一、項目目的意義（項目背景）、項目來源、工作概況

1、項目背景

廣西養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展十分迅速，擁有占全國第5位的牛存欄量，但在

牛傳染性鼻氣管炎（Infectiousbovinerhinotracheitisvirus，

IBRV）的防治方面十分薄弱。IBRV主要引起牛高熱、鼻炎、呼吸困

難和母畜流產(chǎn)等疾病，自2008年以來，廣西多個牛場相繼反復暴發(fā)

此病，無法根除，給廣西給養(yǎng)牛業(yè)帶來極大的危害。

目前國內(nèi)外均沒有關于IBRV巢式PCR診斷技術規(guī)范。巢式PCR

是一種新型的核酸檢測技術，其靈敏度又比普通PCR高100-10000倍，

且操作簡便，特異性強、成本低，已被廣泛應用于動物疫病的診斷中。

廣西獸醫(yī)研究所多年來研究牛傳染性鼻氣管炎病毒，并建立了巢

式PCR檢測方法，其特異性強、敏感性高。既可以對分離培養(yǎng)物的

IBRVDNA進行檢測,也可以對直接從臨床樣品中取樣抽提的IBRV

DNA進行檢測，而且整個操作過程不超過8小時。為了使這一先進的

病原檢測技術能更好地為生產(chǎn)服務，特制定本技術操作標準。內(nèi)容涵

蓋應用巢式PCR檢測IBRV的材料準備、操作方法及結果判定，建立

牛IBRV的快速、特異、靈敏的檢測技術地方標準，為牛IBRV的綜合

防控體系提供診斷技術支撐，這對搞好我區(qū)牛IBRV的綜合防控體系

建設具有重要現(xiàn)實意義。

2.項目來源

根據(jù)《廣西壯族自治區(qū)市場監(jiān)督管理局關于下達2018年第二批

廣西地方標準制定項目計劃的通知》（桂市監(jiān)函〔2018〕253號）精

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神，由廣西獸醫(yī)研究所承擔《牛傳染性鼻氣管炎病毒的檢測巢式聚

合酶鏈反應法》廣西地方標準于2018年12月獲得立項（編號

2018-0271），本標準由廣西畜牧業(yè)標準化技術委員會提出，廣西獸醫(yī)

研究所負責起草。

3.工作概況

本標準起草團隊長期從事牛傳染性鼻氣管炎病毒相關技術的研

究，先后建立了多種IBRV的診斷技術，發(fā)表論文5篇，其中SCI論

文2篇，并將這些技術在臨床診斷上進行應用。上述技術支持確保能

完成本標準起草制定任務。

2018年初本標準起草團隊起草制訂牛傳染性鼻氣管炎病毒廣西

地方標準項目建議書，開展標準的申報。早在2017年1月-2018年

1月成立標準起草工作小組，收集資料，調(diào)查研究，編寫制訂標準。

標準起草小組赴南寧、柳州、來賓、北海、欽州、桂林等廣西養(yǎng)

牛業(yè)發(fā)展較快的地區(qū)及相關牛場企業(yè)進行考察，調(diào)研和檢疫，了解廣

西IBRV流行毒株的發(fā)病癥狀，序列特點，傳播途徑等流行病學調(diào)查。

并查閱相關文獻資料，以及聚合酶鏈式反應法的技術要領，結合我區(qū)

疫情及流行毒株特點，分析IBRV保守序列gB基因，設計引物，通過

實驗室研究試驗及臨床驗證后，編寫制定IBRV巢式PCR檢測標準操

作規(guī)程征求意見稿。

本標準起草人員：范晴、張民秀、王盛、龐耀珊、劉加波。

二、標準編制原則

1.政策性原則

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本標準編寫過程遵循國家相關法律、法規(guī)和國家標準。

2.先進性原則

以國內(nèi)外相關文獻資料為參考，力求反映該領域最新的科技成

果。以國內(nèi)同類標準制訂編寫方法為基礎，對本標準進行規(guī)范、充實

和創(chuàng)新，使之具有先進性。

3.經(jīng)濟性原則

本項目為自籌經(jīng)費項目，因此在本標準編制過程，從獲取信息、

起草、實驗室及臨床驗證到形成征求意見稿的逐一環(huán)節(jié)，在確保質量

的前提下均力行節(jié)約，利用有限的經(jīng)費圓滿完成各階段編寫工作。

4.適用性原則

本標準集國內(nèi)外IBRV的PCR檢測技術的成功經(jīng)驗，并經(jīng)實驗室

與臨床應用驗證，且完全按照國家標準的要求編寫，內(nèi)容全面，形式

規(guī)范，可操作和實用性強。

5.協(xié)調(diào)統(tǒng)一性原則

本標準參照國內(nèi)相關標準的編寫形式和表達方法，力求與國內(nèi)相

關標準的協(xié)調(diào)統(tǒng)一。本標準通過持續(xù)查新，確保內(nèi)容不與已有的國家

標準、行業(yè)標準和地方標準重復或相矛盾。

6.規(guī)范化原則

本標準是嚴格按照GB/T1.1—2009的要求來編寫的。

三、標準主要主要技術內(nèi)容及依據(jù)

本標準的主要依據(jù)是參考有關文獻資料，結合我區(qū)區(qū)情，通過實

驗室研究試驗及臨床驗證后，并參考其他資料經(jīng)室內(nèi)、室間驗證提出。

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本標準針對牛輪狀病毒（IBRV）的gB區(qū)保守序列，設計了2對特異性

引物，優(yōu)化建立可以快速檢測IBRV的巢式PCR，并對其特異性和敏感

性進行了測定，并用臨床樣品對其可行性進行評估。結果表明，該巢

式PCR可檢測出成功地檢測出牛傳染性鼻氣管炎，而對其它牛病病原

的檢測結果為陰性,其最低可檢測出1pg的IBRV核酸。

四、與現(xiàn)行法律、法規(guī)和有關標準的關系

從事IBRV的檢測實驗，必須遵守《動物疫病實驗室檢驗采樣方

法》（NY/T541-2002）、《病原微生物實驗室生物安全管理條例》（中華

人民共和國國務院令第424號）、《獸醫(yī)實驗室生物安全管理規(guī)范》（農(nóng)

業(yè)部302號公告）等相關法律、法規(guī)和強制性標準。對于牛IBRV的

檢測和診斷，目前尚無國家標準及相關行業(yè)及地方標準。PCR方法快

速、準確、敏感、操作較簡便，易標準化，能準確快速檢測和診斷牛

IBRV。目前多數(shù)基層單位均裝備有PCR儀及相關設備，而且IBRV的

PCR檢測操作可在一般獸醫(yī)實驗室如BSL-2實驗室甚至BSL-1實驗室

中進行，所以易于在基層推廣應用。綜上所述，本標準提供的巢式

PCR檢測方法不僅與目前現(xiàn)行法律、法規(guī)和有關標準沒有沖突，而且

是對現(xiàn)行行業(yè)標準和防治技術規(guī)范的有益補充。

五、采用國際標準或國外先進標準的情況

本標準為國內(nèi)首創(chuàng)，未采用國際標準或國外先進標準。

六、本規(guī)程的一些有關說明

因本技術直接針對病原基因進行檢測，敏感性非常高，所以在操

作過程中要特別注意，避免樣品之間交叉污染而出現(xiàn)的假陽性結果。

另外，DNA酶在環(huán)境中無處不在，抽提好的待檢DNA在保存過程中極

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易降解，會由此而導致假陰性結果。因此，對樣品的處理應及時迅速，

避免在冰箱中長時間保存。

再有，本技術科技含量較高，為了避免錯誤的檢測結果，建議在

應用本技術之前，先對操作人員