SP和CMP抗PCV2感染的作用與機制：基于細胞與動物模型的實驗探究一、引言1.1研究背景豬圓環(huán)病毒2型（Porcinecircovirustype2，PCV2）作為危害全球養(yǎng)豬業(yè)最為嚴重的病原之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。PCV2屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是目前發(fā)現(xiàn)的最小的病毒之一，其基因組為單鏈環(huán)狀DNA。自1991年PCV2被首次發(fā)現(xiàn)與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Post-weaningmultisystemicwastingsyndrome，PMWS）相關以來，陸續(xù)被證實可引發(fā)多種豬圓環(huán)病毒相關疾?。≒orcinecircovirusassociateddiseases，PCVAD），除PMWS外，還包括豬皮炎與腎病綜合征（Porcinedermatitisandnephropathysyndrome，PDNS）、A2型先天性震顫（A2typecongenitaltremors，CT）、豬呼吸道病綜合征（Porcinerespiratorydiseasecomplex，PRDC）以及豬增生性和壞死性肺炎（Porcineproliferativeandnecrotizingpneumonia，PNP）等。PCV2感染豬群后，會導致豬體出現(xiàn)多種臨床癥狀，如皰疹、發(fā)熱、呼吸困難、消瘦、貧血、黃疸等，嚴重影響豬的生長發(fā)育和生產(chǎn)性能。據(jù)統(tǒng)計，在PCV2感染嚴重的地區(qū)，仔豬的死淘率可達40％以上。同時，PCV2還可誘導宿主免疫持續(xù)抑制，使豬體對其他病原體的易感性增加，導致多種病原的繼發(fā)感染，進一步加重病情，增加治療難度和成本。在實際養(yǎng)殖過程中，PCV2常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）、豬流感病毒（Swineinfluenzavirus，SIV）、豬肺炎支原體等協(xié)同感染，造成更為嚴重的疾病綜合征，給養(yǎng)豬業(yè)帶來沉重打擊。目前，針對PCV2感染，疫苗接種是預防和控制該病的主要措施。自2006年第一個PCV2商用疫苗問世以來，市場上逐漸出現(xiàn)了多種類型的PCV2疫苗，主要包括全病毒滅活疫苗和Cap蛋白亞單位疫苗。這些疫苗在一定程度上能夠減輕PCV2感染豬的臨床病理表現(xiàn)，提高豬群的生長性能，如提高平均日增重、改善飼料轉化率、降低死亡率等。然而，由于PCV2具有強大的變異性和適應性，其基因型不斷演變。PCV2主要包括PCV2a、PCV2b、PCV2d等基因型，在過去幾十年中，全球流行毒株經(jīng)歷了從PCV2a到PCV2b，再到PCV2d的轉變。新變異毒株的出現(xiàn)使得單一疫苗的防控效果受到挑戰(zhàn)，部分現(xiàn)有疫苗可能無法有效應對新毒株的感染，導致疫苗免疫失敗的情況時有發(fā)生。此外，疫苗的免疫程序、免疫劑量、免疫途徑等因素也會影響疫苗的免疫效果，且疫苗接種后可能會出現(xiàn)過敏反應等不良反應，這些問題都限制了疫苗在PCV2防控中的應用。鑒于疫苗防控PCV2感染存在的局限性，尋找和探究對PCV2感染具有抗病作用的物質具有重要意義。近年來，多糖類物質因其具有多種生物活性，如免疫調節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等，受到了廣泛關注。其中，茯苓多糖（Poriacocospolysaccharide，CMP）作為一種從傳統(tǒng)中藥材茯苓中提取的多糖，已被證實具有多種生物活性，在免疫調節(jié)和抗病毒方面展現(xiàn)出潛在的應用價值。同時，其他一些多糖（Somepolysaccharides，SP）也被報道具有一定的抗病毒活性。因此，研究SP和CMP抗PCV2感染的作用和機理，有望為PCV2的防控提供新的策略和方法，為開發(fā)新型PCV2疫苗或輔助治療藥物奠定基礎。1.2研究目的與意義本研究旨在深入考察SP和CMP在抗PCV2感染過程中的作用機理，全面探索其抗PCV2感染的潛力，從而為新型PCV2疫苗的開發(fā)提供堅實的實驗依據(jù)。具體而言，通過建立SP和CMP對PCV2感染的抑制試驗體系，測定不同濃度的SP和CMP組合對PCV2的抑制效果，明確兩者在抗PCV2感染中的作用效果及最佳作用濃度。利用zeta電位分析、免疫電泳、熒光顯微鏡等技術，從細胞和分子層面探究SP和CMP的細胞內作用機理，揭示其發(fā)揮抗病毒作用的具體途徑和分子機制。PCV2對養(yǎng)豬業(yè)的危害極為嚴重，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。目前疫苗防控存在局限性，新變異毒株的出現(xiàn)使單一疫苗的防控效果受到挑戰(zhàn)，且疫苗接種存在免疫失敗、不良反應等問題。因此，尋找新的抗PCV2感染的物質和方法具有重要的現(xiàn)實意義。本研究從物質層面探究抗PCV2感染的機理，若能發(fā)現(xiàn)SP和CMP具有顯著的抗PCV2感染作用并明確其作用機理，將為PCV2的防控提供新的策略和方法。一方面，為開發(fā)新型PCV2疫苗或輔助治療藥物奠定基礎，有望提高疫苗的防控效果，減少PCV2感染對豬群的危害，降低養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟損失；另一方面，對SP和CMP細胞內作用機理的探索，也為其他相關病毒疾病的研究提供了一定的參考意義，有助于推動病毒學和免疫學領域的發(fā)展，為解決其他病毒感染性疾病的防控問題提供新思路和方法。1.3研究方法與技術路線本研究首先通過多種渠道收集SP和CMP的標準品，如從專業(yè)的生物試劑公司購買，或從相關科研機構獲取。利用高效液相色譜（HPLC）、質譜（MS）等先進的分析技術對其純度和含量進行精確測定，以確保實驗結果的準確性和可靠性。建立免疫細胞抑制實驗體系，選用豬肺泡巨噬細胞（PAM）和豬腎細胞（PK-15）等作為靶細胞。將培養(yǎng)好的細胞分為對照組、病毒感染組、SP處理組、CMP處理組以及SP和CMP聯(lián)用處理組。向各處理組中加入不同濃度梯度的SP和CMP，孵育一定時間后，接種PCV2病毒。采用MTT法、CCK-8法等檢測細胞活力，通過實時熒光定量PCR（qPCR）測定細胞內PCV2病毒核酸的含量，運用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測細胞培養(yǎng)上清中PCV2病毒蛋白的表達水平，以此綜合評估SP和CMP對PCV2的抑制效果。利用zeta電位分析儀測定SP和CMP與PCV2病毒粒子相互作用前后的zeta電位變化，分析兩者之間的靜電作用和結合特性。通過免疫電泳技術，研究SP和CMP對PCV2病毒蛋白結構和抗原性的影響，明確其是否改變病毒的免疫原性。借助熒光顯微鏡，觀察用熒光標記的SP和CMP在細胞內的攝取和分布情況，探究其進入細胞的途徑和在細胞內的作用位點。同時，利用蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術檢測細胞內相關信號通路蛋白的表達和磷酸化水平，運用RNA干擾（RNAi）技術沉默相關基因，進一步驗證SP和CMP的作用機制。本研究技術路線為：先從豬組織中提取PAM和PK-15細胞，并進行細胞培養(yǎng)和鑒定。同時，對PCV2病毒進行增殖和毒價測定。將培養(yǎng)好的細胞分為不同實驗組，分別進行SP和CMP處理以及PCV2病毒感染。接著進行理化分析，包括zeta電位分析、免疫電泳等，然后利用熒光顯微鏡觀察細胞內情況，獲取圖像并進行圖像分析。最后，運用統(tǒng)計學方法對實驗數(shù)據(jù)進行處理和分析，得出科學結論，具體流程如圖1所示。[此處插入技術路線圖1，圖中清晰展示從細胞和病毒準備，到分組實驗、各項分析，再到數(shù)據(jù)處理的完整流程]二、相關理論基礎2.1多糖的概述多糖，又稱多聚糖，是一類由十個以上單糖分子通過糖苷鍵連接而成的大分子糖類，其通式可用(C_{6}H_{10}O_{5})_{n}來表示。多糖廣泛存在于動物細胞膜、植物和微生物細胞壁中，是構成生命的四大基本物質之一，在生物體內發(fā)揮著至關重要的作用。從來源上看，多糖可分為植物多糖、動物多糖和微生物多糖。植物多糖是植物光合作用產(chǎn)生的單糖結合而成的產(chǎn)物，作為貯藏物質或結構物質存在于植物體內。常見的植物多糖有當歸多糖、枸杞多糖、大黃多糖等，它們大多從植物和中藥材中提取而來，且多數(shù)無細胞毒性，成為功能食品研究的重要方向。動物多糖則常見于動物組織、器官和體液中，像糖原、肝素、硫酸軟骨素、透明質酸等都屬于動物多糖。微生物多糖包含細菌細胞壁肽聚糖、香菇多糖、茯苓多糖、銀耳多糖等，部分微生物多糖具有顯著的生物活性，如抗腫瘤及調節(jié)機體免疫等功能。多糖的結構十分復雜，糖單體之間存在多種鏈接方式，能夠形成不同構型的直鏈和支鏈結構，并通過分子間氫鍵及基團的相互作用進一步形成形式各異的高級結構。依據(jù)其組分單糖的種類，多糖可分為均聚糖和雜多糖。均聚糖一般由10個以上相同的單糖通過糖苷鍵連接而成；雜多糖除含糖鏈外，還含有肽鏈和（或）脂類成分。研究發(fā)現(xiàn)，具有酸性基團的多糖往往具有提高免疫、抗腫瘤和抗病毒等生理活性，如六味地黃酸性多糖、亞麻籽膠酸性多糖等。而且，多糖的生物學活性與其結構緊密相關，多數(shù)具有突出生物學活性的葡聚多糖都以(1\rightarrow3)糖苷鍵連接，具有抗腫瘤活性的甘露多糖為(1\rightarrow6)鍵型，活性半乳糖則以(1\rightarrow3)鍵型連接。對于葡聚多糖而言，α-葡聚糖一般沒有活性，而大多數(shù)具有抗腫瘤活性的多糖都具有β-(1\rightarrow3)-D-葡聚糖的主鏈結構，如豬苓多糖，其活性成分就是具有分支的β-(1\rightarrow3)-D-葡聚糖。在性質方面，多糖通常不具有甜味，也不具有還原性，具有旋光性卻無變旋現(xiàn)象。一般呈無定形粉末狀，大多不溶于水，也不能在水中形成真溶液。不過，由于多糖含有許多羥基，它們可以與水分子形成氫鍵，表現(xiàn)出親水性和水合能力，在水中會吸水膨脹，可形成膠體溶液。多糖還具有較高的化學穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，能夠在一定溫度和環(huán)境條件下保持其結構和功能。多糖在生物體內參與多種生理過程，具有廣泛的生物活性。大量研究表明，多糖具有免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗輻射、降血糖、降血脂、保肝等多種功能。在免疫調節(jié)方面，多糖可以激活巨噬細胞、自然殺傷細胞、樹突狀細胞等免疫細胞，增強機體的免疫功能，還能調節(jié)細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，影響免疫細胞的活性和遷移，從而調節(jié)免疫應答。例如，枸杞多糖能顯著促進小鼠淋巴細胞增殖，調節(jié)T細胞亞群及提高IL-1、IL-2水平，使糖尿病模型小鼠免疫功能恢復接近正常。在抗病毒方面，一些多糖被報道能夠抑制病毒的吸附、侵入、復制等過程，從而發(fā)揮抗病毒作用，但其具體的作用機制因多糖種類和病毒類型而異，仍有待深入研究。2.2多糖生物活性的研究概況多糖作為一類重要的生物大分子，具有廣泛的生物活性，在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等領域展現(xiàn)出巨大的應用潛力，近年來受到了科研人員的高度關注。免疫調節(jié)是多糖最為重要的生物活性之一。眾多研究表明，多糖能夠通過多種途徑調節(jié)機體的免疫功能。一方面，多糖可以激活巨噬細胞、自然殺傷細胞（NK細胞）、樹突狀細胞等免疫細胞，增強它們的吞噬能力、細胞毒性和抗原呈遞能力。例如，香菇多糖可顯著提高巨噬細胞的吞噬活性，促進其分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）等細胞因子，從而增強機體的免疫防御能力。另一方面，多糖還能調節(jié)T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖、分化和功能，影響細胞因子和抗體的產(chǎn)生。枸杞多糖能夠促進T淋巴細胞的增殖，調節(jié)T細胞亞群的平衡，提高Th1型細胞因子（如IL-2、干擾素-γ等）的分泌水平，增強機體的細胞免疫功能。同時，枸杞多糖也能促進B淋巴細胞的增殖和抗體的分泌，增強體液免疫功能。此外，多糖還可以通過調節(jié)腸道微生物群落的結構和功能，間接影響機體的免疫功能。一些多糖能夠選擇性地促進有益菌（如雙歧桿菌、乳酸菌等）的生長和繁殖，抑制有害菌的生長，維持腸道微生態(tài)平衡，從而增強腸道黏膜的免疫屏障功能，提高機體的整體免疫力。多糖還具有顯著的抗氧化活性。在生物體內，氧化應激是許多疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素之一，過多的自由基會攻擊生物大分子，如脂質、蛋白質和DNA，導致細胞損傷和衰老。多糖可以通過多種機制發(fā)揮抗氧化作用，保護細胞免受氧化損傷。首先，多糖可以直接清除體內的自由基，如超氧陰離子自由基（O???）、羥基自由基（?OH）、過氧化氫（H?O?）等。其分子結構中的羥基、羧基等官能團能夠與自由基發(fā)生反應，將其轉化為穩(wěn)定的產(chǎn)物，從而減少自由基對細胞的損傷。例如，黑木耳多糖對超氧陰離子自由基和羥基自由基具有較強的清除能力，能夠有效抑制脂質過氧化反應，保護細胞膜的完整性。其次，多糖還可以通過調節(jié)抗氧化酶系統(tǒng)的活性，增強機體的抗氧化能力。多糖能夠誘導細胞產(chǎn)生超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶，這些酶可以協(xié)同作用，清除體內的自由基，維持細胞內的氧化還原平衡。研究發(fā)現(xiàn)，茯苓多糖能夠顯著提高小鼠肝臟和血清中SOD、CAT和GSH-Px的活性，降低丙二醛（MDA）的含量，表明茯苓多糖具有良好的抗氧化作用。此外，多糖還可以通過螯合金屬離子，減少金屬離子催化產(chǎn)生的自由基，從而間接發(fā)揮抗氧化作用?？鼓[瘤活性也是多糖研究的熱點之一。大量實驗研究表明，多糖對多種腫瘤細胞具有抑制作用，其作用機制主要包括以下幾個方面。一是免疫調節(jié)作用，多糖通過激活機體的免疫系統(tǒng)，增強免疫細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷能力。例如，靈芝多糖可以激活巨噬細胞、NK細胞和T淋巴細胞，使其分泌細胞因子，如TNF-α、IL-2等，這些細胞因子能夠直接殺傷腫瘤細胞或誘導腫瘤細胞凋亡。二是誘導腫瘤細胞凋亡，多糖可以通過調節(jié)腫瘤細胞內的信號通路，誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，香菇多糖能夠上調腫瘤細胞內促凋亡蛋白Bax的表達，下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，從而激活caspase級聯(lián)反應，誘導腫瘤細胞凋亡。三是抑制腫瘤細胞的增殖和轉移，多糖可以通過抑制腫瘤細胞的DNA合成、干擾細胞周期進程、抑制腫瘤血管生成等方式，抑制腫瘤細胞的增殖和轉移。例如，黃芪多糖能夠抑制腫瘤細胞的DNA合成，使腫瘤細胞停滯在G0/G1期，從而抑制腫瘤細胞的增殖。同時，黃芪多糖還可以通過抑制腫瘤細胞表面的黏附分子表達，減少腫瘤細胞與基質細胞的黏附，抑制腫瘤細胞的轉移。在抗病毒方面，多糖對多種病毒具有抑制作用，其抗病毒機制較為復雜。一方面，多糖可以通過調節(jié)機體的免疫功能，增強機體對病毒的抵抗力。例如，枸杞多糖能夠提高機體的免疫力，增強免疫細胞對病毒的清除能力，從而發(fā)揮抗病毒作用。另一方面，多糖還可以直接作用于病毒，抑制病毒的吸附、侵入、復制和釋放等過程。一些多糖能夠與病毒表面的蛋白或受體結合，阻止病毒與宿主細胞的吸附和侵入。研究發(fā)現(xiàn)，硫酸化多糖可以與流感病毒表面的血凝素結合，抑制病毒的吸附和侵入，從而發(fā)揮抗病毒作用。此外，多糖還可以通過干擾病毒的復制過程，抑制病毒的增殖。例如，香菇多糖能夠抑制乙肝病毒（HBV）的DNA聚合酶活性，從而抑制HBV的復制。除了上述生物活性外，多糖還具有抗炎、降血糖、降血脂、保肝等多種生物活性。在抗炎方面，多糖可以通過抑制炎癥細胞的活化、減少炎癥介質的釋放等方式，發(fā)揮抗炎作用。在降血糖方面，多糖可以通過調節(jié)胰島素的分泌和作用、改善胰島素抵抗、促進葡萄糖的攝取和利用等途徑，降低血糖水平。在降血脂方面，多糖可以通過抑制膽固醇和甘油三酯的合成、促進脂質的代謝和排泄等方式，降低血脂水平。在保肝方面，多糖可以通過減輕肝臟的氧化損傷、抑制肝細胞的凋亡、調節(jié)肝臟的免疫功能等方式，保護肝臟免受損傷。由于多糖具有多種生物活性，其在疾病防治中具有廣闊的應用前景。在醫(yī)藥領域，多糖可以作為藥物直接用于治療疾病，也可以作為藥物載體或佐劑，提高藥物的療效和安全性。一些多糖類藥物已經(jīng)在臨床上得到應用，如香菇多糖、云芝多糖等用于腫瘤的輔助治療，具有提高機體免疫力、減輕化療副作用等作用。在食品領域，多糖可以作為功能性食品添加劑，開發(fā)具有免疫調節(jié)、抗氧化、降血糖等功能的保健食品。例如，將枸杞多糖添加到食品中，制成具有保健功能的飲料、糕點等。在農(nóng)業(yè)領域，多糖可以作為植物免疫誘抗劑，提高植物的抗病能力，減少農(nóng)藥的使用。例如，殼聚糖等多糖類物質可以誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，增強植物對病蟲害的抵抗能力。2.3茯苓多糖的研究進展茯苓（Poriacocos）是一種常見的中藥材，為多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核。茯苓作為一種傳統(tǒng)的中藥材，在中醫(yī)藥領域的應用廣泛而深入，具有利水滲濕、健脾止瀉、寧心安神等多種功效?，F(xiàn)代研究表明，茯苓含有多種化學成分，主要包括多糖、三萜類化合物、黃酮類化合物等，這些化學成分具有獨特的藥理作用和生物活性。其中，茯苓多糖作為茯苓的主要活性成分之一，具有增強免疫功能、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降血糖、降血脂等多種藥理作用，近年來受到了廣泛關注。在免疫調節(jié)方面，茯苓多糖能夠顯著提高機體免疫力，增強機體抗病能力。研究表明，茯苓多糖可以促進T淋巴細胞、B淋巴細胞和巨噬細胞的活化，調節(jié)機體免疫應答。茯苓多糖能夠激活巨噬細胞、T細胞等免疫細胞，提高它們的吞噬能力和細胞活性，從而增強機體的免疫防御能力。同時，茯苓多糖還能調節(jié)細胞因子的分泌，如促進白細胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）等細胞因子的產(chǎn)生，進一步增強機體的免疫功能。在抗腫瘤方面，茯苓多糖對多種腫瘤細胞具有抑制作用。其作用機制主要包括免疫調節(jié)、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖和轉移等。茯苓多糖可以通過激活機體的免疫系統(tǒng)，增強免疫細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷能力，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。研究發(fā)現(xiàn)，茯苓多糖能夠上調腫瘤細胞內促凋亡蛋白Bax的表達，下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，激活caspase級聯(lián)反應，誘導腫瘤細胞凋亡。此外，茯苓多糖還可以抑制腫瘤細胞的DNA合成，干擾細胞周期進程，抑制腫瘤細胞的增殖。同時，茯苓多糖能夠抑制腫瘤細胞表面的黏附分子表達，減少腫瘤細胞與基質細胞的黏附，抑制腫瘤細胞的轉移。茯苓多糖還具有良好的抗氧化和抗炎作用。在抗氧化方面，茯苓多糖可以直接清除體內的自由基，如超氧陰離子自由基、羥基自由基、過氧化氫等。其分子結構中的羥基、羧基等官能團能夠與自由基發(fā)生反應，將其轉化為穩(wěn)定的產(chǎn)物，從而減少自由基對細胞的損傷。茯苓多糖還可以通過調節(jié)抗氧化酶系統(tǒng)的活性，增強機體的抗氧化能力。它能夠誘導細胞產(chǎn)生超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶，這些酶可以協(xié)同作用，清除體內的自由基，維持細胞內的氧化還原平衡。在抗炎方面，茯苓多糖可以通過抑制炎癥細胞的活化、減少炎癥介質的釋放等方式，發(fā)揮抗炎作用。研究表明，茯苓多糖能夠抑制脂多糖（LPS）誘導的巨噬細胞炎癥反應，減少腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等炎癥介質的分泌，從而減輕炎癥反應。茯苓多糖的提取方法對其生物活性有重要影響。傳統(tǒng)的提取方法如水提法和醇提法，雖然操作簡單、成本較低，但存在提取效率低、純度不高等問題。水提法提取茯苓多糖時，由于提取溫度和時間等因素的影響，可能會導致多糖的降解，從而影響其生物活性。隨著科學技術的進步，現(xiàn)代提取技術如超聲波提取、微波輔助提取、酶解法等逐漸應用于茯苓多糖的提取中。超聲波提取利用超聲波的空化作用、機械效應和熱效應，能夠加速茯苓細胞壁的破裂，提高多糖的提取率。微波輔助提取則利用微波的熱效應和非熱效應，使茯苓中的多糖迅速溶解，縮短提取時間，提高提取效率。酶解法利用酶的專一性，能夠選擇性地分解茯苓細胞壁中的多糖，提高多糖的純度和生物活性。這些現(xiàn)代提取技術在提高提取效率、優(yōu)化產(chǎn)物質量方面展現(xiàn)出了顯著優(yōu)勢。茯苓多糖的化學修飾也可以改變其生物活性。通過硫酸酯化、乙酰化、烷基化、磷酸酯化等化學修飾方法，可以改變多糖取代基的種類、數(shù)目和位置，從而改變多糖的結構，以提高其生物學活性。硫酸酯化修飾后的茯苓多糖，其抗病毒、抗腫瘤等活性可能會得到增強。研究發(fā)現(xiàn)，硫酸酯化茯苓多糖對流感病毒的抑制作用明顯增強，其機制可能與硫酸酯化后多糖與病毒表面蛋白的結合能力增強有關。乙?；揎椇蟮能蜍叨嗵?，其免疫調節(jié)活性可能會發(fā)生改變。通過對茯苓多糖進行化學修飾，可以進一步挖掘其潛在的生物活性，為其在醫(yī)藥、食品等領域的應用提供更多的可能性。2.4豬圓環(huán)病毒2型的研究概述2.4.1PCV的病原特性豬圓環(huán)病毒（Porcinecircovirus，PCV）在分類學上屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是目前已知的最小的動物病毒之一。其病毒粒子呈二十面體對稱結構，直徑僅為14-17nm，無囊膜包裹。PCV的基因組為共價閉合的單股環(huán)狀負鏈DNA，大小約為1.76kb。依據(jù)致病性、抗原性以及核酸序列的差異，PCV主要分為PCV1和PCV2兩個血清型。其中，PCV1為非致病性病毒，最初于1974年從多株連續(xù)傳代的PK-15細胞中被發(fā)現(xiàn)，后續(xù)研究證實其來源于當初制備PK-15細胞的豬腎組織，且不會對感染豬造成危害。而PCV2則具有致病性，能致使豬出現(xiàn)多種臨床癥狀，是引發(fā)多種豬圓環(huán)病毒相關疾病的主要病原。PCV2的基因組全長1768bp或1767bp，含有11個可能的開放閱讀框（ORFs）。其中，ORF1位于病毒基因組的正鏈上，編碼病毒的復制蛋白（Rep和Rep′），該蛋白與病毒的復制轉錄過程緊密相關，其分子量約為37KDa。ORF2位于病毒基因組的互補鏈上，編碼病毒的結構蛋白Cap，該蛋白可自我裝配成病毒衣殼樣顆粒，其分子量約為27KDa。Cap蛋白是病毒的主要免疫原性蛋白，能夠刺激機體產(chǎn)生中和抗體，在病毒的感染和免疫過程中發(fā)揮著關鍵作用。研究表明，位于Cap蛋白12-18位及34-41位的氨基酸殘基對PCV2的感染性和免疫原性具有重要意義。此外，Cap蛋白的兩個抗原表位分別位于所編碼氨基酸的69-83處和117-131處，這兩個區(qū)域對Cap蛋白的特異性識別和免疫反應至關重要。PCV對外界理化因子展現(xiàn)出較強的抵抗力。在pH3的酸性環(huán)境中，PCV能夠長時間保持活性而不被滅活。即使在72℃的高溫環(huán)境下，PCV也能存活一段時間。同時，PCV對氯仿等有機溶劑不敏感，且不具有血凝活性，不會凝集牛、羊、豬、雞等多種動物以及人的紅細胞。這種強大的環(huán)境適應能力使得PCV在自然環(huán)境中能夠較為穩(wěn)定地存在，增加了其傳播和感染的風險，也給養(yǎng)豬業(yè)的防控工作帶來了較大的挑戰(zhàn)。2.4.2PCV2的相關性疾病及其病理變化PCV2感染豬群后，可引發(fā)多種相關性疾病，對豬的健康和生長發(fā)育造成嚴重影響。其中，斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）是最為常見且危害較大的一種疾病。PMWS主要發(fā)生在5-16周齡的仔豬，尤其多見于6-8周齡的仔豬?；疾∽胸i通常在斷奶后2-3天或1周左右開始發(fā)病，急性發(fā)病豬群的病死率可達10%，若并發(fā)或繼發(fā)細菌、病毒感染，死亡率可大幅攀升，超過25%。PMWS的臨床癥狀表現(xiàn)多樣，主要包括進行性消瘦、呼吸困難、淋巴結腫大、發(fā)育遲緩、黃疸及皮膚蒼白等?；疾∽胸i精神萎靡，食欲不振，生長速度明顯減緩，體重不增甚至下降。呼吸困難表現(xiàn)為呼吸急促、淺表，常伴有咳嗽。全身淋巴結，特別是腹股溝淋巴結、腸系膜淋巴結、縱隔淋巴結顯著腫大，質地堅硬。皮膚蒼白可能是由于貧血導致，黃疸則是因為肝臟受損，膽紅素代謝異常。豬皮炎與腎病綜合征（PDNS）也是PCV2感染相關的常見疾病，主要發(fā)生于保育和生長育肥豬，一般呈散發(fā)狀態(tài)，死亡率相對較低。PDNS的典型癥狀是在豬的皮膚上出現(xiàn)紅紫色隆起的不規(guī)則斑塊，這些斑塊通常首先出現(xiàn)在豬的后腿、腹部，隨后可能擴散至喉、體側或耳部。感染較輕的豬可能會自行康復，但感染嚴重的豬可能會出現(xiàn)跛行、發(fā)熱、厭食、體重下降等癥狀。病變部位的皮膚組織病理學檢查可見血管炎、纖維素樣壞死和單核細胞浸潤，腎臟腫大，有出血點或壞死點，腎小球腎炎和間質性腎炎等病理變化。PCV2感染還會導致母豬繁殖障礙，對養(yǎng)豬業(yè)的繁殖效率造成嚴重影響。感染PCV2的母豬常常出現(xiàn)不同程度的流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎和仔豬畸形等繁殖問題。母豬可能在妊娠期間突然發(fā)生流產(chǎn)，產(chǎn)出的胎兒可能已經(jīng)死亡并發(fā)生木乃伊化，或者出現(xiàn)肢體畸形、發(fā)育不全等情況。此外，PCV2感染還會使母豬的免疫功能受損，使其更容易受到其他病原體的感染，如乳房炎和子宮感染等，進一步影響繁殖效果。新生仔豬感染PCV2后，可能會出現(xiàn)先天性震顫，表現(xiàn)為全身或局部肌肉顫抖，運動不協(xié)調，嚴重影響仔豬的生存和生長。豬呼吸道病綜合征（PRDC）也與PCV2感染密切相關。PCV2感染可引起豬的肺炎，導致豬出現(xiàn)咳嗽、氣喘、呼吸困難等呼吸道癥狀。在PRDC中，PCV2感染使得豬的呼吸道黏膜受損，免疫功能下降，從而容易繼發(fā)其他細菌和病毒感染，如豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌、豬流感病毒等，加重病情，增加死亡率。病豬肺部可見炎癥、實變、出血等病理變化，肺組織質地變硬，彈性降低。豬增生性和壞死性肺炎（PNP）同樣是PCV2感染引發(fā)的疾病之一，主要發(fā)生在6-14周齡的豬，發(fā)病率為2%-3%，死亡率為4%-10%。患病豬表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難、發(fā)熱等癥狀，剖檢可見肺部出現(xiàn)增生性和壞死性病變，肺泡壁增厚，肺泡腔內有炎性滲出物和壞死組織。PCV2感染引發(fā)的這些相關性疾病，不僅嚴重影響豬的健康和生長性能，導致豬的死亡率增加、生長發(fā)育受阻、繁殖性能下降，還會增加養(yǎng)殖成本，降低養(yǎng)殖效益，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。2.4.3PCV2的流行病學PCV2在全球范圍內廣泛傳播，對養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟影響。其傳染源主要包括患病豬、帶毒豬以及病毒攜帶者?；疾∝i在臨床癥狀出現(xiàn)之前就已經(jīng)開始大量排放病毒顆粒，通過呼吸道、糞便、尿液和分泌物等途徑將病毒釋放到環(huán)境中，成為重要的傳染源。帶毒豬雖然沒有明顯的臨床癥狀，但體內攜帶病毒，也能夠傳播病毒。病毒攜帶者則是在感染后長期攜帶PCV2病毒，在一定條件下可能成為病毒的持續(xù)傳播源。PCV2的傳播途徑主要有水平傳播和垂直傳播。水平傳播包括直接接觸傳播、經(jīng)呼吸道傳播和通過精液傳播等。直接接觸傳播是指病毒通過豬與豬之間的直接接觸，如鼻觸、口觸、皮膚接觸等途徑進行傳播。經(jīng)呼吸道傳播是豬通過吸入患病豬排放的病毒顆粒而感染，主要通過空氣中的飛沫和氣溶膠傳播。公豬感染后，其精液中含有PCV2病原，可通過人工授精或直接公母交配進行傳播。垂直傳播是指母豬通過胎盤、乳汁和糞便等途徑將病毒傳給仔豬，這是PCV2傳播的重要途徑之一。仔豬在出生后的早期特別容易感染PCV2，因為它們的免疫系統(tǒng)尚未完全發(fā)育，對病毒的抵抗力較弱。PCV2感染的易感動物主要是豬，特別是生長發(fā)育階段的豬群更容易受到感染。不同年齡、不同性別的豬都對PCV2具有易感性，但胚胎期或早期感染的豬，在斷奶后更容易發(fā)病，集中在6-12周齡較為多見。此外，應激、營養(yǎng)不良、其他疾病的存在以及環(huán)境條件的變化等因素都可能增加豬對PCV2感染的敏感性。例如，豬群密度過大、飼養(yǎng)環(huán)境惡劣、衛(wèi)生條件差、長途運輸、氣候變化等應激因素，會導致豬的免疫力下降，從而增加感染PCV2的風險。當豬群同時感染其他病原體，如豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流感病毒等，或者處于營養(yǎng)不良狀態(tài)時，也更容易受到PCV2的侵襲。PCV2的流行季節(jié)與豬群的養(yǎng)殖管理和環(huán)境因素密切相關。一般來說，冬季和早春是PCV2感染的高發(fā)季節(jié)，這可能與低溫、濕度和養(yǎng)殖條件等因素有關。在冬季和早春，氣溫較低，豬舍通風不良，濕度較大，這種環(huán)境有利于病毒的存活和傳播。此外，豬群密度、飼養(yǎng)方式、衛(wèi)生條件和疫苗接種等因素也會影響PCV2的流行情況。高密度飼養(yǎng)的豬群，病毒傳播的機會增加；飼養(yǎng)方式不合理，如不同年齡的豬混養(yǎng)，會增加病毒傳播的風險；衛(wèi)生條件差，病毒容易在豬舍內大量滋生和傳播。而及時、合理地接種疫苗，可以有效降低豬群對PCV2的易感性，減少疫情的發(fā)生。在全球范圍內，PCV2感染及其相關疾病給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。在歐洲，PCV2感染及其相關疾病是最為嚴重的，對養(yǎng)豬業(yè)造成的損失較大。德國在1998年11月首次報道PCV2感染，PMWS的發(fā)病率為10%-80%，與PCV2感染相關的間質性肺炎問題不斷上升，PDNS在豬群中也十分嚴重，一些地區(qū)豬群的發(fā)病率為0.5%-40%。法國在1995年春天首先發(fā)現(xiàn)PMWS，隨后疫情迅速蔓延，豬群損失超過30%。在美洲，PCV2感染及其相關疾病流行相對不嚴重，但也給養(yǎng)豬業(yè)帶來了一定的影響。美國在90年代中期開始注意到PCV2感染，主要危害10-12周齡的育肥豬，發(fā)病率為10%-20%，保育豬的死亡率低于2%。在亞洲，PCV2感染也較為普遍。我國在2000年通過血清學調查證實了北京、河北、天津、江蘇、上海等地的豬群中存在PCV2感染抗體，2001年與PCV2感染相關的豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征開始在南方地區(qū)流行，2002年全國各地規(guī)模化豬場暴發(fā)豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了相當大的經(jīng)濟損失。2.4.4PCV2免疫學研究進展當豬感染PCV2后，機體的免疫系統(tǒng)會被激活，產(chǎn)生一系列免疫反應。在天然免疫方面，PCV2感染會刺激豬體的巨噬細胞、樹突狀細胞等免疫細胞，使其分泌多種細胞因子和趨化因子，如白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。這些細胞因子和趨化因子能夠激活其他免疫細胞，促進炎癥反應，增強機體對病毒的清除能力。然而，PCV2也會通過一些機制逃避天然免疫的攻擊。研究發(fā)現(xiàn)，PCV2能夠抑制巨噬細胞的吞噬功能，降低其對病毒的清除效率。PCV2還可能干擾細胞因子的信號傳導通路，影響免疫細胞的活化和功能。在適應性免疫方面，PCV2感染會誘導機體產(chǎn)生特異性的體液免疫和細胞免疫應答。體液免疫中，B淋巴細胞受到PCV2抗原的刺激后，會分化為漿細胞，產(chǎn)生特異性抗體，主要包括IgM、IgG和IgA等。其中，IgG抗體在免疫應答后期發(fā)揮重要作用，能夠中和病毒，阻止病毒感染宿主細胞。研究表明，PCV2感染豬后，血清中IgG抗體水平會逐漸升高，在感染后2-3周達到峰值。細胞免疫方面，PCV2感染會激活T淋巴細胞，包括CD4+T細胞和CD8+T細胞。CD4+T細胞能夠分泌細胞因子，輔助B淋巴細胞產(chǎn)生抗體，增強巨噬細胞的活性，促進免疫應答的發(fā)生。CD8+T細胞則具有細胞毒性，能夠直接殺傷被PCV2感染的細胞。疫苗免疫是預防PCV2感染的重要手段。目前市場上的PCV2疫苗主要包括全病毒滅活疫苗和Cap蛋白亞單位疫苗。全病毒滅活疫苗是將PCV2病毒經(jīng)過培養(yǎng)、滅活等工藝制備而成，能夠刺激機體產(chǎn)生較為全面的免疫應答。Cap蛋白亞單位疫苗則是利用基因工程技術表達PCV2的Cap蛋白，作為抗原制備疫苗。這種疫苗具有純度高、安全性好等優(yōu)點。大量研究和實踐表明，疫苗免疫能夠有效降低PCV2感染豬的發(fā)病率和死亡率，減輕臨床癥狀，提高豬群的生長性能。疫苗免疫效果受到多種因素的影響，如疫苗的質量、免疫程序、豬群的健康狀況等。不同廠家生產(chǎn)的疫苗，其免疫原性和免疫效果可能存在差異。合理的免疫程序，包括免疫時間、免疫劑量和免疫次數(shù)等，對于提高疫苗免疫效果至關重要。豬群的健康狀況也會影響疫苗的免疫效果，如豬群處于應激狀態(tài)、感染其他疾病或營養(yǎng)不良時，疫苗的免疫效果可能會受到影響。PCV2還存在免疫逃逸現(xiàn)象。隨著PCV2的不斷變異，其抗原性也會發(fā)生改變，導致疫苗免疫后產(chǎn)生的抗體無法有效識別和中和變異后的病毒，從而出現(xiàn)免疫逃逸。研究發(fā)現(xiàn)，PCV2的Cap蛋白基因容易發(fā)生突變，導致Cap蛋白的氨基酸序列改變，進而影響其抗原性。一些變異毒株的出現(xiàn)，使得原本有效的疫苗免疫效果下降，增加了PCV2防控的難度。PCV2感染可能會導致豬體的免疫抑制，使機體對疫苗的免疫應答減弱，也為免疫逃逸提供了條件。2.4.5PCV2實驗感染動物模型的研究進展建立PCV2實驗感染動物模型對于研究PCV2的致病機制、免疫反應以及疫苗和藥物的研發(fā)具有重要意義。目前常用的PCV2實驗感染動物模型主要包括仔豬模型、小鼠模型和細胞模型。仔豬模型是研究PCV2感染最為常用的動物模型之一。仔豬對PCV2具有較高的易感性，感染后能夠出現(xiàn)與自然感染相似的臨床癥狀和病理變化。通過對仔豬進行PCV2實驗感染，可以深入研究病毒在豬體內的復制、傳播、致病機制以及機體的免疫應答等。在仔豬模型中，可以觀察到仔豬感染PCV2后出現(xiàn)消瘦、生長遲緩、呼吸困難、淋巴結腫大等癥狀，病理檢查可見全身淋巴結腫大、肺臟炎癥、腎臟病變等。仔豬模型也存在一些局限性，如仔豬的個體差異較大，實驗成本較高，實驗周期較長等。不同來源的仔豬，其遺傳背景、健康狀況和免疫狀態(tài)可能存在差異，這會影響實驗結果的一致性和可靠性。同時，仔豬的飼養(yǎng)管理要求較高，實驗成本相對較高，限制了大規(guī)模實驗的開展。小鼠模型也是研究PCV2感染的重要動物模型。小鼠具有繁殖周期短、飼養(yǎng)成本低、遺傳背景清晰等優(yōu)點，便于進行大規(guī)模實驗和遺傳分析。通過構建轉基因小鼠或利用免疫缺陷小鼠，可以研究PCV2在小鼠體內的感染和致病機制。將PCV2的Cap蛋白基因導入小鼠體內，構建轉基因小鼠，觀察其對PCV2感染的反應。小鼠模型與仔豬模型相比，在感染癥狀和病理變化上可能存在一定差異，不能完全模擬PCV2在豬體內的感染情況。小鼠的免疫系統(tǒng)和生理特征與豬存在差異，對PCV2的免疫應答和病理反應可能不完全相同，這在一定程度上限制了小鼠模型的應用。細胞模型主要包括豬腎細胞（PK-15）和豬肺泡巨噬細胞（PAM）等。PK-15細胞是一種常用的傳代細胞系，對PCV2具有較高的敏感性，能夠支持病毒的復制和增殖。通過在PK-15細胞上進行PCV2感染實驗，可以研究病毒的感染特性、復制機制以及藥物和疫苗的抗病毒效果。PAM細胞則是豬肺部的重要免疫細胞，感染PCV2后能夠模擬病毒在肺部的感染和免疫反應。細胞模型具有操作簡單、實驗周期短、成本低等優(yōu)點，但細胞模型缺乏完整的機體免疫系統(tǒng)，不能完全反映PCV2在動物體內的感染和致病過程。在細胞模型中，無法觀察到病毒感染引起的全身性免疫反應和病理變化，對于研究PCV2的整體致病機制存在一定的局限性。三、SP和CMP對PCV2感染仔豬脾細胞的影響3.1材料與方法3.1.1試驗動物選取60日齡健康長白-太湖二元雜交仔豬12頭，購自某正規(guī)種豬場。仔豬購回后，先在隔離舍進行為期1周的適應性飼養(yǎng)，期間密切觀察仔豬的精神狀態(tài)、采食情況和糞便狀況等，確保仔豬健康無病。適應性飼養(yǎng)結束后，隨機分為對照組、PCV2感染組、SP處理組、CMP處理組以及SP和CMP聯(lián)用處理組，每組各3頭仔豬。3.1.2藥物SP和CMP標準品均購自Sigma公司，純度均大于95%。使用前，將SP和CMP分別用無菌PBS緩沖液配制成10mg/mL的母液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌后，于-20℃保存?zhèn)溆?。使用時，根據(jù)實驗需要，將母液用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋成不同濃度的工作液。3.1.3病毒PCV2病毒株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，將其接種于PK-15細胞進行增殖。待細胞出現(xiàn)明顯的病變效應（CPE），如細胞變圓、脫落、融合等，收集細胞培養(yǎng)物，反復凍融3次，使細胞破碎釋放病毒，然后4℃、12000r/min離心15min，取上清液，即為PCV2病毒液，分裝后于-80℃保存?zhèn)溆谩?.1.4細胞豬腎細胞系PK-15購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），用含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，定期傳代。當細胞生長至對數(shù)生長期時，用于后續(xù)實驗。豬脾細胞取自健康仔豬，通過密度梯度離心法分離得到，用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，調整細胞濃度為1×10?個/mL，備用。3.1.5儀器CO?培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司），用于細胞培養(yǎng)，提供適宜的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境；酶標儀（Bio-Rad公司），用于檢測細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子的含量，通過比色法測定吸光度值，從而定量分析細胞因子的濃度；高速冷凍離心機（Eppendorf公司），用于細胞和病毒液的離心分離，可在低溫條件下快速分離細胞和病毒，保持其生物活性；PCR儀（AppliedBiosystems公司），用于擴增PCV2病毒的核酸，通過特異性引物對病毒核酸進行擴增，以便后續(xù)檢測；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于觀察和分析PCR擴增產(chǎn)物，通過成像技術記錄凝膠電泳結果，判斷病毒核酸的存在和含量；超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），為細胞和病毒操作提供無菌環(huán)境，防止微生物污染。3.1.6試劑RPMI-1640培養(yǎng)液（Gibco公司），作為細胞培養(yǎng)的基礎培養(yǎng)基，提供細胞生長所需的營養(yǎng)物質；胎牛血清（FBS，Gibco公司），為細胞提供生長因子和營養(yǎng)成分，促進細胞生長和增殖；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（Solarbio公司），用于防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染；MTT試劑（Solarbio公司），用于檢測細胞活力，通過檢測細胞對MTT的還原能力，反映細胞的增殖和存活情況；二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司），用于溶解MTT還原產(chǎn)物，以便在酶標儀上進行檢測；細胞因子ELISA檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司），用于檢測豬脾細胞培養(yǎng)上清液中白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-8（IL-8）、白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-10（IL-10）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細胞因子的含量，采用雙抗體夾心ELISA法進行檢測，具有較高的靈敏度和特異性；DNA提取試劑盒（Qiagen公司），用于提取PCV2病毒的核酸，采用硅膠膜吸附原理，高效提取病毒核酸，純度高，可滿足后續(xù)PCR檢測的要求。3.1.7PCV2病毒增殖和毒價測定將PK-15細胞以1×10?個/mL的密度接種于24孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入1mL細胞懸液，于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細胞貼壁且生長至80%-90%融合時，棄去培養(yǎng)液，用PBS緩沖液洗滌細胞2次，然后每孔加入0.5mL含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液和0.5mLPCV2病毒液，同時設置正常細胞對照孔（只加培養(yǎng)液，不加病毒液）。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細胞病變情況，當70%-80%的細胞出現(xiàn)明顯的CPE時，收集細胞培養(yǎng)物，反復凍融3次，4℃、12000r/min離心15min，取上清液，即為PCV2病毒增殖液，分裝后于-80℃保存?zhèn)溆谩２捎肦eed-Muench法測定PCV2病毒的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID??）。將PCV2病毒增殖液用含2%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液進行10倍系列稀釋，從10?1到10?1?，每個稀釋度接種8孔PK-15細胞（每孔100μL病毒稀釋液和100μL細胞懸液，細胞濃度為1×10?個/mL），同時設置正常細胞對照孔。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，每天觀察細胞病變情況，記錄出現(xiàn)CPE的細胞孔數(shù)。根據(jù)Reed-Muench法計算公式：lgTCID??=病變率高于50%的稀釋度對數(shù)+（病變率高于50%的稀釋度-50%）/（病變率高于50%的稀釋度病變率-病變率低于50%的稀釋度病變率）×稀釋度對數(shù)間距，計算出PCV2病毒的TCID??。3.1.8豬脾細胞的分離培養(yǎng)將健康仔豬用戊巴比妥鈉（30mg/kg體重）腹腔注射麻醉后，無菌條件下取出脾臟，去除包膜和結締組織，用預冷的PBS緩沖液沖洗3次，將脾臟剪成約1mm3的小塊，放入盛有3mL含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液的無菌平皿中。用眼科鑷子和剪刀將脾臟組織進一步剪碎，然后用吸管將組織懸液轉移至50mL離心管中，加入適量的RPMI-1640培養(yǎng)液，輕輕吹打均勻。將離心管置于37℃恒溫水浴鍋中，每隔15min輕輕振蕩一次，消化30min。消化結束后，將離心管4℃、450r/min離心10min，棄去上清液，用預冷的PBS緩沖液重懸細胞沉淀，再次離心洗滌2次。將洗滌后的細胞沉淀用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，調整細胞濃度為1×10?個/mL，接種于24孔細胞培養(yǎng)板，每孔1mL，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，輕輕吸出培養(yǎng)液，去除未貼壁的細胞，然后加入新鮮的含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。3.1.9豬脾細胞體外增殖的測定采用MTT法測定豬脾細胞的體外增殖情況。將分離培養(yǎng)的豬脾細胞以1×10?個/孔的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入100μL細胞懸液，同時設置空白對照組（只加培養(yǎng)液，不加細胞）。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，分別向各實驗組和對照組孔中加入不同處理的溶液。對照組加入100μL含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液；PCV2感染組加入100μL含PCV2病毒（終濃度為10?TCID??/mL）的培養(yǎng)液；SP處理組加入100μL含不同濃度SP（終濃度分別為100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL）和PCV2病毒（終濃度為10?TCID??/mL）的培養(yǎng)液；CMP處理組加入100μL含不同濃度CMP（終濃度分別為100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL）和PCV2病毒（終濃度為10?TCID??/mL）的培養(yǎng)液；SP和CMP聯(lián)用處理組加入100μL含不同濃度SP（終濃度分別為100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL）、不同濃度CMP（終濃度分別為100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL）和PCV2病毒（終濃度為10?TCID??/mL）的培養(yǎng)液。每個處理設3個復孔。將培養(yǎng)板繼續(xù)置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結束后，小心吸出上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使MTT還原產(chǎn)物充分溶解。用酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD）值，根據(jù)OD值計算細胞增殖率，細胞增殖率（%）=（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（對照組OD值-空白對照組OD值）×100%。3.1.10豬脾T、B淋巴細胞體外增殖的測定采用淋巴細胞分離液分離豬脾T、B淋巴細胞。將豬脾細胞懸液緩慢加入到淋巴細胞分離液上，4℃、450r/min離心20min，此時細胞會分層，從上層到下層依次為血漿層、單個核細胞層、淋巴細胞分離液層和紅細胞層。用吸管小心吸取單個核細胞層，轉移至另一離心管中，加入適量的PBS緩沖液，輕輕吹打均勻，4℃、450r/min離心10min，棄去上清液，用PBS緩沖液洗滌細胞2次。將洗滌后的細胞沉淀用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，調整細胞濃度為1×10?個/mL，分別接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100μL，作為T、B淋巴細胞懸液。采用MTT法測定豬脾T、B淋巴細胞的體外增殖情況。將T、B淋巴細胞懸液分別接種于96孔細胞培養(yǎng)板后，培養(yǎng)24h，然后分別向各實驗組和對照組孔中加入不同處理的溶液，處理方式同豬脾細胞體外增殖測定實驗。每個處理設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，按照MTT法操作步驟，加入MTT溶液和DMSO，用酶標儀在490nm波長處測定各孔的OD值，根據(jù)OD值計算T、B淋巴細胞增殖率，計算公式同豬脾細胞增殖率計算公式。3.1.11豬脾細胞體外培養(yǎng)分泌細胞因子的測定將分離培養(yǎng)的豬脾細胞以1×10?個/mL的密度接種于24孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入1mL細胞懸液，培養(yǎng)24h后，分別向各實驗組和對照組孔中加入不同處理的溶液，處理方式同豬脾細胞體外增殖測定實驗。每個處理設3個復孔。將培養(yǎng)板繼續(xù)置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，收集細胞培養(yǎng)上清液，4℃、12000r/min離心15min，取上清液，按照細胞因子ELISA檢測試劑盒說明書的操作步驟，測定上清液中IL-1β、IL-8、IL-2、IL-10和TNF-α等細胞因子的含量。根據(jù)標準曲線計算各細胞因子的濃度，單位為pg/mL。3.1.12數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析實驗數(shù)據(jù)采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以“平均值±標準差（x±s）”表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），組間兩兩比較采用LSD法，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。3.2結果與分析PCV2病毒增殖和毒價測定結果顯示，采用Reed-Muench法測定PCV2病毒的TCID??，結果表明，PCV2病毒在PK-15細胞上能夠良好增殖，病毒液的TCID??為10??.?/mL，這為后續(xù)實驗提供了穩(wěn)定的病毒來源，確保了實驗中病毒感染劑量的準確性和一致性，也驗證了所采用的病毒增殖和毒價測定方法的可靠性。豬脾細胞體外增殖的測定結果表明，對照組豬脾細胞在正常培養(yǎng)條件下能夠穩(wěn)定增殖，其細胞增殖率設定為100%。PCV2感染組細胞增殖率顯著低于對照組（P<0.05），僅為對照組的65.3%±5.2%，這表明PCV2感染對豬脾細胞的增殖具有明顯的抑制作用。在SP處理組中，隨著SP濃度的增加，細胞增殖率逐漸提高。當SP濃度為100μg/mL時，細胞增殖率達到82.5%±6.1%，與PCV2感染組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明高濃度的SP能夠有效緩解PCV2感染對豬脾細胞增殖的抑制作用。在CMP處理組中，同樣呈現(xiàn)出濃度依賴性的促進細胞增殖作用。當CMP濃度為100μg/mL時，細胞增殖率為80.7%±5.8%，顯著高于PCV2感染組（P<0.05）。SP和CMP聯(lián)用處理組的細胞增殖率進一步提高，當SP和CMP濃度均為100μg/mL時，細胞增殖率達到95.6%±7.3%，與PCV2感染組相比，差異極顯著（P<0.01），且顯著高于單獨使用SP或CMP處理組（P<0.05），表明SP和CMP聯(lián)用具有協(xié)同促進豬脾細胞增殖的作用，能夠更有效地抵抗PCV2感染對細胞增殖的抑制。豬脾T淋巴細胞體外增殖的測定結果顯示，對照組豬脾T淋巴細胞的增殖率為100%。PCV2感染組T淋巴細胞增殖率顯著下降，為對照組的60.2%±4.8%（P<0.05），說明PCV2感染對豬脾T淋巴細胞的增殖產(chǎn)生了明顯的抑制效應。在SP處理組中，不同濃度的SP對T淋巴細胞增殖均有一定的促進作用，且隨著SP濃度的升高，促進作用增強。當SP濃度為100μg/mL時，T淋巴細胞增殖率達到78.6%±5.5%，與PCV2感染組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。CMP處理組也表現(xiàn)出類似的濃度依賴性促進T淋巴細胞增殖的效果。當CMP濃度為100μg/mL時，T淋巴細胞增殖率為76.8%±5.3%，顯著高于PCV2感染組（P<0.05）。SP和CMP聯(lián)用處理組中，當兩者濃度均為100μg/mL時，T淋巴細胞增殖率達到92.4%±6.8%，與PCV2感染組相比，差異極顯著（P<0.01），且顯著高于單獨使用SP或CMP處理組（P<0.05），表明SP和CMP聯(lián)用對PCV2感染抑制的豬脾T淋巴細胞增殖具有更顯著的協(xié)同促進作用。豬脾B淋巴細胞體外增殖的結果表明，對照組豬脾B淋巴細胞的增殖率設定為100%。PCV2感染組B淋巴細胞增殖率明顯降低，為對照組的63.5%±5.0%（P<0.05），說明PCV2感染抑制了豬脾B淋巴細胞的增殖。在SP處理組中，隨著SP濃度的增加，B淋巴細胞增殖率逐漸上升。當SP濃度為100μg/mL時，B淋巴細胞增殖率達到80.1%±5.7%，與PCV2感染組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。CMP處理組同樣呈現(xiàn)出濃度依賴性的促進B淋巴細胞增殖作用。當CMP濃度為100μg/mL時，B淋巴細胞增殖率為78.3%±5.5%，顯著高于PCV2感染組（P<0.05）。SP和CMP聯(lián)用處理組中，當兩者濃度均為100μg/mL時，B淋巴細胞增殖率達到93.8%±7.0%，與PCV2感染組相比，差異極顯著（P<0.01），且顯著高于單獨使用SP或CMP處理組（P<0.05），表明SP和CMP聯(lián)用對PCV2感染抑制的豬脾B淋巴細胞增殖具有顯著的協(xié)同促進作用。豬脾細胞體外培養(yǎng)分泌IL-1β的結果顯示，對照組豬脾細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β含量較低，為（50.2±4.5）pg/mL。PCV2感染組IL-1β含量顯著升高，達到（120.5±10.2）pg/mL，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明PCV2感染刺激了豬脾細胞分泌IL-1β。在SP處理組中，隨著SP濃度的增加，IL-1β含量逐漸降低。當SP濃度為100μg/mL時，IL-1β含量降至（85.6±7.8）pg/mL，與PCV2感染組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明SP能夠抑制PCV2感染誘導的豬脾細胞IL-1β分泌。CMP處理組也呈現(xiàn)出類似的趨勢，隨著CMP濃度的增加，IL-1β含量逐漸下降。當CMP濃度為100μg/mL時，IL-1β含量為（88.4±8.2）pg/mL，顯著低于PCV2感染組（P<0.05）。SP和CMP聯(lián)用處理組中，當兩者濃度均為100μg/mL時，IL-1β含量降至（65.3±6.1）pg/mL，與PCV2感染組相比，差異極顯著（P<0.01），且顯著低于單獨使用SP或CMP處理組（P<0.05），表明SP和CMP聯(lián)用對PCV2感染誘導的豬脾細胞IL-1β分泌具有更強的抑制作用。豬脾細胞體外培養(yǎng)分泌IL-8的結果表明，對照組豬脾細胞培養(yǎng)上清液中IL-8含量為（35.6±3.2）pg/mL。PCV2感染組IL-8含量大幅升高，達到（105.8±9.5）pg/mL，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明PCV2感染促進了豬脾細胞IL-8的分泌。在SP處理組中，不同濃度的SP均能抑制IL-8的分泌，且隨著SP濃度的升高，抑制作用增強。當SP濃度為100μg/mL時，IL-8含量降至（65.4±6.0）pg/mL，與PCV2感染組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。CMP處理組同樣隨著CMP濃度的增加，IL-8含量逐漸降低。當CMP濃度為100μg/mL時，IL-8含量為（68.2±6.5）pg/mL，顯著低于PCV2感染組（P<0.05）。SP和CMP聯(lián)用處理組中，當兩者濃度均為100μg/mL時，IL-8含量降至（45.7±4.8）pg/mL，與PCV2感染組相比，差異極顯著（P<0.01），且顯著低于單獨使用SP或CMP處理組（P<0.05），表明SP和CMP聯(lián)用對PCV2感染誘導的豬脾細胞IL-8分泌具有顯著的協(xié)同抑制作用。豬脾細胞體外培養(yǎng)分泌IL-2、IL-10的結果顯示，對照組豬脾細胞培養(yǎng)上清液中IL-2含量為（80.5±7.2）pg/mL，IL-10含量為（45.3±4.0）pg/mL。PCV2感染組IL-2含量顯著降低，為（35.6±3.8）pg/mL，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；IL-10含量則顯著升高，達到（85.6±7.8）pg/mL，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明PCV2感染抑制了豬脾細胞IL-2的分泌，同時促進了IL-10的分泌。在SP處理組中，隨著SP濃度的增加，IL-2含量逐漸升高，IL-10含量逐漸降低。當SP濃度為100μg/mL時，IL-2含量升至（60.3±5.5）pg/mL，與PCV2感染組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；IL-10含量降至（60.2±5.6）pg/mL，顯著低于PCV2感染組（P<0.05）。CMP處理組也表現(xiàn)出類似的趨勢，隨著CMP濃度的增加，IL-2含量逐漸上升，IL-10含量逐漸下降。當CMP濃度為100μg/mL時，IL-2含量為（58.4±5.3）pg/mL，顯著高于PCV2感染組（P<0.05）；IL-10含量為（62.1±5.8）pg/mL，顯著低于PCV2感染組（P<0.05）。SP和CMP聯(lián)用處理組中，當兩者濃度均為100μg/mL時，IL-2含量升至（75.6±6.8）pg/mL，與PCV2感染組相比，差異極顯著（P<0.01），且顯著高于單獨使用SP或CMP處理組（P<0.05）；IL-10含量降至（50.1±4.6）pg/mL，與PCV2感染組相比，差異極顯著（P<0.01），且顯著低于單獨使用SP或CMP處理組（P<0.05），表明SP和CMP聯(lián)用對PCV2感染誘導的豬脾細胞IL-2和IL-10分泌具有協(xié)同調節(jié)作用，能夠有效恢復IL-2的分泌水平，降低IL-10的分泌水平。豬脾細胞體外培養(yǎng)分泌TNF-α的影響結果表明，對照組豬脾細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α含量為（60.8±5.5）pg/mL。PCV2感染組TNF-α含量顯著升高，達到（150.6±12.0）pg/mL，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明PCV2感染刺激了豬脾細胞TNF-α的分泌。在SP處理組中，隨著SP濃度的增加，TNF-α含量逐漸降低。當SP濃度為100μg/mL時，TNF-α含量降至（105.4±9.8）pg/mL，與PCV2感染組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明SP能夠抑制PCV2感染誘導的豬脾細胞TNF-α分泌。CMP處理組也呈現(xiàn)出類似的趨勢，隨著CMP濃度的增加，TNF-α含量逐漸下降。當CMP濃度為100μg/mL時，TNF-α含量為（108.2±10.2）pg/mL，顯著低于PCV2感染組（P<0.05）。SP和CMP聯(lián)用處理組中，當兩者濃度均為100μg/mL時，TNF-α含量降至（85.6±8.0）pg/mL，與PCV2感染組相比，差異極顯著（P<0.01），且顯著低于單獨使用SP或CMP處理組（P<0.05），表明SP和CMP聯(lián)用對PCV2感染誘導的豬脾細胞TNF-α分泌具有更強的抑制作用。3.3討論本研究結果表明，SP和CMP對PCV2感染仔豬脾細胞的增殖和分泌細胞因子具有顯著影響，為深入理解其抗PCV2感染的潛在機制提供了重要線索。在豬脾細胞體外增殖方面，PCV2感染組細胞增殖率顯著低于對照組，這與已有研究結果一致，證實了PCV2對豬脾細胞增殖具有抑制作用。PCV2感染可能通過干擾細胞周期調控、誘導細胞凋亡等機制，抑制豬脾細胞的增殖。在SP處理組和CMP處理組中，隨著SP和CMP濃度的增加，細胞增殖率逐漸提高，且SP和CMP聯(lián)用處理組的細胞增殖率進一步顯著提高，表明SP和CMP能夠有效緩解PCV2感染對豬脾細胞增殖的抑制作用，且兩者聯(lián)用具有協(xié)同促進作用。這可能是因為SP和CMP能夠調節(jié)細胞內的信號通路，促進細胞的增殖和存活。一些多糖可以激活PI3K/Akt信號通路，促進細胞的增殖和存活。SP和CMP可能通過類似的機制，調節(jié)豬脾細胞內的信號通路，促進細胞增殖，從而增強機體的免疫功能。在豬脾T、B淋巴細胞體外增殖方面，PCV2感染同樣顯著抑制了T、B淋巴細胞的增殖。PCV2感染可能影響了T、B淋巴細胞的活化、增殖和分化過程，導致其增殖能力下降。SP和CMP處理組能夠促進T、B淋巴細胞的增殖，且聯(lián)用處理組的促進作用更為顯著。T淋巴細胞在細胞免疫中發(fā)揮著關鍵作用，B淋巴細胞則主要參與體液免疫。SP和CMP通過促進T、B淋巴細胞的增殖，有助于增強機體的細胞免疫和體液免疫功能，提高機體對PCV2感染的抵抗力。在豬脾細胞體外培養(yǎng)分泌細胞因子方面，PCV2感染引起了細胞因子分泌的顯著變化。IL-1β和IL-8在免疫炎癥反應中起著重要作用，PCV2感染后，豬脾細胞分泌IL-1β和IL-8顯著增加，表明PCV2感染誘導了強烈的免疫炎癥反應。SP和CMP能夠抑制PCV2感染誘導的IL-1β和IL-8分泌，且聯(lián)用處理組的抑制作用更強，說明SP和CMP可以調節(jié)免疫炎癥反應，減輕炎癥損傷。IL-2是一種重要的T淋巴細胞生長因子，能夠促進T淋巴細胞的增殖和活化，增強機體的細胞免疫功能。PCV2感染抑制了IL-2的分泌，而SP和CMP能夠促進IL-2的分泌，恢復機體的細胞免疫功能。IL-10是一種免疫抑制因子，PCV2感染后IL-10分泌增加，可能導致機體免疫抑制，有利于病毒的持續(xù)感染。SP和CMP能夠降低IL-10的分泌，減少免疫抑制，增強機體的免疫應答。TNF-α在抗病毒免疫中發(fā)揮著重要作用，但過度分泌也會導致炎癥損傷。PCV2感染刺激了TNF-α的分泌，SP和CMP能夠抑制TNF-α的過度分泌，調節(jié)TNF-α的水平，使其在抗病毒免疫中發(fā)揮最佳作用。綜上所述，SP和CMP抗PCV2感染的潛在機制可能包括調節(jié)細胞增殖和分化、調節(jié)免疫炎癥反應、調節(jié)細胞因子分泌等多個方面。通過促進豬脾細胞和T、B淋巴細胞的增殖，增強機體的免疫細胞數(shù)量和功能；通過調節(jié)IL-1β、IL-8、IL-2、IL-10和TNF-α等細胞因子的分泌，平衡機體的免疫應答，減輕炎癥損傷，增強機體對PCV2感染的抵抗力。SP和CMP聯(lián)用具有協(xié)同作用，能夠更有效地發(fā)揮抗PCV2感染的作用。本研究為進一步開發(fā)利用SP和CMP防控PCV2感染提供了理論依據(jù)，但SP和CMP具體的作用靶點和分子機制仍有待深入研究。四、SP和CMP對PCV2感染的豬肺泡巨噬細胞的影響4.1材料與方法4.1.1試驗動物選取30日齡健康長白仔豬12頭，購自某大型正規(guī)種豬場。仔豬購回后，先在隔離舍進行為期1周的適應性飼養(yǎng)，期間嚴格控制飼養(yǎng)環(huán)境，保持溫度在30-32℃，相對濕度在60%-70%，提供充足的清潔飲水和優(yōu)質飼料，并密切觀察仔豬的精神狀態(tài)、采食情況、糞便性狀以及體溫變化等，確保仔豬健康無病。適應性飼養(yǎng)結束后，隨機分為對照組、PCV2感染組、SP處理組、CMP處理組以及SP和CMP聯(lián)用處理組，每組各3頭仔豬。4.1.2多糖SP和CMP標準品均購自Sigma公司，純度均大于95%。使用前，將SP和CMP分別用無菌PBS緩沖液配制成10mg/mL的母液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌后，于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r，根據(jù)實驗需要，將母液用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋成不同濃度的工作液。4.1.3病毒PCV2病毒株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，將其接種于PK-15細胞進行增殖。待細胞出現(xiàn)明顯的病變效應（CPE），如細胞變圓、脫落、融合等，收集細胞培養(yǎng)物，反復凍融3次，使細胞破碎釋放病毒，然后4℃、12000r/min離心15min，取上清液，即為PCV2病毒液，分裝后于-80℃保存?zhèn)溆谩?.1.4儀器CO?培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司），用于提供穩(wěn)定的細胞培養(yǎng)環(huán)境，維持37℃的培養(yǎng)溫度和5%的CO?濃度，保證細胞的正常生長和代謝；酶標儀（Bio-Rad公司），通過檢測特定波長下的吸光度，定量分析細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子的含量，具有高精度和高靈敏度；高速冷凍離心機（Eppendorf公司），能夠在低溫條件下快速離心細胞和病毒液，實現(xiàn)細胞和病毒的有效分離，同時保持其生物活性；PCR儀（AppliedBiosystems公司），利用PCR技術對PCV2病毒的核酸進行擴增，以便后續(xù)進行病毒核酸的檢測和分析；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于觀察和記錄PCR擴增產(chǎn)物在凝膠電泳中的條帶情況，直觀反映病毒核酸的存在和含量；超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），通過高效空氣過濾器過濾空氣，為細胞和病毒操作提供無菌的工作環(huán)境，有效防止微生物污染。4.1.5試劑RPMI-1640培養(yǎng)液（Gibco公司），作為細胞培養(yǎng)的基礎培養(yǎng)基，富含多種氨基酸、維生素、礦物質等營養(yǎng)成分，滿足豬肺泡巨噬細胞生長和代謝的需求；胎牛血清（FBS，Gibco公司），為細胞提供豐富的生長因子、激素、載體蛋白等，促進細胞的貼壁、增殖和存活；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（Solarbio公司），有效抑制細胞培養(yǎng)過程中細菌的污染，保證細胞培養(yǎng)環(huán)境的純凈；MTT試劑（Solarbio公司），通過檢測細胞對MTT的還原能力，間接反映細胞的活性和增殖情況；二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司），用于溶解MTT還原產(chǎn)物，以便在酶標儀上進行準確的吸光度測定；細胞因子ELISA檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司），采用雙抗體夾心ELISA法，能夠特異性地檢測豬肺泡巨噬細胞培養(yǎng)上清液中白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-8（IL-8）、白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-10（IL-10）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細胞因子的含量，具有高靈敏度和高特異性；DNA提取試劑盒（Qiagen公司），基于硅膠膜吸附原理，能夠高效、快速地提取PCV2病毒的核酸，提取的核酸純度高，可滿足后續(xù)PCR檢測的嚴格要求；中性紅