第3課時(shí)

微生物數(shù)量的測定第1章微生物技術(shù)學(xué)習(xí)導(dǎo)航

1.閱讀教材P17內(nèi)容，概述測定某種微生物數(shù)量的方法和步驟。2.結(jié)合教材P15～17“測定土壤中微生物的數(shù)量”實(shí)驗(yàn)，掌握使用平板菌落計(jì)數(shù)法測定土壤中微生物的數(shù)量。重難點(diǎn)擊

1.掌握測定某種微生物數(shù)量的方法和步驟。2.學(xué)會(huì)使用平板菌落計(jì)數(shù)法測定土壤中微生物的數(shù)量。一、微生物數(shù)量測定的方法和原理二、土壤中尿素分解菌數(shù)量的測定內(nèi)容索引當(dāng)堂檢測一、微生物數(shù)量測定的方法和原理基礎(chǔ)梳理微生物數(shù)量的測定也是重要的微生物技術(shù)之一，平板菌落計(jì)數(shù)法是一種應(yīng)用廣泛的微生物數(shù)量測定方法。1.平板菌落計(jì)數(shù)法的原理：根據(jù)微生物在高度稀釋的條件下，

培養(yǎng)基上所形成的單個(gè)菌落，是由

繁殖而成的，即一個(gè)菌落代表

。2.計(jì)算方法：從平板上的菌落數(shù)推測出每克樣品中的菌落數(shù)的計(jì)算方法是：同一稀釋度的菌落平均數(shù)÷0.2÷稀釋度×10。固體一個(gè)單細(xì)胞一個(gè)單細(xì)胞3.優(yōu)缺點(diǎn)(1)優(yōu)點(diǎn)：能測出樣品的

數(shù)，可用于微生物的選種與

、分離純化及其他方面的測定。(2)缺點(diǎn)：操作煩瑣、時(shí)間較長、測定值常受各種因素的影響。4.該方法統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)比活菌的實(shí)際數(shù)目低，這是因?yàn)開____________

。活菌育種當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落1.為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？答案土壤中各種微生物的數(shù)量是不同的，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離。問題探究答案答案2.平板菌落計(jì)數(shù)法(1)平板菌落計(jì)數(shù)法根據(jù)操作步驟的不同可分為哪兩種？答案①涂布平板法：用滅過菌的涂布器將一定量(一般為0.1mL)的適當(dāng)稀釋過的菌液涂布在瓊脂培養(yǎng)基的表面，然后保溫培養(yǎng)直到菌落的出現(xiàn)。記錄菌落的數(shù)目并換算成每毫升樣品中的活細(xì)胞的數(shù)量。②倒平板法：將已知體積(0.1～1mL)的適當(dāng)稀釋過的菌液加到滅過菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，然后倒入溶化后冷卻至45℃的瓊脂培養(yǎng)基，水平晃動(dòng)混勻，待凝固后保溫培養(yǎng)到出現(xiàn)菌落，然后與涂布平板法同樣計(jì)數(shù)。(2)平板菌落計(jì)數(shù)法中換算樣品的含菌數(shù)依據(jù)什么數(shù)據(jù)換算？答案依據(jù)稀釋倍數(shù)、取樣接種量和菌落數(shù)。(3)每隔多少小時(shí)統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目？應(yīng)選取菌落數(shù)目何時(shí)(穩(wěn)定時(shí)或不穩(wěn)定時(shí))的記錄作為結(jié)果？答案每隔24小時(shí)統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果。(4)統(tǒng)計(jì)菌落時(shí)，要求細(xì)菌和放線菌每皿的菌落數(shù)目范圍是多少？霉菌每皿的菌落數(shù)目范圍是多少？答案若測定細(xì)菌和放線菌，要求每皿以30～300個(gè)菌落為宜，若是霉菌則以每皿10～100個(gè)菌落為宜。答案歸納總結(jié)要使平板菌落計(jì)數(shù)法準(zhǔn)確，需要掌握的關(guān)鍵步驟有：嚴(yán)格的無菌操作，否則容易被雜菌污染；稀釋液要充分混勻，吸量準(zhǔn)確，否則結(jié)果不準(zhǔn)確；多做幾個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，減少誤差。拓展應(yīng)用1.用平板菌落計(jì)數(shù)法來統(tǒng)計(jì)樣品中活菌的數(shù)目。在某稀釋濃度下某同學(xué)做了若干個(gè)平板并統(tǒng)計(jì)每個(gè)平板的菌落數(shù)，最接近樣品中菌體數(shù)真實(shí)值的是A.菌落數(shù)量最多的平板B.菌落數(shù)量最少的平板C.菌落數(shù)量適中的平板D.取若干個(gè)平板菌落數(shù)量的平均值答案解析解析用平板菌落計(jì)數(shù)法對樣品中活菌數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，只是一種估測，根據(jù)此方法的實(shí)驗(yàn)過程可知，在某一稀釋度下涂布的平板菌體數(shù)具有一定的偶然性，并不是絕對均勻，所以取若干個(gè)平板菌落數(shù)量的平均值比較接近樣品中菌體數(shù)的真實(shí)值。2.若某一稀釋度下，平板上生長的平均菌落數(shù)為80，涂布平板時(shí)所用的稀釋液體積為0.1mL，稀釋液的稀釋倍數(shù)為106，則每克樣品中的活菌數(shù)約為A.8×108

B.8×107C.8×105

D.8×106解析每克樣品中的活菌數(shù)＝(80÷0.1)×106。答案解析二、土壤中尿素分解菌數(shù)量的測定基礎(chǔ)梳理土壤中含有種類繁多的微生物，不同微生物的數(shù)量有差別，我們通過實(shí)驗(yàn)來測定土壤中尿素分解菌的數(shù)量。1.下面是土壤中尿素分解菌培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基的配方，請分析：成分用量尿素20g酵母粉0.1g磷酸二氫鉀9.1g磷酸氫二鈉9.5g酚紅0.01g瓊脂20g加熱溶解后，用1mol/LNaOH溶液調(diào)pH至7.2～7.4，補(bǔ)加蒸餾水定容至1000mL(1)在該培養(yǎng)基配方中，為微生物的生長提供碳源的是

，提供氮源的是

，瓊脂的作用是

。(2)微生物要利用尿素需要分泌脲酶，不能分泌脲酶的微生物不能利用尿素。因此該培養(yǎng)基對微生物具有選擇作用，其選擇機(jī)制是__________________

。酵母粉尿素凝固劑只有能夠分泌脲酶從而以尿素作為氮源的微生物才能在該培養(yǎng)基上生長(3)細(xì)菌合成的脲酶分解尿素產(chǎn)生了氨，使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，pH上升，使酚紅變色，菌落周圍變

?？捎脕龛b定選出的菌落是不是尿素分解菌。紅2.結(jié)合下圖分析實(shí)驗(yàn)過程和注意事項(xiàng)步驟實(shí)驗(yàn)操作操作提示制備培養(yǎng)基分別配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和以____為唯一氮源的

培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為

，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了_________制備土壤樣品稀釋液①稱取土樣

g，放入盛有

mL無菌水并帶有玻璃珠的錐形瓶中，充分搖勻；②吸取上清液

mL，轉(zhuǎn)移至盛有

mL的生理鹽水的無菌大試管中，按照上圖流程進(jìn)行樣品的稀釋，依次制成稀釋度為10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6的稀釋液①應(yīng)在

旁稱取土樣；②要充分搖勻尿素選擇對照選擇作用109019火焰加樣取10套無菌培養(yǎng)皿，取

、_____和

不同稀釋度分別做3個(gè)重復(fù)平板，留下一個(gè)平板做空白對照。每皿接種稀釋菌液各0.2mL實(shí)驗(yàn)時(shí)要對所用的平板、試管作好

。如培養(yǎng)皿要注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時(shí)間、

、培養(yǎng)物等倒平板將菌液移入培養(yǎng)皿后立即倒入溶化并冷卻至

℃左右的尿素培養(yǎng)基(倒入量為15mL)，平置，待凝倒平板時(shí)要晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使_______

混合均勻培養(yǎng)將涂布好的培養(yǎng)皿放在

℃溫度下培養(yǎng)在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)目應(yīng)明顯

選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，才說明選擇培養(yǎng)基有選擇作用10－410－510－6標(biāo)記稀釋度45菌液和培養(yǎng)基37多于計(jì)數(shù)當(dāng)菌落數(shù)目

時(shí)，選取菌落數(shù)在_______

的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。在同一稀釋度下，至少對

個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出

，并根據(jù)平板所對應(yīng)的稀釋度計(jì)算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目如果學(xué)生選取的是同一種土樣，結(jié)果相差太遠(yuǎn)，教師需要引導(dǎo)學(xué)生一起分析產(chǎn)生差異的原因穩(wěn)定30～3003平均值1.試寫出測定土壤中尿素分解菌數(shù)量的實(shí)驗(yàn)流程。答案制備尿素固體培養(yǎng)基→制備土壤樣品稀釋液→加樣→倒平板→培養(yǎng)→統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)→計(jì)算樣品中的菌數(shù)。2.甲、乙兩位同學(xué)用平板菌落計(jì)數(shù)法測定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)。在對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計(jì)結(jié)果(1)甲同學(xué)在該濃度下涂布了一個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)為230，該同學(xué)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果是否真實(shí)可靠？為什么？答案不真實(shí)。為增加實(shí)驗(yàn)的說服力與準(zhǔn)確性，應(yīng)設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn)，在同一稀釋度下涂布3個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)結(jié)果后計(jì)算平均值。問題探究答案(2)乙同學(xué)在該濃度下涂布了3個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學(xué)將21舍去，然后取平均值。該同學(xué)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的處理是否合理？為什么？答案不合理。微生物計(jì)數(shù)時(shí)，如果實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不一致的情況，應(yīng)分析實(shí)驗(yàn)過程中可能的影響因素，找出差異的原因，而不能簡單地舍棄后進(jìn)行計(jì)數(shù)。答案(3)某同學(xué)在三種稀釋度下吸取0.1mL的菌液涂布平板，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，得到以下的數(shù)據(jù)，試計(jì)算1g樣品的活菌數(shù)。平板稀釋度平板1平板2平板310－332036035610－421223428710－5212318答案10－4的稀釋度下取0.1mL涂布的三個(gè)平板上的菌落數(shù)在30～300之間，計(jì)算其平均值為(212＋234＋287)/3≈244。進(jìn)一步可以換算出1g樣品中活菌數(shù)為244÷0.1÷10－4×10＝2.44×108。答案答案(4)為什么統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)比活菌的實(shí)際數(shù)目低？答案當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)菌連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落。答案3.微生物數(shù)量測定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(1)如果平板上長出的菌落不是均勻分散的，而是集中在一起，可能的原因有哪些？答案菌體密度太大；倒平板后沒有立即搖勻；平板冷凝水太多。(2)同一個(gè)稀釋度的3個(gè)平板上的細(xì)菌的數(shù)目應(yīng)該比較接近，如果長出的菌落數(shù)差別較大，可能的原因有哪些？答案取樣不準(zhǔn)確；稀釋不均勻；倒平板操作時(shí)培養(yǎng)基溫度差別較大等。(3)實(shí)驗(yàn)中的無菌操作主要有哪些？答案①培養(yǎng)基、錐形瓶、試管、鏟子、信封等，需要進(jìn)行滅菌。②稱取土壤要在火焰旁進(jìn)行。③稀釋土壤溶液的每一步操作都要在火焰旁進(jìn)行。歸納總結(jié)分離尿素分解菌操作中的注意事項(xiàng)(1)在實(shí)驗(yàn)操作中，每個(gè)步驟都要注意無菌操作，以防培養(yǎng)基被污染，影響實(shí)驗(yàn)效果。(2)樣品稀釋液的最佳濃度為獲得每個(gè)平板上有30～300個(gè)菌落，這個(gè)稀釋度細(xì)菌一般為104、105、106倍稀釋液，放線菌一般為103、104、105倍稀釋液，真菌一般為102、103、104倍稀釋液。(3)為排除非測試因素(培養(yǎng)基)的干擾，實(shí)驗(yàn)需設(shè)置牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進(jìn)行空白對照。(4)每一稀釋倍數(shù)的菌液都至少要涂布3個(gè)平板，作為重復(fù)實(shí)驗(yàn)，求其平均值，若其中有菌落數(shù)與其他平板懸殊過大的，需要對該平板重新制作。拓展應(yīng)用3.如圖為“土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)”實(shí)驗(yàn)中樣品稀釋示意圖。據(jù)圖分析下列敘述正確的是答案A.4號(hào)試管中稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)得到的菌落平均數(shù)一定恰為5號(hào)的10倍B.5號(hào)試管的結(jié)果表明每克該土壤中的菌株數(shù)目為1.7×108個(gè)C.在用移液管吸取菌液進(jìn)行梯度稀釋時(shí)，可用手指輕壓移液管上的橡皮頭，

吹吸三次，使菌液與無菌水充分混勻D.某一稀釋度下至少涂布3個(gè)平板，該實(shí)驗(yàn)方法統(tǒng)計(jì)得到的結(jié)果常會(huì)比實(shí)

際活菌數(shù)目高4.自然界中的微生物往往是混雜生長的。人們在研究微生物時(shí)一般要將它們分離提純，然后進(jìn)行數(shù)量的測定。下面是對大腸桿菌進(jìn)行數(shù)量測定的實(shí)驗(yàn)，請回答有關(guān)問題。(1)實(shí)驗(yàn)步驟①制備稀釋倍數(shù)為102、103、104、105、106的系列稀釋液。②為了得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果，應(yīng)選用_________法接種樣品。③適宜溫度下培養(yǎng)。涂布分離答案(2)結(jié)果分析①測定大腸桿菌數(shù)目時(shí)，在對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下幾種統(tǒng)計(jì)結(jié)果，與事實(shí)更加接近的是__________。A.一個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是230B.兩個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是220和260，取平均值240C.三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是400、212和256，取平均值289D.四個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是210、260、240和250，取平均值240②一同學(xué)在稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基上測得平板上菌落數(shù)的平均值為212，那么每克樣品中的活菌數(shù)約是(涂布平板時(shí)所用的稀釋液體積為0.2mL)____________。③用這種方法測定菌體密度時(shí)，實(shí)際活菌數(shù)量要比測得的數(shù)量____(填“多”或“少”)，因?yàn)開_______________________________________________________。答案解析問題導(dǎo)析1.06×109個(gè)多當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)菌連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落返回上頁答案問題導(dǎo)析

(1)因?yàn)轭}中操作的目的是對大腸桿菌進(jìn)行數(shù)量的測定，所以接種的方法是

。(2)測定活菌數(shù)量時(shí)，選擇的平板越多誤差

，且選擇的平板要能形成

個(gè)菌落。(3)所做的多個(gè)平板中，如果其中一個(gè)平板中菌落的數(shù)目明顯__________其他幾個(gè)平板，則說明該平板不符合要求，應(yīng)

或舍棄。涂布分離法越小30～300多于或少于重做返回上頁解析(1)若對大腸桿菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，則需要用涂布分離法接種樣品。(2)①應(yīng)選取多個(gè)菌落數(shù)相差不大的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，取其平均值。②212÷0.2×106＝1.06×109(個(gè))。③因?yàn)橐粋€(gè)菌落可能由兩個(gè)或多個(gè)細(xì)菌連在一起生長而成，所以實(shí)際活菌數(shù)量要比測得的數(shù)量多。一題多變(1)如果某同學(xué)的稀釋倍數(shù)僅為104，則測定的數(shù)值要比題中測定的數(shù)值高還是低？為什么？答案低。因?yàn)橄♂尡稊?shù)太低，則大部分菌落是由多個(gè)細(xì)菌繁殖而成，所以測定的菌落的數(shù)值要偏低。(2)第(2)問第①小題C項(xiàng)中菌落數(shù)為400的平板不符合要求，試分析該平板中菌落數(shù)目多于其他平板的可能的原因。答案①培養(yǎng)基被污染，一些菌落是由雜菌繁殖而成的；②接種過程中由于操作不當(dāng)感染了雜菌；③取菌液時(shí)沒有搖晃，導(dǎo)致所取菌液中細(xì)菌個(gè)體濃度偏大等。答案方法鏈接用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)微生物的方法(1)涂布分離法操作要求：按照平行重復(fù)的原則，每一稀釋度的菌液涂布3個(gè)或3個(gè)以上的平板。(2)計(jì)數(shù)的時(shí)機(jī)：當(dāng)各平板上菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)進(jìn)行計(jì)數(shù)。(3)選擇可用于計(jì)數(shù)的平板：選擇菌落數(shù)在30～300之間的平板(相同稀釋度的平板均符合該特點(diǎn))進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后取平均值。課堂小結(jié)平板菌落稀釋液倒平板菌落當(dāng)堂檢測1.通常用來作為菌種鑒定的重要依據(jù)是A.菌落

B.細(xì)菌形態(tài)C.細(xì)菌體積

D.細(xì)菌結(jié)構(gòu)解析細(xì)菌個(gè)體非常小，不易直接觀察，不同細(xì)菌菌落的形態(tài)特征不同，而且可以用肉眼觀察，因此常作為鑒定菌種的依據(jù)。23451答案解析√2.下列能選擇出分解尿素的細(xì)菌的培養(yǎng)基是A.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、瓊脂、水B.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、瓊脂、水C.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、尿素、瓊脂、水D.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、水答案√234513.請選出下列正確的操作步驟①土壤取樣②稱取10g土壤，取出放入盛有90mL無菌水的錐形瓶中③吸取0.1mL土壤溶液進(jìn)行平板涂布④依次制成10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6稀釋度的稀釋液A.①→②→③→④

B.①→③→②→④C.①→②→④→③

D.①→④→②→③答案23451√4.從土壤中分離以尿素為氮源的細(xì)菌，下列實(shí)驗(yàn)操作不正確的是A.將土壤用無菌水稀釋，制備10－3～10－6土壤稀釋液B.將不同濃度的土壤稀釋液涂布于不同平板上C.用加入剛果紅指示劑的選擇培養(yǎng)基篩選分解尿素的細(xì)菌D.從周圍出現(xiàn)紅色環(huán)帶的菌落中挑取能夠分泌脲酶的菌株解析從土壤中分離以尿素為氮源的細(xì)菌時(shí)，將土壤用無菌水稀釋，制備土壤稀釋液，將不同濃度的土壤稀釋液涂布于不同平板上，用加入酚紅指示劑的鑒別培養(yǎng)基可以鑒別分解尿素的細(xì)菌；從周圍出現(xiàn)紅色環(huán)帶的菌落中挑取能夠分泌脲酶的菌株。答案23451√解析5.尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)肥料，但若不經(jīng)細(xì)菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物種類和數(shù)量繁多，同學(xué)們試圖探究土壤中的微生物對尿素是否有分解作用，設(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)，并成功篩選到能高效降解尿素的