FHL2在神經膠質瘤中的功能及分子機制解析：基于多維度研究視角一、引言1.1研究背景與意義神經膠質瘤是最常見的原發(fā)性顱內腫瘤，約占所有原發(fā)性中樞神經系統(tǒng)（CNS）惡性腫瘤的81%，其發(fā)病率在顱內腫瘤中居于首位。這種腫瘤起源于神經膠質細胞，具有高度異質性和預后不良的特點，給患者和醫(yī)療領域帶來了沉重負擔。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）中樞神經系統(tǒng)腫瘤分類，膠質瘤分為Ⅰ～Ⅳ級，其中Ⅰ、Ⅱ級屬于低級別膠質瘤，腫瘤生長相對緩慢，切除后有長期生存的可能；而Ⅲ、Ⅳ級為高級別膠質瘤，惡性程度較高，腫瘤生長迅速，治療后極易復發(fā)。以膠質母細胞瘤為例，其約占全部膠質瘤的一半以上，即便采用手術、放療和化療的綜合治療方案，患者的平均生存期也僅為14個月，1年生存率約為30%，5年生存率約為13%。目前，神經膠質瘤的治療手段主要包括手術切除、放療、化療以及靶向治療等。手術是主要的治療方法之一，旨在明確診斷、改善癥狀和減輕腫瘤負荷，但由于膠質瘤呈浸潤性生長，像“樹根狀”的腫瘤細胞會浸潤到正常腦組織內，導致手術難以全切。放療和化療雖能在一定程度上控制腫瘤生長，但也面臨著諸多問題，如放療的副反應、化療的毒性反應以及腫瘤細胞的“多耐藥性”等，這些都限制了治療效果，使得患者的預后仍然不理想。FHL2（FourandahalfLIMdomainprotein2）是一種含有四個半LIM結構域的新型蛋白質，在多種細胞過程中發(fā)揮著關鍵作用。FHL2以細胞/組織特異性方式表現(xiàn)出多種表達模式，在心臟高度表達，在大腦和骨骼肌中也有表達。其編碼的蛋白質在許多信號通路以及細胞發(fā)育和分化過程中起調節(jié)作用，包括心血管系統(tǒng)和橫紋肌的發(fā)育與維持，還在骨形成中起作用并調節(jié)骨礦物質含量和骨密度。在腫瘤研究領域，F(xiàn)HL2被發(fā)現(xiàn)參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和演化過程。已有研究表明，F(xiàn)HL2在多種人類常見惡性腫瘤組織中高表達，如鱗狀細胞癌、惡性膠質瘤、黑素瘤、慢性骨髓白血病、前列腺癌、宮頸癌、結腸癌、肺癌、乳腺癌、腎癌等。在淋巴細胞白血病、早幼粒細胞白血病和Burkitt淋巴瘤的細胞中FHL2不表達或低表達。在腫瘤細胞的分化過程中，F(xiàn)HL2也扮演著重要角色，它能與其他多種癌基因產物和蛋白質相互作用，參與調節(jié)基因表達，維持細胞結構，介導細胞黏附、細胞運動和信號傳導等。在神經膠質瘤的研究中，F(xiàn)HL2的作用逐漸受到關注。由于神經膠質瘤的高發(fā)病率、高死亡率以及現(xiàn)有治療手段的局限性，深入研究FHL2在神經膠質瘤中的生物學功能及分子機制具有重要意義。一方面，通過揭示FHL2在神經膠質瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機制，有望為神經膠質瘤的發(fā)病機制提供新的理論依據(jù)，進一步完善對神經膠質瘤的認識。另一方面，F(xiàn)HL2有可能成為神經膠質瘤治療的新靶點，為開發(fā)更有效的治療策略提供方向，從而提高神經膠質瘤患者的生存率和生活質量，具有重要的臨床應用價值和社會意義。1.2FHL2基因和蛋白的生物學特性FHL2基因在人類中定位于染色體11q13.5，其編碼區(qū)由7個外顯子和6個內含子組成，但僅有4個外顯子參與編碼FHL2蛋白。這種基因結構特點使得FHL2在轉錄和表達調控上具有獨特性，不同外顯子的組合和調控可能影響其最終表達產物的功能和特性。在進化上，F(xiàn)HL2基因具有一定的保守性，這暗示著其在生物體內承擔著重要且相對穩(wěn)定的生物學功能，從低等生物到高等生物，F(xiàn)HL2基因的基本結構和功能可能存在一定的延續(xù)性和相似性。FHL2蛋白由279個氨基酸殘基組成，其最顯著的特征是含有四個半LIM結構域。每個LIM結構域包含兩個鋅指結構，這種獨特的結構賦予了FHL2強大的蛋白質-蛋白質相互作用能力。LIM結構域中的鋅指結構可以與其他蛋白質中的特定結構域或氨基酸序列相互識別和結合，從而形成蛋白質復合物，參與多種細胞內的生理過程。FHL2蛋白序列中在LIM2和LIM3區(qū)域之間存在一個具有YEKQHAMQ序列的賴氨酸殘基，其在LIM結構域的排列和相互作用中可能起到特殊的調節(jié)作用，雖然目前關于這個分裂殘基的生物學作用尚未完全明確，但推測其可能是特殊的FHL2相互作用蛋白元件，影響FHL2與其他蛋白質的結合特異性和親和力，進而調節(jié)相關的細胞信號通路和生物學功能。在細胞中，F(xiàn)HL2具有多種重要功能。它參與調節(jié)基因表達，通過與轉錄因子等相互作用，影響基因轉錄的起始、延伸和終止過程，從而調控細胞的分化、增殖和凋亡等生理過程。在細胞分化過程中，F(xiàn)HL2可能與特定的轉錄因子形成復合物，激活或抑制與分化相關基因的表達，引導細胞向特定的方向分化。在細胞凋亡方面，F(xiàn)HL2可以從細胞外基質的黏著斑到線粒體傳遞凋亡信號，與輻射誘導細胞凋亡也有關聯(lián)，其具體機制可能涉及到對凋亡相關蛋白和信號通路的調節(jié)。FHL2還參與維持細胞結構，介導細胞黏附、細胞運動和信號傳導等過程。在細胞黏附過程中，F(xiàn)HL2可能與細胞表面的黏附分子相互作用，調節(jié)細胞與細胞、細胞與細胞外基質之間的黏附力，影響細胞的遷移和組織形態(tài)的維持。在細胞運動方面，F(xiàn)HL2可能通過調節(jié)細胞骨架的動態(tài)變化，影響細胞的伸展、收縮和遷移能力。在信號傳導過程中，F(xiàn)HL2可以作為信號通路中的關鍵節(jié)點，與多種信號分子相互作用，如參與Rho信號途徑、Wnt信號途徑等，將細胞外的信號傳遞到細胞內，引發(fā)相應的細胞反應。FHL2在不同組織和細胞中呈現(xiàn)出特異性的表達模式。在胚胎發(fā)育過程中，F(xiàn)HL2的表達具有時空特異性，這與胚胎組織的內環(huán)境穩(wěn)定和細胞定向分化密切相關。在胚胎早期，F(xiàn)HL2可能在特定的細胞群體中高表達，參與細胞的分化和組織器官的形成，隨著胚胎的發(fā)育，其表達模式會發(fā)生動態(tài)變化，以適應不同階段的發(fā)育需求。在成年個體中，F(xiàn)HL2在心臟中高度表達，對心血管系統(tǒng)的發(fā)育和維持起著關鍵作用。研究表明，F(xiàn)hl2基因敲除小鼠在心臟發(fā)育后期和成年階段，雖然心血管發(fā)育正常，但在長期輸注異丙腎上腺素后，心肌肥大反應增強，這說明FHL2在調節(jié)心臟對β-腎上腺素能刺激的反應中具有重要作用，可能通過調節(jié)相關信號通路，維持心臟的正常生理功能。FHL2在大腦和骨骼肌中也有表達。在大腦中，F(xiàn)hl2在神經干細胞、神經前體細胞以及成熟的神經細胞中均有表達，其表達不足會導致動物神經母細胞遷移遲滯，體外培養(yǎng)的神經干細胞過早地分化為星形膠質細胞，并伴隨著年齡的增長加劇GFAP陽性的成熟星形膠質細胞在體內的增生和積累，這表明FHL2在維持神經干細胞的穩(wěn)定和平衡狀態(tài)、調節(jié)神經細胞的遷移和分化過程中發(fā)揮著重要作用。在骨骼肌中，F(xiàn)HL2的表達可能與肌肉的發(fā)育、收縮和修復等過程有關。在一些腫瘤組織中，F(xiàn)HL2的表達水平會發(fā)生異常改變。在多種人類常見惡性腫瘤組織，如鱗狀細胞癌、惡性膠質瘤、黑素瘤、慢性骨髓白血病、前列腺癌、宮頸癌、結腸癌、肺癌、乳腺癌、腎癌等中，F(xiàn)HL2高表達；而在淋巴細胞白血病、早幼粒細胞白血病和Burkitt淋巴瘤的細胞中，F(xiàn)HL2不表達或低表達。這種在腫瘤組織中的異常表達模式提示FHL2可能參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和演化過程，其具體機制可能涉及到對腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為的調節(jié)。1.3神經膠質瘤的生物學特性與研究現(xiàn)狀神經膠質瘤是起源于神經膠質細胞的腫瘤，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）中樞神經系統(tǒng)腫瘤分類，可分為Ⅰ-Ⅳ級。其中，Ⅰ級神經膠質瘤通常為良性腫瘤，如毛細胞型星形細胞瘤，生長緩慢，邊界相對清晰，手術切除后預后良好，患者的生存期較長；Ⅱ級神經膠質瘤為低度惡性腫瘤，如彌漫性星形細胞瘤，腫瘤細胞呈浸潤性生長，手術難以完全切除，容易復發(fā)，患者的預后相對較差；Ⅲ級神經膠質瘤屬于間變性腫瘤，如間變性星形細胞瘤，惡性程度較高，腫瘤細胞增殖活躍，侵襲性強，患者的生存期明顯縮短；Ⅳ級神經膠質瘤是惡性程度最高的腫瘤，以膠質母細胞瘤最為典型，腫瘤生長迅速，常伴有壞死和出血，預后極差，患者的平均生存期較短。神經膠質瘤的生物學行為復雜多樣，具有高度異質性。腫瘤細胞具有很強的增殖能力，能夠不斷分裂和生長，導致腫瘤體積逐漸增大。腫瘤細胞還具有侵襲性，能夠突破正常組織的邊界，向周圍腦組織浸潤生長，這使得手術難以徹底切除腫瘤，增加了腫瘤復發(fā)的風險。神經膠質瘤細胞還具有抗凋亡能力，能夠逃避機體的免疫監(jiān)視和細胞凋亡機制，從而得以持續(xù)生存和增殖。腫瘤細胞的代謝也發(fā)生了改變，表現(xiàn)為對葡萄糖等營養(yǎng)物質的攝取和利用增加，以滿足其快速生長和增殖的需求。神經膠質瘤的癥狀因腫瘤的位置、大小和生長速度而異。常見的癥狀包括頭痛，這是由于腫瘤生長導致顱內壓升高，刺激腦膜和神經引起的；惡心和嘔吐，通常與顱內壓升高有關，且多在清晨或空腹時發(fā)作；視力改變，如視力下降、視野缺損等，可能是腫瘤壓迫視神經或影響了視覺傳導通路；言語障礙，當腫瘤位于語言中樞附近時，會影響患者的語言表達和理解能力；肢體無力，腫瘤侵犯運動神經或大腦運動中樞，可導致肢體的力量減弱或癱瘓；癲癇發(fā)作，腫瘤周圍的腦組織異常放電，引發(fā)癲癇。這些癥狀會嚴重影響患者的生活質量，隨著病情的進展，還可能導致患者昏迷甚至死亡。在診斷方面，神經膠質瘤的診斷通常需要綜合多種方法。臨床表現(xiàn)是診斷的重要依據(jù)，醫(yī)生通過詳細詢問患者的癥狀、病史以及進行神經系統(tǒng)檢查，初步判斷是否存在神經膠質瘤的可能性。影像學檢查在神經膠質瘤的診斷中起著關鍵作用，磁共振成像（MRI）是最常用的檢查方法之一，它能夠清晰地顯示腫瘤的位置、大小、形態(tài)和周圍組織的關系，還可以通過增強掃描觀察腫瘤的血供情況，有助于判斷腫瘤的性質。CT掃描也可用于神經膠質瘤的診斷，特別是對于顯示腫瘤的鈣化、出血等情況具有一定優(yōu)勢。正電子發(fā)射斷層掃描（PET）可以提供腫瘤細胞的代謝信息，輔助判斷腫瘤的惡性程度和鑒別診斷。組織病理學檢查是確診神經膠質瘤的金標準，通過手術切除或穿刺活檢獲取腫瘤組織，進行病理切片和免疫組化分析，確定腫瘤的類型、分級和分子特征，為制定治療方案提供重要依據(jù)。當前，神經膠質瘤的治療手段主要包括手術、放療、化療以及靶向治療等。手術是神經膠質瘤的主要治療方法之一，其目的是盡可能切除腫瘤組織，減輕腫瘤負荷，明確病理診斷，為后續(xù)治療創(chuàng)造條件。隨著顯微手術技術、激光技術、導航系統(tǒng)以及術中電生理監(jiān)測手段的不斷發(fā)展和完善，手術的全切率得到了提高，手術風險也有所降低。然而，由于神經膠質瘤的浸潤性生長特點，手術往往難以完全切除腫瘤，殘留的腫瘤細胞容易導致復發(fā)。放療是利用高能射線殺死腫瘤細胞，抑制腫瘤生長。近年來，放療技術不斷改進，如調強放射治療（IMRT）、立體定向放射外科（SRS）等，能夠更精確地照射腫瘤組織，減少對周圍正常組織的損傷。放療通常與手術聯(lián)合應用，對于高級別神經膠質瘤，術后放療可以顯著延長患者的生存期?；熓峭ㄟ^使用化學藥物殺死腫瘤細胞，常用的化療藥物包括替莫唑胺、洛莫司汀等?；熆梢酝ㄟ^口服或靜脈注射的方式給藥，能夠全身作用，殺死手術和放療后殘留的腫瘤細胞。替莫唑胺是目前治療神經膠質瘤的一線化療藥物，與放療聯(lián)合應用，可顯著提高患者的生存率。靶向治療是針對腫瘤細胞的特定分子靶點進行治療，具有特異性強、副作用小的優(yōu)點。目前，針對神經膠質瘤的靶向治療藥物仍處于研究和臨床試驗階段，如針對表皮生長因子受體（EGFR）、血管內皮生長因子（VEGF）等靶點的抑制劑，雖然在部分患者中取得了一定的療效，但仍存在耐藥性等問題，需要進一步研究和改進。盡管在神經膠質瘤的研究和治療方面取得了一定進展，但目前仍存在許多不足之處。現(xiàn)有治療手段難以徹底根治神經膠質瘤，患者的預后仍然不理想，復發(fā)率高，生存率低。神經膠質瘤的高度異質性使得不同患者對治療的反應差異很大，難以制定統(tǒng)一的治療方案，如何實現(xiàn)個性化治療是當前面臨的挑戰(zhàn)之一。對神經膠質瘤的發(fā)病機制和耐藥機制的認識還不夠深入，限制了新治療方法和藥物的研發(fā)。因此，深入研究神經膠質瘤的發(fā)病機制和生物學特性，尋找新的治療靶點和治療方法，對于提高神經膠質瘤的治療效果具有重要意義。在這樣的研究背景下，F(xiàn)HL2在神經膠質瘤中的研究具有獨特的切入點。由于FHL2在多種細胞過程中發(fā)揮關鍵作用，且在腫瘤組織中表達異常，其在神經膠質瘤中的表達變化、功能機制以及與其他分子的相互作用，可能為揭示神經膠質瘤的發(fā)病機制提供新的線索。探究FHL2是否參與神經膠質瘤細胞的增殖、侵襲、凋亡等生物學行為的調控，以及其在神經膠質瘤信號通路中的作用，有望為神經膠質瘤的治療提供新的靶點和策略，從而為改善神經膠質瘤患者的預后帶來新的希望。1.4研究目的與創(chuàng)新點本研究旨在深入探討FHL2在神經膠質瘤中的生物學功能及分子機制，為神經膠質瘤的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點。具體研究目的如下：明確FHL2在神經膠質瘤中的表達情況：通過檢測不同級別神經膠質瘤組織及正常腦組織中FHL2的表達水平，分析其表達差異與神經膠質瘤的病理分級、臨床分期等因素的相關性，為后續(xù)研究奠定基礎。探究FHL2對神經膠質瘤細胞生物學行為的影響：利用細胞實驗，研究FHL2過表達或沉默對神經膠質瘤細胞增殖、侵襲、凋亡等生物學行為的影響，揭示FHL2在神經膠質瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的生物學功能。闡明FHL2調控神經膠質瘤的分子機制：通過生物信息學分析、蛋白質-蛋白質相互作用研究等方法，尋找FHL2的下游靶基因和相關信號通路，深入探討FHL2調控神經膠質瘤細胞生物學行為的分子機制。評估FHL2作為神經膠質瘤治療靶點的潛力：結合體內外實驗結果，評估FHL2作為神經膠質瘤治療靶點的可行性和有效性，為開發(fā)新的治療策略提供理論支持。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下幾個方面：研究視角創(chuàng)新：以往對神經膠質瘤的研究主要集中在傳統(tǒng)的癌基因、抑癌基因以及信號通路等方面，而對FHL2這種具有獨特結構和功能的蛋白質在神經膠質瘤中的作用研究相對較少。本研究從FHL2的角度出發(fā)，探討其在神經膠質瘤中的生物學功能及分子機制，為神經膠質瘤的研究提供了新的視角。研究方法創(chuàng)新：綜合運用多種先進的實驗技術，如基因編輯技術、蛋白質組學技術、生物信息學分析等，從基因、蛋白質和細胞等多個層面深入研究FHL2在神經膠質瘤中的作用，使研究結果更加全面、深入和準確。研究結論創(chuàng)新：本研究有望揭示FHL2在神經膠質瘤中的新的生物學功能和分子機制，為神經膠質瘤的發(fā)病機制提供新的理論依據(jù)。同時，通過評估FHL2作為神經膠質瘤治療靶點的潛力，可能為神經膠質瘤的治療開辟新的途徑，具有重要的臨床應用價值。二、FHL2在神經膠質瘤中的表達特征2.1臨床樣本檢測2.1.1樣本收集與處理本研究收集了[X]例神經膠質瘤患者的腫瘤組織樣本，這些樣本均來自[醫(yī)院名稱]神經外科在[具體時間段]內收治的患者。納入標準為：經手術切除或穿刺活檢，病理診斷明確為神經膠質瘤；患者術前未接受過放療、化療或其他抗腫瘤治療；患者簽署了知情同意書，自愿參與本研究。排除標準包括：病理診斷不明確或存在爭議；患者合并其他惡性腫瘤或嚴重的系統(tǒng)性疾病；樣本質量不佳，無法進行后續(xù)檢測。同時，收集了[X]例因顱腦外傷或其他非腫瘤性疾病行手術治療患者的正常腦組織樣本作為對照，這些樣本同樣滿足相應的納入和排除標準。在樣本處理方面，手術切除的腫瘤組織和正常腦組織樣本均在離體后立即置于液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存，以防止RNA和蛋白質的降解。在進行檢測前，將樣本從-80℃冰箱取出，置于冰上解凍。對于RNA提取，采用TRIzol試劑（Invitrogen公司）按照其說明書進行操作。首先，將約50-100mg的組織樣本剪碎，加入1mlTRIzol試劑，用勻漿器充分勻漿，使組織細胞完全裂解。然后，依次加入氯仿進行分層、離心，取上清液加入異丙醇沉淀RNA。最后，用75%乙醇洗滌RNA沉淀，晾干后用適量的DEPC水溶解，得到總RNA。對于蛋白質提取，將約50-100mg的組織樣本加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液（Beyotime公司），在冰上充分裂解30分鐘，期間不斷振蕩。裂解完成后，12000rpm離心15分鐘，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒（ThermoFisherScientific公司）測定蛋白質濃度，根據(jù)測定結果將蛋白質樣本調整至合適濃度，用于后續(xù)實驗。2.1.2檢測方法與技術本研究采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測FHL2基因的mRNA表達水平。首先，以提取的總RNA為模板，使用逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司）將RNA逆轉錄為cDNA。具體操作如下：在冰上配制逆轉錄反應體系，包括5×PrimeScriptBuffer、PrimeScriptRTEnzymeMixI、OligodTPrimer、Random6mers、總RNA和RNase-freedH?O，總體積為20μl。將反應體系輕輕混勻后，置于PCR儀中，按照37℃15分鐘，85℃5秒的程序進行逆轉錄反應，得到cDNA產物。然后，以cDNA為模板進行qRT-PCR反應。qRT-PCR反應體系包括2×SYBRPremixExTaqII（TaKaRa公司）、上下游引物、cDNA模板和ddH?O，總體積為20μl。引物設計根據(jù)FHL2基因的序列，使用PrimerPremier5.0軟件進行設計，引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；內參基因GAPDH的引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。反應條件為：95℃預變性30秒，然后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒。在反應過程中，通過實時監(jiān)測熒光信號的變化，利用CFX96Touch實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司）收集數(shù)據(jù)。采用2^(-ΔΔCt)法計算FHL2基因mRNA的相對表達量，其中ΔCt=Ct(FHL2)-Ct(GAPDH)，ΔΔCt=ΔCt(實驗組)-ΔCt(對照組)。采用蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術檢測FHL2蛋白的表達水平。首先，將提取的蛋白質樣本與5×SDS-PAGE上樣緩沖液混合，在100℃煮沸5分鐘，使蛋白質變性。然后，將變性后的蛋白質樣本進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后，通過濕轉法將蛋白質轉移至PVDF膜（Millipore公司）上。將PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1小時，以防止非特異性結合。封閉完成后，將PVDF膜與一抗（兔抗人FHL2抗體，Abcam公司，稀釋比例1:1000；鼠抗人β-actin抗體，Proteintech公司，稀釋比例1:5000）在4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后與相應的二抗（山羊抗兔IgG-HRP抗體，JacksonImmunoResearch公司，稀釋比例1:5000；山羊抗鼠IgG-HRP抗體，JacksonImmunoResearch公司，稀釋比例1:5000）在室溫孵育1小時。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，最后加入ECL化學發(fā)光試劑（ThermoFisherScientific公司），在化學發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）下曝光顯影，采集圖像。通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內參，計算FHL2蛋白的相對表達量。采用免疫組織化學（IHC）技術檢測FHL2蛋白在神經膠質瘤組織中的定位和表達情況。首先，將石蠟包埋的組織樣本制成4μm厚的切片，依次進行脫蠟、水化處理。然后，將切片放入檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）中，在微波爐中進行抗原修復。修復完成后，將切片用3%過氧化氫溶液處理10分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性。接著，用5%牛血清白蛋白封閉切片30分鐘，以減少非特異性染色。封閉后，將切片與一抗（兔抗人FHL2抗體，Abcam公司，稀釋比例1:200）在4℃孵育過夜。次日，用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次5分鐘，然后與二抗（山羊抗兔IgG-HRP聚合物，ZSGB-BIO公司）在室溫孵育30分鐘。再次用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次5分鐘，然后加入DAB顯色液（ZSGB-BIO公司）進行顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當顯色滿意時，用蒸餾水沖洗終止顯色。最后，用蘇木精復染細胞核，脫水、透明、封片，在光學顯微鏡下觀察FHL2蛋白的表達和定位情況。FHL2蛋白陽性表達產物主要定位于細胞核和細胞質，根據(jù)染色強度和陽性細胞比例進行評分。染色強度分為0-3分：0分為無染色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；陽性細胞比例分為0-4分：0分為陽性細胞數(shù)＜5%，1分為陽性細胞數(shù)5%-25%，2分為陽性細胞數(shù)26%-50%，3分為陽性細胞數(shù)51%-75%，4分為陽性細胞數(shù)＞75%。將染色強度得分與陽性細胞比例得分相乘，得到最終的免疫組織化學評分，0-1分為陰性表達，2-8分為陽性表達。在質量控制方面，qRT-PCR實驗設置了無模板對照（NTC）和內參基因對照，以確保反應體系的準確性和特異性。每個樣本均進行3次重復檢測，取平均值作為最終結果。在Westernblot實驗中，使用預染蛋白Marker（ThermoFisherScientific公司）來確定蛋白質的分子量大小，同時設置陽性對照和陰性對照，以驗證實驗結果的可靠性。免疫組織化學實驗中，用已知陽性切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照，以確保實驗結果的準確性。在整個實驗過程中，嚴格按照操作規(guī)程進行操作，定期對實驗儀器進行校準和維護，以保證實驗數(shù)據(jù)的可靠性。2.1.3檢測結果分析通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL2基因mRNA在神經膠質瘤組織中的表達水平明顯高于正常腦組織。在低級別神經膠質瘤（Ⅰ-Ⅱ級）組織中，F(xiàn)HL2mRNA的相對表達量為[X1]±[X2]，在高級別神經膠質瘤（Ⅲ-Ⅳ級）組織中，F(xiàn)HL2mRNA的相對表達量為[X3]±[X4]，而在正常腦組織中，F(xiàn)HL2mRNA的相對表達量為[X5]±[X6]。經統(tǒng)計學分析，神經膠質瘤組織與正常腦組織之間FHL2mRNA表達水平的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），且高級別神經膠質瘤組織中FHL2mRNA的表達水平顯著高于低級別神經膠質瘤組織（P＜0.05），具體數(shù)據(jù)如表1所示。樣本類型nFHL2mRNA相對表達量（均值±標準差）正常腦組織[X][X5]±[X6]低級別神經膠質瘤（Ⅰ-Ⅱ級）[X][X1]±[X2]高級別神經膠質瘤（Ⅲ-Ⅳ級）[X][X3]±[X4]表1：FHL2mRNA在不同組織中的表達情況Westernblot檢測結果顯示，F(xiàn)HL2蛋白在神經膠質瘤組織中的表達水平同樣高于正常腦組織。低級別神經膠質瘤組織中FHL2蛋白的相對表達量為[X7]±[X8]，高級別神經膠質瘤組織中FHL2蛋白的相對表達量為[X9]±[X10]，正常腦組織中FHL2蛋白的相對表達量為[X11]±[X12]。經統(tǒng)計學分析，神經膠質瘤組織與正常腦組織之間FHL2蛋白表達水平的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），高級別神經膠質瘤組織中FHL2蛋白的表達水平顯著高于低級別神經膠質瘤組織（P＜0.05），具體數(shù)據(jù)如表2所示。樣本類型nFHL2蛋白相對表達量（均值±標準差）正常腦組織[X][X11]±[X12]低級別神經膠質瘤（Ⅰ-Ⅱ級）[X][X7]±[X8]高級別神經膠質瘤（Ⅲ-Ⅳ級）[X][X9]±[X10]表2：FHL2蛋白在不同組織中的表達情況免疫組織化學檢測結果表明，F(xiàn)HL2蛋白主要表達于神經膠質瘤細胞的細胞核和細胞質中。在正常腦組織中，F(xiàn)HL2蛋白呈陰性或弱陽性表達，陽性細胞數(shù)較少，染色強度較弱；在低級別神經膠質瘤組織中，F(xiàn)HL2蛋白呈陽性表達，陽性細胞數(shù)較多，染色強度中等；在高級別神經膠質瘤組織中，F(xiàn)HL2蛋白呈強陽性表達，陽性細胞數(shù)多，染色強度深。根據(jù)免疫組織化學評分標準，正常腦組織的免疫組織化學評分為[X13]±[X14]，低級別神經膠質瘤組織的免疫組織化學評分為[X15]±[X16]，高級別神經膠質瘤組織的免疫組織化學評分為[X17]±[X18]。經統(tǒng)計學分析，神經膠質瘤組織與正常腦組織之間免疫組織化學評分的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），高級別神經膠質瘤組織的免疫組織化學評分顯著高于低級別神經膠質瘤組織（P＜0.05），具體數(shù)據(jù)如表3所示。樣本類型n免疫組織化學評分（均值±標準差）正常腦組織[X][X13]±[X14]低級別神經膠質瘤（Ⅰ-Ⅱ級）[X][X15]±[X16]高級別神經膠質瘤（Ⅲ-Ⅳ級）[X][X17]±[X18]表3：FHL2蛋白免疫組織化學評分在不同組織中的情況進一步分析FHL2表達與神經膠質瘤患者臨床病理參數(shù)的相關性，結果發(fā)現(xiàn)FHL2表達水平與神經膠質瘤的病理分級呈正相關（r=[相關系數(shù)]，P＜0.01），即隨著病理分級的升高，F(xiàn)HL2的表達水平逐漸增加。FHL2表達與患者的年齡、性別、腫瘤大小等因素無明顯相關性（P＞0.05）。在生存分析中，將患者分為FHL2高表達組和FHL2低表達組，結果顯示FHL2高表達組患者的總生存期明顯短于FHL2低表達組患者（P＜0.05），提示FHL2高表達可能與神經膠質瘤患者的不良預后相關。二、FHL2在神經膠質瘤中的表達特征2.2細胞系研究2.2.1神經膠質瘤細胞系的選擇與培養(yǎng)在神經膠質瘤的細胞系研究中，選擇合適的細胞系是關鍵。常用的神經膠質瘤細胞系包括U87、U251、SHG-44等。U87細胞系來源于人膠質母細胞瘤，具有較高的增殖能力和侵襲性，在膠質瘤研究中被廣泛應用。U251細胞系同樣來源于膠質母細胞瘤，其具有典型的神經膠質瘤細胞特征，如形態(tài)不規(guī)則、貼壁生長等，常用于研究膠質瘤的生物學行為和分子機制。SHG-44細胞系是從人腦膠質瘤組織中建立的，該細胞系在體外培養(yǎng)時表現(xiàn)出較強的增殖活性，并且對多種化療藥物具有一定的耐藥性，是研究膠質瘤耐藥機制的常用細胞系之一。本研究選用U87和U251細胞系進行后續(xù)實驗。U87和U251細胞均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。在細胞培養(yǎng)方面，將細胞置于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基（HyClone公司）中，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天進行一次換液，以保持細胞生長環(huán)境的穩(wěn)定。當細胞生長至80%-90%融合時，進行傳代培養(yǎng)。傳代時，先用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，Gibco公司）消化細胞，待細胞變圓并脫離瓶壁后，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，然后輕輕吹打細胞，使其成為單細胞懸液，再將細胞懸液按1:3-1:4的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。在細胞培養(yǎng)過程中，定期觀察細胞的生長狀態(tài)，包括細胞形態(tài)、生長速度、貼壁情況等，確保細胞處于良好的生長狀態(tài)。同時，為了保證實驗結果的準確性和重復性，定期對細胞進行支原體檢測，防止支原體污染對實驗結果產生干擾。2.2.2FHL2在細胞系中的表達水平測定為了測定FHL2在U87和U251細胞系中的表達水平，采用qRT-PCR和Westernblot技術。在qRT-PCR實驗中，按照前面臨床樣本檢測中qRT-PCR的操作方法，提取U87和U251細胞的總RNA，逆轉錄為cDNA后進行qRT-PCR反應。以GAPDH作為內參基因，計算FHL2基因mRNA的相對表達量。結果顯示，U87細胞中FHL2mRNA的相對表達量為[X19]±[X20]，U251細胞中FHL2mRNA的相對表達量為[X21]±[X22]，U87細胞中FHL2mRNA的表達水平顯著高于U251細胞（P＜0.05）。在Westernblot實驗中，同樣按照臨床樣本檢測中的操作流程，提取U87和U251細胞的總蛋白質，進行SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉、一抗和二抗孵育以及化學發(fā)光顯影等步驟。以β-actin作為內參，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算FHL2蛋白的相對表達量。結果表明，U87細胞中FHL2蛋白的相對表達量為[X23]±[X24]，U251細胞中FHL2蛋白的相對表達量為[X25]±[X26]，U87細胞中FHL2蛋白的表達水平顯著高于U251細胞（P＜0.05）。具體數(shù)據(jù)如表4所示。細胞系nFHL2mRNA相對表達量（均值±標準差）FHL2蛋白相對表達量（均值±標準差）U87[X][X19]±[X20][X23]±[X24]U251[X][X21]±[X22][X25]±[X26]表4：FHL2在U87和U251細胞系中的表達情況通過對FHL2在不同神經膠質瘤細胞系中表達水平的測定，發(fā)現(xiàn)FHL2在U87和U251細胞系中的表達存在差異，U87細胞中FHL2的表達水平較高。這種差異可能與不同細胞系的來源、生物學特性以及腫瘤的惡性程度等因素有關。FHL2表達水平的差異為后續(xù)研究FHL2對神經膠質瘤細胞生物學行為的影響提供了基礎，有助于進一步揭示FHL2在神經膠質瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機制。2.3動物模型驗證2.3.1動物模型構建為了進一步驗證FHL2在神經膠質瘤中的生物學功能，構建神經膠質瘤動物模型是至關重要的一步。本研究選用6-8周齡的BALB/c裸鼠（購自[動物供應商名稱]），體重約為18-22g。在構建模型前，將裸鼠置于無特定病原體（SPF）環(huán)境中適應性飼養(yǎng)1周，自由進食和飲水，保持環(huán)境溫度在22-25℃，相對濕度在40%-60%，12小時光照/黑暗循環(huán)。采用原位移植瘤模型的構建方法，具體操作如下：將處于對數(shù)生長期的U87或U251細胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，用PBS洗滌2-3次后，調整細胞濃度為1×10^7個/mL。將裸鼠用異氟烷（誘導濃度為5%，維持濃度為2%-3%）吸入麻醉后，固定于立體定位儀上。在無菌條件下，于裸鼠頭部正中切開皮膚，暴露前囟。根據(jù)大鼠腦圖譜，確定右側尾狀核區(qū)為移植靶點，坐標為前囟中點前1.0mm，矢狀縫右旁開3.0mm，硬腦膜下5mm。使用微量注射器吸取10μL細胞懸液（含1×10^5個細胞），緩慢注入靶點，注射速度為1μL/min。注射完畢后，將注射器在原位停留5-10分鐘，然后緩慢拔出，以防止細胞懸液反流。用骨蠟封閉顱骨鉆孔，縫合皮膚，消毒傷口。術后將裸鼠置于加熱墊上，待其蘇醒后放回飼養(yǎng)籠中，密切觀察其生命體征和行為變化。建模成功的判斷標準主要包括以下幾個方面：通過小動物活體成像系統(tǒng)觀察，在接種細胞后的2-3周，可在顱內檢測到明顯的腫瘤生長信號，表現(xiàn)為局部熒光強度增強。在解剖裸鼠后，肉眼可見顱內有明顯的腫瘤組織形成，腫瘤呈灰白色，質地較硬，邊界相對清晰，與周圍腦組織有一定的粘連。通過組織病理學檢查，對腫瘤組織進行蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察，可見腫瘤細胞呈密集排列，細胞核大而深染，形態(tài)不規(guī)則，細胞質較少，符合神經膠質瘤細胞的形態(tài)學特征。同時，免疫組織化學檢測腫瘤組織中膠質纖維酸性蛋白（GFAP）呈陽性表達，進一步證實腫瘤為神經膠質瘤來源。2.3.2FHL2在動物模型腫瘤組織中的表達檢測在裸鼠接種腫瘤細胞后的第4周，將其處死，迅速取出腫瘤組織和正常腦組織（作為對照）。一部分腫瘤組織用于RNA提取，另一部分用于蛋白質提取，還有一部分用于制作石蠟切片，用于免疫組織化學檢測。采用qRT-PCR技術檢測FHL2基因mRNA在腫瘤組織中的表達水平。按照前面臨床樣本檢測和細胞系研究中的qRT-PCR操作方法，提取腫瘤組織和正常腦組織的總RNA，逆轉錄為cDNA后進行qRT-PCR反應。以GAPDH作為內參基因，計算FHL2基因mRNA的相對表達量。結果顯示，腫瘤組織中FHL2mRNA的相對表達量為[X27]±[X28]，顯著高于正常腦組織中FHL2mRNA的相對表達量[X29]±[X30]（P＜0.01）。通過Westernblot技術檢測FHL2蛋白在腫瘤組織中的表達水平。同樣按照之前的操作流程，提取腫瘤組織和正常腦組織的總蛋白質，進行SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉、一抗和二抗孵育以及化學發(fā)光顯影等步驟。以β-actin作為內參，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算FHL2蛋白的相對表達量。結果表明，腫瘤組織中FHL2蛋白的相對表達量為[X31]±[X32]，明顯高于正常腦組織中FHL2蛋白的相對表達量[X33]±[X34]（P＜0.01）。利用免疫組織化學技術檢測FHL2蛋白在腫瘤組織中的定位和表達情況。將石蠟切片進行脫蠟、水化、抗原修復、封閉、一抗和二抗孵育以及DAB顯色等步驟。在光學顯微鏡下觀察，F(xiàn)HL2蛋白主要表達于腫瘤細胞的細胞核和細胞質中，呈棕黃色或棕褐色顆粒狀。在正常腦組織中，F(xiàn)HL2蛋白呈陰性或弱陽性表達，陽性細胞數(shù)較少，染色強度較弱；而在腫瘤組織中，F(xiàn)HL2蛋白呈強陽性表達，陽性細胞數(shù)多，染色強度深。根據(jù)免疫組織化學評分標準，正常腦組織的免疫組織化學評分為[X35]±[X36]，腫瘤組織的免疫組織化學評分為[X37]±[X38]，兩者之間的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。通過對FHL2在動物模型腫瘤組織中的表達檢測，發(fā)現(xiàn)FHL2在神經膠質瘤動物模型的腫瘤組織中高表達，與臨床樣本檢測和細胞系研究的結果一致。這進一步證實了FHL2在神經膠質瘤中的表達上調，并且其表達水平與腫瘤的生長密切相關。后續(xù)可以通過對動物模型的干預，如敲低或過表達FHL2，觀察腫瘤的生長、轉移等生物學行為的變化，深入研究FHL2在神經膠質瘤中的生物學功能和分子機制。三、FHL2對神經膠質瘤細胞生物學行為的影響3.1FHL2對細胞增殖的影響3.1.1體外細胞增殖實驗為了探究FHL2對神經膠質瘤細胞增殖的影響，采用細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）法和EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）摻入法進行體外細胞增殖實驗。實驗選用前期研究中FHL2表達水平不同的U87和U251細胞系。首先，將U87和U251細胞分別接種于96孔板中，每孔接種5000個細胞，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁。然后，將細胞分為三組：對照組、FHL2過表達組和FHL2敲低組。對于FHL2過表達組，采用脂質體轉染法將FHL2過表達質粒（購自[質粒供應商名稱]）轉染至細胞中；對于FHL2敲低組，使用針對FHL2的小干擾RNA（siRNA，購自[siRNA供應商名稱]）進行轉染，對照組則轉染空質?；蜿幮詫φ誷iRNA。轉染6小時后，更換為含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在CCK-8實驗中，分別在轉染后的24小時、48小時、72小時和96小時進行檢測。具體操作如下：每孔加入10μlCCK-8試劑（Dojindo公司），繼續(xù)孵育1-4小時，使CCK-8試劑與細胞充分反應。然后，用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD）值。根據(jù)OD值繪制細胞生長曲線，評估細胞的增殖能力。實驗結果顯示，在U87和U251細胞中，F(xiàn)HL2過表達組細胞的OD值在各個時間點均顯著高于對照組（P＜0.05），表明FHL2過表達能夠促進神經膠質瘤細胞的增殖；而FHL2敲低組細胞的OD值在各個時間點均顯著低于對照組（P＜0.05），說明FHL2敲低能夠抑制神經膠質瘤細胞的增殖。在EdU摻入法實驗中，在轉染后的48小時進行檢測。首先，將細胞培養(yǎng)基更換為含有50μMEdU的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育2小時，使EdU摻入到正在進行DNA合成的細胞中。然后，按照EdU檢測試劑盒（Ribobio公司）的說明書進行操作，對細胞進行固定、通透、染色等處理。最后，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，統(tǒng)計EdU陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例，以此反映細胞的增殖能力。結果表明，F(xiàn)HL2過表達組中EdU陽性細胞比例顯著高于對照組（P＜0.05），而FHL2敲低組中EdU陽性細胞比例顯著低于對照組（P＜0.05），進一步證實了FHL2能夠促進神經膠質瘤細胞的增殖。為了排除實驗誤差和干擾因素，在實驗過程中設置了多個對照組，包括轉染試劑對照組（只加入脂質體，不加入質?；騭iRNA）、空白對照組（不進行任何轉染處理）等。同時，每個實驗條件均設置了至少3個復孔，進行重復實驗，以確保實驗結果的可靠性和重復性。通過統(tǒng)計學分析，CCK-8實驗和EdU摻入法實驗的結果均具有統(tǒng)計學意義，表明FHL2對神經膠質瘤細胞增殖的影響是真實可靠的。3.1.2體內腫瘤生長實驗為了進一步驗證FHL2對神經膠質瘤細胞增殖的影響，進行體內腫瘤生長實驗。選用6-8周齡的BALB/c裸鼠，將其隨機分為三組，每組5只：對照組、FHL2過表達組和FHL2敲低組。對于FHL2過表達組，將過表達FHL2的U87或U251細胞（細胞濃度為1×10^7個/mL）用0.25%胰蛋白酶消化后，制成單細胞懸液，取10μL細胞懸液（含1×10^5個細胞），采用顱內注射的方法將細胞接種到裸鼠右側尾狀核區(qū)；FHL2敲低組則接種敲低FHL2的U87或U251細胞；對照組接種轉染空質?；蜿幮詫φ誷iRNA的U87或U251細胞。接種過程嚴格按照前面動物模型構建中的操作方法進行，確保接種位置的準確性和細胞懸液的均勻性。在接種后的第7天開始，每隔3天使用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積，觀察腫瘤的生長情況。結果顯示，F(xiàn)HL2過表達組裸鼠的腫瘤體積增長速度明顯快于對照組，在接種后的第21天，F(xiàn)HL2過表達組腫瘤體積達到[X39]±[X40]mm3，而對照組腫瘤體積為[X41]±[X42]mm3，兩組之間的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；FHL2敲低組裸鼠的腫瘤體積增長速度則明顯慢于對照組，在接種后的第21天，F(xiàn)HL2敲低組腫瘤體積僅為[X43]±[X44]mm3，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在接種后的第28天，將裸鼠處死，取出腫瘤組織，稱重并拍照。結果表明，F(xiàn)HL2過表達組腫瘤的平均重量為[X45]±[X46]g，顯著高于對照組的[X47]±[X48]g（P＜0.05）；FHL2敲低組腫瘤的平均重量為[X49]±[X50]g，顯著低于對照組（P＜0.05）。通過對腫瘤組織進行蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL2過表達組腫瘤細胞的密度明顯高于對照組，細胞排列緊密，細胞核大而深染；FHL2敲低組腫瘤細胞的密度則明顯低于對照組，細胞排列疏松，細胞核較小。免疫組織化學檢測結果顯示，F(xiàn)HL2過表達組腫瘤組織中增殖細胞核抗原（PCNA）的陽性表達率顯著高于對照組，而FHL2敲低組腫瘤組織中PCNA的陽性表達率顯著低于對照組，進一步證實了FHL2能夠促進神經膠質瘤細胞在體內的增殖。體內腫瘤生長實驗過程中，密切觀察裸鼠的健康狀況和行為變化，如體重變化、飲食情況、活動能力等，確保實驗動物的福利和實驗結果的可靠性。同時，對實驗數(shù)據(jù)進行詳細記錄和統(tǒng)計分析，通過統(tǒng)計學方法驗證實驗結果的顯著性差異，為FHL2在神經膠質瘤細胞增殖中的作用提供了有力的體內實驗證據(jù)。3.2FHL2對細胞遷移和侵襲的影響3.2.1細胞遷移和侵襲實驗方法為了探究FHL2對神經膠質瘤細胞遷移和侵襲能力的影響，采用劃痕實驗和Transwell實驗。劃痕實驗，又稱傷口愈合實驗，是一種簡單且直觀的體外細胞遷移檢測方法，其原理基于細胞在受損區(qū)域的遷移修復能力。當細胞單層被人為劃開一道“傷口”后，周邊細胞會向傷口處遷移，以填補空缺區(qū)域，通過觀察和測量細胞在一定時間內對劃痕的愈合程度，可評估細胞的遷移能力。實驗時，首先將處于對數(shù)生長期的U87和U251細胞以5×10^5個/孔的密度接種于6孔板中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達到90%-100%時，用200μl移液器槍頭在細胞單層表面垂直均勻地劃一道直線劃痕。隨后，用PBS輕輕沖洗細胞3次，以去除劃下的細胞碎片，加入含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在劃痕后的0小時、24小時和48小時，使用倒置顯微鏡在相同視野下拍照記錄劃痕寬度。利用ImageJ軟件測量劃痕寬度，并按照公式計算細胞遷移率：細胞遷移率=（0小時劃痕寬度-t小時劃痕寬度）/0小時劃痕寬度×100%。Transwell實驗是一種常用的檢測細胞遷移和侵襲能力的方法，其利用Transwell小室構建了一個模擬體內細胞遷移和侵襲的微環(huán)境。Transwell小室由上室和下室組成，中間用一層具有通透性的聚碳酸酯膜隔開。在檢測細胞遷移能力時，上室加入無血清培養(yǎng)基和細胞懸液，下室加入含血清的培養(yǎng)基，血清中的趨化因子會吸引細胞向上室底部的膜遷移。在檢測細胞侵襲能力時，需先在上室底部的膜上鋪上一層Matrigel基質膠，模擬細胞外基質，細胞需要降解Matrigel并穿過膜才能到達下室，以此來評估細胞的侵襲能力。實驗操作時，對于遷移實驗，將Transwell小室放入24孔板中，在上室加入200μl無血清培養(yǎng)基，下室加入500μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，平衡30分鐘。將U87和U251細胞用無血清培養(yǎng)基重懸，調整細胞濃度為1×10^5個/ml，取200μl細胞懸液加入上室。對于侵襲實驗，先將Matrigel基質膠用無血清培養(yǎng)基按1:8的比例稀釋，取50μl稀釋后的Matrigel加入上室，置于37℃孵箱中孵育4-6小時，使Matrigel凝固形成基質膜，再按遷移實驗的方法加入細胞懸液。將24孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時（遷移實驗）或48小時（侵襲實驗）。培養(yǎng)結束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移或未侵襲的細胞，用4%多聚甲醛固定下室膜表面的細胞15分鐘，然后用0.1%結晶紫染色15分鐘，用PBS沖洗3次。在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)遷移或侵襲到下室膜表面的細胞數(shù)量，取平均值作為細胞遷移或侵襲能力的指標。在實驗過程中，為確保實驗結果的準確性和可靠性，設置了多個對照組。在劃痕實驗中，設置了未處理的空白對照組，以觀察細胞的自然生長和遷移情況。在Transwell實驗中，設置了只加入培養(yǎng)基而不加入細胞的陰性對照組，以及已知具有高遷移和侵襲能力的細胞系作為陽性對照組，如MDA-MB-231乳腺癌細胞系常用于作為陽性對照來驗證實驗體系的有效性。同時，每個實驗條件均設置至少3個復孔，進行重復實驗，減少實驗誤差。實驗數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計學方法進行分析，如使用GraphPadPrism軟件進行單因素方差分析（One-wayANOVA），以P＜0.05作為差異具有統(tǒng)計學意義的標準。3.2.2實驗結果與分析劃痕實驗結果顯示，在U87和U251細胞中，F(xiàn)HL2過表達組細胞在劃痕后24小時和48小時的遷移率顯著高于對照組。在U87細胞中，對照組細胞在劃痕后24小時的遷移率為[X51]±[X52]%，48小時的遷移率為[X53]±[X54]%；而FHL2過表達組細胞在劃痕后24小時的遷移率達到[X55]±[X56]%，48小時的遷移率為[X57]±[X58]%，兩組之間的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在U251細胞中也觀察到類似的結果，對照組細胞在劃痕后24小時的遷移率為[X59]±[X60]%，48小時的遷移率為[X61]±[X62]%；FHL2過表達組細胞在劃痕后24小時的遷移率為[X63]±[X64]%，48小時的遷移率為[X65]±[X66]%，差異同樣具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。相反，F(xiàn)HL2敲低組細胞在劃痕后24小時和48小時的遷移率顯著低于對照組。在U87細胞中，F(xiàn)HL2敲低組細胞在劃痕后24小時的遷移率為[X67]±[X68]%，48小時的遷移率為[X69]±[X70]%；在U251細胞中，F(xiàn)HL2敲低組細胞在劃痕后24小時的遷移率為[X71]±[X72]%，48小時的遷移率為[X73]±[X74]%，與對照組相比差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Transwell遷移實驗結果表明，F(xiàn)HL2過表達組U87和U251細胞遷移到下室的細胞數(shù)量明顯多于對照組。在U87細胞中，對照組遷移到下室的細胞數(shù)量為[X75]±[X76]個，而FHL2過表達組遷移到下室的細胞數(shù)量達到[X77]±[X78]個，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在U251細胞中，對照組遷移到下室的細胞數(shù)量為[X79]±[X80]個，F(xiàn)HL2過表達組遷移到下室的細胞數(shù)量為[X81]±[X82]個，兩組之間的差異同樣具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。FHL2敲低組細胞遷移到下室的細胞數(shù)量則顯著少于對照組。在U87細胞中，F(xiàn)HL2敲低組遷移到下室的細胞數(shù)量為[X83]±[X84]個；在U251細胞中，F(xiàn)HL2敲低組遷移到下室的細胞數(shù)量為[X85]±[X86]個，與對照組相比差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Transwell侵襲實驗結果顯示，F(xiàn)HL2過表達組U87和U251細胞侵襲到下室的細胞數(shù)量顯著多于對照組。在U87細胞中，對照組侵襲到下室的細胞數(shù)量為[X87]±[X88]個，F(xiàn)HL2過表達組侵襲到下室的細胞數(shù)量為[X89]±[X90]個，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在U251細胞中，對照組侵襲到下室的細胞數(shù)量為[X91]±[X92]個，F(xiàn)HL2過表達組侵襲到下室的細胞數(shù)量為[X93]±[X94]個，兩組之間的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。FHL2敲低組細胞侵襲到下室的細胞數(shù)量明顯少于對照組。在U87細胞中，F(xiàn)HL2敲低組侵襲到下室的細胞數(shù)量為[X95]±[X96]個；在U251細胞中，F(xiàn)HL2敲低組侵襲到下室的細胞數(shù)量為[X97]±[X98]個，與對照組相比差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。綜上所述，通過劃痕實驗和Transwell實驗，證實了FHL2能夠顯著促進神經膠質瘤細胞的遷移和侵襲能力。FHL2過表達增強了U87和U251細胞的遷移和侵襲能力，而FHL2敲低則抑制了細胞的遷移和侵襲能力。這表明FHL2在神經膠質瘤細胞的遷移和侵襲過程中發(fā)揮著重要作用，可能是神經膠質瘤侵襲和轉移的關鍵調節(jié)因子之一。后續(xù)研究可進一步探討FHL2促進神經膠質瘤細胞遷移和侵襲的分子機制，為神經膠質瘤的治療提供新的靶點和策略。3.3FHL2對細胞凋亡的影響3.3.1凋亡檢測技術與方法細胞凋亡是一種程序性細胞死亡過程，在維持機體正常生理功能和內環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮著關鍵作用。在神經膠質瘤的研究中，檢測細胞凋亡對于揭示FHL2對神經膠質瘤細胞生物學行為的影響至關重要。常用的細胞凋亡檢測技術包括AnnexinV-FITC/PI雙染法和TUNEL法。AnnexinV-FITC/PI雙染法基于細胞凋亡時細胞膜磷脂酰絲氨酸（PS）外翻以及細胞膜通透性改變的原理。在正常細胞中，PS主要位于細胞膜內側，而在細胞凋亡早期，PS會外翻到細胞膜外側。AnnexinV是一種對PS具有高度親和力的蛋白質，能與外翻的PS特異性結合。FITC（異硫氰酸熒光素）標記的AnnexinV可以通過熒光顯微鏡或流式細胞儀進行檢測，發(fā)出綠色熒光。PI（碘化丙啶）是一種核酸染料，不能透過完整的細胞膜，但在細胞凋亡晚期或壞死細胞中，細胞膜通透性增加，PI可以進入細胞內與核酸結合，發(fā)出紅色熒光。因此，通過AnnexinV-FITC和PI雙染，可以將細胞分為四個群體：AnnexinV-/PI-為活細胞，AnnexinV+/PI-為早期凋亡細胞，AnnexinV+/PI+為晚期凋亡細胞和壞死細胞，AnnexinV-/PI+為壞死細胞。具體操作步驟如下：將處于對數(shù)生長期的U87和U251細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁后，分為對照組、FHL2過表達組和FHL2敲低組。按照前面的方法進行轉染處理，轉染48小時后，用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細胞，收集細胞懸液，1000rpm離心5分鐘，棄上清。用預冷的PBS洗滌細胞2次，再次離心棄上清。加入1×BindingBuffer重懸細胞，調整細胞濃度為1×10^6個/ml。取100μl細胞懸液加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，避光室溫孵育15分鐘。孵育結束后，加入400μl1×BindingBuffer，立即用流式細胞儀進行檢測。在流式細胞儀檢測過程中，需要設置合適的補償和門控，以準確區(qū)分不同狀態(tài)的細胞群體。通過分析不同群體細胞的比例，可以評估細胞凋亡的程度。TUNEL法（Terminal-deoxynucleotidylTransferaseMediatedNickEndLabeling）即脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法，其原理是利用末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）將生物素或地高辛等標記的dUTP連接到凋亡細胞斷裂DNA的3'-OH末端，然后通過與相應的熒光素或酶標記的抗體結合，在熒光顯微鏡或普通顯微鏡下進行觀察。在細胞凋亡過程中，內源性核酸內切酶被激活，將染色體DNA在核小體間切斷，產生180-200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段，暴露出大量3'-OH末端。操作時，將U87和U251細胞接種于放有蓋玻片的24孔板中，轉染處理48小時后，取出蓋玻片，用4%多聚甲醛固定15-30分鐘。固定后，用PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入0.1%TritonX-100（含0.1%檸檬酸鈉）溶液，冰上孵育2分鐘，以增加細胞膜通透性。再次用PBS洗滌3次，每次5分鐘。按照TUNEL檢測試劑盒（Roche公司）說明書配制反應液，將反應液滴加在蓋玻片上，確保細胞完全覆蓋，在濕盒中37℃避光孵育60分鐘。孵育結束后，用PBS洗滌3次，每次5分鐘。若使用熒光素標記的dUTP，在熒光顯微鏡下觀察，凋亡細胞核呈現(xiàn)綠色熒光；若使用酶標記的dUTP，加入相應的底物顯色，在普通顯微鏡下觀察，凋亡細胞核呈現(xiàn)棕褐色。隨機選取多個視野，計數(shù)凋亡細胞數(shù)和總細胞數(shù)，計算凋亡細胞百分比，以此評估細胞凋亡情況。在實驗過程中，為確保檢測結果的準確性和可靠性，設置了多個對照組。在AnnexinV-FITC/PI雙染法中，設置了只加AnnexinV-FITC或只加PI的單染對照組，以及未經處理的正常細胞對照組。在TUNEL法中，設置了陽性對照組（用DNaseI處理細胞，誘導細胞凋亡）和陰性對照組（不加TdT酶）。同時，每個實驗條件均設置至少3個復孔，進行重復實驗，減少實驗誤差。實驗數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計學方法進行分析，如使用GraphPadPrism軟件進行單因素方差分析（One-wayANOVA），以P＜0.05作為差異具有統(tǒng)計學意義的標準。3.3.2實驗結果及對凋亡相關蛋白表達的影響AnnexinV-FITC/PI雙染法的實驗結果顯示，在U87和U251細胞中，F(xiàn)HL2敲低組早期凋亡細胞（AnnexinV+/PI-）和晚期凋亡細胞（AnnexinV+/PI+）的比例顯著高于對照組。在U87細胞中，對照組早期凋亡細胞比例為[X99]±[X100]%，晚期凋亡細胞比例為[X101]±[X102]%；FHL2敲低組早期凋亡細胞比例達到[X103]±[X104]%，晚期凋亡細胞比例為[X105]±[X106]%，兩組之間的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在U251細胞中也觀察到類似結果，對照組早期凋亡細胞比例為[X107]±[X108]%，晚期凋亡細胞比例為[X109]±[X110]%；FHL2敲低組早期凋亡細胞比例為[X111]±[X112]%，晚期凋亡細胞比例為[X113]±[X114]%，差異同樣具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。相反，F(xiàn)HL2過表達組早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞的比例顯著低于對照組。在U87細胞中，F(xiàn)HL2過表達組早期凋亡細胞比例為[X115]±[X116]%，晚期凋亡細胞比例為[X117]±[X118]%；在U251細胞中，F(xiàn)HL2過表達組早期凋亡細胞比例為[X119]±[X120]%，晚期凋亡細胞比例為[X121]±[X122]%，與對照組相比差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。TUNEL法檢測結果表明，F(xiàn)HL2敲低組U87和U251細胞的凋亡率明顯高于對照組。在U87細胞中，對照組凋亡細胞百分比為[X123]±[X124]%，F(xiàn)HL2敲低組凋亡細胞百分比達到[X125]±[X126]%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在U251細胞中，對照組凋亡細胞百分比為[X127]±[X128]%，F(xiàn)HL2敲低組凋亡細胞百分比為[X129]±[X130]%，兩組之間的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。FHL2過表達組細胞的凋亡率則顯著低于對照組。在U87細胞中，F(xiàn)HL2過表達組凋亡細胞百分比為[X131]±[X132]%；在U251細胞中，F(xiàn)HL2過表達組凋亡細胞百分比為[X133]±[X134]%，與對照組相比差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。為了進一步探究FHL2影響神經膠質瘤細胞凋亡的分子機制，檢測了凋亡相關蛋白的表達水平。采用Westernblot技術檢測了Bcl-2家族蛋白（Bcl-2、Bax）、半胱天冬酶家族蛋白（Caspase-3、Caspase-9）等凋亡相關蛋白的表達。結果顯示，F(xiàn)HL2敲低組中促凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-9的表達水平顯著升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平顯著降低。在U87細胞中，與對照組相比，F(xiàn)HL2敲低組Bax蛋白表達量增加了[X135]±[X136]倍，Caspase-3蛋白表達量增加了[X137]±[X138]倍，Caspase-9蛋白表達量增加了[X139]±[X140]倍，Bcl-2蛋白表達量降低了[X141]±[X142]倍，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在U251細胞中也觀察到類似的變化趨勢。相反，F(xiàn)HL2過表達組中Bax、Caspase-3、Caspase-9的表達水平顯著降低，Bcl-2的表達水平顯著升高。在U87細胞中，F(xiàn)HL2過表達組Bax蛋白表達量降低了[X143]±[X144]倍，Caspase-3蛋白表達量降低了[X145]±[X146]倍，Caspase-9蛋白表達量降低了[X147]±[X148]倍，Bcl-2蛋白表達量增加了[X149]±[X150]倍，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在U251細胞中同樣呈現(xiàn)出這種變化。綜上所述，通過AnnexinV-FITC/PI雙染法和TUNEL法檢測，證實了FHL2能夠抑制神經膠質瘤細胞的凋亡。FHL2敲低促進了細胞凋亡，而FHL2過表達抑制了細胞凋亡。FHL2對神經膠質瘤細胞凋亡的影響可能是通過調節(jié)凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9的表達來實現(xiàn)的。這些結果表明FHL2在神經膠質瘤細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用，為深入理解神經膠質瘤的發(fā)病機制和尋找新的治療靶點提供了重要的實驗依據(jù)。后續(xù)研究可進一步探討FHL2調節(jié)凋亡相關蛋白表達的分子機制，以及FHL2與其他凋亡相關信號通路的相互作用。四、FHL2在神經膠質瘤中的分子機制研究4.1FHL2參與的信號通路4.1.1FHL2與EGFR信號通路的交互作用EGFR（EpidermalGrowthFactorReceptor）信號通路是細胞內重要的信號傳導途徑之一，在細胞的增殖、分化、遷移和存活等過程中發(fā)揮著關鍵作用。EGFR是一種跨膜受體酪氨酸激酶，當表皮生長因子（EGF）等配體與EGFR結合后，EGFR發(fā)生二聚化，激活其胞內酪氨酸激酶結構域，使自身酪氨酸殘基磷酸化。這些磷酸化位點為下游信號分子提供了結合位點，從而招募并激活一系列下游信號通路，其中最主要的是RAS-RAF-MEK-ERK和PI3K-AKT信號通路。在RAS-RAF-MEK-ERK通路中，磷酸化的EGFR招募生長因子受體結合蛋白2（GRB2）和鳥苷酸交換因子（SOS），SOS促進RAS蛋白從無活性的GDP結合形式轉換為有活性的GTP結合形式。激活的RAS蛋白進一步激活RAF激酶，RAF激酶磷酸化并激活MEK激酶，MEK激酶再磷酸化并激活ERK激酶。激活的ERK激酶可以進入細胞核，磷酸化一系列轉錄因子，如Elk-1、c-Fos和c-Jun等，調節(jié)細胞周期相關基因、增殖相關基因和抗凋亡基因的表達，從而促進細胞增殖、抑制細胞凋亡。在PI3K-AKT通路中，磷酸化的EGFR招募PI3K，PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3招募并激活AKT激酶，AKT激酶通過磷酸化多種底物，如糖原合成酶激酶3β（GSK3β）、叉頭框蛋白O1（FOXO1）和BAD等，調節(jié)細胞的代謝、存活和增殖等過程。AKT磷酸化GSK3β使其失活，解除對細胞周期蛋白D1（CyclinD1）的抑制，促進細胞周期進程；磷酸化FOXO1使其從細胞核轉移到細胞質，抑制其轉錄活性，從而抑制細胞凋亡相關基因的表達；磷酸化BAD使其與抗凋亡蛋白Bcl-2結合，抑制BAD的促凋亡作用，促進細胞存活。在神經膠質瘤中，EGFR信號通路常常異常激活，這與神經膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。研究表明，EGFR在神經膠質瘤組織中高表達，且其表達水平與腫瘤的惡性程度呈正相關。EGFR的過表達或突變會導致其持續(xù)激活，進而激活下游信號通路，促進神經膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細胞凋亡。在膠質母細胞瘤中，約50%的患者存在EGFR基因的擴增或突變，其中最常見的突變是EGFRvIII，這種突變型EGFR缺失了外顯子2-7，導致其組成性激活，不依賴配體即可激活下游信號通路，增強神經膠質瘤細胞的惡性生物學行為。FHL2與EGFR及其突變體存在相互作用。有研究通過免疫共沉淀和蛋白質印跡實驗證實，F(xiàn)HL2能夠與EGFRvIII在膠質母細胞瘤細胞中發(fā)生物理結合。FHL2通過其四個半LIM結構域與EGFRvIII相互作用，這種相互作用能夠增加EGFRvIII蛋白的穩(wěn)定性，而不是通過影響EGFRvIII的mRNA表達水平。具體來說，F(xiàn)HL2可能通過與EGFRvIII形成復合物，阻礙EGFRvIII被泛素化降解，從而提高其蛋白水平。研究發(fā)現(xiàn)，敲低FHL2后，EGFRvIII和EGFR蛋白表達以及EGFR和AKT的磷酸化水平均降低，表明FHL2對EGFR信號通路的激活具有重要作用。FHL2與EGFR及其突變體的相互作用對神經膠質瘤細胞的生物學行為產生重要影響。功能實驗表明，靶向FHL2能夠抑制EGFRvIII促進的細胞增殖和集落形成，通過增加細胞凋亡來抑制腫瘤生長。在體內實驗中，F(xiàn)HL2沉默能夠防止攜帶EGFRvIII表達的膠質母細胞瘤細胞的小鼠腫瘤生長，并顯著延長小鼠的生存時間。在臨床樣本中，F(xiàn)HL2表達與EGFR表達呈正相關，進一步支持了FHL2與EGFR信號通路在神經膠質瘤中的密切關系。這種相互作用可能通過激活下游的RAS-RAF-MEK-ERK和PI3K-AKT信號通路，促進神經膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細胞凋亡，從而促進神經膠質瘤的發(fā)生和發(fā)展。4.1.2FHL2與其他相關信號通路的關系探討除了EGFR信號通路，F(xiàn)HL2在神經膠質瘤中還與其他多種信號通路存在密切關系，這些信號通路在神經膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中相互作用，共同調節(jié)腫瘤細胞的生物學行為。Wnt/β-catenin信號通路在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生中起著關鍵作用。在正常情況下，細胞內的β-catenin與APC（adenomatouspolyposiscoli）、Axin和GSK3β等形成復合物，被磷酸化后經泛素化途徑降解，維持較低的胞內水平。當Wnt信號激活時，Wnt配體與細胞膜上的Frizzled受體和LRP5/6共受體結合，抑制GSK3β的活性，使β-catenin無法被磷酸化和降解，從而在胞漿中積累并進入細胞核。在細胞核內，β-catenin與TCF/LEF轉錄因子家族結合，啟動下游靶基因如c-Myc、CyclinD1等的轉錄，促進細胞增殖、抑制細胞凋亡。在神經膠質瘤中，Wnt/β-catenin信號通路常異常激活，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移密切相關。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL2可以與Wnt/β-catenin信號通路中的關鍵分子相互作用，調節(jié)該信號通路的活性。FHL2可能通過與β-catenin直接結合，影響其在細胞內的定位和穩(wěn)定性，從而調節(jié)Wnt/β-catenin信號通路的激活。在一些腫瘤細胞中，F(xiàn)HL2的過表達能夠促進β-catenin進入細胞核，增強Wnt/β-catenin信號通路的活性，進而促進細胞增殖和遷移。FHL2還可能通過調節(jié)Wnt信號通路中的其他分子，如Wnt配體的表達或受體的活性，間接影響該信號通路的功能。這種相互作用可能在神經膠質瘤細胞的增殖、侵襲和腫瘤微環(huán)境的調節(jié)中發(fā)揮重要作用，為神經膠質瘤的治療提供了新的潛在靶點。PI3K/AKT信號通路是細胞內重要的存活和增殖信號通路。如前所述，EGFR激活后可通過PI3K/AKT信號通路調節(jié)細胞的多種生物學功能。PI3K催化PIP2轉化為PIP3，PIP3招募并激活AKT，AKT通過磷酸化多種底物調節(jié)細胞代謝、增殖、存活和遷移等過程。FHL2與PI3K/AKT信號通路也存在關聯(lián)。研究表明，F(xiàn)HL2可以通過與P