1T/HEBQIAXXXX—2025農(nóng)桿菌介導棉花遺傳轉化技術規(guī)程本文件規(guī)定了農(nóng)桿菌介導棉花遺傳轉化技術的原理、設備和用具、試劑、培養(yǎng)基、無菌苗培養(yǎng)、侵染液制備、遺傳轉化、生根培養(yǎng)、煉苗移栽、目的基因檢測。本文件適用于農(nóng)桿菌介導棉花遺傳轉化的操作過程。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T19495.7轉基因產(chǎn)品檢測抽樣和制樣方法3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1農(nóng)桿菌介導agrobacteriummediation利用土壤中普遍存在的革蘭氏陰性細菌-農(nóng)桿菌，來實現(xiàn)外源基因向植物細胞的轉移和整合的轉基因技術。3.2遺傳轉化genetictransformation同源或異源的游離DNA分子（質粒和染色體DNA）被自然或人工感受態(tài)細胞攝取，并得到表達的水平方向的基因轉移過程。4原理農(nóng)桿菌介導法是通過誘導農(nóng)桿菌侵染過的下胚軸產(chǎn)生轉化的愈傷組織，再將轉化的愈傷組織進行擴增，進一步誘導產(chǎn)生胚性愈傷并誘導植株再生。以棉花幼苗下胚軸為受體材料，利用農(nóng)桿菌中Ti質?；騌i質粒上的T-DNA可被轉移并整合到棉花基因組的特性，通過棉花下胚軸受傷后釋放的信號分子激活農(nóng)桿菌的Vir基因，促使T-DNA攜帶目的基因進入棉花細胞并整合到基因組中，使棉花獲得新性狀。5設備和用具5.1儀器電子天平（精度0.0001g、0.01mg）、超凈工作臺、培養(yǎng)箱、細菌培養(yǎng)箱、超低溫冰箱（-80℃)。T/HEBQIAXXXX—202525.2用具剪刀、手術刀、鑷子、無菌濾紙、培養(yǎng)瓶、離心管、培養(yǎng)皿、營養(yǎng)缽。6試劑6.1除非另有規(guī)定，在分析中僅使用確認為分析純的試劑和蒸餾水或無菌水。所有試劑溶液宜大體積（1L）配制、小體積（10mL）分裝后經(jīng)高壓滅菌后使用，不宜高壓滅菌的試劑通過0.22μm濾膜過濾6.2試劑：硝酸鉀、硫酸鎂或七水合硫酸鎂、磷酸二氫鉀、無水氯化鈣或二水合氯化鈣、硼酸、四水硫酸錳或一水硫酸錳、七水硫酸鋅、六水合氯化鈷、五水硫酸銅、碘化鉀、二水合鉬酸鈉、硫酸亞鐵、乙二胺四乙酸二鈉、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸、甘氨酸、肌醇、葡萄糖、植物凝膠、2，4-D、激動素、硝酸銨、六水合氯化鎂、硫酸卡那霉素、頭孢類抗生素、吲哚丁酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、牛肉浸膏、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂粉、利福平、胰蛋白胨、甘露醇。7培養(yǎng)基7.1MS培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基成分見表1，加蒸餾水定容至1L，調(diào)節(jié)pH=5.85～5.90。表1MS培養(yǎng)基成分T/HEBQIAXXXX—202537.2無菌苗培養(yǎng)基成分：1/2大量元素、15g葡萄糖、2.6g植物凝膠，加蒸餾水定容至1L，調(diào)節(jié)pH=6.00～6.10。7.3共培養(yǎng)培養(yǎng)基成分：MS培養(yǎng)基、0.1mg2，4-D、0.1mg激動素、1.65g硝酸銨、1.0g六水合氯化鎂、30g葡萄糖、2.6g植物凝膠，加蒸餾水定容至1L，調(diào)節(jié)pH=5.85～5.95。7.4愈傷組織誘導培養(yǎng)基成分：MS培養(yǎng)基、0.1mg2，4-D、0.1mg激動素、1.65g硝酸銨、1.0g六水合氯化鎂、30g葡萄糖、2.6g植物凝膠，加蒸餾水定容至1L，調(diào)節(jié)pH=5.85～5.95。滅菌后加50mg硫酸卡那霉素、400mg頭孢類抗生素。7.5愈傷組織分化培養(yǎng)基成分：MS培養(yǎng)基、0.5mg吲哚丁酸、0.15mg激動素、1.9g硝酸鉀、1.0g谷氨酰胺、0.5g天冬酰胺、30g葡萄糖、2.6g植物凝膠，加蒸餾水定容至1L，調(diào)節(jié)pH=5.90～5.95。7.6生根培養(yǎng)基成分：1/2MS培養(yǎng)基、15g葡萄糖、2.6g植物凝膠，加蒸餾水定容至1L，調(diào)節(jié)pH=5.90～5.95。7.7YEP固體培養(yǎng)基成分：5g牛肉浸膏、10g酵母提取物、5g氯化鈉、10g瓊脂粉、50mg利福平、50mg硫酸卡那霉素，加蒸餾水定容至1L，調(diào)節(jié)pH=6.50～7.00。7.8YEP液體培養(yǎng)基成分：5g牛肉浸膏、10g酵母提取物、5g氯化鈉、50mg利福平、50mg硫酸卡那霉素，加蒸餾水定容至1L，調(diào)節(jié)pH=6.50～7.00。7.9侵染液培養(yǎng)基成分：5g胰蛋白胨、5g氯化鈉、0.1g七水合硫酸鎂、0.25g磷酸二氫鉀、5g甘露醇、1.0g甘氨酸，加蒸餾水定容至1L，調(diào)節(jié)pH=5.80～5.85。8無菌苗培養(yǎng)8.1種子處理8.1.1收獲的棉花種子經(jīng)軋花脫去長絨，用適量硫酸脫去表面短絨后，用去離子水洗凈表面硫酸殘留，將種子晾干。8.1.2在超凈工作臺上，挑選籽粒健康飽滿的種子，剝除堅硬種皮，移至滅菌的培養(yǎng)瓶中，用0.1%氯化汞浸泡8min～10min。8.1.3使用無菌水洗凈表面氯化汞殘留，將滅菌后的種子置于含有無菌苗培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中（每個培養(yǎng)瓶宜放5?！?粒種子），放入培養(yǎng)箱中，在26℃~28℃下暗培養(yǎng)，待露白發(fā)芽。8.2幼苗培養(yǎng)T/HEBQIAXXXX—20254培養(yǎng)1d～2d后進行扶苗，將生長出的胚根插入無菌苗培養(yǎng)基中，在26℃~28℃培養(yǎng)箱中，暗培養(yǎng)5d～6d，待幼苗下胚軸伸長至6cm～7cm，即可進行農(nóng)桿菌侵染。9侵染液制備9.1從超低溫冰箱中取出帶有目的基因的農(nóng)桿菌菌液，將菌液在含相應抗生素（根據(jù)構建的載體所帶的抗性基因選擇）的YEP固體培養(yǎng)基板上劃線培養(yǎng)，于細菌培養(yǎng)箱26℃~28℃條件下培養(yǎng)2d～3d。9.2挑選單菌落到YEP液體培養(yǎng)基中，26℃~28℃條件下，擴繁12h～16h。9.3將菌液移入離心管中，4℃條件下，6000rpm，離心5min～8min，倒掉上清液，收集菌體。9.4用侵染液培養(yǎng)基重懸菌體，使OD600值至0.5～1.0，4℃保存?zhèn)溆谩?0遺傳轉化10.1下胚軸預處理用剪刀剪去幼苗子葉端和胚根端各1.0cm，用手術刀將下胚軸切成0.5cm～0.8cm的切段，將切段保存?zhèn)溆谩?0.2農(nóng)桿菌浸染10.2.1取農(nóng)桿菌菌液溶解于侵染液培養(yǎng)基中，26℃~28℃條件下，置于搖床振蕩活化。10.2.2將切段移至培養(yǎng)瓶中，用處理后的農(nóng)桿菌菌液侵染5min～8min，期間輕微晃動使侵染均勻。10.2.3侵染后用鑷子取出切段，用無菌濾紙吸掉多余菌液，在培養(yǎng)皿中晾干。10.3共培養(yǎng)待切段表面稍干燥，轉接到鋪有無菌濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，每段下胚軸均應接觸到無菌濾紙。在培養(yǎng)箱20℃~22℃條件下，暗培養(yǎng)36h～48h。10.4選擇培養(yǎng)使用無菌水將下胚軸沖洗干凈，用無菌濾紙吸去表面水分，將下胚軸移至含有50mg/L硫酸卡那霉素、400mg/L頭孢類抗生素的愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，或者根據(jù)各菌株中植物表達載體篩選基因選擇相對應的篩選劑，在培養(yǎng)箱26℃~28℃條件下，16h光照/8h暗培養(yǎng)，光照強度宜為1500Lx～2000Lx，20d～30d繼代培養(yǎng)一次。10.5分化誘導10.5.1.1在超凈工作臺，用鑷子取下胚軸兩端疏松的淡黃或白色愈傷組織。10.5.1.2待愈傷組織長至指甲蓋大小，移至愈傷組織分化培養(yǎng)基上繼續(xù)誘導培養(yǎng)。10.5.1.3每28d挑選淡黃色、小米粒狀的胚性愈傷組織，轉接至愈傷組織分化培養(yǎng)基上，在26℃~28℃,光照強度宜為1500Lx～2000Lx，16h光照/8h暗培養(yǎng)條件下，進行繼代培養(yǎng)。11生根培養(yǎng)將愈傷組織分化出的子葉胚移至生根培養(yǎng)基上，將子葉胚根部插入生根培養(yǎng)基內(nèi)誘導生根，培養(yǎng)條件為25℃~28℃,光照強度宜為1500Lx～2000Lx，16h光照/8h暗培養(yǎng)20d～30d。T/HEBQIAXXXX—2025512煉苗移栽12.1煉苗打開培養(yǎng)瓶的封口膜，在26℃~28℃,光照強度宜為1500Lx～3000Lx，16h光照/8h暗培養(yǎng)條件下，煉苗2d～3d。12.2室內(nèi)移栽12.2.1選擇根系生長健壯的幼苗，用無菌水洗凈附著的培養(yǎng)基，水培7d左右，每2d～3d換一次水。12.2.2將幼苗移栽于營養(yǎng)缽中，放在溫室中培養(yǎng)，定期澆水，遮陰緩苗7d～14d。13目的基因檢測13.1PCR擴增檢測13.1.1按GB/T19495.7的規(guī)定對幼苗進行抽樣，采用PCR檢測方法對幼苗進行目標基因檢測。13.1.2待轉化苗長出7片～8片葉時，取2片～3片葉提取基因組DNA，對目的基因進