FGF-2與TRX在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)特征、關(guān)聯(lián)機(jī)制及臨床價(jià)值探究一、引言1.1研究背景與意義肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率極高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。在所有肺癌病例中，非小細(xì)胞肺癌（Non-SmallCellLungCancer，NSCLC）約占85%，是最常見的肺癌亞型，主要包括腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌等。盡管近年來在NSCLC的診斷和治療方面取得了一定進(jìn)展，如手術(shù)技術(shù)的改進(jìn)、化療藥物的優(yōu)化、靶向治療和免疫治療的應(yīng)用等，但NSCLC患者的總體預(yù)后仍然不容樂觀，5年生存率僅為15-20%。這主要是因?yàn)榇蟛糠只颊咴诖_診時(shí)已處于疾病晚期，錯(cuò)過了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)，且腫瘤易發(fā)生轉(zhuǎn)移和耐藥，導(dǎo)致治療效果不佳。深入了解NSCLC的發(fā)病機(jī)制，尋找新的生物標(biāo)志物和有效的治療靶點(diǎn)，對(duì)于改善NSCLC的早期診斷、精準(zhǔn)治療和預(yù)后評(píng)估具有至關(guān)重要的意義。生物標(biāo)志物不僅可以用于疾病的早期篩查、輔助診斷，還能預(yù)測(cè)患者對(duì)治療的反應(yīng)和預(yù)后情況，為個(gè)性化治療提供依據(jù)。而有效的治療靶點(diǎn)則能為開發(fā)新的治療藥物和方法指明方向，有望提高治療的針對(duì)性和有效性，延長(zhǎng)患者的生存期，提高生活質(zhì)量。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2（FibroblastGrowthFactor-2，F(xiàn)GF-2）是一種多功能的生長(zhǎng)因子，在細(xì)胞的增殖、分化、遷移和血管生成等過程中發(fā)揮著重要作用。已有研究表明，F(xiàn)GF-2在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，包括NSCLC，其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。FGF-2可以通過激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活，同時(shí)還能誘導(dǎo)血管生成，為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供必要的營(yíng)養(yǎng)和氧氣。此外，F(xiàn)GF-2還與腫瘤的耐藥性相關(guān)，可能影響腫瘤患者的治療效果和預(yù)后。硫氧還蛋白（Thioredoxin，TRX）是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的氧化還原蛋白，具有抗氧化、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡等多種生物學(xué)功能。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，TRX的表達(dá)常常發(fā)生改變，并且與腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、抗凋亡以及對(duì)化療和放療的抵抗密切相關(guān)。在NSCLC中，TRX可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。研究FGF-2和TRX在NSCLC中的表達(dá)及臨床病理學(xué)意義，有助于進(jìn)一步揭示NSCLC的發(fā)病機(jī)制，為NSCLC的早期診斷、預(yù)后評(píng)估和治療提供新的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。通過檢測(cè)FGF-2和TRX的表達(dá)水平，可能能夠更準(zhǔn)確地判斷患者的病情和預(yù)后，為臨床治療決策提供重要參考。對(duì)FGF-2和TRX作用機(jī)制的深入研究，也可能為開發(fā)針對(duì)NSCLC的新型靶向治療藥物和方法提供理論依據(jù)，從而提高NSCLC的治療效果，改善患者的生存狀況，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和理論研究意義。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在肺癌研究領(lǐng)域，非小細(xì)胞肺癌始終是關(guān)注焦點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，對(duì)NSCLC發(fā)病機(jī)制的研究不斷深入，大量與NSCLC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的分子被揭示。FGF-2和TRX作為其中備受關(guān)注的分子，在國(guó)內(nèi)外的研究取得了一定成果，但也存在一些不足與空白。國(guó)外對(duì)FGF-2在NSCLC中的研究開展較早且較為深入。眾多研究表明，F(xiàn)GF-2在NSCLC組織中的表達(dá)水平顯著高于正常肺組織，其高表達(dá)與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，阻斷FGF-2信號(hào)通路能夠抑制NSCLC細(xì)胞的增殖和遷移能力。在動(dòng)物模型中，注射FGF-2中和抗體可有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)和血管生成。在臨床研究方面，一些研究分析了FGF-2表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)FGF-2高表達(dá)的患者總體生存率和無進(jìn)展生存率較低，提示FGF-2可作為評(píng)估NSCLC患者預(yù)后的潛在指標(biāo)。在對(duì)FGF-2作用機(jī)制的研究中，發(fā)現(xiàn)FGF-2主要通過與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（FGFR）結(jié)合，激活下游的Ras-Raf-MEK-ERK和PI3K-Akt等信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和遷移，同時(shí)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)腫瘤血管生成。國(guó)內(nèi)學(xué)者在FGF-2與NSCLC的研究方面也做出了重要貢獻(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-2的表達(dá)與NSCLC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關(guān)，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期較晚的患者中，F(xiàn)GF-2的陽性表達(dá)率更高。一些研究還探討了FGF-2與其他分子的相互作用，為揭示NSCLC的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角。有研究表明，F(xiàn)GF-2與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）在NSCLC中存在協(xié)同作用，共同促進(jìn)腫瘤血管生成。在TRX與NSCLC的研究方面，國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，TRX在NSCLC組織中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤的病理學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良相關(guān)。通過對(duì)TRX基因敲除的NSCLC細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯減弱，對(duì)化療藥物的敏感性增強(qiáng)。在臨床樣本分析中，也證實(shí)了TRX高表達(dá)的NSCLC患者更容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，生存期更短。TRX發(fā)揮作用的機(jī)制主要與其抗氧化功能和調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路有關(guān)。TRX可以通過還原細(xì)胞內(nèi)的氧化還原敏感蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和增殖。TRX還能激活NF-κB等信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和免疫逃逸。國(guó)內(nèi)對(duì)TRX在NSCLC中的研究也取得了一定進(jìn)展。有研究應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)了NSCLC組織中TRX的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TRX的表達(dá)與腫瘤的惡性程度和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。一些研究還嘗試將TRX作為NSCLC的治療靶點(diǎn)，探索新的治療策略。有研究報(bào)道，使用TRX抑制劑可以抑制NSCLC細(xì)胞的生長(zhǎng)，并增強(qiáng)化療藥物的療效。盡管國(guó)內(nèi)外對(duì)FGF-2和TRX在NSCLC中的研究取得了上述成果，但仍存在一些不足與空白。目前對(duì)于FGF-2和TRX在NSCLC中的聯(lián)合研究相對(duì)較少，兩者在NSCLC發(fā)生、發(fā)展過程中的相互作用機(jī)制尚未完全明確。雖然已知FGF-2和TRX各自參與的信號(hào)通路，但這些信號(hào)通路之間是否存在交叉對(duì)話，以及如何通過干預(yù)這些信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)更有效的治療，還需要進(jìn)一步深入研究。在臨床應(yīng)用方面，雖然FGF-2和TRX作為潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)具有一定的研究前景，但目前還缺乏大規(guī)模、多中心的臨床研究來驗(yàn)證其可靠性和有效性，距離真正應(yīng)用于臨床診斷和治療還有一定的距離。1.3研究目的與方法本研究旨在深入探究FGF-2和TRX在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況，分析它們與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)，明確二者表達(dá)的相關(guān)性，并初步探索其在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，為非小細(xì)胞肺癌的診斷、預(yù)后評(píng)估及治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。為實(shí)現(xiàn)上述研究目的，本研究將采用多種實(shí)驗(yàn)方法。首先，收集非小細(xì)胞肺癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本和相應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)FGF-2和TRX蛋白在組織中的表達(dá)水平，通過分析陽性細(xì)胞的比例和染色強(qiáng)度，判斷其表達(dá)情況，并與患者的臨床病理資料進(jìn)行相關(guān)性分析，包括腫瘤的大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、病理類型、患者年齡、性別等，以明確FGF-2和TRX表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)定量檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁正常組織中FGF-2和TRX蛋白的表達(dá)量，進(jìn)一步驗(yàn)證免疫組化的結(jié)果，提高研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)FGF-2和TRX基因在非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁正常組織中的mRNA表達(dá)水平，從基因轉(zhuǎn)錄水平分析二者的表達(dá)差異，為深入研究其作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面，選擇人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達(dá)或沉默F(xiàn)GF-2和TRX基因，觀察細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的變化，利用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，初步探討FGF-2和TRX在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為中的作用。同時(shí)，運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路分子的表達(dá)變化，探索FGF-2和TRX影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的潛在信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。二、FGF-2和TRX的生物學(xué)特性2.1FGF-2的結(jié)構(gòu)、功能與作用機(jī)制FGF-2，又稱堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）和FGF-β，是一種由FGF-2基因編碼的重要生長(zhǎng)因子和信號(hào)蛋白，屬于龐大的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族成員。目前，該家族已確認(rèn)有24個(gè)成員，并且存在四種與之對(duì)應(yīng)的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（FGFR）。FGF-2由分子量約為18kDa的單一多肽構(gòu)成，呈現(xiàn)球狀結(jié)構(gòu)。其分子包含四個(gè)半胱氨酸殘基，獨(dú)特的是這些殘基并不形成分子內(nèi)二硫鍵。通過對(duì)FGF-2晶體結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，在有無硫酸乙酰肝素片段存在的情況下，它均由12個(gè)反向平行β-折疊組成，進(jìn)而形成三角錐體結(jié)構(gòu)。整個(gè)FGF家族成員都具有與肝素或硫酸乙酰肝素結(jié)合的特性，這種結(jié)合對(duì)FGF-2的結(jié)構(gòu)有著重要影響，不僅有助于二聚體的形成，還能促使更高級(jí)寡聚體的產(chǎn)生。同時(shí)，F(xiàn)GF-2與肝素的相互作用為其提供了保護(hù)，使其能夠抵御熱休克、酸性介質(zhì)中的變性以及蛋白水解作用，維持自身結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性。FGF-2具備廣泛而重要的生物學(xué)功能，在多個(gè)生理和病理過程中扮演關(guān)鍵角色。在細(xì)胞增殖方面，它對(duì)成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞類型均有顯著的促增殖作用。在創(chuàng)傷修復(fù)過程中，F(xiàn)GF-2能夠刺激成纖維細(xì)胞大量增殖，加速肉芽組織的形成，從而有效促進(jìn)傷口愈合。在血管生成方面，F(xiàn)GF-2堪稱一種強(qiáng)效的血管生成因子。它能夠有力地促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖和分化，在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)以及腫瘤生長(zhǎng)等需要血管生成的過程中，F(xiàn)GF-2都發(fā)揮著不可或缺的作用，為組織和腫瘤提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣。在神經(jīng)系統(tǒng)中，F(xiàn)GF-2具有突出的神經(jīng)保護(hù)作用，能夠促進(jìn)神經(jīng)元的存活、生長(zhǎng)和分化，在神經(jīng)受損后，還能積極參與神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)與再生，助力神經(jīng)功能的恢復(fù)。在胚胎發(fā)育進(jìn)程中，F(xiàn)GF-2深度參與多個(gè)器官和組織的形成與發(fā)育，如肢體和心臟等，通過精細(xì)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化及遷移，推動(dòng)胚胎正常形態(tài)與結(jié)構(gòu)的塑造。FGF-2發(fā)揮作用的機(jī)制主要是通過與細(xì)胞表面的特異性受體FGFR結(jié)合來啟動(dòng)一系列信號(hào)傳導(dǎo)。FGFR屬于酪氨酸激酶受體家族，包含F(xiàn)GFR1-4四種類型。當(dāng)FGF-2與FGFR結(jié)合后，受體迅速發(fā)生二聚化，緊接著引起酪氨酸殘基的磷酸化，這一磷酸化事件如同多米諾骨牌，進(jìn)而激活下游一系列重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。其中，Ras-Raf-MEK-ERK通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和存活等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，被激活后能夠促使細(xì)胞周期進(jìn)程加快，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞的存活。PI3K-Akt通路同樣在細(xì)胞存活、代謝和生長(zhǎng)等方面有著重要影響，激活該通路可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝活動(dòng)，還能參與細(xì)胞遷移和侵襲等過程。此外，F(xiàn)GF-2還可能激活PLCγ等其他信號(hào)通路，這些通路之間相互協(xié)作、相互影響，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的基因表達(dá)和各種生物學(xué)行為，最終對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程產(chǎn)生重要影響。2.2TRX的結(jié)構(gòu)、功能與作用機(jī)制TRX是一種小分子的氧化還原蛋白，廣泛存在于從細(xì)菌到人類的各種生物體內(nèi)，在維持細(xì)胞的正常生理功能和應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激等方面發(fā)揮著不可或缺的作用。TRX的結(jié)構(gòu)較為獨(dú)特，它由大約105-116個(gè)氨基酸殘基組成，分子量通常在12-13kDa左右。其三維結(jié)構(gòu)主要包含一個(gè)由5個(gè)β-折疊片層和4個(gè)α-螺旋組成的核心結(jié)構(gòu)域，形成了典型的硫氧還蛋白折疊（thioredoxinfold）。在TRX的活性中心，存在一個(gè)高度保守的CXXC基序，通常為Cys-Gly-Pro-Cys序列，這兩個(gè)半胱氨酸殘基在TRX的氧化還原功能中起著關(guān)鍵作用。當(dāng)TRX處于還原態(tài)時(shí)，活性中心的兩個(gè)半胱氨酸以巰基（-SH）形式存在；而在氧化過程中，這兩個(gè)巰基會(huì)被氧化形成二硫鍵（-S-S-）。這種氧化還原狀態(tài)的可逆轉(zhuǎn)換是TRX發(fā)揮其生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。TRX具備多種重要的生物學(xué)功能，對(duì)細(xì)胞的生存、增殖和凋亡等過程產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。首先，TRX是一種強(qiáng)效的抗氧化劑，能夠有效清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS），如超氧陰離子（O??）、過氧化氫（H?O?）和羥自由基（?OH）等。通過還原這些ROS，TRX可以防止它們對(duì)細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，如DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等造成氧化損傷，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。研究表明，在氧化應(yīng)激條件下，細(xì)胞內(nèi)的TRX水平會(huì)迅速升高，以增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化防御能力。其次，TRX在細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)中扮演著重要角色。它可以通過激活細(xì)胞內(nèi)的增殖相關(guān)信號(hào)通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路中的ERK1/2等，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。在凋亡調(diào)控方面，TRX能夠抑制細(xì)胞凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)，通過與凋亡相關(guān)蛋白相互作用，如抑制凋亡蛋白酶（caspase）的活性，從而抑制細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞的存活。TRX還參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的活性，如核因子-κB（NF-κB）、激活蛋白-1（AP-1）等。這些轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，TRX通過調(diào)節(jié)它們的活性，間接影響細(xì)胞的各種生物學(xué)行為。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，TRX發(fā)揮作用的機(jī)制較為復(fù)雜，主要與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)以及參與多條關(guān)鍵信號(hào)通路有關(guān)。腫瘤細(xì)胞通常處于高氧化應(yīng)激狀態(tài)，這會(huì)促使TRX的表達(dá)上調(diào)。高表達(dá)的TRX通過維持細(xì)胞內(nèi)的還原環(huán)境，有利于腫瘤細(xì)胞的存活和增殖。在氧化還原調(diào)節(jié)方面，TRX可以還原細(xì)胞內(nèi)的氧化蛋白，使其恢復(fù)活性，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的代謝和生長(zhǎng)。TRX能夠還原并激活一些與代謝相關(guān)的酶，如葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）等，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的糖代謝和抗氧化能力，滿足腫瘤細(xì)胞快速生長(zhǎng)的能量需求。在信號(hào)通路調(diào)節(jié)方面，TRX可以激活NF-κB信號(hào)通路。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤細(xì)胞中，TRX通過還原NF-κB抑制蛋白（IκB），使其降解，從而釋放NF-κB，使其進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移。TRX還可以通過與其他信號(hào)通路分子相互作用，如PI3K-Akt通路中的Akt蛋白等，調(diào)節(jié)該通路的活性，影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活和侵襲能力。三、FGF-2和TRX在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)檢測(cè)3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備本研究收集了[X]例非小細(xì)胞肺癌患者手術(shù)切除的腫瘤組織標(biāo)本，這些患者均為[具體時(shí)間段]在[醫(yī)院名稱]接受手術(shù)治療，術(shù)前均未接受放療、化療或其他抗腫瘤治療，且病例資料完整。同時(shí)，選取了距離腫瘤邊緣至少5cm的癌旁正常肺組織標(biāo)本作為對(duì)照，數(shù)量同樣為[X]例。所有標(biāo)本在手術(shù)切除后立即放入液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)中使用的主要試劑包括：兔抗人FGF-2多克隆抗體和兔抗人TRX多克隆抗體，均購(gòu)自[抗體公司名稱]，這兩種抗體經(jīng)過前期驗(yàn)證，具有較高的特異性和靈敏度，能準(zhǔn)確識(shí)別相應(yīng)抗原；免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自[試劑盒公司名稱]，該試劑盒包含免疫組化實(shí)驗(yàn)所需的各種試劑，如二抗、顯色劑等，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果穩(wěn)定；蛋白質(zhì)提取試劑盒，購(gòu)自[提取試劑盒公司名稱]，能高效提取組織中的蛋白質(zhì)，保證蛋白質(zhì)的完整性和活性；BCA蛋白定量試劑盒，購(gòu)自[定量試劑盒公司名稱]，用于準(zhǔn)確測(cè)定提取蛋白質(zhì)的濃度；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR擴(kuò)增試劑盒，均購(gòu)自[生物公司名稱]，反轉(zhuǎn)錄試劑盒可將RNA高效反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴(kuò)增試劑盒能特異性擴(kuò)增目的基因，擴(kuò)增效率高、特異性強(qiáng)；其他常規(guī)試劑，如甲醇、乙醇、二甲苯、蘇木精、伊紅等，均為分析純，購(gòu)自[試劑公司名稱]。主要儀器設(shè)備有：石蠟切片機(jī)，型號(hào)為[具體型號(hào)]，購(gòu)自[切片機(jī)公司名稱]，可精確制作厚度均勻的石蠟切片；顯微鏡，型號(hào)為[顯微鏡型號(hào)]，配備圖像采集系統(tǒng)，購(gòu)自[顯微鏡公司名稱]，用于觀察免疫組化染色結(jié)果并采集圖像，圖像清晰、分辨率高；高速冷凍離心機(jī)，型號(hào)為[離心機(jī)型號(hào)]，購(gòu)自[離心機(jī)公司名稱]，能在低溫條件下快速離心，滿足蛋白質(zhì)和RNA提取過程中的離心需求；電泳儀和電泳槽，型號(hào)分別為[電泳儀型號(hào)]和[電泳槽型號(hào)]，購(gòu)自[電泳設(shè)備公司名稱]，用于蛋白質(zhì)和核酸的電泳分離，電泳效果穩(wěn)定；凝膠成像系統(tǒng)，型號(hào)為[成像系統(tǒng)型號(hào)]，購(gòu)自[成像系統(tǒng)公司名稱]，可對(duì)電泳后的凝膠進(jìn)行成像和分析，操作簡(jiǎn)便、靈敏度高；PCR擴(kuò)增儀，型號(hào)為[PCR儀型號(hào)]，購(gòu)自[PCR儀公司名稱]，能精確控制反應(yīng)溫度和時(shí)間，保證PCR擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。3.1.2免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法免疫組織化學(xué)檢測(cè)是一種常用的檢測(cè)組織中蛋白質(zhì)表達(dá)的方法，其原理是利用抗原與抗體的特異性結(jié)合，通過標(biāo)記物來顯示目標(biāo)蛋白的位置和表達(dá)水平。在本研究中，我們使用免疫組織化學(xué)SP法來檢測(cè)FGF-2和TRX蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁正常肺組織中的表達(dá)。首先進(jìn)行樣本處理。從-80℃冰箱中取出組織標(biāo)本，放入37℃恒溫箱中復(fù)溫30min。將復(fù)溫后的組織標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋，用石蠟切片機(jī)切成厚度為4μm的連續(xù)切片，將切片裱貼在經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上，60℃烤箱中烤片2h，以增強(qiáng)切片與載玻片的粘附力。將烤好的切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中脫蠟10min，然后依次經(jīng)過100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇各5min進(jìn)行水化，最后用蒸餾水沖洗3次，每次5min。接著進(jìn)行抗原修復(fù)。將水化后的切片放入盛有檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）的修復(fù)盒中，置于微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)。先高火加熱至沸騰，然后轉(zhuǎn)低火維持沸騰狀態(tài)10-15min，取出修復(fù)盒，自然冷卻至室溫。冷卻后的切片用PBS（pH7.4）沖洗3次，每次5min，以去除殘留的緩沖液。隨后進(jìn)行抗體孵育。將切片從PBS中取出，用濾紙吸干切片周圍的水分，在組織切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育30min，以減少非特異性染色。傾去封閉液，勿洗，直接在切片上滴加適量稀釋好的兔抗人FGF-2多克隆抗體或兔抗人TRX多克隆抗體（抗體稀釋度根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定，一般為1:100-1:200），將切片放入濕盒中，4℃冰箱孵育過夜。第二天取出濕盒，將切片從冰箱中取出，室溫放置30min使其復(fù)溫，然后用PBS沖洗3次，每次5min，以洗去未結(jié)合的一抗。在切片上滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育30min，之后用PBS沖洗3次，每次5min。再在切片上滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30min，最后用PBS沖洗3次，每次5min。然后進(jìn)行顯色。在切片上滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽性部位出現(xiàn)棕黃色著色時(shí)，立即用蒸餾水沖洗終止顯色反應(yīng)，一般顯色時(shí)間為3-10min，具體時(shí)間根據(jù)顯色情況調(diào)整。最后進(jìn)行復(fù)染、脫水、透明和封片。將顯色后的切片用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核1-2min，自來水沖洗返藍(lán)，然后依次經(jīng)過75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ各5min進(jìn)行脫水，再放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中透明10min，最后用中性樹膠封片。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：在顯微鏡下觀察，F(xiàn)GF-2和TRX陽性產(chǎn)物均定位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行判斷。陽性細(xì)胞百分比：無陽性細(xì)胞為0分；陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分；11%-50%為2分；51%-80%為3分；＞80%為4分。染色強(qiáng)度：無著色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。將陽性細(xì)胞百分比得分與染色強(qiáng)度得分相乘，0分為陰性（-）；1-4分為弱陽性（+）；5-8分為中度陽性（++）；9-12分為強(qiáng)陽性（+++）。3.1.3Westernblot檢測(cè)方法Westernblot是一種用于檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平的常用技術(shù)，其原理是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質(zhì)按分子量大小分離，然后將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜上，再用特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。在本研究中，使用該方法定量檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁正常肺組織中FGF-2和TRX蛋白的表達(dá)量。首先進(jìn)行蛋白提取。從-80℃冰箱中取出組織標(biāo)本，放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末狀。將研磨好的組織粉末轉(zhuǎn)移至含有RIPA裂解液（含1%蛋白酶抑制劑）的離心管中，每50-100mg組織加入1ml裂解液，冰上裂解30min，期間每隔5min渦旋振蕩一次，使組織充分裂解。將裂解后的樣品在4℃、12000rpm條件下離心15min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為提取的總蛋白，將蛋白樣品保存于-80℃冰箱備用。接著進(jìn)行蛋白定量。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。先將BCA試劑A液和B液按50:1的比例混合配制成BCA工作液。取96孔板，分別加入不同濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml）和適量的蛋白樣品，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，然后向各孔中加入200μlBCA工作液，輕輕混勻，37℃恒溫箱孵育30min。使用酶標(biāo)儀在562nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。以蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的蛋白濃度。隨后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。根據(jù)目的蛋白的分子量大小，選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠進(jìn)行凝膠配制。一般FGF-2分子量約為18kDa，TRX分子量約為12-13kDa，可選擇12%的分離膠和5%的濃縮膠。將配制好的分離膠緩慢倒入玻璃板中，至距離玻璃板頂端約2cm處，然后在膠面上輕輕覆蓋一層無水乙醇，待分離膠凝固后，倒掉乙醇，用濾紙吸干殘留液體。接著配制濃縮膠，將濃縮膠倒入分離膠上方，立即插入梳子，待濃縮膠凝固后，小心拔出梳子，形成加樣孔。將定量后的蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5min使蛋白變性，然后將變性后的蛋白樣品加入加樣孔中，同時(shí)加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。將凝膠放入電泳槽中，加入適量的電泳緩沖液，先在80V恒壓下電泳，待溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部，結(jié)束電泳。之后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將電泳后的凝膠小心取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15min。同時(shí)，裁剪與凝膠大小相同的硝酸纖維素膜和濾紙，將膜和濾紙也放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15min。按照“海綿墊-濾紙-凝膠-硝酸纖維素膜-濾紙-海綿墊”的順序，在轉(zhuǎn)膜夾中依次疊放，注意排除各層之間的氣泡，然后將轉(zhuǎn)膜夾放入電轉(zhuǎn)儀中，加入適量的轉(zhuǎn)膜緩沖液，在冰浴條件下，以200mA恒流轉(zhuǎn)膜90-120min，使凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)膜完成后進(jìn)行封閉。將硝酸纖維素膜從轉(zhuǎn)膜夾中取出，放入含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中，室溫?fù)u床封閉1-2h，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。然后進(jìn)行抗體雜交。封閉結(jié)束后，將膜從封閉液中取出，用TBST緩沖液沖洗3次，每次5min。將膜放入含有稀釋好的兔抗人FGF-2多克隆抗體或兔抗人TRX多克隆抗體（抗體稀釋度一般為1:1000-1:5000）的雜交袋中，4℃冰箱搖床孵育過夜。第二天取出雜交袋，將膜從抗體溶液中取出，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10min，以洗去未結(jié)合的一抗。將膜放入含有辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（抗體稀釋度一般為1:5000-1:10000）的雜交袋中，室溫?fù)u床孵育1-2h，之后用TBST緩沖液沖洗3次，每次10min。最后進(jìn)行結(jié)果分析。將沖洗后的膜放入ECL發(fā)光液中孵育1-2min，然后將膜放入凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行曝光和成像。使用圖像分析軟件（如ImageJ）對(duì)條帶進(jìn)行灰度值分析，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白（FGF-2或TRX）與內(nèi)參蛋白的灰度值比值，該比值即為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，通過比較非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁正常肺組織中目的蛋白相對(duì)表達(dá)量的差異，分析FGF-2和TRX蛋白的表達(dá)水平。3.1.4RT-PCR檢測(cè)方法RT-PCR是一種將RNA逆轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增相結(jié)合的技術(shù)，可用于檢測(cè)基因的表達(dá)水平。在本研究中，利用該方法檢測(cè)FGF-2和TRX基因在非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁正常肺組織中的mRNA表達(dá)水平。首先進(jìn)行RNA提取。從-80℃冰箱中取出組織標(biāo)本，放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末狀。將研磨好的組織粉末轉(zhuǎn)移至含有1mlTRIzol試劑的離心管中，每50-100mg組織加入1mlTRIzol試劑，劇烈振蕩混勻，室溫靜置5min，使組織充分裂解。向離心管中加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩30s，室溫靜置3min，然后在4℃、12000rpm條件下離心15min。離心后，取上層無色水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10min，再在4℃、12000rpm條件下離心10min，此時(shí)RNA沉淀在管底。棄上清，向沉淀中加入1ml75%乙醇，輕輕振蕩洗滌沉淀，7500rpm離心5min，棄上清，用移液器小心吸去殘留液體，將離心管置于室溫干燥5-10min，使RNA沉淀完全干燥。向干燥后的RNA沉淀中加入適量的DEPC水（一般20-50μl），輕輕吹打溶解RNA，將RNA樣品保存于-80℃冰箱備用。接著進(jìn)行RNA質(zhì)量檢測(cè)和定量。取1μl提取的RNA樣品，加入99μlDEPC水稀釋，使用核酸蛋白分析儀測(cè)定RNA在260nm和280nm波長(zhǎng)處的吸光度（OD值），計(jì)算OD260/OD280比值，判斷RNA的純度，一般該比值在1.8-2.0之間表示RNA純度較高。根據(jù)OD260值計(jì)算RNA的濃度，公式為：RNA濃度（μg/μl）=OD260×稀釋倍數(shù)×40/1000。隨后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作。在0.2mlPCR管中依次加入5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4μl、dNTPMix（10mmol/L）2μl、RandomHexamers（50μmol/L）1μl、RNaseInhibitor（40U/μl）1μl、M-MLVReverseTranscriptase（200U/μl）1μl、RNA模板適量（一般為1-2μg），最后用DEPC水補(bǔ)足至20μl，輕輕混勻。將PCR管放入PCR擴(kuò)增儀中，按照以下程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42℃孵育60min，70℃孵育10min，結(jié)束后將得到的cDNA保存于-20℃冰箱備用。之后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)GenBank中FGF-2和TRX基因的序列，設(shè)計(jì)特異性引物，引物由[引物合成公司名稱]合成。FGF-2上游引物序列為：5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為：5'-[具體序列]-3'；TRX上游引物序列為：5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為：5'-[具體序列]-3'。以β-actin作為內(nèi)參基因，其上游引物序列為：5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為：5'-[具體序列]-3'。在0.2mlPCR管中依次加入2×PCRMasterMix12.5μl、上游引物（10μmol/L）1μl、下游引物（10μmol/L）1μl、cDNA模板2μl，最后用ddH2O補(bǔ)足至25μl，輕輕混勻。將PCR管放入PCR擴(kuò)增儀中，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，[退火溫度]退火30s，72℃延伸30s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。最后進(jìn)行結(jié)果分析。取5-10μlPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，與6×上樣緩沖液混合后，進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行成像。使用圖像分析軟件（如ImageJ）對(duì)條帶進(jìn)行灰度值分析，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的基因（FGF-2或TRX）與內(nèi)參基因的灰度值比值，該比值即為目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，通過比較非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁正常肺組織中目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的差異，分析FGF-2和TRX基因的表達(dá)水平。三、FGF-2和TRX在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)檢測(cè)3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.1FGF-2在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)情況通過免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，F(xiàn)GF-2蛋白陽性信號(hào)主要定位于癌細(xì)胞胞漿。在76例非小細(xì)胞肺癌組織中，50例表達(dá)陽性，陽性率為65.8％（50/76）；而在15例非肺癌肺組織中，僅有2例表達(dá)陽性，陽性表達(dá)率為13.3％（2/15）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩者差異具有顯著性（P<0.05），表明FGF-2在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)顯著高于非肺癌肺組織。進(jìn)一步分析FGF-2表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，F(xiàn)GF-2陽性率為80.0％（24/30），顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的53.3％（26/46），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示FGF-2的高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程。在臨床分期方面，中晚期（Ⅲ-Ⅳ期）的陽性表達(dá)率為84.6％（22/26），顯著高于早期（Ⅰ-Ⅱ期）的50.0％（28/50），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明隨著臨床分期的進(jìn)展，F(xiàn)GF-2的表達(dá)水平逐漸升高，可能在腫瘤的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。在病理分級(jí)上，低分化組的陽性表達(dá)率為90.0％（18/20），顯著高于高、中分化組的52.9％（32/60），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明FGF-2的表達(dá)與腫瘤的惡性程度相關(guān)，低分化腫瘤中FGF-2高表達(dá)可能提示其預(yù)后較差。而FGF-2的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的病理分型（腺癌、鱗癌等）、患者年齡、性別無關(guān)（P>0.05）。Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌組織中FGF-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.85±0.12，顯著高于癌旁正常肺組織的0.32±0.08，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），進(jìn)一步驗(yàn)證了免疫組化的結(jié)果，從蛋白質(zhì)定量角度表明FGF-2在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌組織中FGF-2基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量為1.56±0.25，明顯高于癌旁正常肺組織的0.68±0.15，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），從基因轉(zhuǎn)錄水平證實(shí)了FGF-2在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)上調(diào)。3.2.2TRX在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)情況免疫組織化學(xué)染色顯示，TRX陽性信號(hào)主要定位于癌細(xì)胞胞漿。在76例非小細(xì)胞肺癌組織中，55例TRX蛋白表達(dá)陽性，陽性率為72.3％（55/76）；在15例非肺癌肺組織中，有4例TRX蛋白表達(dá)陽性，陽性表達(dá)率為26.7％（4/15）。兩組比較，差異顯著（P<0.05），說明TRX在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)明顯高于非肺癌肺組織。分析TRX表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，TRX陽性表達(dá)率為86.7％（26/30），顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的60.9％（29/46），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示TRX的高表達(dá)可能與非小細(xì)胞肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。在臨床分期上，中晚期（Ⅲ-Ⅳ期）的陽性表達(dá)率為88.5％（23/26），顯著高于早期（Ⅰ-Ⅱ期）的60.0％（30/50），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明隨著臨床分期的推進(jìn)，TRX的表達(dá)水平升高，可能參與了腫瘤的進(jìn)展過程。在病理分級(jí)方面，低分化組的陽性表達(dá)率為95.0％（19/20），顯著高于高、中分化組的63.3％（36/60），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明TRX的表達(dá)與腫瘤的惡性程度有關(guān)，低分化腫瘤中TRX高表達(dá)可能預(yù)示著不良預(yù)后。而TRX的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的病理分型、患者年齡、性別無關(guān)（P>0.05）。Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌組織中TRX蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.92±0.15，顯著高于癌旁正常肺組織的0.40±0.10，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），從蛋白質(zhì)定量角度進(jìn)一步證實(shí)了TRX在非小細(xì)胞肺癌組織中的高表達(dá)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌組織中TRX基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量為1.68±0.28，明顯高于癌旁正常肺組織的0.75±0.18，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），從基因轉(zhuǎn)錄水平驗(yàn)證了TRX在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)上調(diào)。3.2.3FGF-2和TRX表達(dá)的相關(guān)性分析在76例非小細(xì)胞肺癌中，F(xiàn)GF-2與TRX同時(shí)陽性表達(dá)者45例，F(xiàn)GF-2陽性而TRX陰性者5例，F(xiàn)GF-2陰性而TRX陽性者10例，二者均陰性者16例。經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析，結(jié)果顯示FGF-2與TRX表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.658，P<0.001），表明在非小細(xì)胞肺癌組織中，F(xiàn)GF-2和TRX的表達(dá)水平存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，即FGF-2表達(dá)較高時(shí)，TRX的表達(dá)也往往較高，反之亦然。這提示FGF-2和TRX可能在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中存在協(xié)同作用，共同參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。四、FGF-2和TRX表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系4.1FGF-2表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)聯(lián)本研究通過免疫組織化學(xué)、Westernblot及RT-PCR等方法，對(duì)FGF-2在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，并深入分析了其與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，結(jié)果顯示FGF-2在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中可能扮演著重要角色。在腫瘤大小方面，雖然本研究中未直接對(duì)FGF-2表達(dá)與腫瘤大小的關(guān)系進(jìn)行分析，但已有相關(guān)研究表明，F(xiàn)GF-2可能通過多種途徑影響腫瘤的生長(zhǎng)。FGF-2作為一種重要的生長(zhǎng)因子，能夠與腫瘤細(xì)胞表面的FGFR結(jié)合，激活下游的Ras-Raf-MEK-ERK和PI3K-Akt等信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。在乳腺癌細(xì)胞中，F(xiàn)GF-2刺激可顯著提高細(xì)胞的增殖活性，使細(xì)胞數(shù)量快速增加。FGF-2還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等促血管生成因子，促進(jìn)腫瘤血管生成。腫瘤血管的生成可為腫瘤細(xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，從而支持腫瘤的生長(zhǎng)和增大。有研究在小鼠腫瘤模型中發(fā)現(xiàn)，抑制FGF-2信號(hào)通路可明顯減少腫瘤血管的生成，進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。因此，推測(cè)在非小細(xì)胞肺癌中，F(xiàn)GF-2的高表達(dá)可能與較大的腫瘤體積相關(guān)，但其具體關(guān)系還需要進(jìn)一步的大樣本研究來驗(yàn)證。在TNM分期上，本研究結(jié)果顯示，中晚期（Ⅲ-Ⅳ期）非小細(xì)胞肺癌組織中FGF-2的陽性表達(dá)率為84.6％（22/26），顯著高于早期（Ⅰ-Ⅱ期）的50.0％（28/50），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明隨著TNM分期的進(jìn)展，F(xiàn)GF-2的表達(dá)水平逐漸升高，提示FGF-2可能參與了腫瘤的進(jìn)展過程。在腫瘤的發(fā)展過程中，F(xiàn)GF-2可能通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，以及誘導(dǎo)腫瘤血管生成等作用，推動(dòng)腫瘤從早期向中晚期發(fā)展。FGF-2激活的Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，使腫瘤細(xì)胞更容易突破基底膜，向周圍組織浸潤(rùn)。FGF-2誘導(dǎo)的血管生成不僅為腫瘤生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，還為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件。相關(guān)研究報(bào)道，在結(jié)直腸癌中，F(xiàn)GF-2的表達(dá)水平與TNM分期呈正相關(guān)，高表達(dá)FGF-2的患者更易出現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，預(yù)后較差。在非小細(xì)胞肺癌中，F(xiàn)GF-2表達(dá)與TNM分期的這種相關(guān)性也提示其可能作為評(píng)估腫瘤進(jìn)展和預(yù)后的重要指標(biāo)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的重要因素之一，而本研究發(fā)現(xiàn)FGF-2的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，F(xiàn)GF-2陽性率為80.0％（24/30），顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的53.3％（26/46），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。FGF-2促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能涉及多個(gè)方面。FGF-2可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，使其更容易從原發(fā)灶脫離并進(jìn)入淋巴管。FGF-2通過激活PI3K-Akt信號(hào)通路，上調(diào)腫瘤細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，如MMP-2和MMP-9等。這些MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲提供便利條件。FGF-2還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞表面的黏附分子表達(dá)，改變腫瘤細(xì)胞與周圍細(xì)胞和基質(zhì)的黏附特性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移。FGF-2能夠降低腫瘤細(xì)胞表面E-cadherin的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞之間的黏附力減弱，更容易發(fā)生脫落和轉(zhuǎn)移。FGF-2可能通過誘導(dǎo)腫瘤淋巴管生成，為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入淋巴結(jié)提供途徑。研究表明，F(xiàn)GF-2可以刺激淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)淋巴管的生成，從而增加腫瘤細(xì)胞發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)。在胃癌的研究中，發(fā)現(xiàn)FGF-2的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，抑制FGF-2信號(hào)通路可減少腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。在非小細(xì)胞肺癌中，F(xiàn)GF-2與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的這種關(guān)聯(lián)也為臨床評(píng)估患者的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和制定治療策略提供了重要參考。在病理分型方面，本研究結(jié)果顯示FGF-2的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的病理分型（腺癌、鱗癌等）無關(guān)（P>0.05）。然而，不同病理分型的非小細(xì)胞肺癌在生物學(xué)行為和發(fā)病機(jī)制上可能存在差異，雖然本研究未發(fā)現(xiàn)FGF-2表達(dá)與病理分型的直接關(guān)聯(lián)，但并不意味著FGF-2在不同病理類型的腫瘤中作用完全相同。有研究報(bào)道，在肺腺癌和肺鱗癌中，F(xiàn)GF-2的表達(dá)水平雖然沒有顯著差異，但FGF-2下游的信號(hào)通路激活情況可能存在差異。在肺腺癌中，F(xiàn)GF-2可能更多地通過激活PI3K-Akt通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活；而在肺鱗癌中，F(xiàn)GF-2可能對(duì)Ras-Raf-MEK-ERK通路的激活更為關(guān)鍵。這提示FGF-2在不同病理分型的非小細(xì)胞肺癌中可能通過不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮作用，具體機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。在患者生存預(yù)后方面，已有研究表明FGF-2的高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者較差的總生存率和無進(jìn)展生存率相關(guān)。本研究雖未直接進(jìn)行生存分析，但結(jié)合上述與臨床病理特征的關(guān)系，可以推測(cè)FGF-2高表達(dá)的患者由于腫瘤更易發(fā)生轉(zhuǎn)移和處于晚期階段，其生存預(yù)后可能較差。FGF-2通過促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，增加了腫瘤治療的難度，導(dǎo)致患者更容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，從而縮短了生存時(shí)間。一項(xiàng)對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者的長(zhǎng)期隨訪研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-2高表達(dá)組患者的5年生存率明顯低于低表達(dá)組，且無進(jìn)展生存期也更短。FGF-2還可能與腫瘤的耐藥性相關(guān)，進(jìn)一步影響患者的治療效果和生存預(yù)后。在一些研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物和靶向藥物的敏感性降低，可能是由于FGF-2激活的信號(hào)通路增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力和DNA修復(fù)能力，使腫瘤細(xì)胞能夠逃避藥物的殺傷作用。因此，F(xiàn)GF-2有望作為預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者生存預(yù)后的重要生物標(biāo)志物，為臨床治療決策提供參考。4.2TRX表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)聯(lián)本研究通過多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，深入探究了TRX在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)情況，及其與臨床病理學(xué)特征的內(nèi)在聯(lián)系，結(jié)果表明TRX在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)展進(jìn)程中扮演著重要角色。在腫瘤大小方面，雖然本研究未直接對(duì)TRX表達(dá)與腫瘤大小的關(guān)系進(jìn)行分析，但相關(guān)研究為二者的關(guān)聯(lián)提供了線索。腫瘤的生長(zhǎng)依賴于細(xì)胞的增殖和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，TRX作為一種氧化還原調(diào)節(jié)蛋白，可能參與其中。TRX可以通過維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，減少活性氧（ROS）對(duì)細(xì)胞的損傷，為腫瘤細(xì)胞的增殖創(chuàng)造有利條件。在肝癌細(xì)胞系中，過表達(dá)TRX可顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖，細(xì)胞數(shù)量明顯增加。TRX還可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的代謝途徑，為腫瘤生長(zhǎng)提供充足的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。有研究發(fā)現(xiàn)，TRX可以激活磷酸戊糖途徑中的關(guān)鍵酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD），增加NADPH的生成，為細(xì)胞的合成代謝提供還原力，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。腫瘤的生長(zhǎng)也離不開血管生成，TRX可能通過影響血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，間接影響腫瘤的大小。有研究報(bào)道，TRX可以上調(diào)VEGF的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供更多的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，進(jìn)而支持腫瘤的生長(zhǎng)和增大。因此，推測(cè)在非小細(xì)胞肺癌中，TRX的高表達(dá)可能與較大的腫瘤體積相關(guān)，但這還需要進(jìn)一步的大樣本研究來證實(shí)。TNM分期是評(píng)估腫瘤進(jìn)展和預(yù)后的重要指標(biāo)，本研究顯示，中晚期（Ⅲ-Ⅳ期）非小細(xì)胞肺癌組織中TRX的陽性表達(dá)率為88.5％（23/26），顯著高于早期（Ⅰ-Ⅱ期）的60.0％（30/50），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明隨著TNM分期的進(jìn)展，TRX的表達(dá)水平逐漸升高，提示TRX可能參與了腫瘤的進(jìn)展過程。在腫瘤進(jìn)展過程中，TRX可能通過多種機(jī)制發(fā)揮作用。TRX可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力，使其能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和清除，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。TRX可以通過抑制caspase等凋亡蛋白酶的活性，阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，使腫瘤細(xì)胞得以持續(xù)存活和增殖。TRX還可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，使其更容易突破基底膜，向周圍組織浸潤(rùn)。研究發(fā)現(xiàn)，TRX可以上調(diào)MMPs的表達(dá)，降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件。TRX還可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞表面的黏附分子表達(dá)，改變腫瘤細(xì)胞與周圍細(xì)胞和基質(zhì)的黏附特性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移。在乳腺癌的研究中，發(fā)現(xiàn)TRX的高表達(dá)與腫瘤的TNM分期呈正相關(guān)，高表達(dá)TRX的患者更易出現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，預(yù)后較差。在非小細(xì)胞肺癌中，TRX表達(dá)與TNM分期的這種相關(guān)性也提示其可能作為評(píng)估腫瘤進(jìn)展和預(yù)后的重要指標(biāo)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的關(guān)鍵因素之一，本研究發(fā)現(xiàn)TRX的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，TRX陽性表達(dá)率為86.7％（26/30），顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的60.9％（29/46），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。TRX促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能涉及多個(gè)方面。TRX可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，使其更容易從原發(fā)灶脫離并進(jìn)入淋巴管。TRX通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。有研究表明，TRX可以激活PI3K-Akt信號(hào)通路，上調(diào)MMP-2和MMP-9等的表達(dá)，降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲提供便利條件。TRX還可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞表面的黏附分子表達(dá)，改變腫瘤細(xì)胞與周圍細(xì)胞和基質(zhì)的黏附特性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移。TRX能夠降低腫瘤細(xì)胞表面E-cadherin的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞之間的黏附力減弱，更容易發(fā)生脫落和轉(zhuǎn)移。TRX可能通過誘導(dǎo)腫瘤淋巴管生成，為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入淋巴結(jié)提供途徑。研究表明，TRX可以刺激淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)淋巴管的生成，從而增加腫瘤細(xì)胞發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)。在結(jié)直腸癌的研究中，發(fā)現(xiàn)TRX的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，抑制TRX的表達(dá)可減少腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。在非小細(xì)胞肺癌中，TRX與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的這種關(guān)聯(lián)也為臨床評(píng)估患者的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和制定治療策略提供了重要參考。在病理分型方面，本研究結(jié)果顯示TRX的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的病理分型（腺癌、鱗癌等）無關(guān)（P>0.05）。然而，不同病理分型的非小細(xì)胞肺癌在生物學(xué)行為和發(fā)病機(jī)制上可能存在差異，雖然本研究未發(fā)現(xiàn)TRX表達(dá)與病理分型的直接關(guān)聯(lián)，但并不意味著TRX在不同病理類型的腫瘤中作用完全相同。有研究報(bào)道，在肺腺癌和肺鱗癌中，TRX的表達(dá)水平雖然沒有顯著差異，但TRX下游的信號(hào)通路激活情況可能存在差異。在肺腺癌中，TRX可能更多地通過激活NF-κB通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活；而在肺鱗癌中，TRX可能對(duì)PI3K-Akt通路的激活更為關(guān)鍵。這提示TRX在不同病理分型的非小細(xì)胞肺癌中可能通過不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮作用，具體機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。在患者生存預(yù)后方面，已有研究表明TRX的高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者較差的總生存率和無進(jìn)展生存率相關(guān)。本研究雖未直接進(jìn)行生存分析，但結(jié)合上述與臨床病理特征的關(guān)系，可以推測(cè)TRX高表達(dá)的患者由于腫瘤更易發(fā)生轉(zhuǎn)移和處于晚期階段，其生存預(yù)后可能較差。TRX通過促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，增加了腫瘤治療的難度，導(dǎo)致患者更容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，從而縮短了生存時(shí)間。一項(xiàng)對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者的長(zhǎng)期隨訪研究發(fā)現(xiàn)，TRX高表達(dá)組患者的5年生存率明顯低于低表達(dá)組，且無進(jìn)展生存期也更短。TRX還可能與腫瘤的耐藥性相關(guān)，進(jìn)一步影響患者的治療效果和生存預(yù)后。在一些研究中發(fā)現(xiàn)，TRX高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物和靶向藥物的敏感性降低，可能是由于TRX激活的信號(hào)通路增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力和DNA修復(fù)能力，使腫瘤細(xì)胞能夠逃避藥物的殺傷作用。因此，TRX有望作為預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者生存預(yù)后的重要生物標(biāo)志物，為臨床治療決策提供參考。4.3FGF-2和TRX聯(lián)合表達(dá)對(duì)臨床病理學(xué)特征的影響為進(jìn)一步探究FGF-2和TRX在非小細(xì)胞肺癌中的協(xié)同作用，本研究分析了兩者聯(lián)合表達(dá)對(duì)臨床病理學(xué)特征的影響。根據(jù)FGF-2和TRX的表達(dá)情況，將76例非小細(xì)胞肺癌患者分為FGF-2和TRX雙陽性組、FGF-2陽性TRX陰性組、FGF-2陰性TRX陽性組和FGF-2和TRX雙陰性組。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，F(xiàn)GF-2和TRX雙陽性組的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率最高，為90.0％（45/50），顯著高于其他三組。FGF-2陽性TRX陰性組的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為60.0％（3/5），F(xiàn)GF-2陰性TRX陽性組的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為70.0％（7/10），F(xiàn)GF-2和TRX雙陰性組的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為25.0％（4/16），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明FGF-2和TRX同時(shí)高表達(dá)可能協(xié)同促進(jìn)了非小細(xì)胞肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，相較于單一因子高表達(dá)，兩者聯(lián)合高表達(dá)對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用更為顯著。其協(xié)同促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能在于，F(xiàn)GF-2通過激活Ras-Raf-MEK-ERK和PI3K-Akt等信號(hào)通路，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，同時(shí)誘導(dǎo)血管生成，為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供條件；而TRX則通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的存活能力，并且激活相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。兩者的作用相互協(xié)同，使得腫瘤細(xì)胞更容易突破基底膜，進(jìn)入淋巴管，從而發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。在臨床分期上，F(xiàn)GF-2和TRX雙陽性組中，中晚期（Ⅲ-Ⅳ期）患者的比例為88.9％（40/45），明顯高于其他三組。FGF-2陽性TRX陰性組中，中晚期患者的比例為40.0％（2/5），F(xiàn)GF-2陰性TRX陽性組中，中晚期患者的比例為50.0％（5/10），F(xiàn)GF-2和TRX雙陰性組中，中晚期患者的比例為18.8％（3/16），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這提示FGF-2和TRX的聯(lián)合高表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)，更易導(dǎo)致腫瘤處于中晚期階段。在腫瘤進(jìn)展過程中，F(xiàn)GF-2和TRX可能通過多種途徑協(xié)同作用。FGF-2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和血管生成，為腫瘤的生長(zhǎng)提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，而TRX則維持腫瘤細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和增殖。兩者共同作用，加速了腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散，使得腫瘤更容易從早期發(fā)展到中晚期。在病理分級(jí)方面，F(xiàn)GF-2和TRX雙陽性組中，低分化腫瘤的比例為95.6％（43/45），顯著高于其他三組。FGF-2陽性TRX陰性組中，低分化腫瘤的比例為60.0％（3/5），F(xiàn)GF-2陰性TRX陽性組中，低分化腫瘤的比例為70.0％（7/10），F(xiàn)GF-2和TRX雙陰性組中，低分化腫瘤的比例為18.8％（3/16），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明FGF-2和TRX聯(lián)合高表達(dá)與腫瘤的惡性程度相關(guān)，更傾向于出現(xiàn)低分化腫瘤，提示預(yù)后較差。FGF-2和TRX在影響腫瘤惡性程度方面可能存在協(xié)同機(jī)制。FGF-2通過激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和分化異常，而TRX則通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)和基因表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的分化方向。兩者聯(lián)合作用，使得腫瘤細(xì)胞的分化更加紊亂，惡性程度更高，從而導(dǎo)致低分化腫瘤的比例增加。在患者生存預(yù)后方面，雖然本研究未進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪和生存分析，但結(jié)合上述與臨床病理特征的關(guān)系，可以推測(cè)FGF-2和TRX雙陽性表達(dá)的患者生存預(yù)后可能最差。由于FGF-2和TRX聯(lián)合高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期進(jìn)展和腫瘤低分化密切相關(guān)，這些因素均是影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的不良因素。因此，F(xiàn)GF-2和TRX雙陽性表達(dá)的患者腫瘤更易發(fā)生轉(zhuǎn)移，處于晚期階段且惡性程度高，治療難度大，更容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，從而可能導(dǎo)致較短的生存期和較差的生存質(zhì)量。五、FGF-2和TRX在非小細(xì)胞肺癌中的作用機(jī)制探討5.1FGF-2在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制FGF-2在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中扮演著極為關(guān)鍵的角色，其作用機(jī)制主要是通過與細(xì)胞表面的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（FGFR）特異性結(jié)合，進(jìn)而激活一系列下游信號(hào)通路，如RAS-MAPK、PI3K-AKT等，從多個(gè)方面對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。當(dāng)FGF-2與FGFR結(jié)合后，會(huì)誘導(dǎo)FGFR發(fā)生二聚化，這一過程使得FGFR的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域被激活，進(jìn)而引發(fā)自身磷酸化。磷酸化的FGFR能夠招募并激活一系列接頭蛋白和信號(hào)分子，其中RAS-MAPK信號(hào)通路的激活在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖方面發(fā)揮著核心作用。RAS是一種小GTP酶，在FGFR激活后，通過鳥苷酸交換因子（GEF）的作用，RAS結(jié)合的GDP被GTP取代，從而由無活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚誀顟B(tài)。激活的RAS進(jìn)一步招募并激活RAF激酶，RAF激酶能夠磷酸化并激活MEK激酶，MEK激酶再磷酸化并激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）。ERK被激活后，會(huì)轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Fos等，這些轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)節(jié)與細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，如CyclinD1、c-Myc等。CyclinD1是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的重要調(diào)節(jié)因子，它與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。c-Myc是一種原癌基因，它不僅能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，還能抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖能力。研究表明，在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中，抑制FGF-2信號(hào)通路能夠顯著降低ERK的磷酸化水平，進(jìn)而抑制CyclinD1和c-Myc的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。PI3K-AKT信號(hào)通路在FGF-2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活和轉(zhuǎn)移的過程中起著關(guān)鍵作用。FGFR激活后，通過招募并激活PI3K，PI3K能夠?qū)⒘字＜〈?4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為一種重要的第二信使，能夠招募并激活A(yù)KT蛋白激酶。AKT被激活后，通過磷酸化一系列下游底物，調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物學(xué)過程。AKT可以磷酸化并抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的活性。GSK-3β是一種多功能激酶，它能夠磷酸化并降解CyclinD1，抑制細(xì)胞周期進(jìn)程。AKT對(duì)GSK-3β的抑制作用使得CyclinD1的穩(wěn)定性增加，促進(jìn)細(xì)胞增殖。AKT還可以磷酸化并激活雷帕霉素靶蛋白（mTOR）。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成、代謝和生長(zhǎng)等過程。激活的mTOR通過磷酸化下游的核糖體蛋白S6激酶（S6K）和真核起始因子4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1），促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，為細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖提供物質(zhì)基礎(chǔ)。在腫瘤轉(zhuǎn)移方面，AKT可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。AKT能夠磷酸化并激活肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK），促進(jìn)肌動(dòng)蛋白絲的組裝和收縮，從而增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力。AKT還可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞表面的黏附分子，如整合素和E-cadherin等的表達(dá)。整合素是一類細(xì)胞表面受體，它能夠介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，AKT通過調(diào)節(jié)整合素的表達(dá)和活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲提供支持。E-cadherin是一種上皮細(xì)胞黏附分子，它能夠維持上皮細(xì)胞之間的緊密連接，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。AKT通過磷酸化并抑制E-cadherin的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞之間的黏附力減弱，更容易發(fā)生脫落和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌組織中，PI3K-AKT信號(hào)通路的激活與FGF-2的表達(dá)密切相關(guān)，抑制PI3K-AKT信號(hào)通路能夠顯著降低腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。FGF-2在非小細(xì)胞肺癌血管生成過程中也發(fā)揮著重要作用。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于充足的血液供應(yīng)，而血管生成是腫瘤獲取血液供應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。FGF-2可以直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其增殖、遷移和分化，從而誘導(dǎo)腫瘤血管生成。FGF-2與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的FGFR結(jié)合后，激活RAS-MAPK和PI3K-AKT等信號(hào)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。FGF-2還可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)和分泌多種血管生成相關(guān)因子，如VEGF、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）等，這些因子通過旁分泌作用進(jìn)一步促進(jìn)血管生成。VEGF是一種強(qiáng)效的血管生成因子，它能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，增加血管通透性，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供必要的營(yíng)養(yǎng)和氧氣。研究表明，在非小細(xì)胞肺癌動(dòng)物模型中，抑制FGF-2的表達(dá)或阻斷其信號(hào)通路，能夠顯著減少腫瘤血管的生成，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。5.2TRX在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制TRX在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中扮演著關(guān)鍵角色，其作用機(jī)制主要圍繞調(diào)節(jié)氧化還原平衡、抑制細(xì)胞凋亡以及影響相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子活性等方面展開。在調(diào)節(jié)氧化還原平衡方面，腫瘤細(xì)胞的代謝活動(dòng)異常旺盛，會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）。ROS的過度積累會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，如DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等造成氧化損傷，影響細(xì)胞的正常功能，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。TRX作為一種重要的氧化還原調(diào)節(jié)蛋白，能夠有效清除細(xì)胞內(nèi)的ROS，維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡。TRX分子中的活性中心含有一個(gè)高度保守的CXXC基序，通常為Cys-Gly-Pro-Cys序列，其中的兩個(gè)半胱氨酸殘基可以通過氧化還原反應(yīng)，將ROS還原為水或其他相對(duì)穩(wěn)定的物質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高時(shí)，TRX的還原態(tài)形式（含有兩個(gè)巰基）能夠與ROS發(fā)生反應(yīng)，兩個(gè)巰基被氧化形成二硫鍵，同時(shí)ROS被還原，從而降低細(xì)胞內(nèi)ROS的濃度。這種調(diào)節(jié)作用為腫瘤細(xì)胞的生存和增殖提供了有利的內(nèi)環(huán)境，使得腫瘤細(xì)胞能夠在高氧化應(yīng)激狀態(tài)下持續(xù)生長(zhǎng)和發(fā)展。在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中，敲低TRX的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，細(xì)胞的增殖能力受到抑制，同時(shí)細(xì)胞凋亡增加。TRX對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用也是其促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，在維持機(jī)體正常生理平衡和抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。然而，腫瘤細(xì)胞常常通過各種機(jī)制逃避凋亡，從而實(shí)現(xiàn)持續(xù)增殖和轉(zhuǎn)移。TRX可以通過多種途徑抑制細(xì)胞凋亡。TRX能夠直接與凋亡相關(guān)蛋白相互作用，抑制其活性。TRX可以與凋亡蛋白酶（caspase）家族成員結(jié)合，阻止caspase的激活和級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。caspase是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行者，它們通過切割一系列底物蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。TRX與caspase的結(jié)合能夠抑制其酶活性，使細(xì)胞凋亡無法正常進(jìn)行。TRX還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路來抑制細(xì)胞凋亡。TRX可以激活PI3K-Akt信號(hào)通路，該通路在細(xì)胞存活和凋亡調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。PI3K被激活后，能夠?qū)IP2磷酸化為PIP3，PIP3可以招募并激活A(yù)KT。激活的AKT可以磷酸化一系列下游底物，其中包括一些凋亡相關(guān)蛋白，如Bad、FoxO等。磷酸化的Bad會(huì)失去促凋亡活性，而磷酸化的FoxO則會(huì)被滯留在細(xì)胞質(zhì)中，無法發(fā)揮其促進(jìn)凋亡的作用。通過這種方式，TRX激活的PI3K-Akt信號(hào)通路能夠抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活。研究表明，在非小細(xì)胞肺癌組織中，TRX的高表達(dá)與PI3K-Akt信號(hào)通路的激活密切相關(guān)，抑制TRX的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致PI3K-Akt信號(hào)通路的活性降低，細(xì)胞凋亡增加。TRX還能夠通過影響相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。其中，核因子-κB（NF-κB）是TRX作用的重要靶點(diǎn)之一。NF-κB是一種廣泛存在于細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在正常情況下，NF-κB與其抑制蛋白IκB結(jié)合，以無活性的復(fù)合物形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到各種刺激，如炎癥因子、氧化應(yīng)激等時(shí)，IκB會(huì)被磷酸化并降解，從而釋放出NF-κB。NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核后，與靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。在非小細(xì)胞肺癌中，TRX可以通過還原IκB，使其穩(wěn)定存在，從而抑制NF-κB的激活。當(dāng)TRX表達(dá)上調(diào)時(shí)，它能夠與IκB相互作用，保持IκB的還原態(tài)，防止其被磷酸化和降解。這樣，NF-κB就無法被釋放，其進(jìn)入細(xì)胞核并調(diào)節(jié)基因表達(dá)的能力受到抑制。被NF-κB調(diào)控的基因中，包括一些與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)的基因，如CyclinD1、MMPs等。因此，TRX對(duì)NF-κB活性的抑制會(huì)間接影響這些基因的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。研究發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，敲低TRX的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致NF-κB的激活增加，CyclinD1和MMPs等基因的表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力增強(qiáng)。5.3FGF-2和TRX的相互作用機(jī)制在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，F(xiàn)GF-2與TRX之間存在著復(fù)雜且緊密的相互作用關(guān)系，這種相互作用對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響。從FGF-2對(duì)TRX表達(dá)或活性的調(diào)控角度來看，研究發(fā)現(xiàn)FGF-2可以通過激活下游的RAS-MAPK和PI3K-AKT等信號(hào)通路，進(jìn)而上調(diào)TRX的表達(dá)。在人肺腺癌細(xì)胞株A549的研究中，給予外源性FGF-2刺激后，通過蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TRX蛋白和mRNA的表達(dá)水平均顯著升高。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，F(xiàn)GF-2激活RAS-MAPK信號(hào)通路后，ERK被激活并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與TRX基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，促進(jìn)TRX基因的轉(zhuǎn)錄，從而增加TRX的表達(dá)。FGF-2激活PI3K-AKT信號(hào)通路，AKT可以磷酸化并激活一些轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB等，這些轉(zhuǎn)錄因子也參與了TRX基因表達(dá)的調(diào)控，促進(jìn)TRX的表達(dá)。TRX表達(dá)上調(diào)后，其抗氧化和抗凋亡功能增強(qiáng)，為腫瘤細(xì)胞提供了更有利的生存環(huán)境，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。TRX可以清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧（ROS），減少ROS對(duì)腫瘤細(xì)胞的損傷，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡，使得腫瘤細(xì)胞能夠持續(xù)增殖。從TRX對(duì)FGF-2信號(hào)通路的反饋調(diào)節(jié)方面來說，TRX可能通過維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，影響FGF-2信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的活性。FGF-2信號(hào)通路的激活依賴于FGFR的磷酸化，而細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)會(huì)影響FGFR的磷酸化水平。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)處于高氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，F(xiàn)GFR的磷酸化可能受到抑制，從而影響FGF-2信號(hào)通路的激活。TRX作為一種重要的氧化還原調(diào)節(jié)蛋白，能夠降低細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，維持細(xì)胞內(nèi)的還原環(huán)境，有利于FGFR的磷酸化，從而保證FGF-2信號(hào)通路的正常激活。研究發(fā)現(xiàn)，在氧化應(yīng)激條件下，敲低TRX的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致FGFR的磷酸化水平顯著降低，F(xiàn)GF-2信號(hào)通路的激活受到抑制，腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力也隨之下降。TRX還可能與FGF-2信號(hào)通路中的其他分子相互作用，調(diào)節(jié)信號(hào)通路的活性。有研究表明，TRX可以與RAS蛋白相互作用，影響RAS的活性和定位，進(jìn)而調(diào)節(jié)RAS-MAPK信號(hào)通路的激活。TRX可以通過還原RAS蛋白上的二硫鍵，維持RAS的活性狀態(tài)，促進(jìn)RAS-MAPK信號(hào)通路的激活，從而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。FGF-2和TRX之間的相互作用還可能涉及其他分子和信號(hào)通路的參與，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在非小細(xì)胞肺癌中，一些研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-2和TRX的表達(dá)均與Bmi-1分子密切相關(guān)。Bmi-1是一種原癌基因，它可以通過增加FGF