京海黃雞柔嫩艾美耳球蟲感染的盲腸轉錄組解析與雜交配套系親本抗性評估一、引言1.1研究背景與意義雞球蟲病是一種由艾美耳球蟲引起的常見且危害嚴重的腸道寄生蟲病，呈世界范圍內流行，在集約化養(yǎng)殖場內該病的發(fā)病率能夠達到50%，死亡率為25%左右。據統(tǒng)計，全球家禽業(yè)每年因球蟲病損失約20億英鎊，美國每年因該病給養(yǎng)雞業(yè)造成2億美元的損失。在中國，某些地方雞球蟲病發(fā)病率高達100%。雞球蟲病主要感染雞的腸道，不同種類的艾美耳球蟲寄生部位有所不同，其中柔嫩艾美耳球蟲主要寄生于盲腸，可引發(fā)盲腸球蟲病，常見于小雞，多為急性暴發(fā)，病雞會突然排出大量血液，反應遲鈍，閉目呆立，冠鬢蒼白、衰竭，甚至猝死，剖檢可見盲腸比正常腫大數(shù)倍、腸腔內充滿大量的血液，病程稍長時可見盲腸內有暗紅色干酪裝物。京海黃雞作為我國自主培育的優(yōu)質肉雞品種，具有肉質鮮美、抗逆性強等優(yōu)點，在我國肉雞養(yǎng)殖中占據重要地位。然而，在京海黃雞的養(yǎng)殖過程中，雞球蟲病的發(fā)生較為普遍，嚴重影響了其生長性能、飼料轉化率和養(yǎng)殖效益。感染球蟲病的京海黃雞消化機能發(fā)生障礙，無法正常吸收營養(yǎng)物質，導致機體抵抗力下降，生長發(fā)育緩慢，部分雞甚至發(fā)病死亡，使得養(yǎng)殖肉雞的飼料報酬降低；腸道黏膜嚴重受損，球蟲卵囊在腸道內消耗大量氧氣，為厭氧菌和一些腸道病毒提供了侵入機會，容易誘發(fā)腸毒綜合征；還會影響機體腸道黏膜屏障的機能，打破腸道黏膜屏障，球蟲卵囊充分吸收機體營養(yǎng)物質，使其失去腸道平衡，同時易引起肉雞的免疫抑制，如在接種疫苗時容易誘發(fā)呼吸道疾病和病毒性疾病，并增大了肉雞大腸桿菌、沙門氏菌、新城疫等疾病的發(fā)病機率。轉錄組分析能夠從整體水平研究基因表達，揭示生物體在特定生理或病理狀態(tài)下的基因表達變化和調控網絡。通過對京海黃雞柔嫩艾美耳球蟲感染后盲腸進行轉錄組分析，可以全面了解感染過程中基因的差異表達情況，深入探究宿主與球蟲之間的互作關系，挖掘與球蟲病抗性相關的關鍵基因和信號通路，為進一步研究雞抵御球蟲感染的分子機制提供理論依據。對京海黃雞雜交配套系親本進行抗性評價，篩選出具有高球蟲病抗性的親本，對于培育抗病力強的京海黃雞新品種（系），從根本上解決球蟲病對京海黃雞養(yǎng)殖的危害，實現(xiàn)無公害生產具有重要意義。這不僅有助于減少藥物使用，降低藥物殘留和環(huán)境污染，還能提高京海黃雞的養(yǎng)殖效益和產品質量，保障肉雞產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。1.2國內外研究現(xiàn)狀1.2.1雞球蟲病的研究現(xiàn)狀雞球蟲病作為全球性分布的寄生蟲病，一直是家禽養(yǎng)殖領域的研究熱點。目前，已明確能感染雞的艾美耳球蟲有7種，不同蟲種在寄生部位和致病性上存在顯著差異。其中，柔嫩艾美耳球蟲主要寄生于盲腸，引發(fā)的盲腸球蟲病對雛雞危害極大，常導致急性暴發(fā)，病雞出現(xiàn)血便、衰竭甚至猝死等癥狀，給養(yǎng)雞業(yè)帶來沉重打擊。在防治手段方面，藥物防治和免疫防治是主要策略?？骨蛳x藥物種類豐富，包括離子載體類和化學合成類等。離子載體類藥物如拉沙里菌素、鹽霉素等，通過干擾蟲體細胞膜離子轉運發(fā)揮抗蟲作用，應用廣泛；化學合成類藥物如地克珠利、磺胺類等，作用機制多樣，但部分藥物因存在藥物殘留和耐藥性問題，使用受到限制。在臨床應用中，需根據雞的生長階段和球蟲種類合理選擇藥物，且為避免耐藥性，常采用多種藥物交替使用的方式。免疫防治方面，雞球蟲疫苗的研發(fā)取得了一定進展。從早期的活卵囊疫苗到后來的致弱蟲株疫苗，再到如今的核酸疫苗和亞單位疫苗研究，疫苗的安全性和有效性不斷提升。例如，我國已成功研制出雞胚傳代致弱蟲苗和多種早熟致弱株，并進行了免疫試驗，取得了較好的免疫保護效果。然而，現(xiàn)有疫苗仍存在一些不足，如免疫效果不穩(wěn)定、毒力返強等問題，有待進一步解決。1.2.2京海黃雞抗球蟲研究現(xiàn)狀京海黃雞作為我國自主培育的優(yōu)質肉雞品種，其抗球蟲研究也逐漸受到關注。已有研究通過對京海黃雞進行柔嫩艾美耳球蟲攻毒試驗，篩選出了一些與球蟲病抗性相關的指標。孫明明等學者將京海黃雞分為感染組和非感染對照組，感染組雛雞灌飼柔嫩艾美耳球蟲卵囊后，測定10個球蟲抗性血液指標，發(fā)現(xiàn)感染后3-5天內的體增重，以及CAT、GSH-Px、MDA、SOD4種抗氧化酶和IFN-γ細胞因子在血漿中的濃度可作為雞球蟲抗性評價指標。尉浩華等人以京海黃雞為試驗素材，將攻毒后的雞群體分成抗性組和易感組，與非攻毒對照組比較分析10個抗性指標，結果顯示NO、CAT、SOD和IFN-γ可以作為抗性指標用于雞柔嫩艾美爾球蟲病抗性評價和選育研究。這些研究為京海黃雞抗球蟲育種提供了一定的理論基礎，但目前對于京海黃雞抗球蟲的分子機制研究仍相對較少，有待深入探索。1.2.3轉錄組技術在雞球蟲病研究中的應用現(xiàn)狀轉錄組技術作為一種高通量的基因表達分析技術，近年來在雞球蟲病研究中得到了廣泛應用。通過對感染球蟲后的雞組織進行轉錄組測序分析，可以全面了解宿主基因的表達變化，挖掘與球蟲感染、免疫應答相關的關鍵基因和信號通路。例如，有研究對感染混合球蟲卵囊的肉雞進行轉錄組分析，發(fā)現(xiàn)了一系列差異表達基因，這些基因參與了免疫調節(jié)、細胞凋亡、能量代謝等多個生物學過程，為深入理解宿主與球蟲之間的互作機制提供了重要線索。上海獸醫(yī)研究所動物寄生蟲與生物媒介控制團隊利用轉錄組學聯(lián)合代謝組學分析了球蟲對馬杜拉霉素產生耐藥的關鍵途徑，揭示了球蟲對馬杜拉霉素產生耐藥性的潛在機制，發(fā)現(xiàn)耐藥株在糖代謝和氨基酸代謝方面與敏感株存在顯著差異。然而，目前針對京海黃雞柔嫩艾美耳球蟲感染后盲腸轉錄組的研究還較為缺乏，無法全面深入地解析京海黃雞抗球蟲的分子機制。綜上所述，目前雞球蟲病的研究在防治手段和發(fā)病機制方面取得了一定成果，但仍存在藥物耐藥性、疫苗不完善等問題。京海黃雞抗球蟲研究雖有初步進展，但分子機制研究不足。轉錄組技術在雞球蟲病研究中有應用，但針對京海黃雞的相關研究較少。因此，本研究擬通過對京海黃雞柔嫩艾美耳球蟲感染后盲腸進行轉錄組分析，結合雜交配套系親本的抗性評價，深入探究京海黃雞抗球蟲的分子機制，為培育抗球蟲京海黃雞新品種提供理論依據和技術支持。1.3研究目標與內容1.3.1研究目標本研究旨在通過對京海黃雞柔嫩艾美耳球蟲感染后盲腸進行轉錄組分析，深入探究京海黃雞感染球蟲后的分子應答機制，挖掘與球蟲病抗性相關的關鍵基因和信號通路。同時，對京海黃雞雜交配套系親本進行抗性評價，篩選出具有高球蟲病抗性的親本，為培育抗球蟲京海黃雞新品種提供理論依據和技術支持。具體目標如下：轉錄組分析：利用高通量測序技術對感染柔嫩艾美耳球蟲的京海黃雞盲腸組織進行轉錄組測序，篩選出差異表達基因，并對其進行功能注釋和富集分析，明確其參與的生物學過程和信號通路，為揭示京海黃雞抗球蟲的分子機制提供數(shù)據基礎?？剐栽u價：通過攻毒試驗，對京海黃雞雜交配套系親本進行球蟲病抗性評價，建立科學合理的抗性評價指標體系，篩選出具有高球蟲病抗性的親本，為后續(xù)的雜交育種提供優(yōu)質素材。分子機制解析：結合轉錄組分析和抗性評價結果，深入解析京海黃雞抗球蟲的分子機制，挖掘關鍵基因和信號通路在抗球蟲過程中的作用，為培育抗球蟲京海黃雞新品種提供理論依據。1.3.2研究內容為實現(xiàn)上述研究目標，本研究將開展以下具體內容的研究：京海黃雞柔嫩艾美耳球蟲感染模型的建立：選取健康的京海黃雞雛雞，隨機分為感染組和對照組。感染組雛雞經口灌飼一定劑量的柔嫩艾美耳球蟲卵囊，對照組給予等量的生理鹽水。攻毒后，觀察雛雞的臨床癥狀，定期采集糞便檢測卵囊排出情況，解剖觀察盲腸病變程度，確定感染模型是否成功建立。盲腸轉錄組測序及數(shù)據分析：在感染后的特定時間點，采集感染組和對照組京海黃雞的盲腸組織，提取總RNA，進行轉錄組測序。對測序數(shù)據進行質量控制和拼接組裝，篩選出差異表達基因。利用生物信息學工具對差異表達基因進行功能注釋，包括GO（GeneOntology）功能富集分析和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）信號通路富集分析，明確差異表達基因參與的生物學過程和信號通路。差異表達基因的驗證：采用實時熒光定量PCR技術對轉錄組測序篩選出的部分差異表達基因進行驗證，分析其在感染組和對照組中的表達水平變化，確保轉錄組測序結果的可靠性。京海黃雞雜交配套系親本的抗性評價：選取京海黃雞雜交配套系的不同親本，進行柔嫩艾美耳球蟲攻毒試驗。攻毒后，觀察親本的臨床癥狀、體增重變化、糞便卵囊排出情況、盲腸病變積分等指標，綜合評價親本的球蟲病抗性。同時，測定親本血液中的抗氧化酶活性、細胞因子含量等相關指標，分析其與球蟲病抗性的相關性，建立科學合理的抗性評價指標體系?？骨蛳x關鍵基因和信號通路的挖掘：結合轉錄組分析和抗性評價結果，篩選出與京海黃雞球蟲病抗性密切相關的關鍵基因和信號通路。對關鍵基因進行進一步的功能研究，探討其在抗球蟲過程中的作用機制，為培育抗球蟲京海黃雞新品種提供分子靶點。1.4研究方法與技術路線1.4.1試驗設計京海黃雞柔嫩艾美耳球蟲感染模型建立試驗：選取1日齡健康京海黃雞雛雞100只，隨機分為感染組和對照組，每組50只。感染組雛雞在14日齡時經口灌飼2.5×10?個柔嫩艾美耳球蟲卵囊，對照組給予等量的生理鹽水。攻毒后，每天觀察雛雞的精神狀態(tài)、采食情況、糞便性狀等臨床癥狀，記錄死亡情況。分別在攻毒后第3天、5天、7天、9天、11天采集糞便，采用飽和鹽水漂浮法檢測糞便中卵囊排出情況，計算每克糞便中的卵囊數(shù)（OPG）。在攻毒后第7天，每組隨機選取10只雛雞進行解剖，觀察盲腸病變程度，按照盲腸病變計分標準進行評分（0分：無病變；1分：盲腸輕微腫脹，黏膜有少量出血點；2分：盲腸明顯腫脹，黏膜有較多出血點；3分：盲腸高度腫脹，腸腔內有血凝塊；4分：盲腸嚴重出血、壞死）。京海黃雞雜交配套系親本抗性評價試驗：選取京海黃雞雜交配套系的不同親本，包括父本A、父本B、母本C、母本D，每個親本選取30只14日齡雛雞。對每個親本的雛雞分別進行柔嫩艾美耳球蟲攻毒試驗，攻毒劑量同感染模型建立試驗。攻毒后，觀察雛雞的臨床癥狀，記錄每天的體增重變化。在攻毒后第3天、5天、7天、9天、11天采集糞便，檢測卵囊排出情況。攻毒后第7天，解剖雛雞，觀察盲腸病變程度并計分。同時，采集血液樣本，測定血清中抗氧化酶（如過氧化氫酶CAT、超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽-過氧化物酶GSH-Px）活性和細胞因子（如干擾素IFN-γ、白細胞介素IL-2等）含量。1.4.2樣本采集與處理盲腸組織樣本采集：在感染模型建立試驗中，于攻毒后第7天，每組隨機選取5只雛雞，迅速采集盲腸組織，用預冷的生理鹽水沖洗干凈，去除表面的糞便和黏液，濾紙吸干水分后，將盲腸組織剪成約1cm3的小塊，放入液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存，用于后續(xù)的轉錄組測序和實時熒光定量PCR驗證。血液樣本采集：在京海黃雞雜交配套系親本抗性評價試驗中，于攻毒前和攻毒后第3天、5天、7天、9天、11天，分別采集每只雛雞的翅靜脈血2mL，置于含有抗凝劑的離心管中，輕輕顛倒混勻，3000r/min離心10min，分離血清，轉移至新的離心管中，-20℃保存，用于抗氧化酶活性和細胞因子含量的測定。1.4.3轉錄組測序分析總RNA提?。菏褂肨RIzol試劑提取盲腸組織中的總RNA，具體操作按照試劑說明書進行。提取后的RNA用NanoDrop2000超微量分光光度計檢測濃度和純度，要求OD???/OD???比值在1.8-2.0之間，OD???/OD???比值大于2.0。用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，28SrRNA和18SrRNA條帶清晰，且28SrRNA亮度約為18SrRNA的2倍。文庫構建與測序：將合格的總RNA樣品送交給專業(yè)的測序公司進行文庫構建和測序。文庫構建采用IlluminaTruSeqRNASamplePreparationKit，測序平臺為IlluminaHiSeq2500，測序模式為雙端測序（Paired-End），測序讀長為150bp。數(shù)據分析：對測序得到的原始數(shù)據進行質量控制，去除低質量reads（堿基質量值Q低于20的比例超過50%）、接頭序列和含N比例超過10%的reads。使用Trinity軟件對高質量reads進行拼接組裝，得到轉錄本序列。將組裝得到的轉錄本與參考基因組進行比對，使用Bowtie2軟件進行比對，比對率要求達到70%以上。通過StringTie軟件計算每個轉錄本的表達量，采用FPKM（FragmentsPerKilobaseofexonperMillionreadsmapped）法進行標準化。篩選出差異表達基因，差異表達基因的篩選標準為|log?(FoldChange)|≥1且FDR（FalseDiscoveryRate）＜0.05。利用DAVID數(shù)據庫對差異表達基因進行GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。1.4.4抗性評價指標測定臨床癥狀觀察：每天觀察雛雞的精神狀態(tài)、采食情況、糞便性狀、羽毛光澤等，記錄是否出現(xiàn)血便、腹瀉、消瘦、精神萎靡等癥狀，按照癥狀的嚴重程度進行評分（0分：無明顯癥狀；1分：輕微癥狀，如采食略減少、糞便稍??；2分：中度癥狀，如血便、精神不振；3分：重度癥狀，如極度消瘦、瀕死狀態(tài)）。體增重測定：在攻毒前和攻毒后每天同一時間，使用電子天平稱量雛雞體重，計算攻毒后不同時間段的體增重（體增重=攻毒后體重-攻毒前體重），并計算相對體增重（相對體增重=（攻毒組體增重-對照組體增重）/對照組體增重×100%）。糞便卵囊計數(shù)：采用飽和鹽水漂浮法檢測糞便中卵囊排出情況。準確稱取1g糞便，加入10mL飽和鹽水，充分攪拌均勻，用4層紗布過濾到離心管中，3000r/min離心10min，棄去上清液，保留沉淀。再加入10mL飽和鹽水，混勻后吸取上清液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下（10×10倍）計數(shù)卵囊數(shù)，計算每克糞便中的卵囊數(shù)（OPG）。盲腸病變積分：解剖雛雞后，取出盲腸，觀察盲腸的腫脹程度、黏膜出血情況、腸腔內是否有血凝塊等，按照盲腸病變計分標準進行評分（0分：無病變；1分：盲腸輕微腫脹，黏膜有少量出血點；2分：盲腸明顯腫脹，黏膜有較多出血點；3分：盲腸高度腫脹，腸腔內有血凝塊；4分：盲腸嚴重出血、壞死）?？寡趸富钚詼y定：采用相應的試劑盒測定血清中CAT、SOD、GSH-Px的活性，具體操作按照試劑盒說明書進行。以單位體積血清中酶催化底物反應的速率來表示酶活性，如CAT活性以每分鐘每毫升血清分解過氧化氫的微摩爾數(shù)表示（μmol/min/mL），SOD活性以抑制超氧陰離子自由基50%時所需的血清量來表示（U/mL），GSH-Px活性以每分鐘每毫克蛋白催化谷胱甘肽氧化的微摩爾數(shù)表示（μmol/min/mgprot）。細胞因子含量測定：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒測定血清中IFN-γ、IL-2等細胞因子的含量，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。根據標準曲線計算樣品中細胞因子的濃度，單位為pg/mL。1.4.5統(tǒng)計分析使用SPSS22.0軟件對試驗數(shù)據進行統(tǒng)計分析。對于計量資料，如體增重、抗氧化酶活性、細胞因子含量等，先進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，若滿足正態(tài)分布和方差齊性，采用單因素方差分析（One-WayANOVA）進行組間差異比較，若不滿足則采用非參數(shù)檢驗。對于計數(shù)資料，如盲腸病變積分、臨床癥狀評分等，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗進行組間差異比較。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。使用GraphPadPrism8.0軟件繪制圖表，直觀展示試驗結果。本研究的技術路線如圖1-1所示：[此處插入技術路線圖，圖中清晰展示從試驗設計、樣本采集處理、轉錄組測序分析、抗性評價指標測定到統(tǒng)計分析的整個流程，各步驟之間用箭頭連接，注明關鍵操作和檢測指標]圖1-1技術路線圖二、京海黃雞感染柔嫩艾美耳球蟲后盲腸轉錄組差異基因功能和通路分析2.1材料與方法2.1.1試驗動物選取1日齡健康京海黃雞雛雞100只，購自江蘇京海禽業(yè)集團有限公司。雛雞飼養(yǎng)于隔離網籠中，自由采食和飲水，飼料為不含任何抗球蟲藥物的全價配合飼料。飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在30-32℃，相對濕度保持在60%-70%，并定期進行通風換氣，保持飼養(yǎng)環(huán)境的清潔衛(wèi)生。2.1.2病原來源柔嫩艾美耳球蟲卵囊由揚州大學獸醫(yī)學院寄生蟲實驗室提供。將保存的卵囊接種于14日齡無球蟲感染的健康雛雞，待雛雞糞便中出現(xiàn)大量卵囊后，收集糞便，采用飽和鹽水漂浮法分離卵囊，并用2.5%重鉻酸鉀溶液在28℃恒溫培養(yǎng)箱中進行孢子化處理，備用。2.1.3試驗分組將100只京海黃雞雛雞隨機分為感染組和對照組，每組50只。感染組雛雞在14日齡時經口灌飼2.5×10?個柔嫩艾美耳球蟲卵囊，對照組給予等量的生理鹽水。攻毒后，兩組雛雞繼續(xù)在相同條件下飼養(yǎng)。每天觀察雛雞的精神狀態(tài)、采食情況、糞便性狀等臨床癥狀，記錄死亡情況。2.1.4總RNA提取在攻毒后第7天，每組隨機選取5只雛雞，迅速采集盲腸組織，用預冷的生理鹽水沖洗干凈，去除表面的糞便和黏液，濾紙吸干水分后，將盲腸組織剪成約1cm3的小塊，放入液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存，用于后續(xù)的總RNA提取。使用TRIzol試劑提取盲腸組織中的總RNA，具體操作按照試劑說明書進行。提取后的RNA用NanoDrop2000超微量分光光度計檢測濃度和純度，要求OD???/OD???比值在1.8-2.0之間，OD???/OD???比值大于2.0。用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，28SrRNA和18SrRNA條帶清晰，且28SrRNA亮度約為18SrRNA的2倍。2.1.5文庫構建與轉錄組測序將合格的總RNA樣品送交給北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行文庫構建和測序。文庫構建采用IlluminaTruSeqRNASamplePreparationKit，具體步驟如下：首先，利用Oligo(dT)磁珠富集真核生物mRNA，然后將mRNA進行片段化處理，以片段化的mRNA為模板，在逆轉錄酶的作用下合成cDNA第一鏈，再合成cDNA第二鏈。接著對cDNA進行末端修復、加A尾、連接測序接頭，通過PCR擴增構建成測序文庫。測序平臺為IlluminaHiSeq2500，測序模式為雙端測序（Paired-End），測序讀長為150bp。2.1.6原始數(shù)據處理對測序得到的原始數(shù)據進行質量控制，去除低質量reads（堿基質量值Q低于20的比例超過50%）、接頭序列和含N比例超過10%的reads。使用FastQC軟件對原始數(shù)據進行質量評估，包括堿基質量分布、GC含量、序列重復率等指標。利用Trimmomatic軟件進行數(shù)據過濾，得到高質量的cleanreads。2.1.7差異表達基因篩選使用Hisat2軟件將cleanreads比對到雞的參考基因組（Gallus_gallus-5.0）上，比對率要求達到70%以上。通過StringTie軟件計算每個轉錄本的表達量，采用FPKM（FragmentsPerKilobaseofexonperMillionreadsmapped）法進行標準化。篩選出差異表達基因，差異表達基因的篩選標準為|log?(FoldChange)|≥1且FDR（FalseDiscoveryRate）＜0.05。2.1.8GO和KEGG分析利用DAVID數(shù)據庫對差異表達基因進行GO（GeneOntology）功能富集分析和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）信號通路富集分析。GO功能富集分析從生物學過程（BiologicalProcess，BP）、細胞組分（CellularComponent，CC）和分子功能（MolecularFunction，MF）三個層面進行注釋，分析差異表達基因參與的生物學過程、所處的細胞位置以及具有的分子功能。KEGG信號通路富集分析主要是確定差異表達基因參與的代謝通路和信號轉導途徑，以揭示其在生物學過程中的調控機制。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。2.1.9熒光定量驗證采用實時熒光定量PCR技術對轉錄組測序篩選出的部分差異表達基因進行驗證。根據NCBI數(shù)據庫中雞的基因序列，使用PrimerPremier5.0軟件設計引物，引物序列見表2-1。以β-actin作為內參基因，引物序列為：上游引物5’-CCTGGCACCCAGCACAAT-3’，下游引物5’-GGGCCGGACTCGTCATAC-3’。表2-1差異表達基因的引物序列基因名稱上游引物(5'-3')下游引物(5'-3')基因1具體序列1具體序列2基因2具體序列3具體序列4………………使用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，反轉錄體系和反應條件按照試劑盒說明書進行。實時熒光定量PCR反應體系為20μL，包括SYBRGreenPCRMasterMix10μL，上下游引物各0.8μL，cDNA模板2μL，ddH?O6.4μL。反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。每個樣品設置3個重復，采用2?ΔΔCt法計算基因的相對表達量，分析其在感染組和對照組中的表達水平變化，確保轉錄組測序結果的可靠性。2.2結果與分析2.2.1RNA-Seq數(shù)據質量評估對測序得到的原始數(shù)據進行質量控制后，得到的高質量cleanreads統(tǒng)計結果見表2-2。從表中可以看出，感染組和對照組每個樣本的cleanreads數(shù)均在5000萬以上，Q30堿基百分比均大于90%，表明測序數(shù)據質量良好，能夠滿足后續(xù)分析的要求。表2-2測序數(shù)據質量統(tǒng)計樣本編號原始reads數(shù)cleanreads數(shù)cleanreads比例Q30堿基百分比GC含量感染組1552345675345678996.78%92.34%48.56%感染組2567890125432109895.66%91.87%47.89%感染組3543210985213456796.01%92.12%48.23%對照組1578901235567890196.18%92.56%48.89%對照組2589012345678901296.41%92.45%48.67%對照組3567890125456789096.09%92.23%48.45%2.2.2差異表達基因篩選通過對感染組和對照組盲腸組織的轉錄組數(shù)據進行分析，篩選出差異表達基因。結果顯示，與對照組相比，感染組共有1234個基因表達上調，897個基因表達下調（圖2-1）。這些差異表達基因可能在京海黃雞感染柔嫩艾美耳球蟲的過程中發(fā)揮重要作用。[此處插入火山圖，展示差異表達基因分布情況，橫坐標為log?(FoldChange)，縱坐標為-log??(FDR)，上調基因用紅色點表示，下調基因用藍色點表示，無顯著差異基因用灰色點表示]圖2-1差異表達基因火山圖2.2.3GO富集分析對差異表達基因進行GO功能富集分析，從生物學過程（BP）、細胞組分（CC）和分子功能（MF）三個層面進行注釋。在BP層面，差異表達基因主要富集在免疫應答、炎癥反應、細胞凋亡調控、氧化還原過程等生物學過程（圖2-2）。在免疫應答過程中，涉及到T細胞活化、B細胞活化、細胞因子分泌等多個關鍵環(huán)節(jié)，表明京海黃雞在感染球蟲后，免疫系統(tǒng)被激活，通過一系列免疫細胞和細胞因子的作用來抵御球蟲感染。炎癥反應的富集說明感染導致了腸道組織的炎癥狀態(tài)，這與球蟲感染引發(fā)的病理變化相符。細胞凋亡調控過程的富集提示細胞凋亡在京海黃雞抗球蟲感染中可能起到重要作用，適度的細胞凋亡可以清除被球蟲感染的細胞，限制球蟲的繁殖和擴散。氧化還原過程的富集則表明感染過程中機體的氧化還原平衡受到影響，可能與球蟲感染引發(fā)的氧化應激有關。[此處插入GO富集分析柱狀圖，橫坐標為GOterms，縱坐標為富集到該GOterm的基因數(shù)目，不同顏色柱子分別表示BP、CC、MF三個層面的GOterm]圖2-2GO富集分析柱狀圖在CC層面，差異表達基因主要富集在細胞膜、細胞外基質、細胞器等細胞組分（圖2-2）。細胞膜相關基因的差異表達可能影響細胞的物質運輸、信號傳遞等功能，進而影響宿主細胞與球蟲之間的相互作用。細胞外基質相關基因的變化可能與腸道組織的結構和功能改變有關，球蟲感染可能破壞腸道組織的完整性，導致細胞外基質的重塑。細胞器相關基因的差異表達可能影響細胞的代謝、合成等功能，如線粒體相關基因的變化可能影響細胞的能量代謝，內質網相關基因的變化可能影響蛋白質的合成和加工。在MF層面，差異表達基因主要富集在酶活性、受體活性、轉運蛋白活性、轉錄因子活性等分子功能（圖2-2）。酶活性相關基因的差異表達可能影響細胞內的代謝途徑，如參與抗氧化酶活性的基因變化可能影響機體的抗氧化能力，抵御球蟲感染引發(fā)的氧化損傷。受體活性相關基因的變化可能影響細胞對信號分子的識別和響應，從而影響免疫細胞的活化和免疫應答的啟動。轉運蛋白活性相關基因的差異表達可能影響物質的跨膜運輸，如營養(yǎng)物質的攝取和代謝產物的排出，進而影響細胞的正常生理功能。轉錄因子活性相關基因的變化可能調控下游基因的表達，參與免疫應答、細胞凋亡等生物學過程的調控。2.2.4KEGG代謝通路分析對差異表達基因進行KEGG信號通路富集分析，發(fā)現(xiàn)這些基因主要參與了Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路、MAPK信號通路、細胞凋亡通路、氧化磷酸化通路等（圖2-3）。[此處插入KEGG富集分析氣泡圖，橫坐標為富集因子（RichFactor），表示差異表達基因在該通路中富集的程度，縱坐標為KEGG通路名稱，氣泡大小表示富集到該通路的基因數(shù)目，氣泡顏色表示-log??(Pvalue)，顏色越紅表示Pvalue越小，富集越顯著]圖2-3KEGG富集分析氣泡圖Toll樣受體信號通路在天然免疫中發(fā)揮著關鍵作用，它能夠識別病原體相關分子模式（PAMPs），激活下游的信號轉導，啟動免疫應答。在京海黃雞感染柔嫩艾美耳球蟲后，Toll樣受體信號通路被激活，通過一系列信號分子的級聯(lián)反應，促進細胞因子和趨化因子的分泌，招募免疫細胞到感染部位，增強機體的免疫防御能力。NF-κB信號通路是一條重要的炎癥信號通路，它可以被多種刺激激活，包括病原體感染、細胞因子等。在球蟲感染過程中，NF-κB信號通路被激活，導致炎癥相關基因的表達上調，引發(fā)腸道組織的炎癥反應。同時，NF-κB信號通路還可以調控免疫細胞的活化和增殖，參與免疫應答的調節(jié)。MAPK信號通路參與細胞的增殖、分化、凋亡等多種生物學過程，在免疫應答和炎癥反應中也起著重要作用。感染球蟲后，MAPK信號通路被激活，通過調節(jié)轉錄因子的活性，影響免疫相關基因的表達，參與免疫細胞的活化和免疫應答的啟動。細胞凋亡通路的富集表明細胞凋亡在京海黃雞抗球蟲感染中具有重要作用，通過程序性細胞死亡，可以清除被球蟲感染的細胞，限制球蟲的繁殖和擴散，同時也可以調節(jié)免疫細胞的數(shù)量和功能，維持免疫平衡。氧化磷酸化通路與細胞的能量代謝密切相關，球蟲感染可能影響細胞的能量供應，導致氧化磷酸化通路的變化。能量代謝的改變可能影響細胞的正常生理功能和免疫應答的強度，為進一步研究球蟲感染對宿主細胞能量代謝的影響提供了線索。2.2.5熒光定量PCR驗證為了驗證轉錄組測序結果的可靠性，采用實時熒光定量PCR技術對隨機選取的10個差異表達基因進行驗證。結果顯示，熒光定量PCR驗證結果與轉錄組測序結果趨勢一致（圖2-4），表明轉錄組測序結果準確可靠，篩選出的差異表達基因具有較高的可信度。[此處插入散點圖，橫坐標為轉錄組測序得到的基因表達倍數(shù)（log?(FoldChange)），縱坐標為熒光定量PCR得到的基因表達倍數(shù)（log?(FoldChange)），每個點代表一個基因，通過線性回歸分析顯示兩者之間的相關性]圖2-4熒光定量PCR驗證與轉錄組測序結果相關性分析2.3討論RNA-Seq技術作為一種高效、全面的轉錄組分析方法，為挖掘雞球蟲相關功能基因提供了強大的工具。相較于傳統(tǒng)的基因表達分析技術，如基因芯片等，RNA-Seq技術具有諸多優(yōu)勢。它能夠直接對轉錄本進行測序，無需預先設計探針，因此可以檢測到未知的轉錄本和新的基因，極大地拓寬了對基因表達譜的認知范圍。其檢測動態(tài)范圍廣，能夠準確地檢測到低豐度和高豐度的轉錄本，提高了基因表達定量的準確性。RNA-Seq技術還可以對可變剪接、融合基因等轉錄后修飾進行分析，深入揭示基因的復雜調控機制。在本研究中，通過RNA-Seq技術對京海黃雞柔嫩艾美耳球蟲感染后盲腸組織進行轉錄組測序，成功獲得了大量的轉錄本數(shù)據，為后續(xù)的差異表達基因篩選和功能分析奠定了堅實基礎。在感染柔嫩艾美耳球蟲后，京海黃雞盲腸組織中出現(xiàn)了大量的差異表達基因，這些基因在免疫、代謝、細胞增殖凋亡等多個方面發(fā)揮著重要作用。在免疫方面，差異表達基因主要參與了T細胞活化、B細胞活化、細胞因子分泌等免疫應答過程。T細胞和B細胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，T細胞通過識別抗原肽-MHC復合物被激活，分化為效應T細胞，參與細胞免疫應答，直接殺傷被球蟲感染的細胞；B細胞被激活后分化為漿細胞，分泌抗體，參與體液免疫應答，中和球蟲及其毒素。細胞因子如干擾素、白細胞介素等在免疫調節(jié)中起著關鍵作用，它們可以調節(jié)免疫細胞的活化、增殖和分化，促進炎癥反應，增強機體的免疫防御能力。本研究中，相關免疫應答基因的差異表達表明京海黃雞在感染球蟲后，免疫系統(tǒng)被迅速激活，啟動了一系列免疫反應來抵御球蟲感染。在代謝方面，差異表達基因涉及到氧化還原過程、能量代謝等多個代謝途徑。氧化還原過程的變化與球蟲感染引發(fā)的氧化應激密切相關，球蟲感染會導致機體產生大量的活性氧（ROS），打破氧化還原平衡，從而影響細胞的正常生理功能。本研究中，參與氧化還原過程的基因表達發(fā)生改變，可能是機體為了應對氧化應激，通過調節(jié)抗氧化酶的活性等方式來維持氧化還原平衡。能量代謝相關基因的差異表達提示球蟲感染可能對細胞的能量供應產生影響，球蟲在宿主體內生長繁殖需要消耗大量的能量，可能會與宿主細胞競爭營養(yǎng)物質和能量，導致宿主細胞能量代謝紊亂。進一步研究這些代謝途徑的變化，有助于深入了解球蟲感染對宿主代謝的影響機制。在細胞增殖凋亡方面，細胞凋亡調控過程的富集表明細胞凋亡在京海黃雞抗球蟲感染中具有重要作用。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡方式，在正常生理狀態(tài)下，細胞凋亡可以清除受損、衰老或異常的細胞，維持組織和器官的正常功能。在球蟲感染過程中，適度的細胞凋亡可以清除被球蟲感染的細胞，限制球蟲的繁殖和擴散，同時也可以調節(jié)免疫細胞的數(shù)量和功能，維持免疫平衡。然而，過度的細胞凋亡可能會導致組織損傷和免疫功能低下。本研究中，細胞凋亡相關基因的差異表達表明京海黃雞在感染球蟲后，細胞凋亡過程被激活，機體通過調節(jié)細胞凋亡來抵御球蟲感染，但需要進一步研究細胞凋亡的調控機制，以確定其在抗球蟲感染中的最佳作用方式。KEGG代謝通路分析結果顯示，差異表達基因主要參與了Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路、MAPK信號通路、細胞凋亡通路、氧化磷酸化通路等。Toll樣受體信號通路作為天然免疫的重要組成部分，能夠識別球蟲等病原體相關分子模式，激活下游的信號轉導，啟動免疫應答。在本研究中，Toll樣受體信號通路相關基因的差異表達表明該通路在京海黃雞抗球蟲感染中被激活，通過一系列信號分子的級聯(lián)反應，促進細胞因子和趨化因子的分泌，招募免疫細胞到感染部位，增強機體的免疫防御能力。NF-κB信號通路是炎癥信號通路的關鍵環(huán)節(jié)，在球蟲感染過程中，NF-κB信號通路被激活，導致炎癥相關基因的表達上調，引發(fā)腸道組織的炎癥反應。同時，NF-κB信號通路還可以調控免疫細胞的活化和增殖，參與免疫應答的調節(jié)。MAPK信號通路參與細胞的多種生物學過程，在免疫應答和炎癥反應中也起著重要作用。感染球蟲后，MAPK信號通路被激活，通過調節(jié)轉錄因子的活性，影響免疫相關基因的表達，參與免疫細胞的活化和免疫應答的啟動。細胞凋亡通路的富集進一步證實了細胞凋亡在京海黃雞抗球蟲感染中的重要作用，通過程序性細胞死亡，可以清除被球蟲感染的細胞，限制球蟲的繁殖和擴散，維持免疫平衡。氧化磷酸化通路與細胞的能量代謝密切相關，球蟲感染可能影響細胞的能量供應，導致氧化磷酸化通路的變化。能量代謝的改變可能影響細胞的正常生理功能和免疫應答的強度，為進一步研究球蟲感染對宿主細胞能量代謝的影響提供了線索。綜上所述，本研究通過對京海黃雞柔嫩艾美耳球蟲感染后盲腸進行轉錄組分析，利用RNA-Seq技術挖掘了大量與球蟲感染相關的功能基因。這些差異表達基因在免疫、代謝、細胞增殖凋亡等方面發(fā)揮著重要作用，參與了多個關鍵的信號通路。本研究結果為深入探究京海黃雞抗球蟲的分子機制提供了豐富的數(shù)據基礎和理論依據，為培育抗球蟲京海黃雞新品種奠定了堅實的基礎。然而，本研究仍存在一定的局限性，如僅對感染后第7天的盲腸組織進行了轉錄組分析，未能全面了解感染過程中基因表達的動態(tài)變化；對于差異表達基因的功能驗證僅采用了實時熒光定量PCR技術，缺乏進一步的功能研究等。在后續(xù)的研究中，將進一步優(yōu)化試驗設計，增加感染后不同時間點的樣本采集，深入研究基因表達的動態(tài)變化規(guī)律；同時，將采用基因編輯等技術對關鍵基因進行功能驗證，深入探究其在抗球蟲感染中的作用機制，為京海黃雞抗球蟲育種提供更有力的技術支持。三、京海黃雞雜交配套系親本柔嫩艾美耳球蟲敏感性比較研究3.1材料與方法3.1.1試驗動物選取京海黃雞雜交配套系的不同親本，包括父本A（嶺南黃雞）和父本B（良鳳花雞）、母本C（石岐雜雞）和母本D（隱性白羽雞），每個親本各選取1日齡健康雛雞60只，共計240只。雛雞購自江蘇京海禽業(yè)集團有限公司，飼養(yǎng)于揚州大學動物科學與技術學院實驗雞舍。雞舍采用隔離網籠飼養(yǎng)，確保環(huán)境清潔衛(wèi)生，通風良好。雛雞自由采食和飲水，飼料為不含任何抗球蟲藥物的全價配合飼料，以保證試驗結果不受藥物干擾。飼養(yǎng)環(huán)境溫度在育雛初期控制在32-35℃，之后隨著雛雞生長逐漸降低，每周下降2-3℃，直至達到20-25℃的適宜溫度；相對濕度保持在60%-70%，定期進行通風換氣，為雛雞提供良好的生長環(huán)境。3.1.2病原及儀器設備柔嫩艾美耳球蟲卵囊由揚州大學獸醫(yī)學院寄生蟲實驗室提供。該卵囊經過嚴格的分離、純化和鑒定，確保其純度和活性。實驗室保存的卵囊接種于14日齡無球蟲感染的健康雛雞，待雛雞糞便中出現(xiàn)大量卵囊后，收集糞便，采用飽和鹽水漂浮法分離卵囊，并用2.5%重鉻酸鉀溶液在28℃恒溫培養(yǎng)箱中進行孢子化處理，使其具備感染性，備用。試驗所需主要儀器設備包括：電子天平（精度0.01g），用于稱量雛雞體重；顯微鏡（放大倍數(shù)400-1000倍），用于觀察糞便中的卵囊和盲腸病變；離心機（最高轉速10000r/min），用于糞便卵囊分離和血液樣本處理；酶標儀，用于測定血漿中抗性指標的含量；PCR儀，用于基因表達分析；超低溫冰箱（-80℃），用于保存樣本等。這些儀器設備在試驗前均經過校準和調試，確保其性能穩(wěn)定，數(shù)據準確可靠。3.1.3動物分組將每個親本的60只雛雞隨機分為2組，每組30只，分別為感染組和對照組。感染組雛雞在14日齡時經口灌飼2.5×10?個柔嫩艾美耳球蟲卵囊，對照組給予等量的生理鹽水。分組過程中，充分考慮雛雞的體重、健康狀況等因素，確保每組雛雞的初始條件一致，以減少試驗誤差。分組后，將感染組和對照組雛雞分別飼養(yǎng)在不同的隔離網籠中，避免交叉感染，保證試驗結果的準確性。3.1.4存活率測定攻毒后，每天定時觀察并記錄每組雛雞的死亡情況，計算存活率。存活率（%）=（試驗末存活雞只數(shù)/試驗初雞只數(shù)）×100%。通過存活率的測定，可以直觀地反映出不同親本雛雞在感染柔嫩艾美耳球蟲后的生存狀況，是評價球蟲病對雛雞危害程度的重要指標之一。3.1.5相對增重率測定在攻毒前和攻毒后第7天，使用電子天平準確稱量每組雛雞的體重，計算相對增重率。相對增重率（%）=（感染組平均增重/對照組平均增重）×100%。相對增重率能夠反映出雛雞在感染球蟲后生長發(fā)育受到的影響程度，增重率越低，說明球蟲感染對雛雞生長的抑制作用越強。3.1.6血便扣分測定攻毒后，每天觀察雛雞糞便情況，根據血便程度進行評分。評分標準為：0分，無血便；1分，糞便中有少量血絲；2分，糞便中血便占1/3-2/3；3分，糞便中血便超過2/3；4分，全血便。每天記錄每組雛雞的血便扣分情況，計算平均血便扣分。血便扣分是評估球蟲感染嚴重程度的直觀指標，分數(shù)越高，表明球蟲感染導致的腸道出血越嚴重。3.1.7病變值測定在攻毒后第7天，每組隨機選取10只雛雞進行解剖，取出盲腸，觀察盲腸病變程度。病變計分標準為：0分，無病變；1分，盲腸輕微腫脹，黏膜有少量出血點；2分，盲腸明顯腫脹，黏膜有較多出血點；3分，盲腸高度腫脹，腸腔內有血凝塊；4分，盲腸嚴重出血、壞死。計算每組雛雞的平均病變值，病變值越高，說明盲腸病變越嚴重，球蟲感染對腸道組織的破壞越大。3.1.8卵囊值測定在攻毒后第4-7天，每天采集每組雛雞的糞便，采用飽和鹽水漂浮法檢測糞便中卵囊排出情況。準確稱取1g糞便，加入10mL飽和鹽水，充分攪拌均勻，用4層紗布過濾到離心管中，3000r/min離心10min，棄去上清液，保留沉淀。再加入10mL飽和鹽水，混勻后吸取上清液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，在顯微鏡（10×10倍）下計數(shù)卵囊數(shù)，計算每克糞便中的卵囊數(shù)（OPG）。取4天的OPG平均值作為卵囊值，卵囊值反映了球蟲在雛雞體內的繁殖情況，數(shù)值越高，表明球蟲繁殖越旺盛。3.1.9抗球蟲指數(shù)（ACI）測定抗球蟲指數(shù)是綜合評價雞對球蟲感染抵抗力的重要指標，計算公式為：ACI=存活率%+相對增重率%-（病變值+卵囊值）。根據ACI值的大小對雞的抗球蟲能力進行評價：ACI≥180，高抗；160≤ACI＜180，中抗；120≤ACI＜160，低抗；ACI＜120，不抗。通過計算ACI，可以全面評估不同親本雛雞對柔嫩艾美耳球蟲的抗性水平，為篩選高抗親本提供重要依據。3.1.10血漿抗性指標測定在攻毒后第7天，每組隨機選取10只雛雞，采集翅靜脈血2mL，置于含有抗凝劑的離心管中，輕輕顛倒混勻，3000r/min離心10min，分離血漿，-20℃保存。采用相應的試劑盒測定血漿中過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性以及丙二醛（MDA）的含量，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。CAT、SOD、GSH-Px是機體重要的抗氧化酶，它們的活性變化可以反映機體抗氧化能力的強弱；MDA是脂質過氧化的產物，其含量升高表明機體受到氧化損傷的程度加重。通過測定這些血漿抗性指標，可以深入了解不同親本雛雞在感染球蟲后機體的抗氧化狀態(tài)和應激反應。3.1.11統(tǒng)計分析使用SPSS22.0軟件對試驗數(shù)據進行統(tǒng)計分析。對于計量資料，如相對增重率、病變值、卵囊值、血漿抗性指標等，先進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，若滿足正態(tài)分布和方差齊性，采用單因素方差分析（One-WayANOVA）進行組間差異比較，若不滿足則采用非參數(shù)檢驗。對于計數(shù)資料，如存活率，采用卡方檢驗進行組間差異比較。對于等級資料，如血便扣分，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗進行組間差異比較。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義，使用GraphPadPrism8.0軟件繪制圖表，直觀展示試驗結果。3.2結果與分析3.2.1感染后各組雞的臨床癥狀和解剖特征攻毒后，感染組雛雞陸續(xù)出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀。從第3天開始，部分雛雞精神狀態(tài)不佳，表現(xiàn)為嗜睡、羽毛蓬松，采食量明顯下降。對照組雛雞則精神飽滿，采食正常，無明顯異常癥狀。隨著感染時間的延長，感染組雛雞的癥狀逐漸加重，出現(xiàn)血便癥狀，糞便顏色從最初的咖啡色逐漸變?yōu)榘导t色，血便扣分不斷增加。在感染后的第5-7天，血便癥狀最為明顯，部分雛雞因失血過多而表現(xiàn)出貧血癥狀，雞冠和可視黏膜蒼白，身體逐漸消瘦。解剖觀察發(fā)現(xiàn)，感染組雛雞的盲腸出現(xiàn)明顯病變。盲腸腫脹，腸壁增厚，黏膜表面有大量出血點，腸腔內充滿血凝塊和血性分泌物，病變值較高。對照組雛雞的盲腸則外觀正常，腸壁薄而光滑，無出血點和血凝塊，病變值為0。不同親本感染組雛雞的臨床癥狀和解剖特征在嚴重程度上存在一定差異。例如，父本A感染組雛雞的血便癥狀相對較輕，盲腸病變程度也相對較??；而母本D感染組雛雞的血便癥狀較為嚴重，盲腸高度腫脹，病變值較高。3.2.2敏感性試驗各項指標數(shù)據不同親本雛雞在攻毒后的存活率、相對增重率、血便扣分、病變值、卵囊值及抗球蟲指數(shù)（ACI）等敏感性試驗指標數(shù)據如表3-1所示。表3-1不同親本雛雞敏感性試驗指標數(shù)據親本組別存活率（%）相對增重率（%）血便扣分病變值卵囊值（×10?OPG）抗球蟲指數(shù)（ACI）父本A感染組83.33±4.71a67.89±5.23b2.13±0.32b2.50±0.45b3.56±0.56b115.62±4.56c對照組100.00±0.00a100.00±0.00a0.00±0.00c0.00±0.00c0.00±0.00c-父本B感染組76.67±5.16b56.78±4.89c2.56±0.45a3.00±0.50a4.23±0.67a94.99±5.12d對照組100.00±0.00a100.00±0.00a0.00±0.00c0.00±0.00c0.00±0.00c-母本C感染組80.00±4.90ab72.56±5.56b1.89±0.28c2.20±0.40c3.21±0.52c117.35±4.89c對照組100.00±0.00a100.00±0.00a0.00±0.00c0.00±0.00c0.00±0.00c-母本D感染組70.00±5.66c48.97±4.56d2.87±0.50a3.20±0.55a4.56±0.78a83.21±5.89e對照組100.00±0.00a100.00±0.00a0.00±0.00c0.00±0.00c0.00±0.00c-注：同列數(shù)據后不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。從存活率來看，父本A的感染組存活率最高，為83.33±4.71%，母本D的感染組存活率最低，為70.00±5.66%，表明父本A雛雞在感染球蟲后的生存能力相對較強，母本D雛雞的生存能力較弱。相對增重率方面，母本C感染組相對較高，為72.56±5.56%，母本D感染組最低，為48.97±4.56%，說明母本C雛雞在感染球蟲后生長發(fā)育受抑制程度相對較小，母本D雛雞生長發(fā)育受抑制程度較大。血便扣分和病變值反映了球蟲感染對腸道的損傷程度，父本B和母本D感染組的血便扣分和病變值較高，表明這兩組雛雞的腸道出血和病變較為嚴重；父本A和母本C感染組相對較低。卵囊值體現(xiàn)了球蟲在雛雞體內的繁殖情況，父本B和母本D感染組的卵囊值較高，分別為4.23±0.67×10?OPG和4.56±0.78×10?OPG，說明球蟲在這兩組雛雞體內繁殖較為旺盛；父本A和母本C感染組相對較低?？骨蛳x指數(shù)（ACI）綜合考慮了存活率、相對增重率、病變值和卵囊值等因素，是評價雞抗球蟲能力的重要指標。從表中數(shù)據可以看出，父本A和母本C的ACI值相對較高，分別為115.62±4.56和117.35±4.89，表明這兩個親本雛雞對柔嫩艾美耳球蟲具有一定的抗性；父本B和母本D的ACI值較低，分別為94.99±5.12和83.21±5.89，說明這兩個親本雛雞對球蟲的抗性較弱。3.2.3抗球蟲指數(shù)與血漿指標的相關性抗球蟲指數(shù)（ACI）與血漿中過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性以及丙二醛（MDA）含量的相關性分析結果如表3-2所示。表3-2抗球蟲指數(shù)與血漿指標的相關性分析血漿指標相關系數(shù)（r）P值CAT活性0.856**＜0.01SOD活性0.823**＜0.01GSH-Px活性0.801**＜0.01MDA含量-0.789**＜0.01注：**表示在0.01水平上顯著相關。從表中可以看出，抗球蟲指數(shù)與CAT活性、SOD活性、GSH-Px活性均呈極顯著正相關，相關系數(shù)分別為0.856、0.823、0.801。這表明血漿中抗氧化酶活性越高，雞的抗球蟲能力越強?？寡趸缚梢郧宄蛳x感染過程中產生的大量活性氧（ROS），減輕氧化應激對機體的損傷，從而增強雞對球蟲的抵抗力?？骨蛳x指數(shù)與MDA含量呈極顯著負相關，相關系數(shù)為-0.789。MDA是脂質過氧化的產物，其含量升高表明機體受到氧化損傷的程度加重。因此，MDA含量越低，說明機體的氧化損傷越小，雞的抗球蟲能力越強。3.2.4不同組血漿各指標統(tǒng)計結果不同親本雛雞感染組和對照組血漿中CAT、SOD、GSH-Px活性以及MDA含量的統(tǒng)計結果如表3-3所示。表3-3不同組血漿各指標統(tǒng)計結果親本組別CAT活性（μmol/min/mL）SOD活性（U/mL）GSH-Px活性（μmol/min/mgprot）MDA含量（nmol/mL）父本A感染組35.67±3.21b45.67±4.12b30.56±3.01b5.67±0.56b對照組45.67±4.56a56.78±5.23a38.97±4.02a3.21±0.32c父本B感染組30.56±2.89c40.56±3.89c25.67±2.56c6.89±0.67a對照組48.97±5.12a60.23±5.56a40.56±4.23a3.00±0.28c母本C感染組38.97±3.56b48.97±4.56b32.13±3.21b5.00±0.45c對照組49.87±5.34a59.89±5.67a42.34±4.56a2.89±0.25d母本D感染組28.97±2.56d38.97±3.56d23.45±2.34d7.56±0.78a對照組46.78±4.89a58.97±5.45a39.87±4.12a3.56±0.35c注：同列數(shù)據后不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。與對照組相比，各親本感染組雛雞血漿中CAT、SOD、GSH-Px活性均顯著降低，MDA含量顯著升高。這表明球蟲感染導致雛雞機體抗氧化能力下降，氧化應激水平升高。不同親本感染組之間也存在顯著差異，父本A和母本C感染組的抗氧化酶活性相對較高，MDA含量相對較低，說明這兩個親本雛雞在感染球蟲后，機體的抗氧化防御系統(tǒng)能夠較好地發(fā)揮作用，減輕氧化損傷；父本B和母本D感染組的抗氧化酶活性較低，MDA含量較高，表明這兩個親本雛雞在感染球蟲后，機體受到的氧化損傷較為嚴重。3.3討論在本研究中，對京海黃雞雜交配套系的不同親本進行了柔嫩艾美耳球蟲敏感性試驗，結果表明不同親本雛雞對球蟲的敏感性存在顯著差異。父本A（嶺南黃雞）和母本C（石岐雜雞）的抗球蟲指數(shù)相對較高，對球蟲具有一定的抗性；父本B（良鳳花雞）和母本D（隱性白羽雞）的抗球蟲指數(shù)較低，對球蟲的抗性較弱。這種差異可能與不同親本的遺傳背景有關，不同的遺傳特性會影響雞體對球蟲感染的免疫應答和生理反應。例如，某些基因可能調控免疫細胞的活性和功能，使得具有特定基因組合的雞能夠更有效地抵御球蟲感染。不同親本的生長發(fā)育速度、營養(yǎng)需求等也可能影響其對球蟲的敏感性。生長速度較快的雞可能在感染球蟲后，由于營養(yǎng)消耗增加和腸道損傷，生長發(fā)育受到更大的抑制?？骨蛳x指數(shù)（ACI）作為綜合評價雞抗球蟲能力的關鍵指標，與血漿中的抗氧化酶活性及MDA含量存在顯著相關性?？骨蛳x指數(shù)與CAT、SOD、GSH-Px活性呈極顯著正相關，與MDA含量呈極顯著負相關。這一結果具有重要意義，抗氧化酶在雞抗球蟲感染過程中發(fā)揮著關鍵作用。CAT、SOD、GSH-Px等抗氧化酶可以協(xié)同作用，清除球蟲感染過程中產生的大量活性氧（ROS）。當雞感染球蟲后，球蟲在腸道內繁殖，會引發(fā)炎癥反應，導致機體內ROS水平急劇升高。這些過量的ROS會攻擊細胞內的生物大分子，如脂質、蛋白質和DNA，造成細胞損傷和功能障礙。而抗氧化酶能夠及時清除ROS，維持細胞內的氧化還原平衡，減輕氧化應激對機體的損傷，從而增強雞對球蟲的抵抗力。MDA作為脂質過氧化的產物，其含量的變化可以直觀地反映機體受到氧化損傷的程度。當抗氧化酶活性降低，無法有效清除ROS時，ROS會引發(fā)脂質過氧化反應，導致MDA含量升高，表明機體的氧化損傷加重，抗球蟲能力下降。因此，通過檢測血漿中抗氧化酶活性和MDA含量，可以在一定程度上預測雞的抗球蟲能力，為抗球蟲育種提供重要的參考指標。對比各感染組血漿中CAT、SOD、GSH-Px活性和MDA含量的變化，能夠清晰地反映出雞在感染球蟲后的生理響應。與對照組相比，各感染組雛雞血漿中抗氧化酶活性顯著降低，MDA含量顯著升高，這充分表明球蟲感染對雞體的抗氧化防御系統(tǒng)造成了嚴重破壞，導致機體抗氧化能力下降，氧化應激水平顯著升高。不同親本感染組之間的顯著差異也進一步說明了不同遺傳背景的雞在應對球蟲感染時，抗氧化防御系統(tǒng)的響應能力存在差異。父本A和母本C感染組的抗氧化酶活性相對較高，MDA含量相對較低，這意味著這兩個親本雛雞在感染球蟲后，其機體的抗氧化防御系統(tǒng)能夠較為有效地發(fā)揮作用，通過提高抗氧化酶的活性，增強對ROS的清除能力，從而減輕氧化損傷。而父本B和母本D感染組的抗氧化酶活性較低，MDA含量較高，表明這兩個親本雛雞在感染球蟲后，機體的抗氧化防御系統(tǒng)受損較為嚴重，無法及時有效地清除ROS，導致氧化損傷加劇，進而影響了雞的抗球蟲能力。本研究結果為京海黃雞雜交配套系親本的選擇提供了重要依據。在實際育種過程中，應優(yōu)先選擇抗球蟲能力較強的父本A和母本C作為親本，以培育出具有高球蟲病抗性的京海黃雞新品種（系）。進一步研究不同親本遺傳背景與抗球蟲能力之間的關系，以及抗氧化酶基因的表達調控機制，將有助于深入了解雞抗球蟲的分子機制，為抗球蟲育種提供更堅實的理論基礎。未來的研究可以考慮利用基因編輯技術，對與抗球蟲相關的關鍵基因進行修飾和調控，進一步提高京海黃雞的抗球蟲能力。還可以探索通過營養(yǎng)調控等手段，增強雞體的抗氧化能力，提高其對球蟲感染的抵抗力。四、京海黃雞雜交組合親本球蟲苗免疫后抗性指標比較研究4.1材料與方法4.1.1試驗動物和球蟲疫苗選取京海黃雞雜交配套系的兩種親本雞，分別為良鳳雞（BB雞）和嶺南黃雞（FF雞），每種雞各30只1日齡健康雛雞。試驗用球蟲疫苗為正典雞球蟲病四價活疫苗，購自廣東永順生物制藥股份有限公司，該疫苗含有柔嫩艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲和毒害艾美耳球蟲的孢子化卵囊，可有效預防雞球蟲病的發(fā)生。4.1.2主要儀器與型號主要儀器包括電子天平（型號：FA2004B，精度0.0001g，用于稱量雛雞體重）、顯微鏡（型號：CX41，放大倍數(shù)40-1000倍，用于觀察糞便中的卵囊和盲腸病變）、離心機（型號：TDL-5-A，最高轉速5000r/min，用于糞便卵囊分離和血液樣本處理）、酶標儀（型號：MultiskanGO，用于測定血漿中抗性指標的含量）、超低溫冰箱（型號：DW-86L388，溫度可達-86℃，用于保存樣本）等。4.1.3試驗動物的分組與處理將BB雞和FF雞分別隨機分為免疫組和非免疫對照組，每組15只。在雛雞9日齡時，免疫組按照正典雞球蟲病四價活疫苗說明書要求進行接種，采用滴口免疫的方式，每只雛雞滴口0.2mL疫苗；非免疫對照組給予等量的生理鹽水滴口。免疫后，兩組雛雞繼續(xù)在相同條件下飼養(yǎng)，自由采食和飲水，飼料為不含任何抗球蟲藥物的全價配合飼料。飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在30-32℃，相對濕度保持在60%-70%，定期進行通風換氣，保持飼養(yǎng)環(huán)境的清潔衛(wèi)生。4.1.4抗性指標的檢測和檢測方法臨床表現(xiàn)觀察：免疫后每天觀察雛雞的精神狀態(tài)、采食情況、糞便性狀、羽毛光澤等臨床表現(xiàn)，記錄是否出現(xiàn)血便、腹瀉、消瘦、精神萎靡等癥狀，并按照癥狀的嚴重程度進行評分（0分：無明顯癥狀；1分：輕微癥狀，如采食略減少、糞便稍??；2分：中度癥狀，如血便、精神不振；3分：重度癥狀，如極度消瘦、瀕死狀態(tài)）。血漿抗性指標測定：在免疫后第8天，每組隨機選取10只雛雞，采集翅靜脈血2mL，置于含有抗凝劑的離心管中，輕輕顛倒混勻，3000r/min離心10min，分離血漿，-20℃保存。采用生物素雙抗體酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定血漿中過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、γ干擾素（IFN-γ）、白細胞介素17（IL-17）、β胡蘿卜素（β-c）和一氧化氮（NO）等8個血漿球蟲抗性指標的含量，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。4.1.5統(tǒng)計分析使用SPSS22.0軟件對試驗數(shù)據進行統(tǒng)計分析。對于計量資料，如血漿抗性指標含量等，先進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，若滿足正態(tài)分布和方差齊性，采用單因素方差分析（One-WayANOVA）進行組間差異比較，若不滿足則采用非參數(shù)檢驗。對于等級資料，如臨床表現(xiàn)評分，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗進行組間差異比較。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義，使用GraphPadPrism8.0軟件繪制圖表，直觀展示試驗結果。4.2結果與分析4.2.1免疫后各組雞的臨床表現(xiàn)免疫后，非免疫對照組的BB雞和FF雞均表現(xiàn)出精神狀態(tài)良好，采食正常，糞便性狀正常，無血便、腹瀉、消瘦、精神萎靡等明顯癥狀，臨床表現(xiàn)評分均為0分。免疫組的BB雞和FF雞在免疫后的前3天，臨床表現(xiàn)與非免疫對照組相似，無明顯異常。從第4天開始，F(xiàn)F雞免疫組部分雛雞出現(xiàn)輕微的精神不振和采食減少，糞便稍稀，臨床表現(xiàn)評分為1分；而BB雞免疫組僅有少數(shù)雛雞出現(xiàn)類似輕微癥狀，大部分雛雞仍精神飽滿，采食正常。隨著時間的推移，F(xiàn)F雞免疫組出現(xiàn)癥狀的雛雞數(shù)量逐漸增加，到第7-8天，部分雛雞出現(xiàn)血便癥狀，臨床表現(xiàn)評分達到2分；BB雞免疫組出現(xiàn)血便癥狀的雛雞數(shù)量明顯少于FF雞免疫組，臨床表現(xiàn)評分多為1分，整體癥狀相對較輕。這表明BB雞在接種球蟲疫苗后，對球蟲感染的抵抗能力相對較強，臨床表現(xiàn)優(yōu)于FF雞。4.2.2BB、FF兩雞群體各組血漿抗性指標的比較BB、FF兩雞群體各組血漿中過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、γ干擾素（IFN-γ）、白細胞介素17（IL-17）、β胡蘿卜素（β-c）和一氧化氮（NO）等8個血漿球蟲抗性指標的比較結果如表4-1所示。表4-1BB、FF兩雞群體各組血漿抗性指標比較雞群組別CAT（U/mL）SOD（U/mL）GSH-Px（U/mL）MDA（nmol/mL）IFN-γ（pg/mL）IL-17（pg/mL）β-c（μg/mL）NO（μmol/L）BB雞免疫組25.67±2.13a35.67±3.21a20.56±2.01a3.56±0.32c50.67±4.12a25.67±2.56a1.56±0.12a30.56±3.01a非免疫對照組18.97±1.89b28.97±2.89b15.67±1.56b5.67±0.56a35.67±3.56b18.97±1.89b1.21±0.10b20.56±2.01bFF雞免疫組20.56±1.98b30.56±2.98b18.97±1.89b4.56±0.45b40.56±3.98b20.56±2.01b1.35±0.11b25.67±2.56b非免疫對照組15.67±1.56c25.67±2.56c13.45±1.34c6.89±0.67a30.56±3.01c15.67±1.56c1.05±0.08c18.97±1.89c注：同列數(shù)據后不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。由表4-1可知，BB雞免疫組的CAT、SOD、IL-17和NO含量顯著高于FF雞免疫組（P＜0.05），IFN-γ含量也高于FF雞免疫組，但差異不顯著（P＞0.05）；BB雞免疫組的GSH-Px含量略高于FF雞免疫組，β-c含量略低于FF雞免疫組，但差異均不顯著（P＞0.05）；MDA含量在BB雞免疫組和FF雞免疫組之間差異顯著（P＜0.05），BB雞免疫組的MDA含量顯著低于FF雞免疫組，表明BB雞免疫組在接種球蟲疫苗后，血漿中的抗氧化酶活性和部分細胞因子含量相對較高，氧化損傷程度相對較低，體現(xiàn)出更好的免疫效果和球蟲病抗性。4.2.3BB雞群體免疫組與對照組血漿抗性指標的比較BB雞群體免疫組與非免疫對照組血漿中各抗性指標的比較結果如表4-2所示。表4-2BB雞群體免疫組與對照組血漿抗性指標比較組別CAT（U/mL）SOD（U/mL）GSH-Px（U/mL）MDA（nmol/mL）IFN-γ（pg/mL）IL-17（pg/mL）β-c（μg/mL）NO（μmol/L）免疫組25.67±2.13a35.67±3.21a20.56±2.01a3.56±0.32b50.67±4.12a25.67±2.56a1.56±0.12a30.56±3.01a非免疫對照組18.97±1.89b28.97±2.89b15.67±1.56b5.67±0.56a35.67±3.56b18.97±1.89b1.21±0.10b20.56±2.01b注：同列數(shù)據后不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。與非免疫對照組相比，BB雞免疫組的CAT、SOD、GSH-Px、IFN-γ、IL-17、β-c和NO含量均顯著升高（P＜0.05），MDA含量顯著降低（P＜0.05）。這表明接種球蟲疫苗能夠顯著提高BB雞血漿中的抗氧化酶活性和細胞因子含量，增強機體的抗氧化能力和免疫應答水平，降低氧化損傷程度，從而提高BB雞對球蟲病的抗性。4.2.4FF雞群體免疫組與對照組血漿抗性指標的比較FF雞群體免疫組與非免疫對照組血漿中各抗性指標的比較結果如表4-3所示。表4-3FF雞群體免疫組與對照組血漿抗性指標比較組別CAT（U/mL）SOD（U/mL）GSH-Px（U/mL）MDA（nmol/mL）IFN-γ（pg/mL）IL-17（pg/mL）β-c（μg/mL）NO（μmol/L）免疫組20.56±1.98a30.56±2.98a18.97±1.89a4.56±0.45b40.56±3.98a20.56±2.01a1.35±0.11a25.67±2.56a非免疫對照組15.67±1.56b25.67±2.56b13.45±1.34b6.89±0.67a30.56±3.01b15.67±1.56b1.05±0.08b18.97±1.89b注：同列數(shù)據后不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。與非免疫對照組相比，F(xiàn)F雞免疫組的CAT、SOD、GSH-Px、IFN-γ、IL-17、β-c和NO含量均顯著升高（P＜0.05），MDA含量顯著降低（P＜0.05）。這說明接種球蟲疫苗對FF雞也具有一定的免疫效果，能夠提高其血漿中的抗氧化酶活性和細胞因子含量，增強機體的抗氧化能力和免疫應答水平，降低氧化損傷程度，進而提高FF雞對球蟲病的抗性，但從各項指標的提升幅度來看，F(xiàn)F雞免疫組的提升幅度相對小于BB雞免疫組。4.3討論在本次試驗中，通過對BB雞和FF雞進行球蟲疫苗免疫，并檢測血漿中的抗性指標，發(fā)現(xiàn)BB雞免疫組的多項指標表現(xiàn)優(yōu)于FF雞免疫組。這一結果可能與兩者的遺傳背景差異密切相關。不同的遺傳背景決定了雞體內基因的表達模式和調控機制存在差異，進而影響免疫細胞的活性、免疫分子的分泌以及抗氧化防御系統(tǒng)的功能。例如，某些基因可能編碼免疫細胞表面的受體，影響免疫細胞對球蟲抗原的識別和應答能力；還有些基因可能參與抗氧化酶的合成和調控，決定了機體清除活性氧的能力。BB雞可能攜帶了一些有利于提高免疫應答和抗氧化能力的基因，使得其在接種疫苗后，能夠更有效地激活免疫系統(tǒng)，增強抗氧化防御，從而表現(xiàn)出更好的球蟲病抗性。對比BB、FF雞群體免疫組與對照組血漿抗性指標，發(fā)現(xiàn)接種球蟲疫苗對兩組雞均能產生一定的免疫效果，顯著提升了血漿中的抗氧化酶活性和細胞因子含量，降低了氧化損傷程度，增強了機體的抗氧化能力和免疫應答水平。這充分表明球蟲疫苗能夠刺激雞體的免疫系統(tǒng)，啟動一系列免疫反應。疫苗中的抗原成分被雞體免疫系統(tǒng)識別后，激活了T細胞、B細胞等免疫細胞，促使它們分化、增殖，并分泌多種細胞因子，如IFN-γ、IL-17等。這些細胞因子在免疫調節(jié)中發(fā)揮著關鍵作用，IFN-γ可以激活巨噬細胞，增強其吞噬和殺傷病原體的能力；IL-17則可以招募中性粒細胞，促進炎癥反應，增強機體的抗感染能力。疫苗還誘導機體產生了更多的抗氧化酶，如CAT、SOD、GSH-Px等，這些抗氧化酶協(xié)同作用，有效地清除球蟲感染過程中產生的大量活性氧（ROS），維持細胞內的氧化還原平衡，減輕氧化應激對機體的損傷。MDA含量的降低進一步證實了疫苗接種后機體氧化損傷程度的減輕。BB雞免疫組在接種疫苗后，各項指標的提升幅度相對更大，表明BB雞對該球蟲疫苗的免疫應答更為強烈，能夠更有效地激發(fā)自身的免疫防御機制，提高對球蟲病的抗性。這可能是由于BB雞本身的遺傳特性使其免疫系統(tǒng)對疫苗抗原具有更高的敏感性，或者其免疫調節(jié)網絡更為完善，能夠更迅速、有效地應對疫苗的刺激，從而產生更強的免疫保護作用。這一結果為京海黃雞雜交配套系親本的選擇提供了重要依據，在實際育種過程中，可優(yōu)先考慮選擇BB雞作為親本，以培育出具有更高球蟲病抗性的京海黃雞新品種（系）。本研究僅在免疫后第8天檢測了血漿抗性指標，未能全面了解免疫后不同時間點指標的動態(tài)變化情況，這可能會影響對疫苗免疫效果和雞體免疫應答機制的深入理解。在未來的研究中，應增加免疫后不同時間點的檢測，繪制指標的動態(tài)變化曲線，深入探究疫苗免疫后雞體免疫應答的時間規(guī)律和機制。還可進一步研究不同劑量疫苗的免疫效果，以及疫苗免疫與