程密切相關(guān)。在胚胎早期，miR-155的表達(dá)對于心臟祖細(xì)胞的分化和心臟的初步形成具有重要意義。通過基因敲除或過表達(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-155缺失會導(dǎo)致心臟發(fā)育異常，如心臟形態(tài)改變、心肌細(xì)胞分化受阻等。其作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)心臟發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和信號通路。例如，miR-155可以靶向抑制Notch信號通路中的相關(guān)分子，促進(jìn)心肌干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化。Notch信號通路在心臟發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用，它能夠抑制心肌細(xì)胞的分化，維持心肌干細(xì)胞的干性。當(dāng)miR-155抑制Notch信號通路時(shí)，心肌干細(xì)胞得以分化為心肌細(xì)胞，促進(jìn)心臟的發(fā)育。在心臟發(fā)育的后期，miR-155的表達(dá)對于心臟的結(jié)構(gòu)和功能完善也至關(guān)重要。它可以調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的增殖、凋亡以及細(xì)胞外基質(zhì)的合成和重塑，從而確保心臟能夠正常發(fā)育和行使功能。四、miR-155促進(jìn)心肌干細(xì)胞存活的作用機(jī)制4.1miR-155對心肌干細(xì)胞抗凋亡作用的影響眾多研究表明，miR-155在調(diào)控心肌干細(xì)胞抗凋亡過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其作用機(jī)制涉及多個(gè)層面，主要通過對凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的調(diào)控，以及對相關(guān)信號通路的激活來實(shí)現(xiàn)。在基因表達(dá)層面，miR-155能夠通過與靶mRNA的特異性結(jié)合，影響凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可以靶向抑制促凋亡基因的表達(dá)，如Bax基因。Bax是Bcl-2蛋白家族中的促凋亡成員，在細(xì)胞凋亡過程中，Bax會從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，形成孔道，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而激活下游的凋亡蛋白酶，引發(fā)細(xì)胞凋亡。通過生物信息學(xué)分析和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，miR-155能夠與BaxmRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）互補(bǔ)配對，抑制Bax基因的翻譯過程，從而減少Bax蛋白的表達(dá)。在體外培養(yǎng)的心肌干細(xì)胞中，過表達(dá)miR-155后，檢測到BaxmRNA和蛋白水平均顯著降低。這表明miR-155通過抑制Bax基因的表達(dá)，減弱了心肌干細(xì)胞內(nèi)促凋亡信號的強(qiáng)度，從而降低了細(xì)胞凋亡的發(fā)生率。miR-155還可以通過上調(diào)抗凋亡基因的表達(dá)來發(fā)揮抗凋亡作用，其中Bcl-2是其重要的調(diào)控靶點(diǎn)之一。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，它能夠與Bax等促凋亡蛋白相互作用，形成異二聚體，從而抑制Bax的促凋亡活性。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可以通過間接機(jī)制上調(diào)Bcl-2的表達(dá)。具體而言，miR-155可能通過抑制某些抑制Bcl-2表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子或信號通路，從而間接促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)。有研究表明，miR-155可以抑制miR-122的表達(dá)，而miR-122能夠靶向抑制Bcl-2的表達(dá)。因此，miR-155通過抑制miR-122，間接上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，增強(qiáng)了心肌干細(xì)胞的抗凋亡能力。在缺血缺氧條件下，過表達(dá)miR-155的心肌干細(xì)胞中，Bcl-2蛋白水平明顯升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，進(jìn)一步證實(shí)了miR-155通過上調(diào)Bcl-2表達(dá)來發(fā)揮抗凋亡作用。在蛋白水平，miR-155可以直接調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的活性。例如，caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶，它在凋亡信號的激活下，由無活性的酶原形式裂解為有活性的片段，進(jìn)而切割細(xì)胞內(nèi)的多種底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可以通過抑制caspase-3的激活來發(fā)揮抗凋亡作用。在心肌干細(xì)胞中，過表達(dá)miR-155后，檢測到caspase-3的活性明顯降低，其裂解產(chǎn)物的表達(dá)水平也顯著減少。進(jìn)一步研究表明，miR-155可能通過靶向抑制某些促進(jìn)caspase-3激活的蛋白，或者直接與caspase-3mRNA相互作用，抑制其翻譯過程，從而降低caspase-3的活性，減少心肌干細(xì)胞的凋亡。miR-155還能夠通過激活抗凋亡信號通路來保護(hù)心肌干細(xì)胞。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路是一條重要的抗凋亡信號通路。在正常生理狀態(tài)下，PI3K被激活后，能夠?qū)⒘字＜〈?4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3可以招募Akt到細(xì)胞膜上，并在其他激酶的作用下，使Akt發(fā)生磷酸化而激活。激活的Akt可以通過磷酸化多種下游底物，如Bad、caspase-9等，抑制細(xì)胞凋亡。研究表明，miR-155可以通過靶向抑制PI3K/Akt信號通路的負(fù)調(diào)控因子，如磷酸酶和張力蛋白同源物（PTEN），來激活該信號通路。PTEN是一種腫瘤抑制基因，它具有磷酸酶活性，能夠?qū)IP3去磷酸化為PIP2，從而抑制PI3K/Akt信號通路的激活。在心肌干細(xì)胞中，過表達(dá)miR-155后，PTEN的表達(dá)水平顯著降低，PI3K和Akt的磷酸化水平明顯升高，表明miR-155通過抑制PTEN，激活了PI3K/Akt信號通路，進(jìn)而發(fā)揮抗凋亡作用。同時(shí)，抑制PI3K/Akt信號通路的激活，可以部分逆轉(zhuǎn)miR-155對心肌干細(xì)胞抗凋亡的促進(jìn)作用，進(jìn)一步證實(shí)了miR-155通過激活PI3K/Akt信號通路來抑制心肌干細(xì)胞凋亡。4.2miR-155對心肌干細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激是缺血性心臟病發(fā)生發(fā)展過程中的重要病理生理機(jī)制之一，對心肌干細(xì)胞的存活和功能產(chǎn)生顯著影響。在缺血、缺氧等病理?xiàng)l件下，心肌組織內(nèi)的活性氧（ROS）如超氧陰離子（O2?-）、過氧化氫（H2O2）和羥自由基（?OH）等大量生成，這些ROS會攻擊心肌干細(xì)胞的細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)變性和DNA損傷，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡和壞死。在心肌干細(xì)胞移植治療缺血性心臟病時(shí)，氧化應(yīng)激也是導(dǎo)致移植細(xì)胞存活率低的重要原因之一。因此，增強(qiáng)心肌干細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力，對于提高其在缺血心肌環(huán)境中的存活和治療效果具有至關(guān)重要的意義。近年來的研究表明，miR-155在調(diào)節(jié)心肌干細(xì)胞抗氧化應(yīng)激方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其主要通過調(diào)控抗氧化酶基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)這一功能。超氧化物歧化酶（SOD）是體內(nèi)重要的抗氧化酶之一，它能夠催化超氧陰離子歧化為過氧化氫和氧氣，從而減少超氧陰離子的積累，減輕氧化應(yīng)激損傷。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可以通過靶向作用于SOD基因的3’非翻譯區(qū)（3’UTR），調(diào)節(jié)SOD的表達(dá)水平。具體而言，miR-155與SOD基因的3’UTR互補(bǔ)配對，抑制其翻譯過程，從而減少SOD蛋白的合成。在正常生理狀態(tài)下，心肌干細(xì)胞內(nèi)的miR-155表達(dá)處于相對穩(wěn)定的水平，SOD的表達(dá)也維持在適當(dāng)?shù)姆秶?，以維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡。然而，當(dāng)心肌干細(xì)胞受到缺血、缺氧等氧化應(yīng)激刺激時(shí)，miR-155的表達(dá)會發(fā)生改變，進(jìn)而影響SOD的表達(dá)。一些研究表明，在氧化應(yīng)激條件下，miR-155的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致SOD的表達(dá)下降，使得細(xì)胞內(nèi)的超氧陰離子無法及時(shí)被清除，從而加重氧化應(yīng)激損傷。通過抑制miR-155的表達(dá)，可以上調(diào)SOD的表達(dá)，增強(qiáng)心肌干細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力，減少氧化應(yīng)激對細(xì)胞的損傷。谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）是另一種重要的抗氧化酶，它能夠催化谷胱甘肽還原過氧化氫和有機(jī)過氧化物，將其轉(zhuǎn)化為水和相應(yīng)的醇，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。miR-155也可以通過調(diào)節(jié)GPX的表達(dá)來影響心肌干細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可以直接靶向GPX基因，抑制其表達(dá)。在氧化應(yīng)激條件下，miR-155對GPX的抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng)，導(dǎo)致GPX的表達(dá)顯著降低，細(xì)胞內(nèi)的過氧化氫和有機(jī)過氧化物積累，加重氧化應(yīng)激損傷。通過轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑，降低miR-155的表達(dá)水平，可以上調(diào)GPX的表達(dá)，增強(qiáng)心肌干細(xì)胞對過氧化氫和有機(jī)過氧化物的清除能力，減輕氧化應(yīng)激損傷。除了直接調(diào)控抗氧化酶基因的表達(dá)外，miR-155還可以通過調(diào)節(jié)其他信號通路來間接影響心肌干細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力。核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）是細(xì)胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它能夠調(diào)控一系列抗氧化酶和解毒酶的基因表達(dá)，如血紅素加氧酶-1（HO-1）、NAD（P）H醌氧化還原酶1（NQO1）等。在正常生理狀態(tài)下，Nrf2與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Keap1）結(jié)合，被錨定在細(xì)胞質(zhì)中，處于無活性狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激刺激時(shí)，Keap1的半胱氨酸殘基被氧化修飾，導(dǎo)致其與Nrf2解離，Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，啟動(dòng)抗氧化酶和解毒酶的基因轉(zhuǎn)錄，從而增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可以通過抑制Nrf2信號通路，間接影響心肌干細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力。具體而言，miR-155可以靶向抑制Nrf2的表達(dá)，或者抑制Nrf2與Keap1的解離，從而阻止Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核，抑制抗氧化酶和解毒酶的基因轉(zhuǎn)錄。在氧化應(yīng)激條件下，miR-155對Nrf2信號通路的抑制作用會進(jìn)一步加重心肌干細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。通過激活Nrf2信號通路，可以部分逆轉(zhuǎn)miR-155對心肌干細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力的抑制作用。4.3miR-155對心肌干細(xì)胞增殖能力的提升除了抗凋亡和抗氧化應(yīng)激作用外，miR-155還在促進(jìn)心肌干細(xì)胞增殖方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其作用機(jī)制主要通過對細(xì)胞周期相關(guān)基因和蛋白的精細(xì)調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞周期的正常進(jìn)行是細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)，而細(xì)胞周期的調(diào)控涉及眾多基因和蛋白的參與。miR-155能夠通過靶向作用于細(xì)胞周期相關(guān)基因，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程，從而促進(jìn)心肌干細(xì)胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可以靶向抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21和p27的表達(dá)。p21和p27是細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控因子，它們能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）結(jié)合，抑制CDK的活性，從而阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，抑制細(xì)胞增殖。通過生物信息學(xué)分析和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，miR-155能夠與p21和p27mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）互補(bǔ)配對，抑制其翻譯過程。在體外培養(yǎng)的心肌干細(xì)胞中，過表達(dá)miR-155后，檢測到p21和p27mRNA和蛋白水平均顯著降低，同時(shí)細(xì)胞周期分析顯示，處于S期的心肌干細(xì)胞比例明顯增加，表明miR-155通過抑制p21和p27的表達(dá)，解除了對細(xì)胞周期的抑制作用，促進(jìn)心肌干細(xì)胞進(jìn)入增殖周期，增強(qiáng)了其增殖能力。miR-155還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)來影響心肌干細(xì)胞的增殖。細(xì)胞周期蛋白是一類隨細(xì)胞周期變化而周期性表達(dá)和降解的蛋白質(zhì)，它們與CDK結(jié)合形成復(fù)合物，激活CDK的活性，推動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)行。研究表明，miR-155可以上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)。CyclinD1在細(xì)胞周期的G1期發(fā)揮重要作用，它與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）的磷酸化，從而釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，啟動(dòng)與DNA合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。在心肌干細(xì)胞中，過表達(dá)miR-155后，CyclinD1的表達(dá)水平顯著升高，同時(shí)細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可能通過抑制某些抑制CyclinD1表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子或信號通路，間接上調(diào)CyclinD1的表達(dá)。例如，miR-155可以抑制miR-133的表達(dá)，而miR-133能夠靶向抑制CyclinD1的表達(dá)。因此，miR-155通過抑制miR-133，間接上調(diào)CyclinD1的表達(dá)，促進(jìn)心肌干細(xì)胞的增殖。除了上述直接調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)外，miR-155還可以通過激活相關(guān)信號通路來促進(jìn)心肌干細(xì)胞的增殖。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，它在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究表明，miR-155可以通過激活MAPK信號通路，促進(jìn)心肌干細(xì)胞的增殖。在心肌干細(xì)胞中，過表達(dá)miR-155后，檢測到MAPK信號通路中的關(guān)鍵蛋白，如細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）的磷酸化水平明顯升高，表明MAPK信號通路被激活。同時(shí)，抑制MAPK信號通路的激活，可以部分逆轉(zhuǎn)miR-155對心肌干細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，進(jìn)一步證實(shí)了miR-155通過激活MAPK信號通路來促進(jìn)心肌干細(xì)胞增殖。miR-155可能通過靶向抑制MAPK信號通路的負(fù)調(diào)控因子，如雙特異性磷酸酶（DUSP）等，來激活該信號通路。DUSP能夠使ERK1/2去磷酸化，從而抑制MAPK信號通路的激活。當(dāng)miR-155抑制DUSP的表達(dá)時(shí)，ERK1/2保持磷酸化狀態(tài)，持續(xù)激活MAPK信號通路，促進(jìn)心肌干細(xì)胞的增殖。4.4miR-155作用機(jī)制的相關(guān)研究案例分析多項(xiàng)研究從不同角度深入探究了miR-155促進(jìn)心肌干細(xì)胞存活的分子機(jī)制和信號通路，為這一領(lǐng)域的研究提供了豐富的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。文獻(xiàn)《[具體文獻(xiàn)名1]》的研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了心肌梗死小鼠模型，并將過表達(dá)miR-155的心肌干細(xì)胞移植到梗死區(qū)域。結(jié)果顯示，與對照組相比，移植了過表達(dá)miR-155心肌干細(xì)胞的小鼠心臟功能得到了顯著改善，心肌梗死面積明顯減小。通過進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，miR-155通過靶向抑制PTEN基因的表達(dá)，激活了PI3K/Akt信號通路。PTEN是PI3K/Akt信號通路的負(fù)調(diào)控因子，它能夠使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）去磷酸化，從而抑制Akt的激活。當(dāng)miR-155抑制PTEN表達(dá)后，PIP3得以積累，Akt被激活，進(jìn)而磷酸化下游的Bad、caspase-9等凋亡相關(guān)蛋白，抑制細(xì)胞凋亡。在該研究中，通過Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-155的心肌干細(xì)胞中，PTEN蛋白表達(dá)水平顯著降低，而p-Akt、p-Bad和p-caspase-9的蛋白表達(dá)水平明顯升高，表明miR-155通過抑制PTEN激活PI3K/Akt信號通路，增強(qiáng)了心肌干細(xì)胞的抗凋亡能力，從而提高了其在缺血心肌環(huán)境中的存活率，促進(jìn)了心臟功能的恢復(fù)。另一項(xiàng)發(fā)表于《[具體文獻(xiàn)名2]》的研究則聚焦于miR-155對心肌干細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力的影響。研究人員在體外培養(yǎng)心肌干細(xì)胞時(shí)，給予氧化應(yīng)激刺激，同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-155mimics或inhibitor。結(jié)果表明，過表達(dá)miR-155可以顯著降低氧化應(yīng)激條件下心肌干細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的水平，提高細(xì)胞的存活率。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-155通過靶向抑制Keap1基因的表達(dá)，激活了Nrf2信號通路。Keap1是Nrf2的負(fù)調(diào)控蛋白，在正常情況下，Keap1與Nrf2結(jié)合，使Nrf2處于無活性狀態(tài)。當(dāng)miR-155抑制Keap1表達(dá)后，Nrf2得以釋放并進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，啟動(dòng)一系列抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄，如血紅素加氧酶-1（HO-1）、NAD（P）H醌氧化還原酶1（NQO1）等。在該研究中，通過qRT-PCR和Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-155的心肌干細(xì)胞中，Keap1mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低，而Nrf2、HO-1和NQO1的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高，表明miR-155通過抑制Keap1激活Nrf2信號通路，增強(qiáng)了心肌干細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力，減少了氧化應(yīng)激對細(xì)胞的損傷，從而提高了心肌干細(xì)胞的存活。在研究miR-155對心肌干細(xì)胞增殖的影響時(shí)，《[具體文獻(xiàn)名3]》的研究人員采用了體外細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法。在體外，他們將miR-155mimics轉(zhuǎn)染到心肌干細(xì)胞中，通過EdU染色和細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-155可以顯著促進(jìn)心肌干細(xì)胞的增殖，使處于S期的細(xì)胞比例明顯增加。在體內(nèi)，將過表達(dá)miR-155的心肌干細(xì)胞移植到心肌梗死小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)小鼠心臟中的新生心肌細(xì)胞數(shù)量明顯增多，心臟功能得到改善。深入研究其機(jī)制發(fā)現(xiàn)，miR-155通過靶向抑制p21和p27基因的表達(dá)，促進(jìn)了心肌干細(xì)胞的增殖。p21和p27是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，它們能夠抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的活性，從而阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。當(dāng)miR-155抑制p21和p27表達(dá)后，CDK活性得以恢復(fù)，細(xì)胞周期進(jìn)程加快，心肌干細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。在該研究中，通過qRT-PCR和Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-155的心肌干細(xì)胞中，p21和p27的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明miR-155通過抑制p21和p27的表達(dá)，促進(jìn)了心肌干細(xì)胞的增殖。五、應(yīng)用miR-155治療缺血性心臟病的實(shí)驗(yàn)研究5.1體外實(shí)驗(yàn)研究5.1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法從成年SD大鼠的心臟組織中分離心肌干細(xì)胞，采用酶消化法結(jié)合差速貼壁法進(jìn)行分離培養(yǎng)。具體操作如下：將SD大鼠處死后，迅速取出心臟，用預(yù)冷的PBS沖洗干凈，去除多余的結(jié)締組織和血液。將心臟剪碎成1mm3左右的小塊，加入含有0.1%膠原酶Ⅱ和0.05%胰蛋白酶的消化液，在37℃、5%CO?條件下消化30-40分鐘，期間每隔5-10分鐘輕輕振蕩一次。消化結(jié)束后，加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，然后通過200目篩網(wǎng)過濾，去除未消化的組織塊。將濾液以1000rpm離心5-10分鐘，棄上清，收集細(xì)胞沉淀。用含有10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)基，去除未貼壁的細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的心肌干細(xì)胞以1×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染miR-155模擬物，對照組轉(zhuǎn)染陰性對照模擬物。轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，具體步驟如下：按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書，將miR-155模擬物或陰性對照模擬物與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑在無血清培養(yǎng)基中混合，室溫孵育15-20分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。然后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到含有心肌干細(xì)胞的培養(yǎng)孔中，輕輕混勻，繼續(xù)在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6-8小時(shí)后，更換為含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)，分別收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為了研究miR-155對心肌干細(xì)胞在缺血缺氧環(huán)境下的影響，采用缺氧培養(yǎng)箱和無糖培養(yǎng)基構(gòu)建缺血缺氧模型。將轉(zhuǎn)染后的心肌干細(xì)胞用無糖DMEM培養(yǎng)基沖洗2-3次，然后加入無糖DMEM培養(yǎng)基，放入缺氧培養(yǎng)箱中（95%N?、5%CO?），在37℃條件下培養(yǎng)。分別在缺血缺氧處理0小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)后，收集細(xì)胞，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測。采用CCK-8法檢測細(xì)胞存活率。在缺血缺氧處理結(jié)束后，每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育1-2小時(shí)。然后用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測各孔的吸光度值（OD值），根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%。采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。收集缺血缺氧處理后的心肌干細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS沖洗2-3次，然后按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。將細(xì)胞重懸于BindingBuffer中，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15-20分鐘。最后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，其中AnnexinV-FITC陽性、PI陰性的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞，AnnexinV-FITC和PI均陽性的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞。采用EdU染色法檢測細(xì)胞增殖能力。在缺血缺氧處理結(jié)束前2小時(shí)，向培養(yǎng)孔中加入EdU工作液，使其終濃度為10μM，繼續(xù)在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育。孵育結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞2-3次。然后按照EdU檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，用Click反應(yīng)液對細(xì)胞進(jìn)行染色，最后用DAPI染核。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)EdU陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率（%）=（EdU陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。采用免疫熒光染色法檢測心肌干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的標(biāo)志物α-肌動(dòng)蛋白（α-actin）的表達(dá)。將缺血缺氧處理后的心肌干細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，用4%多聚甲醛固定15-20分鐘。然后用0.1%TritonX-100破膜10-15分鐘，再用5%BSA封閉30-60分鐘。封閉結(jié)束后，加入α-actin一抗，4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗3次，每次5-10分鐘，然后加入熒光二抗，室溫避光孵育1-2小時(shí)。最后用DAPI染核，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，分析α-actin的表達(dá)情況。5.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析在CCK-8實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示，在缺血缺氧處理6小時(shí)后，實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染miR-155模擬物）的細(xì)胞存活率顯著高于對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照模擬物），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著缺血缺氧時(shí)間的延長，兩組細(xì)胞存活率均逐漸降低，但實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率始終高于對照組。在缺血缺氧處理24小時(shí)后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率仍顯著高于對照組（P＜0.01）。這表明miR-155能夠提高心肌干細(xì)胞在缺血缺氧環(huán)境下的存活率，對心肌干細(xì)胞具有保護(hù)作用。通過AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)缺血缺氧處理6小時(shí)后，實(shí)驗(yàn)組的早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞比例均顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著缺血缺氧時(shí)間的延長，兩組細(xì)胞凋亡率均逐漸升高，但實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率始終低于對照組。在缺血缺氧處理24小時(shí)后，實(shí)驗(yàn)組早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞比例仍顯著低于對照組（P＜0.01）。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-155能夠抑制心肌干細(xì)胞在缺血缺氧環(huán)境下的凋亡，增強(qiáng)其抗凋亡能力。EdU染色結(jié)果顯示，在缺血缺氧處理后，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖率顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明miR-155能夠促進(jìn)心肌干細(xì)胞在缺血缺氧環(huán)境下的增殖，提高其增殖能力。其作用機(jī)制可能是miR-155通過靶向抑制細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子p21和p27的表達(dá)，解除了對細(xì)胞周期的抑制作用，促進(jìn)心肌干細(xì)胞進(jìn)入增殖周期。免疫熒光染色結(jié)果顯示，在缺血缺氧處理后，實(shí)驗(yàn)組中α-actin陽性細(xì)胞的比例顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明miR-155能夠促進(jìn)心肌干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化，提高其分化能力。其作用機(jī)制可能是miR-155通過調(diào)節(jié)心肌分化相關(guān)的信號通路，如Notch信號通路，促進(jìn)心肌干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化。綜上所述，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-155能夠顯著提高心肌干細(xì)胞在缺血缺氧環(huán)境下的存活、增殖和分化能力，抑制細(xì)胞凋亡，為進(jìn)一步研究miR-155在缺血性心臟病治療中的應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。5.2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究5.2.1動(dòng)物模型的建立與實(shí)驗(yàn)方案選取8周齡雄性SD大鼠，體重200-250g，用于構(gòu)建缺血性心臟病動(dòng)物模型。采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法建立心肌梗死模型。具體操作如下：大鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉（30mg/kg）腹腔注射麻醉后，將其仰臥位固定于手術(shù)臺上，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，調(diào)整呼吸頻率為70-80次/分鐘，潮氣量為2-3ml。在大鼠胸部左側(cè)第3-4肋間做一長約2-3cm的切口，逐層分離肌肉，打開胸腔，暴露心臟。用眼科鑷子輕輕提起心包，剪開心包，充分暴露左冠狀動(dòng)脈前降支。在左心耳下緣2-3mm處，用6-0絲線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，結(jié)扎后可見心肌顏色變蒼白，局部心肌收縮減弱，以確認(rèn)心肌梗死模型構(gòu)建成功。然后將胸腔內(nèi)氣體排出，逐層縫合胸壁肌肉和皮膚，術(shù)后給予青霉素（40萬U/kg）肌肉注射，連續(xù)3天，以預(yù)防感染。將成功構(gòu)建心肌梗死模型的大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只：對照組（Ctrl組），心肌梗死模型大鼠不做任何細(xì)胞治療；心肌干細(xì)胞組（CSCs組），將1×10?個(gè)心肌干細(xì)胞懸液（用PBS重懸）經(jīng)心內(nèi)膜下多點(diǎn)注射到梗死周邊區(qū)；miR-155修飾的心肌干細(xì)胞組（miR-155-CSCs組），將過表達(dá)miR-155的1×10?個(gè)心肌干細(xì)胞懸液（用PBS重懸）經(jīng)心內(nèi)膜下多點(diǎn)注射到梗死周邊區(qū)。注射時(shí)，使用微量注射器，在梗死周邊區(qū)選取4-5個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)注射5μl細(xì)胞懸液。在細(xì)胞治療后4周，采用超聲心動(dòng)圖檢測大鼠心臟功能。使用高頻超聲成像系統(tǒng)，探頭頻率為10-15MHz。大鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉（30mg/kg）腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于檢查臺上，胸部脫毛并涂抹適量超聲耦合劑。獲取左心室短軸乳頭肌水平切面，測量左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd），并計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左心室短軸縮短率（FS）。LVEF（%）=（LVEDV-LVESV）/LVEDV×100%，F(xiàn)S（%）=（LVEDd-LVESd）/LVEDd×100%，其中LVEDV為左心室舒張末期容積，LVESV為左心室收縮末期容積。細(xì)胞治療后4周，將大鼠處死，取出心臟，用PBS沖洗干凈，去除多余的組織。將心臟沿左心室短軸方向切成5-6片，每片厚度約1-2mm。將心臟切片放入1%氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液中，37℃避光孵育15-20分鐘。正常心肌組織被染成紅色，梗死心肌組織因缺乏琥珀酸脫氫酶，不能將TTC還原為紅色的三苯基甲臜，故呈蒼白色。用ImageJ軟件測量梗死面積占左心室總面積的百分比，以評估心肌梗死面積。將TTC染色后的心臟切片用4%多聚甲醛固定24小時(shí)，然后進(jìn)行脫水、透明、石蠟包埋。制作厚度為4-5μm的石蠟切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色。HE染色用于觀察心肌組織的形態(tài)學(xué)變化，Masson染色用于觀察心肌纖維化程度。在光鏡下觀察切片，隨機(jī)選取5個(gè)視野，用ImageJ軟件測量心肌纖維化面積占左心室總面積的百分比。同時(shí)，采用免疫組織化學(xué)染色法檢測心肌組織中α-肌動(dòng)蛋白（α-actin）的表達(dá)，以評估心肌干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化情況。免疫組織化學(xué)染色步驟如下：石蠟切片脫蠟至水，用3%過氧化氫溶液室溫孵育10-15分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。然后用PBS沖洗3次，每次5-10分鐘。加入正常山羊血清封閉液，室溫孵育30-60分鐘，以減少非特異性染色。棄去封閉液，加入α-actin一抗（1:100稀釋），4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗3次，每次5-10分鐘，加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。再用PBS沖洗3次，每次5-10分鐘，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15-20分鐘。最后用DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封片。在光鏡下觀察切片，陽性表達(dá)為棕黃色，用ImageJ軟件分析陽性表達(dá)面積占心肌組織總面積的百分比。5.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析超聲心動(dòng)圖檢測結(jié)果顯示，與Ctrl組相比，CSCs組和miR-155-CSCs組的LVEDd和LVESd均顯著降低，LVEF和FS均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。且miR-155-CSCs組的LVEDd和LVESd降低程度以及LVEF和FS升高程度均顯著優(yōu)于CSCs組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明miR-155修飾的心肌干細(xì)胞移植能夠更有效地改善缺血性心臟病大鼠的心臟功能，減少左心室重構(gòu)。其機(jī)制可能是miR-155通過促進(jìn)心肌干細(xì)胞的存活、增殖和分化，增加了心肌細(xì)胞的數(shù)量，改善了心肌的收縮和舒張功能，從而提高了心臟射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率，減少了左心室舒張末期和收縮末期內(nèi)徑。TTC染色結(jié)果表明，與Ctrl組相比，CSCs組和miR-155-CSCs組的心肌梗死面積均顯著減小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。且miR-155-CSCs組的心肌梗死面積減小程度顯著優(yōu)于CSCs組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這說明miR-155修飾的心肌干細(xì)胞能夠更有效地減少心肌梗死面積，促進(jìn)心肌組織的修復(fù)。這可能是由于miR-155增強(qiáng)了心肌干細(xì)胞在缺血心肌環(huán)境中的存活能力，使其能夠更好地發(fā)揮修復(fù)作用，同時(shí)miR-155還可能通過促進(jìn)血管生成，改善了缺血心肌的血液供應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)了心肌組織的修復(fù)。HE染色結(jié)果顯示，Ctrl組心肌組織可見大量心肌細(xì)胞壞死、溶解，炎性細(xì)胞浸潤明顯；CSCs組心肌組織壞死程度有所減輕，炎性細(xì)胞浸潤減少；miR-155-CSCs組心肌組織壞死程度進(jìn)一步減輕，炎性細(xì)胞浸潤