農(nóng)產(chǎn)品食品檢驗(yàn)員主講教師：徐英菊糧食理化檢驗(yàn)——谷物及其制品中β-葡聚糖含量的測定2第十節(jié)谷物及其制品中β-葡聚糖含量的測定3學(xué)習(xí)目標(biāo)掌握谷物及制品中β-葡聚糖含量測定主要依據(jù)；掌握β-葡聚糖含量測定的原理；掌握試樣制備的要求；掌握β-葡聚糖含量測定的操作步驟；掌握β-葡聚糖含量測定的結(jié)果分析。4β-葡聚糖通常存在于植物種子的皮層及糊粉層中。生物醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為β-葡聚糖具有清腸、降低膽固醇、調(diào)節(jié)血糖、提高免疫力等四大生理作用，已引起了全世界的廣泛關(guān)注。一、測定原理5NY/T2006—2011《谷物及其制品中β-葡聚糖含量的測定》一、測定原理1、依據(jù)6利用地衣聚糖酶（或稱葡聚糖酶）和β-葡萄糖苷酶對樣品中（1→3）（1→4）-β-D-葡聚糖（混聯(lián)β-D-葡聚糖，或簡稱β-葡聚糖)的酶解作用，由地衣聚糖酶專一性地水解β-葡聚糖成寡糖，β-葡萄糖苷酶則將寡糖水解成葡萄糖。一、測定原理2、原理7葡萄糖在葡萄糖氧化酶作用下生成葡萄糖酸和過氧化氫，過氧化氫在過氧化物酶作用下，與4-氨基安替比林氧化縮合生成紅色錕類化合物。此化合物在510nm有吸收，其吸光度值與葡萄糖含量成正比。一、測定原理2、原理8（1）50U/mL地衣聚糖酶溶液：將1mL地衣聚糖酶溶被（1000U/mL）用磷酸鈉緩沖液（20mmol/L、pH6.5）稀釋至20.0mL，把酶液等分成4份，每份5mL，置于聚丙烯塑料瓶中，在-20℃下冷凍保存，備用。二、試劑與設(shè)備1、試劑9（2）2U/mLβ-葡萄糖苷酶溶液：將lmL-葡萄糖苷酶榕液(40U/mL)用乙酸鈉緩沖液（50mmol/L、pH4.0）稀釋至20.0mL，把酶液等分成4份，每份5mL，置于聚丙烯塑料瓶中，在-20℃冷凍保存，備用。二、試劑與設(shè)備1、試劑10（3）葡萄糖氧化酶-過氧化物酶-緩沖液混合物。內(nèi)含葡萄糖氧化酶（>12000U/L）、過氧化物酶（6>50U/L）、4-氨基安替比林（0.4mmol/L）。二、試劑與設(shè)備1、試劑11（3）葡萄糖氧化酶-過氧化物酶-緩沖液混合物。緩沖液的配制：稱取13.6gKH2PO4、4.2gNaOH和3.0g4-羥基苯甲酸，溶于水中，調(diào)節(jié)pH7.4，定容至100mL。葡萄糖氧化酶-過氧化物酶-緩沖液混合物的配制：取50mL緩沖液稀釋至1000mL；用該稀釋緩沖液溶解葡萄糖氧化酶-過氧化物酶混合試劑，使之達(dá)到所需濃度。二、試劑與設(shè)備1、試劑12二、試劑與設(shè)備1、試劑（4）50%乙醇溶液。（5）20mmol/L、pH6.5磷酸鈉緩沖液。稱取3.12gNaH2PO4·2H2O，加900mL水溶解；調(diào)節(jié)pH6.5，定容至1000mL。（6）乙酸鈉緩沖液。13二、試劑與設(shè)備1、試劑（7）200mmol/L、pH4.0乙酸鈉緩沖液：取7.6mL冰醋酸于900mL水中，加入4.8g三水乙酸鈉，溶解；調(diào)節(jié)pH4.0，定容至1000mL。（8）50mmol/L、pH4.0乙酸鈉緩沖液：取250mL200mmol/L、pH4.0乙酸鈉緩沖液稀釋至1000mL。14二、試劑與設(shè)備1、試劑（9）1000mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯存溶液：將葡萄糖粉末(純度大于99%)于100℃常壓干燥2h，置于干燥器中冷卻，室溫下密閉保存。準(zhǔn)確稱取0.1000g干燥葡萄糖，用50mmol/L、pH4.0乙酸鈉緩沖液溶解并定容至100mL。15二、試劑與設(shè)備2、儀器與設(shè)備（1）旋風(fēng)磨或粉碎機(jī)。樣品粉碎后可過0.5mm或35目篩網(wǎng)。（2）離心機(jī)。能容納15mm×100mm或10mm×75mm的玻璃試管，離心力1000×g。（3）水浴鍋。溫度穩(wěn)定性±0.2℃。（4）旋渦混合儀。（5）pH計(jì)。精度0.01。16二、試劑與設(shè)備2、儀器與設(shè)備（6）分析天平。感量0.0001g。（7）干燥箱?？杀３?05℃±1℃。（8）分光光度計(jì)。檢測波長510nm。（9）比色皿。（10）移液器。量程10~100μL、20~200μL、1000~5000μL，配備一次性吸頭。17二、試劑與設(shè)備2、儀器與設(shè)備（11）容量瓶。容積100mL、1000mL。（12）具塞玻璃試管。容積15~20mL。（13）試管架。30孔或40孔，能放置15~20mL具塞玻璃試管。（14）計(jì)時(shí)器(秒表)。18三、試樣制備1.待測樣品：按照GB/T5491的規(guī)定取樣。粉末狀樣品：取50g以上，充分混勻后于廣口瓶中密閉保存。顆粒或片狀樣品：取50g以上，使用粉碎機(jī)粉碎，混勻后于廣口瓶中密閉保存。19三、試樣制備2.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作液：平行移取100μL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯存溶液至3支試管中，分別添加100μL50mmol/L乙酸鈉緩沖液。3.試劑空白：移取200μL50mmol/L乙酸鈉緩沖液至試管中。20四、分析步驟

在樣品測定時(shí)，需同時(shí)進(jìn)行葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作液3個(gè)平行的測定，分光光度計(jì)用試劑空白調(diào)零。必要時(shí)可添加一個(gè)已知β-葡聚糖含量的對照樣品以檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。（一）樣品稱取

精確稱取待測樣品0.0800~0.1000g，放入玻璃試管底部。21四、分析步驟（二）酶解前處理

向待測樣品試管中添加0.2mL50%乙醇溶液，于旋渦混合儀上振蕩分散；加入4.0mL磷酸鈉緩沖液，充分振蕩。將試管放入沸水浴中，保持lmin；取出試管，在旋渦混合儀上劇烈振蕩數(shù)秒；沸水浴中繼續(xù)保持2min，振蕩處理同前。22四、分析步驟（三）酶解反應(yīng)

試管在50℃水浴中保溫5min，添加0.2mL地衣聚糖酶溶液，劇烈振蕩數(shù)秒；加蓋試管塞50℃水浴繼續(xù)保溫60min；其間將試管取出，振蕩處理3~4次。取出試管，向其中添加5mL200mmol/L乙酸鈉緩沖液，混合均勻，室溫下冷卻5~10min；離心(1000×g，10min)，取上清液備用。23四、分析步驟（三）酶解反應(yīng)

分別準(zhǔn)確移取0.1mL上清液至3支試管的底部，向其中2支試管中分別添加0.1mLβ-葡萄糖苷酶溶液；另一支試管中添加0.1mL50mmol/L乙酸鈉緩沖，作為反應(yīng)空白，將上述試管在50℃保溫10min。24四、分析步驟（四）顯色反應(yīng)

分別移取3.0mL葡萄糖氧化酶-過氧化物酶-緩沖液混合物至各試管(包括2個(gè)測試樣、1個(gè)反應(yīng)空白、3個(gè)D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、1個(gè)試劑空白，50℃反應(yīng)20min；取出試管，冷卻至室溫。25四、分析步驟（五）比色

以試劑空白調(diào)零于510nm處測定吸光值。如果試樣中β-葡聚糖的濃度大于10%，將產(chǎn)生比100μg葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作溶液高的吸光度。26四、分析步驟（五）比色

此時(shí)，需在步驟(二)之后，取適量50mmol/L乙酸緩沖液稀釋上清液，然后繼續(xù)3以下步驟，結(jié)果計(jì)算時(shí)應(yīng)把稀釋因子考慮在內(nèi)。27五、結(jié)果分析1、樣品濕基中β-葡聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%），按下式計(jì)算：式中ΔA——樣品吸光值與反應(yīng)空白吸光值的差值F——吸光值轉(zhuǎn)化為μg葡萄糖的轉(zhuǎn)換因子，F(xiàn)=100μg葡萄糖/100μg葡萄的吸光值94——體積校正因子（從9.4mL取0.lmL用于分析）W——固體樣品質(zhì)量（g）0.9——葡萄糖轉(zhuǎn)化為自葡聚糖的脫水轉(zhuǎn)換因子28五、結(jié)果分析2、樣品干基中β-葡聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%），按下式計(jì)算：29五、結(jié)果分析3、精密度（1）重復(fù)性在重復(fù)性條件下測試結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDr)不超過5%。（2）再現(xiàn)性在再現(xiàn)性條件下測試結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDR)不超過10%。30隨堂測試1、簡答題（1）植物中β-葡聚糖