DB42湖北省市場監(jiān)督管理局發(fā)布I 2 3 3 3 4 5 本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利本文件實施應(yīng)用中的疑問，可咨詢湖北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳，聯(lián)系電話郵箱郵箱：597871辣椒炭疽病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程NY/T2060.1辣椒抗病性鑒定技術(shù)規(guī)程第1部分：辣椒抗疫病鑒定技術(shù)規(guī)程4接種體制備上用紗布過濾馬鈴薯殘渣，收集濾液置于干凈鍋中，加入14.2接種體的分離4.3接種體的鑒定4,4接種體保存將鑒定的新鮮膠孢炭疽菌進行3次單孢分離純化后，轉(zhuǎn)接于含PDA斜面培養(yǎng)基的5cm試管中，28℃24,6接種孢子制備取辣椒青熟果（花后35d～40d）或紅熟果（花后45d～50d），每個鑒定品種或材料設(shè)3次重復(fù)，5.3對照材料致性。鑒定材料的育苗應(yīng)符合NY/T2060.175%的乙醇溶液中浸泡2min，用1%次氯酸鈉溶液浸泡2min，用無菌水洗凈，置于超凈工作臺晾干。5.5接種5.5.1接種體濃度接種分生孢子懸浮液1μL，濃度為1×105個/mL。接種無菌水1μ5.5.2接種方法5.5.3接種后的管理保鮮膜密閉。置于室內(nèi)28℃黑暗保濕（相對濕度100%）24h，培養(yǎng)條件控制為：溫度28℃,相對濕度80%～100%，每天光照和黑暗各12h。36.2調(diào)查方法6.3病情分級6.4病情記載依據(jù)鑒定材料3次重復(fù)的病情指數(shù)（DI）的平均值確定其抗病水平，劃分標準見附錄7.2鑒定結(jié)果的有效性判別4A.1辣椒炭疽病及其分類侵染辣椒青果和紅果的炭疽病菌以膠孢炭疽菌A.2辣椒炭疽病的癥狀病，病部呈現(xiàn)不規(guī)則或梭形病斑，縱裂凹陷，見圖A.1和圖51×TEBuffer（500mL）：1mol/LTris-HClBuffer，pH8.0，5mL；0.5mol/LEDTA，pH8.0，1mL；均勻混合定容到500mL，高溫高壓滅菌后，室溫保存。2%CTAB裂解液（1L）：NaCl82g，EDTA7.44g，Tris12.12g，CTAB20g，PVP2g，用ddH2O定容至1L，常溫保存，使用時可加入1%的β-巰基乙醇。50×Tris-乙酸（TAE）電泳緩沖液：242gTris；57.1mL冰乙酸；100mL0.5MEDTA（pH=8.0去離子水定容至1000ml，室溫保存。將保存的病原菌菌株在PDA培養(yǎng)基上、28℃暗培養(yǎng)7d～10d后，將培養(yǎng)基表面菌絲輕輕刮下，液氮45min～60min，并不時輕輕轉(zhuǎn)動離心管。加入等體積的氯仿：異戊醇，輕輕地顛倒混勻，室溫下10000r/min離心10min，轉(zhuǎn)移上清液至另一新離心管中。加入2倍體積的無水乙醇或0.7倍體積的異丙醇，出現(xiàn)絮狀沉淀后，-20℃放置30min，12000r/min離心10min～15min，回收DNA沉淀。用70%的乙醇清洗沉淀2次，吹干后溶于適量的滅菌水中。PCR反應(yīng)體系和PCR引物分別見表B.1和表B.6擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳后，BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)進行紫