試驗一紙層析法分離鑒定氨基酸通過試驗，掌握紙層析的基本操作技能。加深對分派層析原理的理解?！疽?、試驗目的】1可編輯版【二、試驗原理】層析技術是運用混合物中各組分的物理化學性質的差異，使各組分以不一樣程度分布在兩相中，其中一相為固定相，另一相流過此相稱作流動相，并使各組分以不一樣速度移動，從而到達分離的目的?？煞蛛x物質糖類、有機酸、氨基酸、核苷等2可編輯版固定相在層析中起分離作用而不隨層析過程移動的物質。如紙層析中固定相是濾紙纖維中結合的水。固定相被當作是樣品移動的阻力。流動相在層析過程因其自身流動而推進樣品移動的物質。3可編輯版名稱操作方式固定相流動相分離依據

分配層析紙層析薄層層析液體液體溶解度離子交換層析離子交換柱層析固體液體帶電性靜電引力吸附層析吸附薄層層析氣體吸附層析固體液體氣體吸附力親和層析酶與底物抗原與抗體固體液體配體專一性凝膠層析凝膠過濾固體液體分子大小層析的分類4可編輯版分派層析：是運用不一樣物質在兩種不相溶的溶劑中的分派系數不一樣而到達分離的一種技術。分派系數=溶質在固定相的溶解度溶質在流動相的溶解度5可編輯版紙層析是以濾紙作為惰性支持物的分派層析：紙纖維上的–OH基具有親水性，因此能吸附一層水作為固定相，而一般把有機溶劑作為流動相。流動相流經支持物時與固定相間持續(xù)抽提，使物質在兩相間不停地分派而得到分離。6可編輯版溶質在濾紙上的移動速率用Ｒf（比移）值來表達：

展層層斑點中心與原點間的距離Rf=--------------------------------------------溶劑前沿與原點之間的距離7可編輯版8可編輯版影響Rf值的原因（多種）物質構造與極性物質的極性大小決定了物質在水和有機溶劑之間的分派狀況。pH值

展層劑的pH影響被分離物質的極性基團的解離形式。層析濾紙的質量層析用濾紙要質地均勻，緊密，有一定的機械強度，并含雜質少。國產新華濾紙可用于一般的紙層析。9可編輯版【三、器材與試劑】器材：1、層析缸

2、毛細管3、噴霧器4、培養(yǎng)皿5、層析濾紙(新華一號)

試劑：1、擴展劑

（正丁醇：水：冰醋酸=4：3：1）

2、顯色劑

0.1％茚三酮正丁醇溶液。

3、氨基酸溶液

0.5％的賴氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸溶液及它們的混合液10可編輯版

1、層析濾紙準備：取層析濾紙(長20cm、寬15cm)一張。在紙的一端距邊緣2～3cm處用鉛筆劃一條直線，在此直線上每間隔2cm作一記號。2、點樣：用毛細管將各氨基酸樣品分別點在這5個位置上，干后再點一次。每點在紙上擴散的直徑，最大不超過3mm?！舅?、試驗環(huán)節(jié)】11可編輯版3、擴展

：用線將濾紙縫成筒狀，紙的兩邊不能接觸。將濾紙直立于培養(yǎng)皿中（點樣的一端在下，擴展劑的液面需低于點樣線1cm）。待溶劑上升約15cm時即取出濾紙，鉛筆描出溶劑前沿界線，自然干燥或用吹風機熱風吹干。4、顯色：用噴霧器均勻噴上0。1％茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分鐘(100℃)或用熱風吹干即可顯出各層析斑點。

5、計算Rf值12可編輯版【五、試驗成果與分析】【六、注意事項】【七、思索題】1、試驗中作為固定相和流動相的物質分別是什么？2、Rf值的含義、影響原因？下次試驗：試驗二蛋白質和氨基酸的顏色反應值日生值日13可編輯版小試驗當濾紙接觸到溶劑時，溶液將上升。濾紙上的小圓點是4種不一樣的氨基酸的混合物?？纯唇酉聛頃l(fā)生什么事情…14可編輯版可以看出1號氨基酸上升的最高，在濾紙上跑得最快。而4號氨基酸與濾紙的結合最緊，因此跑的速度比其他的氨基酸慢。123415可編輯版這就是紙色譜法。對照上圖，可懂得1-4號的各代表什么氨基酸。紙色譜法是分離鑒定蛋白質的氨基酸構成的重要工具。