凝血檢驗的標準化一、標本采集、處理的標準化凝血檢驗標本的分析前誤差來源：■采集順序、添加劑使用錯誤(添加劑污染);■采集不順利(血液凝固、采集量不足、溶血);■特殊人群(紅細胞壓積過高);■標本處理不當(保存時間、溫度、離心不當);姓名:腐區(qū)雙頭針采血順序注射器采血順序用途工1學/血清學檢查22凝血項目/血小板功能33輸血全套志物等4556血常規(guī)642.添加劑污染表現(xiàn)：APTT、T顯著延長，PT接近正常鑒別：魚精蛋白糾正試驗、爬蟲酶時間機制：抑制凝血因子V、VII活性鑒別：重采樣表現(xiàn)：APTT(硅土激活試劑)單獨延長機制：接觸因子PK、HMWK消耗鑒別：重采樣APTT(秒)PT(秒)□凝血時間均不凝，大量肝素污染?血清標本?鑒別：待測血漿與正常血漿1:1混合檢測TT,若TT可凝集，提示血清標本；TT仍不凝集，提示肝注：即使沒有肉眼可見的凝塊，也不能排除微小凝塊(或小凝塊體外降解),排查方法：混勻標本后放置2小時，再測D-dimer水平，若繼續(xù)升高提示存在體外凝血激活與繼發(fā)纖溶，標本不合格?！鰢乐厝苎獦吮窘ㄗh退還，除非患者體內(nèi)存在溶血，若不能確定原因，可備注并報告；a.釋放組織因子，導致凝血激活、消耗；我們的臨床研究提示重度機械性溶血對凝血常規(guī)(磁珠法)的干擾仍可接受：Table1.Thrombelastography(TEG)androutinecoagulationnparametersincontrolsamplesandafterinducionofincreasingmechanicalhemolysis(MH) SlightMHModerateMHSevereMHAverageAverageAverageDesiredCLIAParametersControlResultsbias(96)Resultsbias(96)Resultsbias(9%)bias±(%)±(9%)CellfreeHb(g/L)R(min)K(min)MA(mm)PT(s)FIB(g/L)Plateletcount0.02(0.02-0.04)4.9[4.7-5.1]74.1[73.7-74.9]62.6[61.6-63.2]35.9[35.2-36.6]3.18[3.12-3.33]0.9(0.5-1.0)58.3[54.6-61.0]13.2[12.8-13.7]3.24[3.06-3.36]-15.2-14.84.8(2.3-5.8)3.3[32-3.4113.5[13.1-13.6]34.8[33.6-35.513-31.4-5.81-30.410.9(7.1-13.4)35.2[31.5-37.913.6[13.3-14.0]-35.1-43.4NingTang,efal.(2017)Efectsofhemolysisandlipemiainterferenceonkaolin-acivatedthromboelastography,■嚴重脂血標本建議退還，除非患者為高脂血癥，若不能確定原因，可備注并報告；高速離心可避免脂血干擾；b.各項因子水平及血小板功能水平降低；我們的臨床研究提示重度脂血對凝血常規(guī)(磁珠法)的干擾仍可接受：ParametersControlMildAveragebias(9%)ModeratelipemiaAverageAverageDesiredCLIA0.8(0.5-1.1)6.3(5.6-6.8)58.6[57.5-61.535.6[35.4-35.8]-10.1—0.3-11.112.1(11.6-12.7)55.2[53.2-57.2-14.3-10.6-28.118.0(17.4-18.7)70.7[68.8-72.213.05[2.85-3.47]80[76-86-19.6-13.2-42.3R(min)K(min)MA(mm)FIB(g/L)PLT(x×10?/L)NingTang,efal(2017)Efectsofhemolysisandlipemiainterferenceonkaolin-acivatedthromboelastography,andcomparisonwithconventionalcoagulationtests,SCANDJCLINLABINV,77:2,98-103..抗凝劑比例過高(枸櫞酸鈉抗凝血)病例2-4:抗凝劑量調(diào)整公式C=1.85×10-3(100-H)×VAPTT(秒)PT(秒)第一次檢測調(diào)整后檢測APTT(秒)PT(秒)第一次檢測調(diào)整后檢測APTT(秒)PT(秒)第一次檢測調(diào)整后檢測b.采血量不足：不少于90%標準量(fromCAPchecklist)應大于80%標準量(我們的驗證)偏差偏差偏差偏差49.1PT、APTT等凝血常規(guī)：室溫6~8h不影響醫(yī)學決定；不可2-8℃冷藏■凍存標本融解：37℃溫育ToulonP,etal.Impactofdifferentbloodsamplesonroutinecoagulationtestsresults.Resultsofabicenterstudyandreviewoftheliterature.fntJLabHematol.2017;39(5):458-468.■VⅢ因子穩(wěn)定性低，需注意及時檢測或冷凍保存0羊士fIIFengL,etal.SciRep,2014,4(3):3868.8.血漿離心要求●按規(guī)定離心方法，所得血漿中血小板數(shù)量應<10×109L;常用范圍：150-200g10-15min二、檢測系統(tǒng)的標準化■乏血小板血漿中加入組織因子、磷脂和鈣，激活外源凝血途徑，導致血漿凝固所需的時間。■最初被用于評估凝血酶原(Ⅱ因子)水平而得名，之后發(fā)現(xiàn)對V、VII、X及纖維蛋白原均敏感?！鰬茫汉Y選外源凝血因子缺陷及口服抗凝藥檢測■試劑特點：通常含足量磷脂和肝素拮抗劑，受狼瘡抗凝物、肝素影響小。PT及INR(國際標準化比值)1.檢測20例正常人PT,計算獲得PT幾何均值；2.更新ISI值(通過定標或生產(chǎn)商提供);2.活化部分凝血活酶時間■乏血小板血漿中加入接觸活化物、磷脂和鈣，激活內(nèi)源凝血途徑，導致血漿凝固所需的時間。指試劑中加入了接觸活化物(如硅土、白陶土、鞣花1.試劑中只有磷脂沒有組織因子(凝血活酶最初被認為就是組織因子+磷脂);■應用：篩選內(nèi)源因子缺陷及抗凝物質(zhì)(肝素、狼瘡抗凝物)等CLSI的H47-A2建議臨床實驗室評估其特別是APT應對<30%的FVIII、FIX、FXI將定標血漿與乏因子血漿按不同比例混>APTT達參考上限(我室為42秒)對應的FVII及FIX水平分別為：20%和35%。案例5歲男性患兒，4個月前接受扁桃體切除術(shù)，術(shù)前檢查均正常。9因子活性：58%(Ref:60.0-150);10因子活性：59%(Ref:70-120)其他凝血因子活性均在參考范圍內(nèi)?；颊呓?jīng)止血治療后出院，近期再次因出血傾向就診，凝血篩查結(jié)果：VWF、血小板聚集試驗結(jié)果均正常。9因子活性：24%(Ref:60.0-150)建議送檢9因子基因，結(jié)果檢出未報道半合突變?？紤]診斷遺傳性輕型血友病乙。IncubatedmixingtestIncubateeachatmixpatientwthNPPBB后溫育1h,測定APTTAPTTA-B>3秒，提示存在時間依賴性凝血抑制物(如FVII抑制物)50:50MixingStudyaPTTIncubatedMix-SecondsREAGENTINSTRUMENTREAGENTINSTRUMENTDiagnosticaStagoSTA-R,STA-RSiemensBCS,BCSXPYes56944.1%S.D.C.V.MEDIANVALUEVALUEINCUBATIONLABS%80min.postincubation21882.5狼瘡抗凝物混合試驗；某些試驗的正常對照(如ADAMTS13活性測定)4.性能評價/驗證線性(分析測量范圍)驗證：斜率在1±0.05范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r≥0.975;最大稀釋度(可報告范圍)驗證：稀釋后實測值與理論值偏差≤15%;用于VTE排除的敏感度≥97%;陰性預測值95%置信區(qū)間下限≥95%;5.試劑的配制、保存■復溶用水對凝血試驗的影原因分析：自來水含少量鈣，部分凝血因子預先活化，APTT已不能反映相關(guān)凝血因子水平。6.凝血因子活性測定的標準化一步法：將稀釋待測血漿與乏某因子血漿混合后測定APTT/PT,通過測定標準品建立的定標曲線，確定因子活性?！鰬獪y定多個(建議3個)稀釋度，取均值報告；■當各稀釋度檢測結(jié)果不一致時(偏差>20%),需增加稀釋度、取最大值報告，并提示存在凝血抑制■患者65歲男性，臨床診斷：腔隙性腦梗塞、冠心病、陳舊性心肌梗塞，欲行抗血小板、抗凝治療；APTT(秒)PT(秒)T(秒)提示可行抗凝治療推薦：200-250*109/L花生四烯酸：推薦終濃度1.0(0.5-1.6)mmol/L膠原：推薦終濃度2.0(1.0-5.0)ug/mL腎上腺素：推薦終濃度5.0(0.5-10.0)umol/L瑞斯托霉素：終濃度高：0.8-1.5mg/mL;低：<0.6mg/mL形態(tài)(反應時間：5-10min)pcpc8.凝血實驗室人員的要求■血小板聚集試驗、部分凝血特檢建議固定某個上午10:00檢測高峰期：發(fā)現(xiàn)一批標本凝血酶原時間(PT)均顯著延長，8點做的PT室內(nèi)質(zhì)控在控，儀器狀態(tài)未見明顯異常。原因：機上第一瓶PT試劑用盡，第二瓶PT試劑失效。1.室內(nèi)質(zhì)控頻度2.檢測中途更換試劑瓶時，可能更換到失效的試劑?如吸樣探針不完全堵塞、檢測光強度衰減……CAP要求：至少每8h一次凝血質(zhì)控。ISO15189應用說明：至少當天一次凝血質(zhì)控。適合樣本量較小的實驗室■完成一定樣本測試數(shù)時檢測質(zhì)控品pertests:適合樣本量波動較大的實驗室■更換試劑瓶時檢測質(zhì)控品適合大樣本量、頻繁更換試劑瓶的實驗室2013年全國凝血試驗室間質(zhì)統(tǒng)計結(jié)果實驗室編碼：113017測定日期：2013/9/2第2次秒項樣本編號你室結(jié)果靶值偏倚(%)允許范圍下限靶值上限評價結(jié)果-4.32-3.69通過通過通過45.4-61.4通過通過61.2-82.8本組實驗室數(shù)儀器Stago試劑+各種類型儀器組CAP室間質(zhì)評(覆蓋項目廣、強調(diào)能力考核),舉例：2019年CGE-A:01號質(zhì)評物為加入了約2.0U/mL普通肝素的正常人混合凍干血漿。QUANTITATIVE這不僅干擾了內(nèi)源凝血因子的檢測(未檢測3個或以上稀釋度的實驗室可能得到偏低的因子活性結(jié)果),也使得28.6%的實驗室報告了存在VIII因子抑制物及52.3%的實QUANTITATIVEFactorVIlIInhibitorBethesdaBethesdaUnitsINTERPRETATIONINTERPRETATIONPresentNotPresentPresentNotPresent9571.4FactorXIIIQUANTITATIVENO.LABSMEANS.D.C.V.MEDIANVALUECGECGE01Activity.%NormalINTERPRETATIONINTERPRETATIONNormalAbnormalNormalAbnormalLABS3786.06NO.LABS%6747.752.3■抗凝治療期間，送檢抗凝物質(zhì)(蛋白C、蛋■妊娠期、血栓急性期送檢蛋白S;抗凝藥物對狼瘡抗凝物檢測的影響1.萬脈舒(低分子肝素鈣、那曲肝素)2.希弗全(帕肝素鈉)FranzRatzinger;MonaLang;SabineBelik;PetraJilma-Stohlawetz;KlausG.Schmetterer;HelmuthHaslacher;ThomasPerkmann;PeterQuehenberger狼瘡抗凝物檢測受不同濃度新型口服抗凝藥的影響達比加群利伐沙班阿哌沙班B.)C.)B.)C.)80.0%-80.0%-PercentagePercentage60.0%-PercentagePercentage60.0%-PercentagePercentage40.0%40.0%-40.0%40.0%-68.97%20.0%-20.0%-2667%2667%2414%20.69%2069%20.69%2069%000000抗凝藥物對狼瘡抗凝物檢測的影響TABLEIⅢ.EffectofLupusAnticoagulantsandAnticoagulantTherNormalTypicalyProlonge??2012WileyPeriodicals,Inc.AmericanJournalofHematologyAntiphospholipidsyndrome:LaboratorytestinganddiagnosticstrategiesThomasL.Ortel*Case患者女，45歲，外院診斷三尖瓣關(guān)閉不全、肺動脈高壓轉(zhuǎn)入院，CTA檢查提示肺栓塞，給予利伐沙班、阿替普酶抗凝溶栓治療。10月13日下午：服用負荷劑量利伐沙班50mgod10月14日上午送檢：狼瘡抗凝物DRVVT標準化比值：1.36(Ref:<1.2)抗凝血酶：96%(Ref:80-120)抗