第二篇動物細(xì)胞工程

第4章細(xì)胞培養(yǎng)

楊紀(jì)峰7新C404yangjf12@動物細(xì)胞工程單克隆抗體養(yǎng)細(xì)胞融合與單克隆抗體細(xì)胞培養(yǎng)胚胎工程核移植轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞融合與單克隆抗體細(xì)胞培養(yǎng)胚胎工程干細(xì)胞核移植染色體工程第4章細(xì)胞培養(yǎng)4.1培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性4.2細(xì)胞培養(yǎng)液4.3細(xì)胞的基本培養(yǎng)技術(shù)4.4細(xì)胞系和細(xì)胞株的建立4.5細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇和運(yùn)輸動物細(xì)胞與組織培養(yǎng)（cellandtissueculture）是動物細(xì)胞工程的重要技術(shù)基礎(chǔ)。動物細(xì)胞與組織培養(yǎng)是指從活的機(jī)體中取出組織或細(xì)胞，模擬機(jī)體內(nèi)生理條件，在體外建立無菌、適溫和一定營養(yǎng)條件等，使之生長和生存，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)。組織培養(yǎng)的概念組織培養(yǎng)這一名詞實際上是一個通用名詞，習(xí)慣上泛指所有的體外培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)物的不同可概括為三個不同概念：細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和器官培養(yǎng)。A：細(xì)胞培養(yǎng)：將組織塊用機(jī)械方法或酶解法分離成單個細(xì)胞，做成細(xì)胞懸液，再培養(yǎng)于固體基質(zhì)上，成單層細(xì)胞生長，或在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)培養(yǎng)的技術(shù)稱為細(xì)胞培養(yǎng)。B：組織培養(yǎng)：將活體的一小片組織放在盛有培養(yǎng)液的玻璃或塑料培養(yǎng)器皿中，待組織塊粘著后，沿底面平面移動生長的過程稱為組織培養(yǎng)。從組織塊中生長出來的仍然是細(xì)胞，細(xì)胞在生長的同時也發(fā)生移動，至使組織培養(yǎng)難以長時間維持其原有結(jié)構(gòu)，結(jié)果也就成了細(xì)胞培養(yǎng)。C：器官培養(yǎng)：是指采取某些措施使器官的原基、器官的一部分或整個器官在體外存活、生長，并保持其原有結(jié)構(gòu)和功能的培養(yǎng)技術(shù)。體外培養(yǎng)的種類二、細(xì)胞培養(yǎng)的現(xiàn)實意義

生物技術(shù)上：生產(chǎn)各種生物技術(shù)產(chǎn)品，如：狂犬病、小兒麻痹癥等病毒疫苗，表皮生長因子、干擾素、白細(xì)胞介素等生長因子及單克隆抗體等?？茖W(xué)研究上：在病毒學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)等方面。臨床醫(yī)學(xué)上：胎兒的遺傳性疾病分析，藥物篩選及某些疾病的治療等三、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)

1.研究的對象是活細(xì)胞

在實驗過程中，根據(jù)要求可始終保持細(xì)胞活力，并可長時間監(jiān)控、檢測甚至定量評估一部分活細(xì)胞的情況，包括活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動等。

2.

研究條件可以人為控制

可以根據(jù)需要，控制包括pH、溫度、氧氣、二氧化碳、張力等物理化學(xué)條件；同時，可以施加化學(xué)、物理、生物等因素作為條件而進(jìn)行實驗觀察，這些因素同樣可以處于嚴(yán)格控制之下。3.研究的樣本可以達(dá)到比較的均一

通過細(xì)胞培養(yǎng)一定代數(shù)后，所得到的細(xì)胞系則可以達(dá)到均一性，屬于同一類型的細(xì)胞，需要時，可采用克隆化等方法使細(xì)胞達(dá)到純化。4.研究內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄

采用各種研究技術(shù)、記錄方法：

研究:

倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、激光共焦顯微鏡、免疫組織化學(xué)、原位雜交、同位素標(biāo)記…….

記錄:攝影照片、縮時電影、電視…….5.研究的范圍比較廣泛

學(xué)科多：細(xì)胞學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等

對象廣：

各種動物：低等動物--高等動物--人類

一種動物：不同年齡--

不同組織--

正常或異常（腫瘤--）

6.研究的費(fèi)用相對較經(jīng)濟(jì)

可提供大量、同一時期、重復(fù)性好的、生物學(xué)性狀相似的實驗對象。四、細(xì)胞培養(yǎng)的缺點(diǎn)

現(xiàn)在人工模擬體內(nèi)環(huán)境的技術(shù)已經(jīng)很高,但人工所模擬的條件與體內(nèi)實際情況仍不完全相同。當(dāng)細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后,生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中,時間久了，必然發(fā)生變化。

因此，對于體外培養(yǎng)的細(xì)胞，應(yīng)該把他們視作一種既能保持動物體內(nèi)原細(xì)胞一定的性狀、結(jié)構(gòu)和功能又具有某些改變的特定的細(xì)胞群體，而不能將之與體內(nèi)的細(xì)胞完全等同。五、細(xì)胞培養(yǎng)的工作原則有標(biāo)準(zhǔn)化的工作方法。培養(yǎng)用的液體極多（如培養(yǎng)液、胰蛋白酶、HANKS液及抗菌素等），應(yīng)由專人負(fù)責(zé)，并保證做到按規(guī)程行事，配制濃度準(zhǔn)確，滅菌可靠，所有配好的溶液瓶上都要標(biāo)明名稱、濃度、消毒與否和制備日期等。一切培養(yǎng)用品都要有固定的存放點(diǎn)，避免雜亂無章，其中尤其重要的是：培養(yǎng)用品與非培養(yǎng)用品應(yīng)嚴(yán)格分開，已消毒品與未消毒品應(yīng)分別存放。

4.1組織培養(yǎng)的細(xì)胞生物學(xué)---培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特征一、體內(nèi)外細(xì)胞的差異和分化（一）體內(nèi)外細(xì)胞的差異

培養(yǎng)細(xì)胞最多見的表現(xiàn)是：失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)，分化減弱或不顯，出現(xiàn)類似“反祖”現(xiàn)象；表現(xiàn)為細(xì)胞趨單一化，或獲得不死性，或變成具有惡性性狀的細(xì)胞群。1.與體內(nèi)主要不同

相對孤立、相對單一，

缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞相互間的影響。

2.主要表現(xiàn)

失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)

分化減弱或不顯

細(xì)胞趨向單一化

3.提示

要正確認(rèn)識體外培養(yǎng)細(xì)胞是一種特定條件下生長的細(xì)胞群體。

（二）培養(yǎng)細(xì)胞的分化

1．不適應(yīng)(Deadaption)：

表現(xiàn)為，細(xì)胞在體內(nèi)時所擁有的分化特性減弱或不顯，如肝細(xì)胞產(chǎn)生酪氨酸轉(zhuǎn)移酶(TyrosineAminotranserase)特性的喪失.2．脫分化或去分化(Dedifferentiation)

細(xì)胞也可能出現(xiàn)脫分化或去分化，即細(xì)胞失掉發(fā)生分化的能力。二、培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)分類體外細(xì)胞培養(yǎng)物的生長類型

按生長方式:2種類型

粘附型(貼壁型)細(xì)胞:附著在某一固相支持物表面才能生長的細(xì)胞。

懸浮型細(xì)胞:不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長的細(xì)胞。

絕大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞屬粘附型細(xì)胞，只有少數(shù)細(xì)胞類型如某些腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞可在懸浮狀態(tài)下生長。

貼壁(粘附)型細(xì)胞

粘附:是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式。體內(nèi)：基于粘附特性，使細(xì)胞與細(xì)胞之間相互結(jié)合形成組織，

有機(jī)體的絕大多數(shù)細(xì)胞必須粘附于一固相表面

才能生存和生長。

培養(yǎng)時：這些細(xì)胞被放到體外環(huán)境中以后,同樣需要粘附于某一固相表面才能生存和生長，因而屬于粘附型細(xì)胞。粘附(錨定或錨著)依賴型(性)細(xì)胞：唯有粘附于固相表面才能生存的細(xì)胞。

細(xì)胞在體內(nèi)、外粘附方式存在差異：

體內(nèi)：粘附是全方位

外形具有復(fù)雜的立體特征。

體外：多數(shù)情況，細(xì)胞只有一個附著平面

外形一般與體內(nèi)時明顯不同。

按照培養(yǎng)細(xì)胞粘附生長時的主要形態(tài)，可分為幾大類型：

根據(jù)粘附生長時形態(tài)的不同，主要分為4類：

上皮細(xì)胞型成纖維細(xì)胞型

游走細(xì)胞型多形型細(xì)胞

1，上皮細(xì)胞型名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實際上不完全等于--來源：來源于外胚層、內(nèi)胚層細(xì)胞。

如：皮膚及其衍生物消化道，乳腺，肺泡上皮性腫瘤形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞

扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核

生長特點(diǎn)：

易相連成片

相靠—緊密相連—成薄層—

鋪路石狀

生長時呈膜狀移動

很少脫離細(xì)胞群而單個活動體外培養(yǎng)細(xì)胞類型（1）—上皮細(xì)胞型2，成纖維細(xì)胞型名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織

如：真正的成纖維細(xì)胞、心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞。形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)

胞體梭形或不規(guī)則三角形

胞質(zhì)向外伸出2—3個長短不等的突起

中間有卵圓形核生長特點(diǎn)：

排列成放射狀，漩渦狀，并不緊靠連成片，細(xì)胞—細(xì)胞接觸易斷開而單獨(dú)行動。游離的單獨(dú)的成纖維樣細(xì)胞，常有幾個伸長的細(xì)胞突起。體外培養(yǎng)細(xì)胞類型（2）——成纖維細(xì)胞型游走細(xì)胞型

伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運(yùn)動。形狀不穩(wěn)定。單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及某些腫瘤細(xì)胞。多形細(xì)胞型有一些組織和細(xì)胞，如神經(jīng)組織的細(xì)胞等，難以確定他們規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，都?xì)w入多形細(xì)胞型。貼附生長型--類型1.與體內(nèi)同名的細(xì)胞不完全相同

如：形態(tài)相似的成纖維細(xì)胞，可不同來源

自同一動物不同組織的成纖維樣細(xì)胞相似但

發(fā)展趨向不同2.培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)不穩(wěn)定

條件改變，細(xì)胞形態(tài)可有變化

培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)不穩(wěn)定

血清

Hela

高血清

低血清

成纖維細(xì)胞樣上皮樣細(xì)胞

pH

Hela

太酸或太堿

標(biāo)準(zhǔn)pH

成纖維細(xì)胞樣上皮樣細(xì)胞

細(xì)胞密度

3T3低密度

高密度

成纖維細(xì)胞樣上皮樣細(xì)胞

生長狀態(tài)改變

懸浮或貼附

懸浮

貼附

圓形成纖維或上皮樣

轉(zhuǎn)化與否

未轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化后

成纖維樣可成上皮樣懸浮生長型

概念

培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長

或以機(jī)械方法使保持在懸浮狀態(tài)下生長來源

自血，脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞癌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞也可能特點(diǎn)

在懸浮條件下生長良好細(xì)胞圓形，單個或小細(xì)胞團(tuán)DT40isaBcelllinederivedfromanavianlymphomainachicken.

優(yōu)點(diǎn)

生存空間大，提供數(shù)量大傳代方便(不需消化)

易于收獲可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點(diǎn)觀察不方便很多細(xì)胞不能懸浮生長(尤以正常細(xì)胞)

4.1.2培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點(diǎn)（一）貼附（二）接觸抑制（三）密度抑制4.1.2培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點(diǎn)

正常動物細(xì)胞培養(yǎng)的典型特征（P39）核型（染色體）正常，表明沒有明顯的基因改變。細(xì)胞的傳代次數(shù)大約在50代左右，有限的壽命反應(yīng)了細(xì)胞的生長調(diào)節(jié)。細(xì)胞無惡性，表現(xiàn)在將該細(xì)胞注入免疫抑制動物不能形成腫瘤。貼壁依賴、接觸抑制和密度抑制表明其增殖受到抑制，當(dāng)細(xì)胞在介質(zhì)表面生長至匯合單層時增殖就停止。接觸抑制細(xì)胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細(xì)胞，由于細(xì)胞的相互接觸能抑制細(xì)胞的運(yùn)動，這種現(xiàn)象稱接觸抑制（ContactInhibition）。細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細(xì)胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。

ContactInhibition

dieproducenewcells4.1.3培養(yǎng)細(xì)胞的生長與增殖過程單個細(xì)胞的生長過程細(xì)胞系的生長過程每代細(xì)胞的生長過程1單個細(xì)胞的生長過程LivingCellDynamics

TheNeuronalCellLine2細(xì)胞系的生長過程組織培養(yǎng)細(xì)胞生命期(LifeSpanofCultureCells)所謂培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間，包括原代培養(yǎng)期、傳代培養(yǎng)期及衰退期三個階段。正常培養(yǎng)細(xì)胞的生命期原代培養(yǎng)期(PrimaryCulture)也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1-4周。特點(diǎn)：1，細(xì)胞呈活躍移動，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。2，與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上相似性大。3，細(xì)胞群是異質(zhì)的，各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)，即細(xì)胞獨(dú)立生存性差。4，初代培養(yǎng)的細(xì)胞多呈二倍體核型。傳代期特點(diǎn)：在整個生命期中此期的持續(xù)時間最長，整個培養(yǎng)過程的主要時期。細(xì)胞增殖旺盛，細(xì)胞生長活躍，并能維持二倍體核型。傳代：體內(nèi)細(xì)胞生長在動態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間和營養(yǎng)是有限的。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要分離出一部分細(xì)胞和更新營養(yǎng)液，否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代。初代培養(yǎng)的細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系（CellLine）。

衰退期特點(diǎn)：此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。3.體外培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期（每代細(xì)胞的生長過程）潛伏期指數(shù)增生期停滯期所謂“一代”是指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時間。1，潛伏期細(xì)胞對傳代操作所致?lián)p傷的恢復(fù)期和對新的生長環(huán)境的適應(yīng)期，一般為期6~24h。也是原代培養(yǎng)開始時細(xì)胞必須經(jīng)歷的時期。接種到培養(yǎng)器皿內(nèi)以后，細(xì)胞開始經(jīng)歷黏附、貼壁和鋪展等過程。修復(fù)損傷，熟悉環(huán)境，恢復(fù)生長，但很少分裂。接種的細(xì)胞密度越大，數(shù)量越多，細(xì)胞群體越容易適應(yīng)體外環(huán)境，潛伏期就短。2，指數(shù)生長期又叫對數(shù)生長期（logarithmicgrowthphase），是細(xì)胞增生最活躍、活力最旺盛的階段，培養(yǎng)物中的細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)增長。細(xì)胞群體均一，理想的實驗用細(xì)胞。細(xì)胞分裂活動（即增殖活性）的衡量指標(biāo)：有絲分裂指數(shù)（mitoticindex,MI）細(xì)胞群體倍增時間：培養(yǎng)物中細(xì)胞數(shù)量翻倍的平均時間MTT法、標(biāo)記核苷酸（H3-TdR）摻入法、BrdU標(biāo)記法有絲分裂指數(shù)(MI)

指培養(yǎng)物中分裂相數(shù)量占全部細(xì)胞數(shù)量的百分比，統(tǒng)計時，每瓶至少需計數(shù)1000個細(xì)胞。

一般細(xì)胞的MI約為0.1－0.5%。原代培養(yǎng)物的MI比繼代培養(yǎng)物低。連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞高，可達(dá)3%－5%。在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)3～5天后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多，生長空間漸趨減少，最后細(xì)胞相互接觸匯合成片。細(xì)胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細(xì)胞，發(fā)生接觸抑制。發(fā)生接觸抑制以后，雖然運(yùn)動受到限制，但只要營養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細(xì)胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度依賴性細(xì)胞生長抑制，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止，細(xì)胞數(shù)量即不再增加，進(jìn)入平臺期（停滯期）。3，停滯期也叫平臺期（plateauphase），意即細(xì)胞不再分裂增殖，細(xì)胞數(shù)量維持在某一水平上，生長活動停滯。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累，pH降低。此時需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。傳代過晚（已有中毒跡象）能影響下一代細(xì)胞的機(jī)能狀態(tài)。在這種情況下，雖進(jìn)行了傳代，因細(xì)胞已受損，需要恢復(fù)，至少還要再傳1～2兩代，通過換液淘汰死細(xì)胞和使受損輕微的細(xì)胞得以恢復(fù)后，才能再用。4.1.4體外培養(yǎng)細(xì)胞的遺傳學(xué)特征（一）核型變化（二）永生化和惡變（三）細(xì)胞性別體外培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境（一）無污染環(huán)境（二）溫度（三）氣體環(huán)境和氫離子濃度體外培養(yǎng)細(xì)胞生存所需基本物質(zhì)（一）糖（二）氨基酸（三）維生素（四）促生長因子（五）其它物質(zhì)4.2細(xì)胞培養(yǎng)液4.2.1細(xì)胞培養(yǎng)的常用液體水平衡鹽溶液消化液消化酶抑制劑pH調(diào)整液抗生素液谷氨酰胺補(bǔ)充液培養(yǎng)用水體外培養(yǎng)的細(xì)胞對水質(zhì)特別敏感，對水的純度要求較高。培養(yǎng)用水中如果含有一些雜質(zhì)，即使含量極微，有時也會影響細(xì)胞的存活和生長，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。用金屬蒸餾器制備的蒸餾水，可能會含有某些金屬離子，一般不作為培養(yǎng)用水。配制培養(yǎng)用液應(yīng)使用經(jīng)石英玻璃蒸餾器三次蒸餾的三蒸水或超純水凈化裝置制備的超純水。

平衡鹽溶液平衡鹽溶液主要是由無機(jī)鹽、葡萄糖組成，它的作用是維持細(xì)胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)。主要用于取材時組織塊的漂洗、細(xì)胞的漂洗、配制其他試劑等。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的pH值。消化液

進(jìn)行原代培養(yǎng)時常常需要將組織塊消化解離形成細(xì)胞懸液，傳代培養(yǎng)時也需要將貼壁細(xì)胞從瓶壁上消化下來，常用的消化液有胰酶（Trypsin）溶液和EDTA溶液，有時也用膠原酶（collagenase）溶液等。胰酶溶液

胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常見有1：125和1：250，即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。組織培養(yǎng)用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%濃度，配制時要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡鹽溶液，因為這些物質(zhì)會對胰酶產(chǎn)生抑制作用。胰酶作用及溶解的最佳pH是8-9，配制胰酶溶液應(yīng)將液體調(diào)至pH8左右，充分溶解，過濾除菌。過濾后可以再調(diào)只pH7.5，也可不調(diào)。分裝于4度保存。

EDTA溶液

EDTA溶液也常用來解離細(xì)胞，它的作用機(jī)制是破壞細(xì)胞間的連接。對于一些貼壁特別牢固的細(xì)胞，還可以用EDTA和胰酶的混合液進(jìn)行消化。EDTA溶液的使用濃度為0.02%，配制時應(yīng)加堿助溶，配制后可過濾除菌，也可高溫消毒滅菌。

消化酶抑制劑血清大豆胰蛋白酶抑制劑

pH調(diào)整液NaHCO3溶液：NaHCO3是培養(yǎng)基中必須添加的成分，一般情況下按說明書的要求準(zhǔn)確添加，以保證培養(yǎng)基在5%CO2的環(huán)境下pH達(dá)到設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)。如果是封閉式培養(yǎng)，即不與5%CO2的環(huán)境發(fā)生交換達(dá)到平衡，所使用的培養(yǎng)基就不能按照說明書所要求加入NaHCO3。此時常用5.6%或7.4%的NaHCO3溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基，使之達(dá)到所要求的pH環(huán)境。pH調(diào)整液HEPES溶液：是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細(xì)胞無毒性，主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時要添加HEPES?？股爻Ｓ玫氖乔噫溍顾兀追Q“雙抗溶液”。青霉素主要是對革蘭陽性菌有效，鏈霉素主要對革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預(yù)防絕大多數(shù)細(xì)菌污染。一般配制成100倍濃縮液，可用PBS或培養(yǎng)基配制。

谷氨酰胺補(bǔ)充液谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過程中起重要作用，合成培養(yǎng)基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%，所以都是在使用前添加。配制好的培養(yǎng)液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上時，要重新加入原來量的谷氨酰胺，故需單獨(dú)配制谷氨酰胺，以便臨時加入培養(yǎng)液內(nèi)。配制時應(yīng)加溫30℃，完全溶解后過濾除菌，分裝至小瓶，儲存于－20℃。二肽谷氨酰胺

（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）

在細(xì)胞培養(yǎng)液中頻繁地補(bǔ)加谷氨酰胺，因而在培養(yǎng)操作過程中經(jīng)常：

（1）頻繁打開蓋子，增加了破壞無菌狀態(tài)的可能性；

（2）過多的追加L-谷氨酰胺，增加了培養(yǎng)基中氨的毒性水平。二肽谷氨酰胺

（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）二肽谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中穩(wěn)定而不降解,可高壓滅菌,釋放毒性氨最少!二肽谷氨酰胺在細(xì)胞內(nèi)被氨肽酶所水解，產(chǎn)生L-谷氨酰胺和L-丙氨酸；因此在大部分細(xì)胞系統(tǒng)中二肽谷氨酰胺就可以象L-谷氨酰胺同樣有效地被利用。二肽谷氨酰胺是最優(yōu)替代物，它無需適應(yīng)；既可用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，也適合于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。4.2.2培養(yǎng)基培養(yǎng)基細(xì)胞的生長需要一定的營養(yǎng)環(huán)境，用于維持細(xì)胞生長的營養(yǎng)基質(zhì)稱為培養(yǎng)基，即指所有用于各種目的的體外培養(yǎng)、保存細(xì)胞用的物質(zhì)，就其本意上講為人工模擬體內(nèi)生長的營養(yǎng)環(huán)境，使細(xì)胞在此環(huán)境中有生長和繁殖的能力。它是提供細(xì)胞營養(yǎng)和促進(jìn)細(xì)胞生長增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)。細(xì)胞培養(yǎng)基的基本要求

體外培養(yǎng)的細(xì)胞直接生活在培養(yǎng)基中，因此培養(yǎng)基應(yīng)能滿足細(xì)胞對營養(yǎng)成分、促生長因子、激素、滲透壓、pH等諸多方面的要求。

營養(yǎng)成分

1.氨基酸

2.單糖：體外培養(yǎng)動物細(xì)胞時，幾乎所有的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。

3.維生素

4.無機(jī)離子與微量元素促生長因子及激素

各種激素、生長因子對于維持細(xì)胞的功能、保持細(xì)胞的狀態(tài)（分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素對許多細(xì)胞生長有促生長作用，如胰島素，它能促進(jìn)細(xì)胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素對某一類細(xì)胞有明顯促進(jìn)作用，如氫化可的松可促進(jìn)表皮細(xì)胞的生長，泌乳素有促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞生長作用等。

氣體與pH

氣體也是細(xì)胞生存的必需條件之一，所需氣體主要是氧和二氧化碳。一般置細(xì)胞于95％空氣加5％二氧化碳的混合氣體環(huán)境中培養(yǎng)。動物細(xì)胞大多數(shù)需要輕微的堿性條件，pH值約在7.2-7.4pH在細(xì)胞生長過程中，隨細(xì)胞數(shù)量的增多和代謝活動的加強(qiáng)，二氧化碳不斷被釋放，培養(yǎng)液變酸，PH值發(fā)生變化。由于NaHCO3容易分解為二氧化碳，很不穩(wěn)定，致使緩沖系統(tǒng)難以精確地控制。故這一緩沖系統(tǒng)適合密閉培養(yǎng)。合成培養(yǎng)基中使用了NaHCO3-CO2緩沖系統(tǒng)，并采用開放培養(yǎng)，使細(xì)胞代謝產(chǎn)生的CO2及時溢出培養(yǎng)瓶，再通過穩(wěn)定調(diào)節(jié)溫箱中CO2濃度（5％），與培養(yǎng)基中的NaHCO3處于平衡狀態(tài)。滲透壓

細(xì)胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞對滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg,可視為培養(yǎng)人體細(xì)胞的理想滲透壓。鼠細(xì)胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對于大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞，滲透壓在260－320mOsm/kg的范圍都適宜。

無毒、無污染

體外生長的細(xì)胞對微生物及一些有害有毒物質(zhì)沒有抵抗能力，因此培養(yǎng)基應(yīng)達(dá)到無化學(xué)物質(zhì)污染、無微生物污染（如細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等）、無其他對細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染（如抗體、補(bǔ)體）。對于天然培養(yǎng)基，污染主要來源于取材過程及生物材料本身，應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格選材，嚴(yán)格操作。對于合成培養(yǎng)基，污染主要來源于配制過程，配制所用的水，器皿應(yīng)十分潔凈，配制后應(yīng)嚴(yán)格過濾除菌。

2天然培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養(yǎng)技術(shù)建立早期，體外培養(yǎng)細(xì)胞都是利用天然培養(yǎng)基。但是由于天然培養(yǎng)基制作過程復(fù)雜、批間差異大，因此逐漸為合成培養(yǎng)基所替代。目前廣泛使用的天然培養(yǎng)基是血清，另外各種組織提取液、促進(jìn)細(xì)胞貼壁的膠原類物質(zhì)在培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞也是必不可少。

血清(serum)

血清種類:主要是牛血清，培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞也用人血清、馬血清等。牛血清分為小牛血清(calfserum，CS)、胎牛血清(fetalbovineserum，F(xiàn)BS)

。胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛；新生小牛血清取自出生24小時之內(nèi)的新生牛；小牛血清取自出生10-30天的小牛。fetalbovineserum，F(xiàn)BSWhenthemediaisneeded,add50-mlofFBSand5-mlofantibioticstooneoftheportions.Thiscompletesthemediaforuse.

IneedtodecreasetheconcentrationofFBSinmymedia.Normally,Iuse10%FBSandIwouldliketouse1%.Doesitcauseanyproblemforcellgrowth?胎牛血清的有關(guān)問題：胎牛血清：（進(jìn)口血清）要求剖腹取胎制成。國內(nèi)廠家往往不能做到，經(jīng)常把出生2天以內(nèi)采血稱為胎牛血清。血清污染的檢測(視頻)血清的主要作用

●提供基本營養(yǎng)物質(zhì)●提供激素和各種生長因子●提供結(jié)合蛋白●提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷?！駥ε囵B(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用：血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)在則有目的的使用血清來終止胰蛋白酶的消化作用。

細(xì)胞培養(yǎng)中使用血清的缺點(diǎn)

●對大多數(shù)細(xì)胞，在體內(nèi)狀態(tài)，血清不是它們接觸的生理學(xué)液體，只是在損傷愈合以及血液凝固過程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細(xì)胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)，血清可能促進(jìn)某些細(xì)胞的生長（成纖維細(xì)胞）同時抑制另一類細(xì)胞生長（表皮細(xì)胞）?！裱搴恍?xì)胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì)血清的缺點(diǎn)●動物個體不同，血清產(chǎn)地、批號不同，每批質(zhì)量差異甚大，其成分不能保持一致。

●取材中可能帶入支原體、病毒，對細(xì)胞產(chǎn)生潛在影響，可能導(dǎo)致實驗失敗或?qū)嶒灲Y(jié)果不可靠性。

●血清的使用使得實驗和生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化困難，其中的蛋白質(zhì)使得某些轉(zhuǎn)基因蛋白生物藥品生產(chǎn)中分離純化工作很難完成。

●大規(guī)模生產(chǎn)中，血清來源越來越困難，價格昂貴，是構(gòu)成動物細(xì)胞培養(yǎng)對生產(chǎn)成本的主要部分之一。

血清的使用使用前處理：大部分血清在使用前必須滅活處理，即56℃30分鐘。滅活的目的是滅活血清中的補(bǔ)體和支原體。血清經(jīng)過滅活也會損失一些對細(xì)胞有利的成分，如生長因子，因此也有人提出血清不經(jīng)滅活直接用于培養(yǎng)，這樣做的前提是確認(rèn)血清中不含補(bǔ)體成分。對于一些品質(zhì)高的胎牛血清和新牛血清可以考慮不經(jīng)滅活直接用于細(xì)胞培養(yǎng)。

血清的儲存儲存條件：血清一般儲存于-20℃，同時應(yīng)避免反復(fù)凍融。購買大包裝的血清后，首先要滅活處理，然后分裝成小包裝，儲存于-20℃，使用前融化。融化時最好現(xiàn)置于4℃。融化后的血清在4℃不宜長時間存放，應(yīng)盡快使用。

3合成培養(yǎng)基

基本培養(yǎng)基包括四大類物質(zhì)：無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物。

常用合成培養(yǎng)基(1).MEM細(xì)胞培養(yǎng)基系列(2).DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基系列(3)RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基系列(4).199細(xì)胞培養(yǎng)基系列(5).水解乳蛋白細(xì)胞培養(yǎng)基(6)歐氏平衡鹽(7)F-10,F-12細(xì)胞培養(yǎng)基系列(8)其它類型細(xì)胞培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基沒有一定的標(biāo)準(zhǔn)，有幾點(diǎn)建議可供參考：(1)建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基。可以查閱參考文獻(xiàn)，或在購買細(xì)胞株時咨詢。(2)其它實驗室慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種細(xì)胞。(3)根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實驗的需要來選擇培養(yǎng)基。如小鼠細(xì)胞株多選RPMI1640。(4)用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實驗結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。

干粉培養(yǎng)基的配制

●認(rèn)真閱讀說明書。說明書都注明干粉不包含的成分，常見的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必須添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根據(jù)實驗需要決定。●配制是要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物質(zhì)都要等培養(yǎng)基完全溶解之后才能添加?！衽渲扑玫乃畱?yīng)是三蒸水，離子濃度很低。●所用器皿應(yīng)嚴(yán)格消毒?！衽渲坪玫呐囵B(yǎng)基應(yīng)馬上過濾，無菌保存于4度。配制方法

●加入比預(yù)期總體積少50％的三蒸水?！窦尤敫煞叟囵B(yǎng)基，輕輕攪拌，不要加熱。●水洗包裝袋的內(nèi)部，轉(zhuǎn)移全部的痕量干粉到容器內(nèi)。●加NaHCO3到培養(yǎng)基中?！裼萌羲♂尩较胍捏w積，攪拌溶解。注意不要過分?jǐn)嚢??！裢ㄟ^緩慢攪拌加入1NNaOH

或1NHCL調(diào)節(jié)pH值，由于pH值在過濾時會上升0.1到0.3，因而調(diào)節(jié)pH值使它比最終想要的pH值低0.2到0.3。培養(yǎng)基在過濾前要保持密封。

無血清培養(yǎng)基

是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基?？赡馨瑐€別蛋白或大量蛋白組分。研制出無血清培養(yǎng)基一直是生物科學(xué)工作者努力的目標(biāo)。4.3細(xì)胞的基本培養(yǎng)技術(shù)4.3.1原代培養(yǎng)1取材組織:雞胚鼠胚皮膚和黏膜血細(xì)胞內(nèi)臟和實體瘤2組織細(xì)胞的分離機(jī)械法：離心、切割分離、機(jī)械分散法消化法：胰酶、EDTA、膠原酶3培養(yǎng)方法組織塊培養(yǎng)法單層細(xì)胞培養(yǎng)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)原代培養(yǎng)視頻雞胚胎成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)

1.取9日齡的雞胚，用酒精消毒，在超凈工作臺內(nèi)，小心取出雞胚，放在培養(yǎng)皿中，除去頭尾、四肢及內(nèi)臟；2.胚體用含雙抗PBS沖洗2~3次，切成1~2mm3的小塊，然后轉(zhuǎn)入容積適量大小的三角瓶內(nèi)（或試管、燒杯）；3.按每個雞胚加入約5mL的EDTA-胰酶消化液，在室溫下消化10min；4.小牛血清終止消化，收集細(xì)胞懸液，沒有消化完全的組織塊可再消化一次；5.收集到的細(xì)胞懸液經(jīng)100目過濾篩過濾，1000rpm離心5min，去上清；6.細(xì)胞沉淀用DMEM培養(yǎng)液重新懸浮，取出少量細(xì)胞懸液臺盼藍(lán)染色，計算細(xì)胞活力；7.以5×105個/mL的密度接種到培養(yǎng)瓶中（30mL細(xì)胞液/雞胚），于38.5℃、5%CO2濃度、飽和濕度條件下培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的注意事項：分離組織：使用鋒利的刀具，減少對組織的損傷。在取材時除去脂肪和壞死組織。離心轉(zhuǎn)速要適度。消化及接種：選取合適的消化酶，消化的時間因組織而異，一般為30min。接種的密度應(yīng)比傳代培養(yǎng)大——選擇營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基和血清胚胎組織在原代培養(yǎng)中容易分離，細(xì)胞較易存活，增殖速度快，故比成年組織更可取。4.3.2傳代培養(yǎng)當(dāng)原代培養(yǎng)成功以后，隨著培養(yǎng)時間的延長和細(xì)胞不斷分裂，一則細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長速度減慢甚至停止；另一方面也會因營養(yǎng)物不足和代謝物積累而不利于生長或發(fā)生中毒。此時就需要將培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)，再進(jìn)行培養(yǎng)。這個過程就稱為傳代（passage）或者再培養(yǎng)（subculture）。對單層培養(yǎng)而言，80%匯合或剛匯合的細(xì)胞是較理想的傳代階段。

體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線傳代培養(yǎng)第一次傳代常規(guī)傳代：貼壁細(xì)胞／懸浮細(xì)胞貼壁細(xì)胞傳代貼壁細(xì)胞傳代-消化過程圖示

胰酶消化雞胚胎成纖維細(xì)胞的傳代原代培養(yǎng)的細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部時（約2天），即可進(jìn)行傳代；吸出原培養(yǎng)液，然后用PBS清洗細(xì)胞2~3次，盡量除去殘余的血清；3.加入0.2mL的消化液進(jìn)行消化，消化程度可在倒置顯微鏡下觀察，一般以細(xì)胞突起縮回、細(xì)胞間間隙增大、細(xì)胞近乎縮成圓形為度；4.吸出消化液，加入適量的含小牛血清的培養(yǎng)液，反復(fù)輕輕吹打培養(yǎng)瓶底部，使經(jīng)消化的細(xì)胞脫離瓶底并分散為單個細(xì)胞；5.收集細(xì)胞懸液，1000rpm離心5min，去上清；6.用培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞并計算細(xì)胞活力和密度，以5×105個/mL密度（1：3）接種到培養(yǎng)瓶中，于38.5℃、5%CO2濃度、飽和濕度條件下培養(yǎng)。懸浮細(xì)胞傳代Wave-bioreactor懸浮細(xì)胞傳代常用培養(yǎng)技術(shù)懸滴培養(yǎng)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)克隆培養(yǎng)法細(xì)胞同步化培養(yǎng)動物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)懸滴培養(yǎng)

hanging－dropculture，slidecellculture

Coverslipculture培養(yǎng)瓶培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶

(rollerbottle)克隆培養(yǎng)法指單細(xì)胞培養(yǎng)，使之無性繁殖獲得克隆細(xì)胞株的方法。有采用在每一毛細(xì)管內(nèi)滴一滴培養(yǎng)液，各自放入一個細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的方法；但一般是在培養(yǎng)皿中使細(xì)胞相互間維持一定的間隔，培養(yǎng)極少量的細(xì)胞以使各個細(xì)胞得以增殖。細(xì)胞克隆技術(shù)的方法1.稀釋鋪板法2.飼養(yǎng)層克隆法3.膠原膜板或纖維蛋白膜板克隆法4.瓊脂克隆法5.毛細(xì)管克隆法ColonyPicking細(xì)胞同步化培養(yǎng)

在一般培養(yǎng)條件下，群體中的細(xì)胞處于不同的細(xì)胞周期時相之中。為了研究某一時相細(xì)胞的代謝、增殖、基因表達(dá)或凋亡，常需采取一些方法使細(xì)胞處于細(xì)胞周期的同一時相，這就是細(xì)胞同步化技術(shù)。選用DNA合成抑制劑可逆地抑制S期細(xì)胞DNA合成而不影響其他細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)，最終可將細(xì)胞群體阻斷在G1／S期交界處；一些抑制微管聚合的藥物，因抑制有絲分裂裝置的形成和功能行使，可將細(xì)胞阻斷在有絲分裂中期，即使細(xì)胞同步于M期。細(xì)胞同步化實際包括用一定的方法獲得一定數(shù)量的同步化細(xì)胞群和使細(xì)胞進(jìn)入同步化生長的兩層含義。

動物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)分批式流加式半連續(xù)式連續(xù)式灌注式

動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)（large-scaleculturetechnology）是指在人工條件下（設(shè)定ph、溫度、溶氧等），在細(xì)胞生物反應(yīng)器（bioreactor）中高密度大量培養(yǎng)動物細(xì)胞用于生產(chǎn)生物制品的技術(shù)。目前已實現(xiàn)商業(yè)化的產(chǎn)品有：口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、皰瘡病毒疫苗、巨細(xì)胞病毒疫苗、α及β干擾素、血纖維蛋白溶酶原激活劑、凝血因子Ⅷ和Ⅸ、促紅細(xì)胞素、松弛素、生長激素、蛋白C、免疫球蛋白、尿激酶、激肽釋放酶及200種單克隆抗體等。其中，口蹄疫疫苗是動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法生產(chǎn)的主要產(chǎn)品之一。1983年，英國Wellcome公司就已能夠利用動物細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)口蹄疫疫苗。美國Genentech公司應(yīng)用SV40為載體，將乙型肝炎病毒表面抗原基因插入哺乳動物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行高效表達(dá)，已生產(chǎn)出乙型肝炎疫苗。英國Wellcome公司采用8000LNamalwa細(xì)胞生產(chǎn)α干擾素。英國Celltech公司用氣升式生物反應(yīng)器生α、β和γ干擾素；用無血清培養(yǎng)液在10000L氣升式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體。美國Endotronic公司用中空纖維生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞生產(chǎn)出免疫球蛋白G、A、M和尿激酶、人生長激素等。4.4細(xì)胞系和細(xì)胞株的建立細(xì)胞系和細(xì)胞株的種類原代培養(yǎng)細(xì)胞系克隆細(xì)胞株二倍體細(xì)胞遺傳缺陷細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系或株

從一個經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，稱細(xì)胞株。再由原細(xì)胞株進(jìn)一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細(xì)胞群，亦可稱之為亞株（Substrain）

細(xì)胞株細(xì)胞系正常細(xì)胞培養(yǎng)的世代數(shù)有限，只有癌細(xì)胞和發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞才能無限生長下去。所謂轉(zhuǎn)化即是指正常細(xì)胞在某種因子的作用下發(fā)生突變而具有癌性的細(xì)胞。目前世界上許多實驗室所廣泛傳用的HeLa細(xì)胞系就是1951年從一位名叫HenriettaLacks的婦女身上取下的宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)而成（宮頸癌上皮細(xì)胞）。此細(xì)胞系一直延用至今。細(xì)胞系或細(xì)胞株的命名

HeLa：為供體患者的姓名（來源于宮頸癌）

CHO：中國地鼠卵巢細(xì)胞（ChineseHamsterOvary）宮-743：宮頸癌上皮細(xì)胞，1974年3月建立

NIH3T3：美國國立衛(wèi)生研究院（NationalInstituteofHealth）建立；每3天傳代，每次接種3×105細(xì)胞／毫升。

CellLinesforTherapeuticProteinManufacturing

建立細(xì)胞系（細(xì)胞株）的要求組織來源細(xì)胞生物學(xué)檢測培養(yǎng)條件和方法檔案資料及其管理和使用細(xì)胞庫：美國標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物收集所(ATCC)歐洲動物細(xì)胞庫(ECACC)日本細(xì)胞庫(RCB)中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會：中科院上海細(xì)胞庫昆明細(xì)胞庫武漢細(xì)胞庫

ATCC:TheAmericanTypeCultureCollection

美國ATCC菌種保藏中心，又稱美國模式菌種收集中心，座落于馬里蘭洲洛克菲勒的一家私營的，非贏利性組織。目前它可以提供以下物品：細(xì)胞系（3000種）；細(xì)菌和噬菌體（15000種）；動植物病毒（2500種）；原生動物

1200種以及重組物品等。

ATCC:AmericanTypeCultureCollection

ATCC

isanonprofitrepositoryandworldwidedistributorofvariouscelllinesandprimarycelltypesusedforcellbiologyresearch.

ATCCwasestablishedin1925whenacommitteeofscientistsrecognizedaneedforacentralcollectionofmicroorganismsthatwouldservescientistsallovertheworld.

4.5細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇和運(yùn)輸為了防止因污染或技術(shù)原因使長期培養(yǎng)功虧一簣，考慮到培養(yǎng)細(xì)胞因傳代而遲早會出現(xiàn)變異，有時因寄贈、交換和購買，培養(yǎng)細(xì)胞從一個實驗室轉(zhuǎn)運(yùn)到另一個實驗室，最佳的策略是進(jìn)行低溫保存。這對于維持一些特殊細(xì)胞株的遺傳特性極為重要。

細(xì)胞低溫保存的基本原理在－70℃－196℃以下時，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止，即代謝處于完全停止?fàn)顟B(tài)，故可以長期保存