七氟醚預(yù)處理對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠TDAG8表達(dá)的影響一、研究背景腦缺血再灌注損傷是臨床常見且嚴(yán)重的病理過程，可導(dǎo)致一系列神經(jīng)功能障礙，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞和分子生物學(xué)事件。七氟醚作為一種常用的吸入性麻醉藥，近年來研究發(fā)現(xiàn)其在腦缺血再灌注損傷中具有潛在的保護(hù)作用。TDAG8（T-celldeath-associatedgene8）是一種在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)的G蛋白偶聯(lián)受體，其在腦缺血再灌注損傷中的作用逐漸受到關(guān)注，但七氟醚預(yù)處理與TDAG8表達(dá)之間的關(guān)系尚不明確。深入探究這一關(guān)系，有望為腦缺血再灌注損傷的防治提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。二、研究目的本研究旨在探討七氟醚預(yù)處理對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠TDAG8表達(dá)的影響，明確七氟醚預(yù)處理是否通過調(diào)節(jié)TDAG8的表達(dá)發(fā)揮腦保護(hù)作用，為臨床治療腦缺血再灌注損傷提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。三、材料與方法（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取健康成年雄性SD大鼠[X]只，體重[250-300]g，購自[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商名稱]。動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、濕度（50±10）%的環(huán)境中，自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。（二）主要試劑與儀器試劑：七氟醚（[生產(chǎn)廠家]）、2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC，[生產(chǎn)廠家]）、兔抗大鼠TDAG8多克隆抗體（[生產(chǎn)廠家]）、二抗（[生產(chǎn)廠家]）、RNA提取試劑盒（[生產(chǎn)廠家]）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（[生產(chǎn)廠家]）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（[生產(chǎn)廠家]）等。儀器：小動(dòng)物麻醉機(jī)（[品牌及型號(hào)]）、腦立體定位儀（[品牌及型號(hào)]）、PCR儀（[品牌及型號(hào)]）、凝膠成像系統(tǒng)（[品牌及型號(hào)]）、冰凍切片機(jī)（[品牌及型號(hào)]）等。（三）實(shí)驗(yàn)分組將大鼠隨機(jī)分為3組，每組[X]只：假手術(shù)組（Sham組）：僅暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，不進(jìn)行線栓阻斷大腦中動(dòng)脈操作。腦缺血再灌注組（I/R組）：采用線栓法制備局灶性腦缺血再灌注模型，缺血2小時(shí)后再灌注24小時(shí)。七氟醚預(yù)處理+腦缺血再灌注組（Sevo+I/R組）：在腦缺血再灌注模型制備前，先將大鼠置于含有2%七氟醚的麻醉箱中預(yù)處理30分鐘，然后進(jìn)行腦缺血再灌注模型制備，缺血2小時(shí)后再灌注24小時(shí)。（四）局灶性腦缺血再灌注模型制備參照Longa等的方法，采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。大鼠經(jīng)10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于腦立體定位儀上。頸部正中切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈。將一端燒鈍的4-0尼龍線經(jīng)頸外動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈，直至遇到阻力，表明線栓已阻塞大腦中動(dòng)脈起始部，阻斷血流2小時(shí)。然后輕輕拔出尼龍線，實(shí)現(xiàn)再灌注，再灌注時(shí)間為24小時(shí)。假手術(shù)組大鼠僅進(jìn)行頸部血管分離，不插入線栓。（五）標(biāo)本采集與檢測(cè)神經(jīng)功能缺損評(píng)分：再灌注24小時(shí)后，采用Longa5分制評(píng)分法對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。腦梗死體積測(cè)定：神經(jīng)功能缺損評(píng)分后，迅速斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干。將大腦冠狀切成2mm厚的腦片，放入2%TTC溶液中，37℃避光孵育30分鐘。正常腦組織染成紅色，梗死腦組織呈白色。用Image-ProPlus軟件分析腦梗死體積，腦梗死體積百分比=（梗死面積/全腦面積）×100%。TDAG8蛋白表達(dá)檢測(cè)：采用免疫組織化學(xué)法和Westernblot法檢測(cè)TDAG8蛋白在大鼠腦組織中的表達(dá)。免疫組織化學(xué)染色步驟如下：取大鼠腦組織，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，制成4μm厚的切片。切片脫蠟至水，微波修復(fù)抗原，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉非特異性抗原。加入兔抗大鼠TDAG8多克隆抗體（1:200），4℃孵育過夜。次日，PBS沖洗后加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30分鐘。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片。在顯微鏡下觀察并拍照，用Image-ProPlus軟件分析陽性細(xì)胞平均光密度值。Westernblot檢測(cè)步驟如下：取大鼠腦組織，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉2小時(shí)，加入兔抗大鼠TDAG8多克隆抗體（1:1000），4℃孵育過夜。次日，TBST沖洗后加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1小時(shí)。ECL發(fā)光液顯色，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算TDAG8蛋白相對(duì)表達(dá)量。TDAG8mRNA表達(dá)檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)TDAG8mRNA在大鼠腦組織中的表達(dá)。取大鼠腦組織，用RNA提取試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，采用特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。引物序列如下：TDAG8上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'；β-actin上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算TDAG8mRNA相對(duì)表達(dá)量。四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。五、預(yù)期結(jié)果神經(jīng)功能缺損評(píng)分和腦梗死體積：與Sham組相比，I/R組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著升高，腦梗死體積明顯增大（P<0.05）。與I/R組相比，Sevo+I/R組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低，腦梗死體積減?。≒<0.05）。TDAG8蛋白和mRNA表達(dá)：免疫組織化學(xué)和Westernblot結(jié)果顯示，與Sham組相比，I/R組大鼠腦組織中TDAG8蛋白表達(dá)顯著增加（P<0.05）。與I/R組相比，Sevo+I/R組大鼠腦組織中TDAG8蛋白表達(dá)降低（P<0.05）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與Sham組相比，I/R組大鼠腦組織中TDAG8mRNA表達(dá)顯著增加（P<0.05）。與I/R組相比，Sevo+I/R組大鼠腦組織中TDAG8mRNA表達(dá)降低（P<0.05）。六、討論本研究預(yù)期結(jié)果表明，七氟醚預(yù)處理能夠改善局灶性腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能，減小腦梗死體積，同時(shí)下調(diào)TDAG8蛋白和mRNA在腦組織中的表達(dá)。這提示七氟醚預(yù)處理可能通過抑制TDAG8的表達(dá)發(fā)揮腦保護(hù)作用。TDAG8作為一種G蛋白偶聯(lián)受體，在腦缺血再灌注損傷過程中可能參與了炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等病理生理過程。七氟醚預(yù)處理可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，抑制TDAG8的表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，保護(hù)神經(jīng)元功能。然而，本研究仍存在一些局限性，如未進(jìn)一步探討七氟醚預(yù)