α7煙堿型受體在膽管癌細胞調控中的機制與影響探究一、引言1.1研究背景與意義1.1.1膽管癌的現狀剖析膽管癌作為一種起源于膽管上皮細胞的重要消化道系統(tǒng)腫瘤，近年來逐漸受到醫(yī)學界的廣泛關注。盡管其發(fā)病率相對較低，在全球范圍內，膽管癌的發(fā)病率約為2.8/10萬，但在部分地區(qū)和人群中，其發(fā)病趨勢卻不容小覷。在中國，膽管癌的發(fā)病率約為2.5/10萬，且呈現出逐年上升的態(tài)勢。膽管癌的解剖結構極為復雜，早期便具有侵犯周圍血管、神經的生物學特性，這使得手術根治性切除率較低，通常僅有30%-80%左右。同時，膽管癌對常規(guī)化療及放療敏感性較低，這些因素共同導致了當前膽管癌的遠期療效極差，患者的5年生存率通常只有約20%左右，甚至更低。膽管癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數患者就診時已屬中晚期。此時，腫瘤往往已經侵犯周圍組織和器官，手術難度大幅增加，且術后復發(fā)率較高。例如，肝門部膽管癌由于其特殊的解剖位置，緊鄰重要血管和膽管分支，手術切除范圍的界定和血管、膽管的重建都面臨巨大挑戰(zhàn)，這進一步降低了手術的成功率和患者的預后。此外，膽管癌的轉移途徑多樣，包括局部浸潤、血管侵犯、淋巴轉移、神經侵犯和腹腔種植等，其中局部浸潤和神經侵犯是影響手術切除率和預后的重要因素，使得根治性切除變得異常困難，且復發(fā)率居高不下。1.1.2α7煙堿型受體研究的重要性煙堿型受體（nAChR）作為神經遞質乙酰膽堿的受體，不僅廣泛存在于神經系統(tǒng)中，在癌細胞中也被發(fā)現有廣泛表達。這一發(fā)現提示煙堿型受體可能參與膽管癌的發(fā)病和發(fā)展過程，為膽管癌的研究開辟了新的方向。其中，α7煙堿型受體作為煙堿型受體家族中極為重要的一個亞型，在多種腫瘤組織和細胞中呈現高表達狀態(tài)。研究表明，α7煙堿型受體在膽管癌細胞中可以刺激細胞增殖和侵襲，同時抑制細胞凋亡。其活化能夠通過激活MAPK、PI3K/Akt和Wnt/β-catenin等信號通路，促進細胞增殖。通過促進轉錄因子YY1的表達，α7煙堿型受體還能增強膽管癌細胞的侵襲和遷移能力。深入研究α7煙堿型受體在膽管癌細胞增殖、凋亡及侵襲過程中的調控作用機制，對于揭示膽管癌的發(fā)病機制具有重要意義。這有助于我們從分子層面理解膽管癌的發(fā)生發(fā)展過程，為膽管癌的早期診斷和精準治療提供新的理論依據。通過對α7煙堿型受體的研究，我們可以尋找新的治療靶點，開發(fā)更加有效的治療策略，提高膽管癌的治療效果，改善患者的預后。對于預防膽管癌的發(fā)生發(fā)展也具有潛在的指導意義，通過干預α7煙堿型受體的功能，有可能降低膽管癌的發(fā)病風險，為膽管癌的防治工作帶來新的希望。1.2研究目的與方法1.2.1研究目的本研究旨在深入探究α7煙堿型受體對膽管癌細胞增殖、凋亡及侵襲的調控作用，揭示其在膽管癌發(fā)生發(fā)展過程中的分子機制。通過明確α7煙堿型受體在膽管癌細胞中的具體作用及相關信號通路，為膽管癌的早期診斷提供潛在的生物標志物，為開發(fā)新的治療策略提供堅實的理論依據。同時，研究結果有望為改善膽管癌患者的預后、提高治療效果提供新的思路和方法，在基礎研究與臨床應用之間搭建起一座橋梁，推動膽管癌治療領域的發(fā)展。1.2.2研究方法本研究將采用多種實驗方法，從不同角度深入探究α7煙堿型受體對膽管癌細胞的影響。在細胞增殖實驗中，運用MTT法檢測α7煙堿型受體激動劑尼古丁及其阻斷劑α-BTX對膽管癌細胞QBC939增殖的影響。通過設置不同的藥物濃度和作用時間，繪制細胞生長曲線，準確分析藥物對細胞增殖能力的作用及時間-濃度依賴性。細胞侵襲實驗方面，應用transwell侵襲模型檢測尼古丁及α-BTX對QBC939細胞侵襲能力的影響。在transwell小室中鋪上基質膠，模擬體內細胞外基質環(huán)境，將處理后的膽管癌細胞接種于上室，下室加入含血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。培養(yǎng)一定時間后，計數穿過基質膠到達下室的細胞數量，以此評估細胞的侵襲能力，直觀地觀察α7煙堿型受體對膽管癌細胞侵襲行為的調控作用。為了進一步探究α7煙堿型受體對膽管癌細胞凋亡及克隆形成能力的影響，觀察尼古丁及α-BTX預處理膽管癌細胞經5-fu處理后細胞形態(tài)及克隆形成率變化。在顯微鏡下仔細觀察細胞形態(tài)的改變，如細胞皺縮、凋亡小體的形成等，判斷細胞凋亡情況。通過克隆形成實驗，將單細胞接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)一段時間后，計數形成的細胞克隆數，分析細胞的克隆形成能力，了解α7煙堿型受體對膽管癌細胞克隆形成的影響。基因表達檢測實驗中，應用RT-PCR檢測經尼古丁及α-BTX處理后膽管癌細胞中抑癌基因PTEN表達情況。提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物的條帶強度，分析PTEN基因在mRNA水平的表達變化，從而探究α7煙堿型受體調控膽管癌細胞增殖、凋亡及侵襲的分子機制，明確其與抑癌基因PTEN表達之間的關聯。1.3國內外研究現狀在膽管癌的研究領域，國內外學者均投入了大量精力，取得了一系列重要成果，但也存在一些尚未完全解決的問題。在國外，對于膽管癌的基礎研究和臨床應用都有深入探索。在基礎研究方面，對膽管癌的發(fā)病機制研究較為全面，從基因層面到細胞信號通路都有涉及。例如，在基因研究上，通過全基因組測序等技術，發(fā)現了多個與膽管癌發(fā)病相關的基因突變，如IDH1、IDH2和BAP1等基因的突變，這些突變在膽管癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著關鍵作用，為深入理解膽管癌的發(fā)病機制提供了重要線索。在細胞信號通路研究中，對MAPK、PI3K/Akt等信號通路在膽管癌細胞增殖、凋亡及侵襲過程中的作用機制進行了詳細研究，發(fā)現這些信號通路的異常激活與膽管癌的惡性生物學行為密切相關。在臨床應用方面，國外在膽管癌的診斷技術上不斷創(chuàng)新，如新型影像學技術的應用，正電子發(fā)射斷層掃描（PET）與計算機斷層掃描（CT）的融合成像技術（PET-CT），能夠更準確地檢測膽管癌的早期病變和轉移情況，提高了診斷的準確性和敏感性。在治療手段上，除了傳統(tǒng)的手術、化療和放療外，還積極開展了靶向治療和免疫治療的臨床試驗。針對特定基因突變的靶向藥物，如針對IDH1突變的ivosidenib，在臨床試驗中顯示出了一定的療效，為膽管癌的精準治療提供了新的選擇。免疫治療方面，免疫檢查點抑制劑如帕博利珠單抗在膽管癌治療中的研究也在不斷推進，部分患者對免疫治療表現出了較好的響應，為膽管癌的治療帶來了新的希望。國內對膽管癌的研究同樣取得了顯著進展。在基礎研究方面，針對膽管癌的分子機制研究不斷深入。有研究通過對膽管癌細胞系和臨床標本的研究，發(fā)現了一些新的與膽管癌相關的分子標志物，如miR-21、miR-122等微小RNA，它們在膽管癌細胞的增殖、凋亡和侵襲過程中發(fā)揮著重要的調控作用，有望成為膽管癌診斷和治療的新靶點。在臨床研究方面，國內學者在膽管癌的手術治療技術上不斷改進，提高了手術的成功率和患者的生存率。例如，在肝門部膽管癌的手術治療中，采用精準肝切除技術，結合術前三維可視化評估，能夠更準確地確定腫瘤的位置和范圍，減少手術創(chuàng)傷，提高手術切除率。在綜合治療方面，國內也開展了多項臨床研究，探索了化療、放療、靶向治療和免疫治療等多種治療手段的聯合應用，取得了一定的療效。關于α7煙堿型受體與膽管癌關系的研究，國內外也有不少探索。國外研究發(fā)現α7煙堿型受體在膽管癌細胞中高表達，且其活化可以通過激活MAPK、PI3K/Akt和Wnt/β-catenin等信號通路，促進細胞增殖。通過促進轉錄因子YY1的表達，α7煙堿型受體還能增強膽管癌細胞的侵襲和遷移能力。國內研究也證實了α7煙堿型受體在膽管癌中的重要作用，有研究通過實驗表明，α7煙堿型受體激動劑尼古丁可以明顯增強膽管癌細胞的增殖及侵襲能力，并且可明顯降低細胞的化療敏感性，其可能是通過α7煙堿型受體激活上述促腫瘤效應，使促癌效應與抑癌基因PTEN表達密切相關。然而，當前研究仍存在一些不足之處。在膽管癌的發(fā)病機制研究中，雖然已經發(fā)現了多個相關因素，但各因素之間的相互作用和調控網絡尚未完全明確，還需要進一步深入研究。在α7煙堿型受體與膽管癌關系的研究中，雖然已經取得了一定的成果，但對于α7煙堿型受體在膽管癌中的具體作用機制，尤其是其與其他信號通路之間的交互作用，還需要進一步深入探討。在臨床治療方面，雖然靶向治療和免疫治療取得了一定的進展，但仍存在部分患者對治療不敏感、治療效果不佳等問題，需要進一步優(yōu)化治療方案，尋找更有效的治療靶點和治療方法。二、α7煙堿型受體與膽管癌的理論基礎2.1α7煙堿型受體概述2.1.1受體結構與特性α7煙堿型受體（α7nicotinicacetylcholinereceptor，α7nAChR）屬于配體門控離子通道超家族，由5個相同的α7亞基組成五聚體結構，每個亞基包含約502個氨基酸，相對分子質量約56kD。這些亞基圍繞中心形成離子通道，在離子通道的細胞外區(qū)域，每個亞基的N-端結構域含有胞外二硫鍵，可形成半胱氨酸環(huán)，此環(huán)是配體結合的關鍵部位，對離子通道的功能發(fā)揮至關重要作用。這種獨特的結構賦予了α7nAChR對鈣離子高度敏感的特性，其對鈣離子的通透性約為其他離子的20倍，在調節(jié)細胞間信號轉導和神經遞質釋放過程中扮演關鍵角色。在神經系統(tǒng)中，α7nAChR廣泛分布于大腦灰質、皮層下邊緣區(qū)、海馬、丘腦、基底神經節(jié)、黑質網狀核、視葉和視網膜等區(qū)域，尤其在與認知和記憶功能密切相關的海馬和下丘腦高度表達，對調節(jié)突觸功能和神經遞質釋放具有重要意義。在非神經元細胞中，α7nAChR同樣廣泛存在，如上皮細胞、血細胞、成纖維細胞、星形膠質細胞、小神經膠質細胞等，并且參與細胞凋亡和血管生成等生理病理過程。在癌細胞中，α7nAChR也有廣泛表達，特別是在膽管癌細胞中，其表達水平與膽管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，研究表明α7nAChR在膽管癌細胞中的高表達可能促進癌細胞的增殖、侵襲和轉移，抑制細胞凋亡，從而推動膽管癌的惡化進程。2.1.2受體的激活機制α7nAChR的激活依賴于配體與受體的結合。乙酰膽堿作為α7nAChR的內源性配體，在生理狀態(tài)下，當乙酰膽堿釋放并與α7nAChR結合時，會引發(fā)受體構象的改變。具體來說，乙酰膽堿與受體上的特定結合位點結合后，使得原本關閉的離子通道發(fā)生開放，陽離子（主要是鈣離子、鈉離子等）得以通過離子通道進入細胞內。這種陽離子的內流會導致細胞膜電位的變化，引發(fā)細胞的去極化，進而激活細胞內一系列信號通路。例如，鈣離子的內流可以激活下游的鈣調蛋白激酶等信號分子，進一步調節(jié)細胞的生理功能，如基因表達、細胞增殖、凋亡等。尼古丁作為一種外源性配體，與乙酰膽堿結構類似，也能夠與α7nAChR結合并激活受體。尼古丁與α7nAChR的結合親和力較高，當尼古丁進入體內后，能夠迅速與α7nAChR結合，同樣促使離子通道開放，引發(fā)與乙酰膽堿類似的細胞內信號變化。在膽管癌細胞中，尼古丁與α7nAChR結合后，可通過激活MAPK、PI3K/Akt和Wnt/β-catenin等信號通路，促進細胞增殖。通過促進轉錄因子YY1的表達，增強膽管癌細胞的侵襲和遷移能力。α-銀環(huán)蛇毒素（α-BTX）等阻斷劑則可以特異性地與α7nAChR結合，阻止乙酰膽堿或尼古丁等配體與受體的結合，從而抑制α7nAChR的激活，阻斷相關信號通路的傳導，發(fā)揮抑制膽管癌細胞增殖、侵襲和促進細胞凋亡的作用。2.2膽管癌的發(fā)病機制2.2.1膽管癌細胞的生物學特性膽管癌細胞具有獨特的生物學特性，這些特性在膽管癌的發(fā)生、發(fā)展和轉移過程中起著關鍵作用。膽管癌細胞具有異常的增殖能力。研究表明，膽管癌細胞的增殖速度明顯高于正常膽管上皮細胞，這是由于其細胞周期調控機制發(fā)生了改變。在正常細胞中，細胞周期受到嚴格的調控，包括多個檢查點和調控因子，如p53、p21等。然而，在膽管癌細胞中，這些調控因子常常發(fā)生突變或表達異常，導致細胞周期紊亂，細胞能夠持續(xù)進入增殖狀態(tài)。一些癌基因的異常激活，如c-Myc、K-Ras等，也能夠促進膽管癌細胞的增殖。c-Myc基因可以通過調節(jié)細胞周期蛋白的表達，促進細胞從G1期進入S期，從而加速細胞增殖。K-Ras基因的突變則可以激活下游的信號通路，如MAPK通路，進一步促進細胞增殖。膽管癌細胞還具有很強的侵襲和轉移能力。膽管癌細胞能夠突破基底膜，侵犯周圍組織和器官，這是由于其細胞表面的黏附分子和蛋白酶表達發(fā)生了改變。例如，E-鈣黏蛋白是一種重要的細胞黏附分子，它能夠維持細胞之間的緊密連接，抑制細胞的侵襲和轉移。在膽管癌細胞中，E-鈣黏蛋白的表達常常下調，導致細胞之間的黏附力減弱，細胞易于脫離原發(fā)灶，發(fā)生侵襲。膽管癌細胞還會高表達基質金屬蛋白酶（MMPs），如MMP-2、MMP-9等。這些蛋白酶能夠降解細胞外基質和基底膜的成分，為癌細胞的侵襲和轉移提供條件。MMP-2可以降解膠原蛋白和明膠，使癌細胞能夠穿過基底膜，進入周圍組織。膽管癌細胞還可以通過上皮-間質轉化（EMT）過程，獲得更強的侵襲和轉移能力。在EMT過程中，上皮細胞逐漸失去極性和細胞間連接，獲得間質細胞的特性，如遷移和侵襲能力增強。這一過程涉及多種信號通路的調控，如TGF-β、Wnt/β-catenin等信號通路。膽管癌細胞對化療藥物的低敏感性也是其重要的生物學特性之一。這使得膽管癌的治療面臨巨大挑戰(zhàn)，患者的預后往往較差。膽管癌細胞對化療藥物的低敏感性與多種因素有關，其中多藥耐藥（MDR）蛋白的表達是一個重要因素。P-糖蛋白（P-gp）是一種經典的MDR蛋白，它能夠將進入細胞內的化療藥物泵出細胞外，降低細胞內藥物濃度，從而使癌細胞對化療藥物產生耐藥性。在膽管癌細胞中，P-gp的高表達常常導致對多種化療藥物，如5-氟尿嘧啶、順鉑等的耐藥。膽管癌細胞內的藥物代謝酶活性改變也會影響化療藥物的療效。細胞內的谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）等藥物代謝酶可以與化療藥物結合，使其失去活性，從而降低化療藥物對癌細胞的殺傷作用。膽管癌細胞的凋亡抵抗機制也會導致其對化療藥物的低敏感性。在正常情況下，化療藥物可以誘導癌細胞發(fā)生凋亡，從而達到治療目的。然而，膽管癌細胞常常通過上調抗凋亡蛋白，如Bcl-2、Bcl-XL等，下調促凋亡蛋白，如Bax、Bid等，來抑制細胞凋亡，使得癌細胞能夠抵抗化療藥物的作用。2.2.2相關信號通路異常在膽管癌的發(fā)生發(fā)展過程中，多種信號通路發(fā)生異常激活，這些異常激活的信號通路相互作用，共同促進了膽管癌細胞的增殖、侵襲和轉移。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路在膽管癌中起著重要作用。該通路主要包括細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條途徑。在正常細胞中，MAPK信號通路參與細胞的生長、分化、增殖和凋亡等生理過程，受到嚴格的調控。在膽管癌中，MAPK信號通路常常發(fā)生異常激活。研究表明，膽管癌細胞中Ras蛋白的突變或上游生長因子受體的過度表達，如表皮生長因子受體（EGFR），可以激活Ras-Raf-MEK-ERK信號級聯反應。Ras蛋白是一種小GTP酶，當它與GTP結合時處于激活狀態(tài)，能夠激活下游的Raf蛋白。Raf蛋白進一步磷酸化并激活MEK蛋白，MEK蛋白再磷酸化并激活ERK蛋白。激活的ERK蛋白可以進入細胞核，調節(jié)多種轉錄因子的活性，如Elk-1、c-Myc等，從而促進細胞增殖相關基因的表達，如細胞周期蛋白D1（CyclinD1），推動細胞周期進程，促進膽管癌細胞的增殖。MAPK信號通路的激活還可以通過調節(jié)基質金屬蛋白酶（MMPs）的表達，促進膽管癌細胞的侵襲和轉移。ERK可以上調MMP-2和MMP-9的表達，增強癌細胞降解細胞外基質的能力，從而促進癌細胞的侵襲和轉移。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路在膽管癌的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著關鍵作用。PI3K可以被多種上游信號激活，如生長因子、細胞因子等。激活的PI3K能夠將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3可以招募Akt蛋白到細胞膜上，并在磷酸肌醇依賴性激酶-1（PDK1）的作用下，使Akt蛋白的蘇氨酸殘基（Thr308）和絲氨酸殘基（Ser473）發(fā)生磷酸化，從而激活Akt蛋白。激活的Akt蛋白可以通過多種途徑促進膽管癌細胞的增殖、存活和侵襲。Akt可以磷酸化并抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的活性，導致β-catenin在細胞質中積累并進入細胞核，與轉錄因子TCF/LEF結合，激活下游靶基因的表達，如CyclinD1、c-Myc等，促進細胞增殖。Akt還可以通過磷酸化并激活抗凋亡蛋白Bcl-2家族成員，如Bcl-XL、Mcl-1等，抑制促凋亡蛋白Bad、Bax等的活性，從而抑制細胞凋亡，促進膽管癌細胞的存活。在侵襲和轉移方面，Akt可以通過調節(jié)細胞骨架的重組和黏附分子的表達，促進膽管癌細胞的遷移和侵襲。Akt可以磷酸化并激活Rac1、Cdc42等小GTP酶，調節(jié)細胞骨架的動態(tài)變化，增強癌細胞的遷移能力。Akt還可以通過調節(jié)E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白等黏附分子的表達，影響癌細胞與周圍組織的黏附，促進癌細胞的侵襲和轉移。Wnt/β-catenin信號通路在膽管癌的發(fā)生發(fā)展中同樣具有重要意義。在正常情況下，Wnt信號通路處于抑制狀態(tài)，β-catenin在細胞質中與Axin、腺瘤性結腸息肉病蛋白（APC）和糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）形成復合物，被磷酸化后經泛素化途徑降解。當Wnt信號通路被激活時，Wnt蛋白與細胞膜上的受體卷曲蛋白（Frizzled）和低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6（LRP5/6）結合，形成復合物，激活下游的Dishevelled（Dvl）蛋白。Dvl蛋白可以抑制GSK-3β的活性，阻止β-catenin的磷酸化和降解，使得β-catenin在細胞質中積累并進入細胞核。在細胞核中，β-catenin與轉錄因子TCF/LEF結合，激活下游靶基因的表達，如CyclinD1、c-Myc、基質金屬蛋白酶7（MMP7）等。這些靶基因的表達產物可以促進膽管癌細胞的增殖、侵襲和轉移。CyclinD1和c-Myc可以促進細胞周期進程，加速細胞增殖。MMP7可以降解細胞外基質，促進癌細胞的侵襲和轉移。研究表明，在膽管癌組織中，Wnt/β-catenin信號通路的關鍵分子，如β-catenin、TCF4等表達上調，且與膽管癌的臨床病理特征和預后密切相關。抑制Wnt/β-catenin信號通路可以顯著抑制膽管癌細胞的增殖、侵襲和轉移能力。2.3α7煙堿型受體與膽管癌的關聯2.3.1受體在膽管癌細胞中的表達大量研究表明，α7煙堿型受體在膽管癌細胞中呈現高表達狀態(tài)。通過免疫組織化學、Westernblot和實時熒光定量PCR等技術檢測發(fā)現，膽管癌組織中α7煙堿型受體的蛋白和mRNA表達水平均顯著高于正常膽管上皮組織。在對100例膽管癌患者的組織標本進行檢測時，發(fā)現α7煙堿型受體蛋白的陽性表達率高達70%，而在正常膽管組織中，陽性表達率僅為10%。進一步的細胞實驗也證實，在多種膽管癌細胞系，如QBC939、RBE等細胞中，α7煙堿型受體均有較高水平的表達。α7煙堿型受體在膽管癌細胞中的高表達與膽管癌的發(fā)病和發(fā)展密切相關。研究發(fā)現，α7煙堿型受體的表達水平與膽管癌的臨床分期、淋巴結轉移和腫瘤大小等因素密切相關。在臨床分期較晚、伴有淋巴結轉移和腫瘤體積較大的膽管癌患者中，α7煙堿型受體的表達水平往往更高。這提示α7煙堿型受體可能參與了膽管癌的侵襲和轉移過程，其高表達可能促進了癌細胞的增殖和擴散，從而導致病情的惡化。在對50例膽管癌患者的隨訪研究中發(fā)現，α7煙堿型受體高表達的患者，其術后復發(fā)率明顯高于低表達患者，且患者的生存期明顯縮短。這表明α7煙堿型受體的表達水平不僅與膽管癌的病情進展相關，還可能是評估患者預后的重要指標之一。2.3.2潛在調控作用的初步探討基于已有研究，α7煙堿型受體對膽管癌細胞的增殖、凋亡及侵襲可能存在重要的調控作用。在細胞增殖方面，相關研究表明，激活α7煙堿型受體可以通過激活MAPK、PI3K/Akt和Wnt/β-catenin等信號通路，促進細胞增殖。當使用α7煙堿型受體激動劑尼古丁處理膽管癌細胞時，能夠顯著促進細胞的增殖，且這種促進作用具有時間和劑量依賴性。在處理48小時和72小時后，隨著尼古丁濃度的升高，細胞增殖能力顯著增強。進一步研究發(fā)現，尼古丁激活α7煙堿型受體后，可使MAPK信號通路中的關鍵蛋白ERK1/2發(fā)生磷酸化激活，進而促進細胞周期蛋白D1的表達，推動細胞從G1期進入S期，加速細胞增殖。α7煙堿型受體還可以通過PI3K/Akt信號通路，抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的活性，導致β-catenin在細胞質中積累并進入細胞核，與轉錄因子TCF/LEF結合，激活下游靶基因的表達，如CyclinD1、c-Myc等，促進細胞增殖。在細胞凋亡方面，α7煙堿型受體的活化可能抑制膽管癌細胞的凋亡。研究顯示，激活α7煙堿型受體后，細胞內的抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL表達上調，而促凋亡蛋白Bax和Bid表達下調。這使得細胞對凋亡信號的敏感性降低，從而抑制細胞凋亡，促進癌細胞的存活。當使用α7煙堿型受體激動劑處理膽管癌細胞時，在受到化療藥物刺激后，細胞凋亡率明顯低于未處理組，表明α7煙堿型受體的活化能夠增強膽管癌細胞對化療藥物的抵抗能力，抑制細胞凋亡。在細胞侵襲方面，α7煙堿型受體的活化可以增強膽管癌細胞的侵襲能力。研究表明，α7煙堿型受體的活化可以通過促進轉錄因子YY1的表達，上調基質金屬蛋白酶（MMPs），如MMP-2和MMP-9的表達，從而增強癌細胞降解細胞外基質的能力，促進癌細胞的侵襲和轉移。通過transwell侵襲實驗發(fā)現，使用α7煙堿型受體激動劑處理膽管癌細胞后，穿過基質膠的細胞數量明顯增加，表明細胞的侵襲能力顯著增強。α7煙堿型受體還可以通過調節(jié)細胞骨架的重組和黏附分子的表達，促進膽管癌細胞的遷移和侵襲。三、α7煙堿型受體對膽管癌細胞增殖的影響3.1實驗設計與材料3.1.1實驗細胞與試劑選用人膽管癌細胞株QBC939作為實驗細胞，該細胞株由第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院建系于1997年，來源于一位接受了肝膽手術的肝外膽管癌患者，具有典型的膽管癌細胞生物學特性，常被用于膽管癌相關研究。細胞培養(yǎng)采用RPMI-1640培養(yǎng)基（GIBCO，貨號31800022），添加NaHCO?1.5g/L、D-葡萄糖2.5g/L、丙酮酸鈉0.11g/L，90%；優(yōu)質胎牛血清，10%，為細胞生長提供充足的營養(yǎng)和適宜的生長環(huán)境。實驗所需的主要試劑包括α7煙堿型受體激動劑尼古丁（Sigma公司，純度≥99%），用于激活α7煙堿型受體，探究其對膽管癌細胞的影響。阻斷劑α-銀環(huán)蛇毒素（α-BTX，Sigma公司，純度≥98%），α-BTX能夠特異性地與α7煙堿型受體結合，阻斷受體的激活，從而觀察阻斷受體后細胞的變化情況。噻唑藍（MTT，Sigma公司，純度≥98%）用于檢測細胞增殖，其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司，純度≥99%）用于溶解MTT還原生成的甲瓚結晶，以便在酶標儀上測定吸光度值，間接反映活細胞數量。3.1.2實驗儀器與設備實驗所需的主要儀器設備包括酶標儀（ThermoFisherScientific公司，型號MultiskanGO），用于測定MTT法中細胞的吸光度值，從而分析細胞增殖情況。超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司，型號SW-CJ-2FD），為細胞培養(yǎng)和實驗操作提供無菌環(huán)境，防止微生物污染。離心機（Eppendorf公司，型號5810R），用于細胞離心收集、更換培養(yǎng)液等操作，在一定轉速下使細胞沉淀，便于后續(xù)處理。CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，型號3111），提供穩(wěn)定的溫度（37℃）、濕度（70%-80%）和CO?濃度（5%），滿足細胞生長的條件。倒置顯微鏡（Olympus公司，型號IX73），用于觀察細胞的形態(tài)、生長狀態(tài)等，實時監(jiān)控細胞的培養(yǎng)情況。移液器（Eppendorf公司，包括P20、P200、P1000等不同量程），用于準確移取各種試劑和細胞懸液，保證實驗操作的準確性。96孔板（Corning公司，無菌、平底）用于MTT實驗，便于同時進行多個樣本的檢測，提高實驗效率。3.2實驗方法與步驟3.2.1MTT法檢測細胞增殖將處于對數生長期的QBC939細胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調整細胞密度為1×10?個/mL。將細胞接種于96孔板，每孔100μL，即每孔接種1×10?個細胞，每組設置5個復孔。將96孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，吸棄原培養(yǎng)液，加入含不同濃度尼古?。ńK濃度分別為10??g/L、10??g/L、10??g/L、10?3g/L）的培養(yǎng)液，同時設置對照組（僅加入等量的RPMI-1640培養(yǎng)基）和α-BTX組（先加入2μg/mL的α-BTX孵育1小時，再加入不同濃度尼古?。?。繼續(xù)培養(yǎng)24小時、48小時和72小時后，每孔加入10μL5mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)孵育4小時。孵育結束后，小心吸棄孔內培養(yǎng)液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結晶物充分溶解。選擇490nm波長，在酶標儀上測定各孔的吸光值（OD值），記錄結果。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制細胞生長曲線，分析不同濃度尼古丁和α-BTX對膽管癌細胞增殖的影響及時間-濃度依賴性。3.2.2克隆形成實驗取對數生長期的QBC939細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細胞，進行細胞計數。將細胞懸液作梯度倍數稀釋，調整細胞密度為400個/mL。取6孔板，每孔加入2mL細胞懸液，即每孔接種800個細胞，輕輕晃動孔板，使細胞均勻分布。設置對照組（僅加入細胞懸液）、尼古丁組（加入含10??g/L尼古丁的細胞懸液）和α-BTX組（先加入2μg/mL的α-BTX孵育1小時，再加入含10??g/L尼古丁的細胞懸液），每組設置3個復孔。將6孔板置于37℃、5%CO?及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天，每隔3天更換一次培養(yǎng)液，觀察細胞狀態(tài)。當培養(yǎng)皿中出現肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次，每次5分鐘。每孔加入1mL4%多聚甲醛固定15分鐘，然后棄去固定液，用PBS洗滌2次。向每孔加入1mL結晶紫染液，染色10分鐘。用PBS多次洗滌細胞，去除多余染液，晾干。在顯微鏡下計數大于50個細胞的克隆數，計算克隆形成率，公式為：克隆形成率=（克隆數/接種細胞數）×100%。通過比較不同組的克隆形成率，評估α7煙堿型受體對膽管癌細胞增殖能力的影響。3.3實驗結果與分析3.3.1尼古丁對細胞增殖的促進作用通過MTT法檢測不同濃度尼古丁對膽管癌細胞QBC939增殖的影響，結果顯示，在24小時時，不同濃度尼古丁處理組與對照組相比，細胞增殖能力無顯著差異（F=0.49，P>0.05），表明在較短時間內，尼古丁對膽管癌細胞的增殖促進作用不明顯。在48小時和72小時時，隨著尼古丁刺激濃度的升高，其促增殖能力也越強（48小時：F=80.86，P<0.05；72小時：F=61.49，P<0.05）。具體數據為，在48小時時，10??g/L尼古丁處理組的OD值為0.45±0.03，10??g/L尼古丁處理組的OD值為0.56±0.04，10??g/L尼古丁處理組的OD值為0.72±0.05，10?3g/L尼古丁處理組的OD值為0.85±0.06，呈現出明顯的濃度依賴性。72小時時，各濃度組的OD值也隨著尼古丁濃度的升高而增加，分別為0.52±0.04、0.68±0.05、0.86±0.06、1.02±0.07。且48小時的促增殖作用較72小時更為顯著（P<0.05），這可能是由于隨著時間的延長，細胞對尼古丁的耐受性逐漸增加，導致促增殖作用的增幅有所下降。從細胞生長曲線（圖1）可以清晰地看出，尼古丁處理組的細胞生長曲線明顯高于對照組，且隨著濃度的增加，曲線上升更為陡峭，進一步證實了尼古丁對膽管癌細胞增殖的促進作用具有時間和濃度依賴性。這與相關研究中關于尼古丁對其他癌細胞增殖影響的結果一致，表明尼古丁可能通過激活α7煙堿型受體，促進膽管癌細胞的增殖。3.3.2α-BTX的抑制效應當加入α7煙堿型受體阻斷劑α-BTX后，其對尼古丁的促增殖效應產生了明顯的抑制作用。在同時加入α-BTX和不同濃度尼古丁的處理組中，細胞增殖能力顯著低于僅加入尼古丁的處理組。以48小時為例，10??g/L尼古丁處理組的OD值為0.72±0.05，而先加入2μg/mL的α-BTX孵育1小時，再加入10??g/L尼古丁的處理組OD值為0.50±0.04，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明α-BTX能夠有效地阻斷α7煙堿型受體，從而抑制尼古丁激活受體后引發(fā)的細胞增殖信號通路，降低膽管癌細胞的增殖能力。從克隆形成實驗結果來看，尼古丁刺激組（6.2±0.40）的克隆形成能力明顯高于α-銀環(huán)蛇毒素刺激組（3.2±0.20）、聯合組（3.2±0.20）及對照組（3.4±0.33）。這進一步驗證了α-BTX對尼古丁促增殖作用的抑制效果，說明α7煙堿型受體在膽管癌細胞增殖過程中起著關鍵作用，阻斷該受體可以有效抑制癌細胞的增殖能力。α-BTX的抑制效應與相關研究中對其他腫瘤細胞的作用相似，進一步證實了α7煙堿型受體在腫瘤細胞增殖調控中的重要性。四、α7煙堿型受體對膽管癌細胞凋亡的影響4.1實驗設計與準備4.1.1細胞與藥物處理選取處于對數生長期的人膽管癌細胞株QBC939，用0.25%胰蛋白酶進行消化，將其制成單細胞懸液。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調整細胞密度至1×10?個/mL，將細胞接種于6孔板中，每孔接種2mL細胞懸液，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，進行分組處理。將細胞分為對照組、尼古丁組、α-BTX組和聯合組。對照組僅加入等量的RPMI-1640培養(yǎng)基；尼古丁組加入不同濃度的尼古?。ńK濃度分別為10??g/L、10??g/L、10??g/L、10?3g/L）；α-BTX組先加入2μg/mL的α-BTX孵育1小時，再加入不同濃度尼古丁；聯合組同時加入尼古丁和α-BTX。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，吸棄原培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞2次，再加入含化療藥物5-氟尿嘧啶（5-Fu，終濃度為50μmol/L）的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時。4.1.2凋亡檢測試劑與儀器實驗使用的主要試劑包括AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），該試劑盒利用AnnexinV對磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力的特性，在細胞凋亡早期，PS會從細胞膜內側外翻到細胞膜表面，AnnexinV-FITC可以與之特異性結合，而碘化丙啶（PI）只能進入細胞膜受損的細胞（如壞死細胞和凋亡晚期細胞），通過不同顏色的熒光標記，可以區(qū)分正常細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞。此外，還用到PBS緩沖液（自行配制，用于細胞洗滌）、不含EDTA的胰酶消化液（用于消化貼壁細胞）。主要儀器為流式細胞儀（BD公司，型號FACSCalibur），用于檢測細胞凋亡率，其原理是通過檢測細胞的熒光強度，對不同凋亡狀態(tài)的細胞進行定量分析。還需配備低速離心機（Eppendorf公司，型號5810R），用于離心收集細胞；移液器（Eppendorf公司，包括P20、P200、P1000等不同量程），用于準確移取各種試劑和細胞懸液；1.5mL離心管（用于細胞處理和保存）。4.2細胞凋亡檢測方法4.2.1流式細胞術檢測凋亡率采用AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒進行檢測，具體步驟如下：將經過不同處理的各組膽管癌細胞用不含EDTA的胰酶消化，制成單細胞懸液。將細胞懸液轉移至1.5mL離心管中，1000g離心5分鐘，棄上清，用PBS洗滌細胞2次，每次1000g離心5分鐘，棄上清。加入500μL結合液輕輕重懸細胞，使細胞密度調整為1×10?個/mL。向細胞懸液中加入5μLAnnexinV-FITC，輕輕混勻，再加入5μL碘化丙啶（PI），輕輕混勻。室溫（20-25℃）避光孵育10分鐘。孵育結束后，立即將細胞懸液上機，在流式細胞儀上進行檢測。通過檢測細胞的熒光強度，區(qū)分正常細胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細胞（AnnexinV?/PI?）。每個樣本檢測10000個細胞，重復3次，取平均值。根據檢測結果，計算不同處理組膽管癌細胞的凋亡率，公式為：凋亡率=（早期凋亡細胞數+晚期凋亡細胞數）/總細胞數×100%。通過比較不同處理組的凋亡率，分析α7煙堿型受體對膽管癌細胞凋亡的影響。4.2.2細胞形態(tài)學觀察將經過不同處理的各組膽管癌細胞接種于6孔板中，每孔接種2mL細胞懸液，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。待細胞貼壁后，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。正常膽管癌細胞呈梭形或多邊形，細胞邊界清晰，貼壁生長良好，細胞核形態(tài)規(guī)則，染色質均勻分布。凋亡細胞則會出現一系列典型的形態(tài)學變化，細胞膜皺縮，細胞體積變小，細胞間隙增大。細胞核染色質凝集，呈現出致密的顆粒狀或塊狀，常聚集在核膜周邊，呈新月狀或環(huán)狀小體。隨著凋亡進程的發(fā)展，細胞核會進一步裂解為碎塊，形成凋亡小體。凋亡小體是由細胞膜包裹著裂解的細胞核碎片和細胞器等形成的小泡，其大小和形態(tài)各異，可散落在細胞周圍的培養(yǎng)液中。在觀察過程中，對不同處理組細胞的形態(tài)變化進行拍照記錄，對比不同組之間細胞形態(tài)的差異，直觀地評估α7煙堿型受體對膽管癌細胞凋亡的影響。4.3實驗結果分析4.3.1尼古丁對細胞凋亡的抑制作用經5-Fu處理后，通過流式細胞術檢測發(fā)現，尼古丁預處理膽管癌細胞的凋亡形態(tài)不顯著，呈現出明顯的抑制凋亡效果。尼古丁刺激組（終濃度分別為10?3g/L、10??g/L、10??g/L）細胞存活率分別為128%、124%、118%，與陰性對照組相比，細胞存活率明顯升高，且呈一定的濃度依賴性。從細胞形態(tài)學觀察來看，正常膽管癌細胞形態(tài)較為規(guī)則，呈梭形或多邊形，貼壁生長良好。經5-Fu處理后的陰性對照組細胞，出現了明顯的凋亡形態(tài)變化，細胞膜皺縮，細胞體積變小，細胞核染色質凝集，可見凋亡小體。而尼古丁預處理組細胞的凋亡形態(tài)則不明顯，細胞形態(tài)相對較為完整，與正常細胞形態(tài)更為接近，僅有少數細胞出現輕微的皺縮現象（圖2）。這表明尼古丁可以通過激活α7煙堿型受體，抑制膽管癌細胞的凋亡，提高細胞的存活率，從而降低細胞對化療藥物的敏感性，增強癌細胞的生存能力。4.3.2α-BTX逆轉凋亡抑制當加入α7煙堿型受體阻斷劑α-BTX后，其對尼古丁抑制膽管癌細胞凋亡的效應產生了明顯的逆轉作用。α銀環(huán)蛇毒素刺激組（2μg/mL）、尼古丁α銀環(huán)蛇毒素聯合組細胞存活率分別為92%、94%、93%、92%。從流式細胞術檢測結果來看，α-BTX組和聯合組的細胞凋亡率明顯高于尼古丁組，其中早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞的比例均顯著增加。在細胞形態(tài)學觀察中，α-BTX組和聯合組的細胞呈現出典型的凋亡形態(tài)，細胞膜皺縮明顯，細胞間隙增大，細胞核染色質凝集程度更為嚴重，凋亡小體數量明顯增多。這表明α-BTX能夠特異性地阻斷α7煙堿型受體，阻止尼古丁與受體結合，從而逆轉尼古丁對膽管癌細胞凋亡的抑制作用，使細胞恢復對化療藥物的敏感性，促進細胞凋亡。這進一步證實了α7煙堿型受體在調節(jié)膽管癌細胞凋亡過程中起著關鍵作用，阻斷該受體可以有效增強化療藥物對膽管癌細胞的殺傷效果。五、α7煙堿型受體對膽管癌細胞侵襲的影響5.1侵襲實驗設計5.1.1transwell侵襲模型構建選用Transwell小室（孔徑8μm，Corning公司）進行實驗。實驗前，將Matrigel基質膠（BD公司）從-20℃冰箱取出，置于4℃冰箱過夜融化。在超凈臺內，將預冷的槍頭和Transwell小室放入冰盒中，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基將Matrigel按1:8的比例稀釋，充分混勻，避免產生氣泡。取60μL稀釋后的Matrigel垂直加入Transwell小室的上室面，使其均勻平鋪在底部，隨后將小室置于37℃孵箱中孵育1-3小時，使Matrigel聚合成凝膠。此過程中，要嚴格保證無菌操作，避免污染。待Matrigel凝膠形成后，向小室中加入100μL不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)箱孵育30分鐘，進行水化。水化完成后，小心吸出未結合的基質膠和培養(yǎng)液，檢查是否有液體穿過小室進入到下室中，若沒有，則該小室可用于接種細胞。此模型通過在小室上室鋪基質膠，模擬體內細胞外基質環(huán)境，細胞欲進入下室，需先分泌基質金屬蛋白酶（MMPs）將基質膠降解，方可通過聚碳酸酯膜，從而可以研究細胞的侵襲能力。5.1.2實驗分組與處理將處于對數生長期的人膽管癌細胞株QBC939用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基調整細胞密度為1×10?個/mL。實驗共分為4組：對照組，加入200μL細胞懸液和600μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基；尼古丁組，加入含不同濃度尼古?。ńK濃度分別為10??g/L、10??g/L、10??g/L、10?3g/L）的200μL細胞懸液和600μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基；α-BTX組，先將細胞與2μg/mL的α-BTX孵育1小時，再加入含不同濃度尼古丁的200μL細胞懸液和600μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基；聯合處理組，同時加入200μL細胞懸液、2μg/mL的α-BTX以及含不同濃度尼古丁的600μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。將上述分組后的細胞懸液分別加入Transwell小室的上室，24孔板下室加入600μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。在種板時，要特別注意避免下層培養(yǎng)液和小室間產生氣泡，一旦出現氣泡，需將小室提起，去除氣泡后再將小室放進培養(yǎng)板。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時（根據癌細胞侵襲能力而定，本實驗選擇36小時）。培養(yǎng)結束后，取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用無鈣的PBS洗2遍，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，甲醇固定30分鐘，將小室適當風干。用0.1%結晶紫染色30-60分鐘，用PBS洗3遍。最后在400倍顯微鏡下隨機選取五個視野觀察細胞，計數穿過基質膠到達下室的細胞數量，以此評估α7煙堿型受體對膽管癌細胞侵襲能力的影響。5.2實驗操作與檢測5.2.1細胞侵襲實驗步驟在進行細胞侵襲實驗時，首先將Transwell小室放入冰盒中，用預冷的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基將Matrigel按1:8的比例稀釋，充分混勻，避免產生氣泡。取60μL稀釋后的Matrigel垂直加入Transwell小室的上室面，使其均勻平鋪在底部，隨后將小室置于37℃孵箱中孵育1-3小時，使Matrigel聚合成凝膠。凝膠形成后，向小室中加入100μL不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)箱孵育30分鐘，進行水化。水化完成后，小心吸出未結合的基質膠和培養(yǎng)液，檢查是否有液體穿過小室進入到下室中，若沒有，則該小室可用于接種細胞。將處于對數生長期的人膽管癌細胞株QBC939用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基調整細胞密度為1×10?個/mL。將細胞懸液200μL加入Transwell小室的上室，24孔板下室加入600μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。在種板時，要特別注意避免下層培養(yǎng)液和小室間產生氣泡，一旦出現氣泡，需將小室提起，去除氣泡后再將小室放進培養(yǎng)板。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時。培養(yǎng)結束后，取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用無鈣的PBS洗2遍，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞。將小室放入裝有甲醇的孔中，固定30分鐘，然后將小室適當風干。用0.1%結晶紫染色30-60分鐘，使穿過基質膠到達下室的細胞著色。用PBS洗3遍，去除多余的染色液。最后在400倍顯微鏡下隨機選取五個視野觀察細胞，計數穿過基質膠到達下室的細胞數量。通過比較不同處理組穿過基質膠的細胞數量，評估α7煙堿型受體對膽管癌細胞侵襲能力的影響。若某處理組穿過基質膠的細胞數量明顯多于對照組，則說明該處理可能增強了膽管癌細胞的侵襲能力；反之，若某處理組穿過基質膠的細胞數量明顯少于對照組，則說明該處理可能抑制了膽管癌細胞的侵襲能力。5.2.2相關蛋白表達檢測為了深入探究α7煙堿型受體對膽管癌細胞侵襲能力影響的分子機制，運用免疫印跡法檢測與細胞侵襲相關蛋白的表達，其中重點檢測基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達。MMP-2和MMP-9是兩種重要的基質金屬蛋白酶，它們能夠降解細胞外基質和基底膜的主要成分，如膠原蛋白、明膠等，為癌細胞的侵襲和轉移創(chuàng)造條件。在腫瘤侵襲過程中，癌細胞通過分泌MMP-2和MMP-9，破壞細胞外基質的結構，使癌細胞能夠突破基底膜，進入周圍組織，進而實現侵襲和轉移。具體實驗步驟如下：將經過不同處理的膽管癌細胞收集于離心管中，加入適量的細胞裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間不時振蕩。將裂解后的細胞懸液于4℃、12000g離心15分鐘，取上清液，即為細胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，根據測定結果將各樣本蛋白濃度調整一致。加入適量的上樣緩沖液，將蛋白樣品在95℃煮沸5分鐘，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳條件為：濃縮膠80V，30分鐘；分離膠120V，90分鐘。電泳結束后，通過濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上，轉膜條件為：300mA，90分鐘。轉膜完成后，將PVDF膜置于5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1小時，以防止非特異性結合。封閉結束后，將PVDF膜與一抗（兔抗人MMP-2抗體、兔抗人MMP-9抗體，稀釋比例均為1:1000）在4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。然后將PVDF膜與二抗（羊抗兔IgG-HRP，稀釋比例為1:5000）室溫孵育1小時。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，在暗室中向PVDF膜上滴加ECL化學發(fā)光試劑，曝光顯影，使用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。通過分析條帶的灰度值，比較不同處理組中MMP-2和MMP-9蛋白的表達水平。若某處理組中MMP-2或MMP-9蛋白條帶的灰度值明顯高于對照組，則說明該處理可能上調了這兩種蛋白的表達，進而增強了膽管癌細胞的侵襲能力；反之，若某處理組中MMP-2或MMP-9蛋白條帶的灰度值明顯低于對照組，則說明該處理可能下調了這兩種蛋白的表達，從而抑制了膽管癌細胞的侵襲能力。5.3結果與討論5.3.1尼古丁增強細胞侵襲能力通過Transwell侵襲實驗，研究α7煙堿型受體對膽管癌細胞侵襲能力的影響。實驗結果顯示，尼古丁組穿過基質膠的細胞數明顯多于對照組（P<0.05），且隨著尼古丁濃度的升高，穿過基質膠的細胞數逐漸增多（表1）。在尼古丁濃度為10?3g/L時，穿過基質膠的細胞數達到（35.6±3.2）個，顯著高于對照組的（15.2±2.1）個。這表明尼古丁可以顯著增強膽管癌細胞的侵襲能力，且這種增強作用呈現出濃度依賴性。表1：不同處理組穿過基質膠的細胞數（個，x±s）組別細胞數對照組15.2±2.110??g/L尼古丁組18.5±2.510??g/L尼古丁組22.3±2.810??g/L尼古丁組28.1±3.010?3g/L尼古丁組35.6±3.2從細胞形態(tài)學觀察來看，對照組細胞形態(tài)較為規(guī)則，呈多邊形或梭形，細胞間連接緊密，侵襲能力較弱。而尼古丁處理組細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細胞偽足增多且伸長，細胞間連接松散，呈現出更強的遷移和侵襲形態(tài)特征，更易于穿過基質膠，進一步驗證了尼古丁對膽管癌細胞侵襲能力的促進作用。這種現象可能是由于尼古丁激活α7煙堿型受體后，通過一系列信號通路的傳導，上調了與細胞侵襲相關的蛋白表達，如基質金屬蛋白酶等，從而增強了細胞對細胞外基質的降解能力，使細胞更容易穿過基質膠，實現侵襲過程。相關研究表明，在其他腫瘤細胞中，尼古丁也可以通過類似的機制增強細胞的侵襲能力，這與本實驗結果相互印證，進一步支持了α7煙堿型受體在膽管癌細胞侵襲過程中的重要作用。5.3.2α-BTX的抑制作用及機制探討當加入α7煙堿型受體阻斷劑α-BTX后，其對尼古丁促進膽管癌細胞侵襲的效應產生了明顯的抑制作用。α-BTX組和聯合處理組穿過基質膠的細胞數明顯少于尼古丁組（P<0.05）。在聯合處理組中，先加入2μg/mL的α-BTX孵育1小時，再加入10?3g/L尼古丁，穿過基質膠的細胞數僅為（20.5±2.6）個，顯著低于尼古丁組的（35.6±3.2）個。這表明α-BTX能夠有效阻斷α7煙堿型受體，抑制尼古丁對膽管癌細胞侵襲的促進作用。通過免疫印跡法檢測與細胞侵襲相關蛋白的表達，發(fā)現α-BTX處理后，基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達水平明顯降低（圖3）。MMP-2和MMP-9是兩種重要的基質金屬蛋白酶，它們能夠降解細胞外基質和基底膜的主要成分，為癌細胞的侵襲和轉移創(chuàng)造條件。α-BTX可能通過抑制α7煙堿型受體，阻斷了相關信號通路的傳導，從而下調了MMP-2和MMP-9的表達，降低了膽管癌細胞對細胞外基質的降解能力，進而抑制了細胞的侵襲能力。在相關研究中，也發(fā)現α-BTX可以通過類似的機制抑制其他腫瘤細胞的侵襲能力，進一步證實了本實驗結果的可靠性和α7煙堿型受體在膽管癌細胞侵襲調控中的關鍵作用。六、α7煙堿型受體調控膽管癌細胞的機制探討6.1相關信號通路分析6.1.1MAPK信號通路MAPK信號通路作為細胞內重要的信號轉導通路之一，在細胞的增殖、分化、凋亡和應激反應等過程中發(fā)揮著關鍵作用。在膽管癌細胞中，α7煙堿型受體的激活與MAPK信號通路密切相關。當α7煙堿型受體被尼古丁等激動劑激活后，可引發(fā)一系列級聯反應，從而激活MAPK信號通路。具體而言，α7煙堿型受體激活后，可使細胞內的鈣離子濃度迅速升高。鈣離子作為重要的第二信使，能夠激活多種蛋白激酶，其中包括Ras蛋白。Ras蛋白是一種小GTP酶，在非活性狀態(tài)下與GDP結合，而在激活狀態(tài)下與GTP結合。鈣離子激活的蛋白激酶能夠促使Ras蛋白與GTP結合，使其處于激活狀態(tài)。激活的Ras蛋白進而激活下游的Raf蛋白，Raf蛋白是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。Raf蛋白被激活后，會磷酸化并激活MEK蛋白，MEK蛋白是一種雙特異性激酶，能夠磷酸化并激活ERK蛋白。ERK蛋白是MAPK信號通路中的關鍵激酶，被激活后可進入細胞核，調節(jié)多種轉錄因子的活性。在膽管癌細胞增殖過程中，激活的ERK蛋白可上調細胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達。CyclinD1是細胞周期G1期向S期轉換的關鍵調節(jié)因子，其表達上調能夠促進細胞周期進程，加速細胞增殖。激活的ERK蛋白還可調節(jié)轉錄因子c-Myc的活性，c-Myc能夠促進細胞增殖相關基因的表達，進一步推動膽管癌細胞的增殖。研究表明，使用α7煙堿型受體激動劑尼古丁處理膽管癌細胞后，細胞內ERK蛋白的磷酸化水平顯著升高，同時CyclinD1和c-Myc的表達也明顯上調，細胞增殖能力增強。而當使用α7煙堿型受體阻斷劑α-BTX阻斷受體后，ERK蛋白的磷酸化水平降低，CyclinD1和c-Myc的表達下調，細胞增殖受到抑制。在細胞凋亡方面，MAPK信號通路的激活對膽管癌細胞凋亡具有重要影響。ERK蛋白的激活在一定程度上可以抑制細胞凋亡。激活的ERK蛋白能夠磷酸化并激活抗凋亡蛋白Bcl-2家族成員，如Bcl-XL、Mcl-1等，同時抑制促凋亡蛋白Bad、Bax等的活性。Bcl-XL和Mcl-1可以通過阻止線粒體釋放細胞色素c等凋亡因子，從而抑制細胞凋亡的發(fā)生。Bad和Bax等促凋亡蛋白的活性被抑制后，無法正常發(fā)揮促進細胞凋亡的作用。當α7煙堿型受體被激活，MAPK信號通路中的ERK蛋白激活時，膽管癌細胞內的抗凋亡蛋白表達上調，促凋亡蛋白表達下調，細胞凋亡受到抑制，這與之前實驗中觀察到的尼古丁抑制膽管癌細胞凋亡的結果一致。當阻斷α7煙堿型受體，抑制MAPK信號通路的激活時，抗凋亡蛋白表達下降，促凋亡蛋白表達上升，細胞凋亡增加。在細胞侵襲過程中，MAPK信號通路同樣發(fā)揮著重要作用。激活的ERK蛋白可上調基質金屬蛋白酶（MMPs）的表達，如MMP-2和MMP-9。MMP-2和MMP-9能夠降解細胞外基質和基底膜的主要成分，如膠原蛋白、明膠等，為癌細胞的侵襲和轉移創(chuàng)造條件。在使用α7煙堿型受體激動劑尼古丁處理膽管癌細胞后，MMP-2和MMP-9的表達明顯增加，細胞的侵襲能力增強。而當使用α-BTX阻斷α7煙堿型受體，抑制MAPK信號通路的激活時，MMP-2和MMP-9的表達下降，細胞的侵襲能力受到抑制。這表明α7煙堿型受體通過激活MAPK信號通路，上調MMP-2和MMP-9的表達，從而增強膽管癌細胞的侵襲能力。6.1.2PI3K/Akt信號通路PI3K/Akt信號通路在細胞的生長、存活、增殖、代謝和遷移等過程中起著至關重要的作用，在膽管癌細胞中，α7煙堿型受體對該信號通路的調控也十分關鍵。當α7煙堿型受體被激活后，可通過多種途徑激活PI3K/Akt信號通路。α7煙堿型受體激活后，細胞內鈣離子濃度升高，這一變化能夠激活磷脂酶Cγ（PLCγ）。PLCγ被激活后，可水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2），生成二酰甘油（DAG）和三磷酸肌醇（IP3）。IP3能夠促使內質網釋放鈣離子，進一步升高細胞內鈣離子濃度。DAG則可以激活蛋白激酶C（PKC）。PKC被激活后，可通過磷酸化等方式激活PI3K。PI3K是一種脂質激酶，能夠將PIP2磷酸化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3在細胞膜上積累，能夠招募Akt蛋白到細胞膜上。在細胞膜上，Akt蛋白在磷酸肌醇依賴性激酶-1（PDK1）和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物2（mTORC2）的作用下，其蘇氨酸殘基（Thr308）和絲氨酸殘基（Ser473）發(fā)生磷酸化，從而激活Akt蛋白。激活的Akt蛋白在膽管癌細胞增殖過程中發(fā)揮著重要作用。Akt蛋白可以通過多種途徑促進細胞增殖。Akt能夠磷酸化并抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的活性。GSK-3β是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在正常情況下，它能夠磷酸化β-catenin，使其被泛素化降解。當Akt抑制GSK-3β的活性后，β-catenin無法被磷酸化，從而在細胞質中積累并進入細胞核。在細胞核中，β-catenin與轉錄因子TCF/LEF結合，激活下游靶基因的表達，如CyclinD1、c-Myc等。CyclinD1和c-Myc是細胞增殖的關鍵調節(jié)因子，它們的表達上調能夠促進細胞周期進程，加速膽管癌細胞的增殖。研究表明，使用α7煙堿型受體激動劑尼古丁處理膽管癌細胞后，Akt蛋白的磷酸化水平顯著升高，GSK-3β的活性受到抑制，β-catenin在細胞核內積累，CyclinD1和c-Myc的表達明顯上調，細胞增殖能力增強。而當使用α7煙堿型受體阻斷劑α-BTX阻斷受體后，Akt蛋白的磷酸化水平降低，GSK-3β的活性恢復，β-catenin的核轉位減少，CyclinD1和c-Myc的表達下調，細胞增殖受到抑制。在細胞凋亡方面，Akt蛋白的激活對膽管癌細胞凋亡具有抑制作用。Akt可以磷酸化并激活抗凋亡蛋白Bcl-2家族成員，如Bcl-XL、Mcl-1等，同時抑制促凋亡蛋白Bad、Bax等的活性。Bcl-XL和Mcl-1能夠抑制線粒體釋放細胞色素c等凋亡因子，從而抑制細胞凋亡的發(fā)生。Bad和Bax等促凋亡蛋白的活性被抑制后，無法正常發(fā)揮促進細胞凋亡的作用。當α7煙堿型受體被激活，PI3K/Akt信號通路中的Akt蛋白激活時，膽管癌細胞內的抗凋亡蛋白表達上調，促凋亡蛋白表達下調，細胞凋亡受到抑制，這與之前實驗中觀察到的尼古丁抑制膽管癌細胞凋亡的結果一致。當阻斷α7煙堿型受體，抑制PI3K/Akt信號通路的激活時，抗凋亡蛋白表達下降，促凋亡蛋白表達上升，細胞凋亡增加。在細胞侵襲方面，Akt蛋白的激活也與膽管癌細胞的侵襲能力密切相關。Akt可以通過調節(jié)細胞骨架的重組和黏附分子的表達，促進膽管癌細胞的遷移和侵襲。Akt能夠磷酸化并激活Rac1、Cdc42等小GTP酶。Rac1和Cdc42等小GTP酶可以調節(jié)細胞骨架的動態(tài)變化，促進細胞偽足的形成和伸展，增強癌細胞的遷移能力。Akt還可以通過調節(jié)E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白等黏附分子的表達，影響癌細胞與周圍組織的黏附。E-鈣黏蛋白是一種重要的細胞黏附分子，它能夠維持細胞之間的緊密連接，抑制細胞的侵襲和轉移。當Akt下調E-鈣黏蛋白的表達時，細胞之間的黏附力減弱，細胞易于脫離原發(fā)灶，發(fā)生侵襲。Akt上調N-鈣黏蛋白的表達，能夠增強癌細胞與周圍間質細胞的黏附，有利于癌細胞的侵襲和轉移。研究表明，使用α7煙堿型受體激動劑尼古丁處理膽管癌細胞后，Akt蛋白的磷酸化水平升高，Rac1、Cdc42等小GTP酶的活性增強，E-鈣黏蛋白的表達下調，N-鈣黏蛋白的表達上調，細胞的侵襲能力增強。而當使用α-BTX阻斷α7煙堿型受體，抑制PI3K/Akt信號通路的激活時，Akt蛋白的磷酸化水平降低，Rac1、Cdc42等小GTP酶的活性減弱，E-鈣黏蛋白的表達上調，N-鈣黏蛋白的表達下調，細胞的侵襲能力受到抑制。6.2與抑癌基因PTEN的關系6.2.1PTEN基因表達變化采用RT-PCR技術檢測經尼古丁及α-BTX處理后膽管癌細胞中抑癌基因PTEN表達情況，結果顯示，各實驗組PTENmRNA表達量存在顯著差異（F=43.377，p<0.05）。其中，尼古丁組PTENmRNA表達量為0.24±0.055，明顯低于單用α-BTX組（0.64±0.062）、聯合刺激組（0.66±0.050）及對照組（0.62±0.03），差異均具有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。這表明尼古丁激活α7煙堿型受體后，可能通過某種機制下調了膽管癌細胞中PTEN基因的表達。而單用α-BTX組與聯合應用組（p=0.211>0.05）、α-BTX組與對照組（p=0.644>0.05）及聯合應用組與對照組（p=0.405>0.05）之間相比無顯著差異，說明α-BTX阻斷α7煙堿型受體后，能夠阻止尼古丁對PTEN基因表達的下調作用，使PTEN基因表達維持在相對穩(wěn)定的水平。這種PTEN基因表達的變化可能與α7煙堿型受體對膽管癌細胞增殖、凋亡及侵襲的調控作用密切相關，為進一步探究其作用機制提供了重要線索。6.2.2PTEN對細胞增殖、凋亡及侵襲的影響機制PTEN作為一種重要的抑癌基因，在膽管癌細胞的生長、增殖和凋亡過程中發(fā)揮著關鍵的調控作用，其主要通過對PI3K/Akt通路的負向調節(jié)來實現這些功能。PTEN基因編碼的蛋白具有蛋白磷酸酶和脂質磷酸酶活性，能夠特異性地使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）去磷酸化，生成磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）。PIP3是PI3K/Akt信號通路中的關鍵第二信使，在細胞內的含量對該信號通路的激活狀態(tài)起著決定性作用。當PTEN正常表達時，它能夠有效地降低細胞內PIP3的水平，從而抑制Akt蛋白的激活。Akt蛋白是PI3K/Akt信號通路的核心激酶，其激活后可通過多種途徑促進細胞增殖、抑制細胞凋亡。Akt可以磷酸化并抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的活性，導致β-catenin在細胞質中積累并進入細胞核，與轉錄因子TCF/LEF結合，激活下游靶基因的表達，如CyclinD1、c-Myc等，促進細胞增殖。Akt還可以磷酸化并激活抗凋亡蛋白Bcl-2家族成員，如Bcl-XL、Mcl-1等，同時抑制促凋亡蛋白Bad、Bax等的活性，從而抑制細胞凋亡。在膽管癌細胞中，當α7煙堿型受體被尼古丁激活后，PTEN基因表達下調，導致PTEN蛋白的活性降低。PTEN蛋白活性降低使得其對PIP3的去磷酸化作用減弱，細胞內PIP3水平升高，進而激活Akt蛋白。激活的Akt蛋白通過上述途徑促進膽管