1標(biāo)準(zhǔn)編制說明2 3 7 10 28 29 29 29 3（一）工作簡況，包括任務(wù)來源、協(xié)作單位、起草過程、國家標(biāo)準(zhǔn)主要起草人及其所做的工作等白反式切割活性檢測方法。本標(biāo)準(zhǔn)由全國生化檢測技術(shù)委員會（SAC/TC387）提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由深圳市第二人民醫(yī)院、無錫吐露港生具有酶活性的蛋白通常以活性單位濃度來標(biāo)識蛋白的濃度，以便于確定酶促反應(yīng)的用量，如聚合酶活性單位濃度通常為5U/μL，核酸酶活性單位濃度為1U/μL。然而對于Cas12a蛋白，由于缺乏統(tǒng)一的反式切割活性單位(trans-U)，目前國內(nèi)外生產(chǎn)廠家及相關(guān)研究單位，例如NEB、百普賽斯、金斯瑞、吐露港、東抗生物等幾乎所有在售的產(chǎn)品，仍然以質(zhì)量濃度或摩爾濃度來標(biāo)識蛋白濃度，因而對于應(yīng)用Cas12a蛋白的反式切割活性來進(jìn)行體外檢測的相關(guān)產(chǎn)品和技術(shù)，其準(zhǔn)確用量難以推導(dǎo)，造成檢測結(jié)果往往存在較大偏差。這無疑將限制CRISPR-Cas檢測技術(shù)的應(yīng)用范圍。因此，亟需制定CRISPRCas12a蛋白反式切割活性檢測方法和定義CRISPRCas12a反式切割活性單位的國家標(biāo)準(zhǔn)，以其次，目前中外CRISPR檢測技術(shù)公司不分伯仲，基本處于同一起跑線，當(dāng)前市場上還未形成絕對壟斷的CRISPR-Cas通用型檢測技術(shù)和產(chǎn)品。在此關(guān)4鍵發(fā)展時期，我們既需要在技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)層面上不斷優(yōu)化CRISPR檢測技術(shù)的便捷方法，在技術(shù)原研創(chuàng)新中搶占專利優(yōu)勢，也需要在市場產(chǎn)品層面加大產(chǎn)品應(yīng)用的范圍，反過來不斷促進(jìn)技術(shù)的發(fā)展與進(jìn)步。可喜的是，在CRISPR-Cas檢測技術(shù)領(lǐng)域，以吐露港為代表的一批中國企業(yè)，站在了國際前沿水平上，可與國外企業(yè)一較高下。因此，為搶占國際市場上CRISPR-Cas檢測技術(shù)的商業(yè)化和產(chǎn)業(yè)化的制高點，亟需制定CRISPRCas12a蛋白反式切割活性檢測方法的國本標(biāo)準(zhǔn)作為規(guī)范和有效開展Cas12a蛋白反式切割活性的檢測方法的技術(shù)導(dǎo)反式切割活性檢測過程中各環(huán)節(jié)應(yīng)遵循的主要原則。本標(biāo)準(zhǔn)明確所用的試劑、本標(biāo)準(zhǔn)起草承擔(dān)單位為深圳市第二人民醫(yī)院、限公司、中國測試技術(shù)研究院生物研究所等單位負(fù)責(zé)與單位負(fù)責(zé)前期方法結(jié)果比對、配合牽頭單位收集樣性研究。本標(biāo)準(zhǔn)測試方法驗證單位有深圳大學(xué)、江蘇5了《蛋白檢測CRISPRCas12a蛋白反式切割活性檢測方法》標(biāo)準(zhǔn)的起草工作，與會專家就《蛋白檢測CRISPRCas12a蛋白反式切割活性檢測方法》標(biāo)準(zhǔn)（草案）進(jìn)行了討論，提出了寶貴的意見和建議。標(biāo)化技術(shù)委員會匯報了《蛋白檢測CRISPRCas12a蛋白反式切割活性檢測方法》標(biāo)準(zhǔn)（草案）進(jìn)一步完善和修改情況，向全國生化了《蛋白檢測CRISPRCas12a蛋白反式切割活性檢測方法》標(biāo)準(zhǔn)（征求意見匯總表—《蛋白檢測CRISPRCas12a蛋白反式切割活性檢測方法》標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿。”6“國家標(biāo)準(zhǔn)反饋意見匯總表）—《蛋白檢測CRISPRCas12a蛋白反式切割活性檢測方法》標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿?！盋RISPRCas12a蛋白反式切《蛋白檢測CRISPRCas12a蛋白反式切割活性檢測方法》標(biāo)準(zhǔn)送審稿組織函XX人，達(dá)到3/4通過。全體委員中，有XX人為起草組成員。見建議進(jìn)行了匯總整理，主要是單位、格式進(jìn)行了進(jìn)一步修改和完善，形成了報批稿。報全國生化作的組織、協(xié)調(diào)，相關(guān)資料的查閱、收集，檢7（二）國家標(biāo)準(zhǔn)編制原則、主要內(nèi)容（如技術(shù)指標(biāo)、參數(shù)、公式、性能要求、試驗方法、檢驗規(guī)則等）及其確定依據(jù)（包括試驗、統(tǒng)計數(shù)據(jù)）本標(biāo)準(zhǔn)的起草是在對國內(nèi)外資料分析、研究及性，按照標(biāo)準(zhǔn)的制定及《國家標(biāo)準(zhǔn)管理辦法》的程序與的制定過程中嚴(yán)格遵循國家有關(guān)方針、政策、法規(guī)和規(guī)寫規(guī)則》的要求編寫，在標(biāo)準(zhǔn)制定過程中力求做到：技文本語言精煉明確；層次編排、章節(jié)劃分清根據(jù)市場應(yīng)用和行業(yè)技術(shù)的實際情況出發(fā)，堅持先進(jìn)性與實用性相結(jié)合、統(tǒng)一性與靈活性相結(jié)合的原則，以標(biāo)準(zhǔn)化為引領(lǐng)，最大限度的促進(jìn)我國Cas12a蛋白生產(chǎn)、建立CRISPRCas12a蛋白反式切割活性的檢測標(biāo)準(zhǔn)等方面的創(chuàng)新與發(fā)展。本標(biāo)準(zhǔn)對Cas12a蛋白反式切割的活性檢測進(jìn)行規(guī)范統(tǒng)一，為Cas12a蛋根據(jù)樣品檢測結(jié)果和實際需求，在確定本標(biāo)準(zhǔn)所用的儀器、試劑以及相關(guān)的活性評估方法等內(nèi)容時，綜合考慮行業(yè)的需求、科學(xué)研究需要和用戶的利8益，尋求最大經(jīng)濟(jì)社會效益，充分體現(xiàn)了標(biāo)準(zhǔn)在技術(shù)上的先進(jìn)性和經(jīng)濟(jì)上的合根據(jù)國情，本標(biāo)準(zhǔn)制訂堅持面向市場、服務(wù)產(chǎn)業(yè)的原則。結(jié)合我國Cas12a蛋白應(yīng)用領(lǐng)域的實際現(xiàn)狀，并以引領(lǐng)和促進(jìn)Cas12a蛋白應(yīng)用質(zhì)量水平的提升為目標(biāo)而制定。制定標(biāo)準(zhǔn)時同時要考慮適應(yīng)市場需求，滿足行業(yè)發(fā)展，為科研開發(fā)、企業(yè)生產(chǎn)、質(zhì)量檢驗提供技術(shù)指導(dǎo)，有助于引導(dǎo)本行業(yè)采用標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行規(guī)范2.1標(biāo)準(zhǔn)編寫遵循GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)2.2標(biāo)準(zhǔn)編寫內(nèi)容參考的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)包括：GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗2.3本標(biāo)準(zhǔn)主要定義了CRISPRCas12a蛋白反式切割活性單位（trans-U），規(guī)定了CRISPRCas12a蛋白反式切割活性檢測方法的檢測流程。本標(biāo)準(zhǔn)為首次制2.4本標(biāo)準(zhǔn)的重要內(nèi)容包括有：范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語和定義、原理、試表1本標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容129續(xù)表1第2頁/共2頁345678顯示出不依賴于靶標(biāo)核酸序列的核酸酶活性，法來看，檢測Cas12a蛋白的反式切割活性的反應(yīng)體系中常見的報告系統(tǒng)主要有熒光報告法、電化學(xué)法、比色法。其中熒光報告法使用熒光強度與Cas12a蛋白的反式切割活性在一定濃度范圍內(nèi)成正相關(guān)性，具有靈蛋白反式切割活性的主流報告系統(tǒng)?；谝陨纤觯b位（trans-U）這一術(shù)語作出明確定義，屬于該領(lǐng)域的（三）主要試驗（或驗證）的分析、綜述報告，技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證，預(yù)期的經(jīng)濟(jì)效益、社會效益：滅基團(tuán)標(biāo)記，當(dāng)報告探針完整時，熒光信號被切碎后，淬滅基團(tuán)與熒光基團(tuán)的距離會增大而失去信號。在此反應(yīng)中，由于低濃度的CRISPRCas12a蛋白的反式切割活性與熒光應(yīng)速率值，然后將不同濃度的Cas12a蛋白和與之對應(yīng)的最大反應(yīng)速率值進(jìn)行線蛋白濃度以及對應(yīng)的Cas12a蛋白反式切割活性單位。2.2LbCas12a蛋白（CataLo粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒表達(dá)載體。接著將其轉(zhuǎn)入大腸勻漿或超聲波破碎等裂解工藝裂解菌體，15000rpm離心1小時。收集上換層析去除雜蛋白，或使用凝膠層析柱進(jìn)一步精細(xì)純化行濃縮操作與緩沖液置換。同時進(jìn)行純度測定和活性驗圖1LbCas12a蛋白的基因序列精密稱取0.29g亞精胺，6.30g三羥甲基氨基甲烷，0.57g氯化鎂，0.15g量取10μLTriton?X-100，溶于無核酸酶的一級水中，用稀鹽酸調(diào)至溫度為精密稱取0.13g硫酸銨，0.15g氯化鉀，0.02g硫酸鎂，0.32g三羥甲基氨crRNA序列為5'-AAUUUCUACUCUUGUAGAUUUAUCGCAACUUUCUACUGAAUU-3'。其正向引物序列為：5'-GTTGTAAAACGACGGCCAGTTTTGTTATCGCAACTTTCTACTGAATTCG-3'。反向引物序列為：5'-CCGAATTCAGTAGAAAGTTGCGATAACAAAACTGGCCGTCGTTTTACAAC-3'。單鏈DNA熒光報告探針序列為5(6)-FAM-CCCCCCCC-3'-BHQ1。取9個無菌的1.5mL離心管并標(biāo)記，按表2的配制方法將單鏈DNA熒光報告探針母液進(jìn)行連續(xù)2倍梯度稀釋，得到8個不同濃度梯度工作液，同時以表2單鏈DNA熒光報告探針溶液稀釋梯度表續(xù)表2第2頁/共2頁4.1.2加入靶標(biāo)雙鏈DNA的Cas12a蛋白實驗組的反式切割反應(yīng)表3加入雙鏈DNA靶標(biāo)的Cas12a蛋白反式切割反應(yīng)體系012345678水NC12348285778續(xù)表3第2頁/共2頁照平臺期的熒光值得到的平均值即為凈熒光值Fcl。以各濃度梯度已被切割的單DNA熒光報告探針的凈熒光值Fcl為Y軸繪制散點圖，并做線性擬合，制作標(biāo)R2≥0.99。scl=20.1340。4.2.2未加入靶標(biāo)雙鏈DNA的Cas12a蛋白實驗組的反式切割反應(yīng)表4未加入雙鏈DNA靶標(biāo)的Cas12a蛋白反式切割反應(yīng)體系012345678水NC1234825678選取不同濃度梯度單鏈DNA熒光報告探針平臺期的熒光值，減去空白對照平臺期的熒光值得到的平均值即為凈熒光值Fucl。以各濃度梯度未被切割的單鏈DNA熒光報告探針的濃度值(nmol/L)為X軸，以各濃度梯度未被切割的單鏈DNA熒光報告探針的凈熒光值Fucl為Y軸繪制散點圖，并做線性擬合，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到如下圖3所示的未發(fā)生反式切割反應(yīng)實驗組標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，其中R2≥0.99。由圖3所得，未發(fā)生反式切割反應(yīng)的實驗組線性方程擬合曲線的斜率sucl=0.3347。表5Cas12a蛋白酶稀釋梯度表性的反應(yīng)體系，不同編號的離心管中所需的Cas12a蛋白濃度不同。將配制完成表6Cas12a蛋白反式切割活性反應(yīng)體系012345682水續(xù)表6第2頁/共2頁24.4.1被切割的單鏈DNA熒光報告探針濃度CClt計算CcL(t)——某個時間點t時被切割的單鏈DNA熒光報告探針的濃度，單位為納摩爾每升(nmol/L)；F(t)——某個時間點t時的熒光信號值，單位為相對熒光單位(RFU)；C0——單鏈DNA熒光報告探針的初始濃度，即為1000納摩爾每升(nmol/L)；Scl——已發(fā)生反式切割反應(yīng)的實驗組線性方程擬合曲線的斜率，其值為20.1340；Sucl——未發(fā)生反式切割反應(yīng)的實驗組線性方程擬合曲線的斜率，其值為0.3347。線的最大反應(yīng)速度作為初速度V0：V0——初速度，這里取不同濃度單鏈DNA熒光報告探針熒光曲線的最大速度作為初速度，單位為皮摩爾每分鐘(pmol/分鐘)；n——采樣次數(shù)，共120次采樣，但第120個點無法計算速度，只取到n=119；Cp(n)——第n個循環(huán)時底物消耗量，即第n個循環(huán)時單鏈DNA熒光報告探針的消耗量，單位為皮摩爾(pmol)；ΔT——采樣間隔時間，單位為分鐘(min)。4.4.3Cas12a蛋白反式切割A(yù)(trans-U/pmol)—Cas12a蛋白酶活性單位，單位為反式切割單位每皮摩爾(trans-U/pmol)；kcat——Cas12a蛋白酶的催化常數(shù)，由圖3可得其值為53.4830；1pmol/min——定義Cas12a蛋白酶反式切割活性時對應(yīng)的速度，即當(dāng)Vmax=1pmol/min時，示例中所測樣品最終反式切割活性應(yīng)為53.4830trans-U/pmol。底物報告探針序列堿基組成及長度、反應(yīng)時間等CRISPRCas12a反式切割活性的測定方法的優(yōu)化，采用度可以增加酶促反應(yīng)的速度，另一方面酶的化學(xué)本質(zhì)是對Cas12a蛋白的反式切割活性的影響如圖到平臺期的熒光信號增量兩方面因素考慮，選取37℃作為檢測Cas12a蛋白反圖5不同反應(yīng)溫度條件下的熒光曲線圖和速率圖和反應(yīng)動力學(xué)特性。反應(yīng)體系中亞精胺作為帶正電荷的多胺類化心輔助因子，直接影響酶活性、靶標(biāo)識別效蛋白活性中心的巰基處于還原狀態(tài)，防止其氧化失活。而反應(yīng)體們選擇市場上成熟的含有以上相關(guān)組分的兩種緩沖液F(RNAmMNaCl；50mMTris-HCl；圖6不同反應(yīng)緩沖液下的熒光曲線圖和速率圖較高時又會降低反應(yīng)體系中Mg2+的游離濃度，破壞活性位點的電荷分布，導(dǎo)致圖7不同pH值下的熒光曲線圖和速率圖圖8不同堿基組成的單鏈報告探針下的熒光曲線圖和速率圖圖9不同長度的poly-C單鏈報告探針下的熒光曲線圖和速率圖白進(jìn)行重復(fù)性實驗，收集不同時間點的數(shù)據(jù)進(jìn)行計算整理。由圖10和圖10不同反應(yīng)時間下的熒光曲線圖表7不同反應(yīng)時間下的trans-U值表8重復(fù)性條件下的LbCas12a蛋白反式切割活性測定數(shù)據(jù)12346789供，將驗證樣品分別委托至深圳大學(xué)、江蘇析納生物科表9不同單位實驗室同一批次Cas12a蛋白檢測結(jié)果7.2不同廠家的Cas12a蛋白的反式切割活性的檢測結(jié)果展了驗證實驗。收集了市場上七個不同廠家的Cas12a蛋白，按照本標(biāo)準(zhǔn)的方法用統(tǒng)一的反式切割活性單位trans-U來評價Cas12a的酶活力，具有較強的普遍適用性。而由于現(xiàn)在市面上不同廠家仍然以質(zhì)量濃度或度，其準(zhǔn)確用量難以推導(dǎo)，造成檢測結(jié)果往往存在較表10不同廠家的Cas12a反式切割活性測定廠家標(biāo)稱摩爾濃度(μM）反式切割活性trans-Ua1b1cdefgCRISPR-Cas12a反式切割活性檢測方法國家標(biāo)準(zhǔn)的建立，解決了該技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的核心瓶頸——酶活性量化與質(zhì)控的統(tǒng)一性問題，為產(chǎn)業(yè)規(guī)范化發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。通過定義標(biāo)準(zhǔn)化的檢測流程、反式切割活性單位（trans-U）和數(shù)據(jù)計算方法，該標(biāo)準(zhǔn)顯著提升了檢測結(jié)果的可靠性和跨平臺可比性，有效降低了因從產(chǎn)業(yè)影響看，本標(biāo)準(zhǔn)文件將加速