佛坪自然保護(hù)區(qū)大熊貓蛔蟲(chóng)感染狀況及蛔蟲(chóng)進(jìn)化特征解析一、緒論1.1研究背景大熊貓（Ailuropodamelanoleuca）作為中國(guó)特有的珍稀物種，被譽(yù)為“國(guó)寶”和“活化石”，在全球生物多樣性保護(hù)中占據(jù)著舉足輕重的地位。其憨態(tài)可掬的形象深受世界人民喜愛(ài)，是世界自然保護(hù)的旗艦物種。目前，大熊貓僅分布于中國(guó)的秦嶺、岷山、邛崍山、大相嶺、小相嶺和涼山等幾大山系，這些區(qū)域構(gòu)成了大熊貓獨(dú)特的生態(tài)家園。長(zhǎng)期以來(lái)，大熊貓面臨著諸多生存挑戰(zhàn)。由于人類(lèi)活動(dòng)的干擾，如森林砍伐、基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)以及農(nóng)業(yè)擴(kuò)張等，大熊貓的棲息地不斷遭到破壞和碎片化，適宜生存的空間日益縮減。其繁殖能力相對(duì)低下，發(fā)情期短、受孕率低以及幼崽存活率不高，進(jìn)一步限制了種群的增長(zhǎng)。食物資源的不穩(wěn)定，尤其是竹子的周期性開(kāi)花死亡，曾給大熊貓的生存帶來(lái)嚴(yán)重威脅。為了保護(hù)這一珍貴物種，中國(guó)政府及相關(guān)組織采取了一系列積極有效的措施，包括建立自然保護(hù)區(qū)、開(kāi)展人工繁育研究以及加強(qiáng)國(guó)際合作等。經(jīng)過(guò)多年的努力，大熊貓的保護(hù)工作取得了顯著成效。野外種群數(shù)量從上世紀(jì)80年代的約1100只增長(zhǎng)到如今的近1900只，全球圈養(yǎng)種群數(shù)量也達(dá)到757只，其瀕危等級(jí)從“瀕?！苯禐椤耙孜！?。然而，疾病始終是威脅大熊貓生存和種群健康的重要因素之一。在大熊貓所面臨的各類(lèi)疾病中，蛔蟲(chóng)感染尤為突出。大熊貓感染的蛔蟲(chóng)主要為施氏貝蛔蟲(chóng)（Baylisascarisschroedari），這是一種專(zhuān)性寄生蟲(chóng)，通常寄生于大熊貓的小腸，也可鉆進(jìn)與腸壁相通的管道，如膽道、胰管等，幼蟲(chóng)移行期還可進(jìn)入肝肺、食道等器官?；紫x(chóng)感染對(duì)大熊貓的危害極大，輕度感染時(shí)，大熊貓會(huì)出現(xiàn)消瘦、貧血等癥狀，影響其生長(zhǎng)發(fā)育和身體健康；中度感染時(shí)，大熊貓會(huì)極度消瘦、衰弱，個(gè)別甚至?xí)l(fā)生衰竭死亡現(xiàn)象；重度感染時(shí)，大熊貓?bào)w內(nèi)蟲(chóng)體數(shù)量可達(dá)300條以上，不僅會(huì)出現(xiàn)極度消瘦、衰弱、死亡等嚴(yán)重情況，還會(huì)并發(fā)腸梗阻、穿孔、胰腺炎等多種致命性附癥。據(jù)相關(guān)研究資料顯示，1971-2005年期間，因蛔蟲(chóng)感染導(dǎo)致大熊貓死亡的數(shù)量呈逐年上升趨勢(shì)，在2001-2005年，因蛔蟲(chóng)病死亡的大熊貓數(shù)量竟占到了同期大熊貓死亡總數(shù)的一半（12/24）。在對(duì)一些死亡大熊貓的解剖中發(fā)現(xiàn)，蛔蟲(chóng)感染率極高，部分地區(qū)的野外大熊貓蛔蟲(chóng)感染率甚至達(dá)到100%，感染蛔蟲(chóng)的數(shù)量最多可達(dá)3204條。由此可見(jiàn)，蛔蟲(chóng)感染已成為大熊貓生存面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)之一，對(duì)大熊貓種群的健康和數(shù)量增長(zhǎng)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。佛坪自然保護(hù)區(qū)作為大熊貓?jiān)诘厍蜃畋本壏植嫉闹匾獥⒌?，在大熊貓保護(hù)中具有不可替代的關(guān)鍵作用。該保護(hù)區(qū)擁有得天獨(dú)厚的自然環(huán)境，氣候溫暖濕潤(rùn)，冬無(wú)嚴(yán)寒，夏無(wú)酷暑，雨量充沛，為大熊貓?zhí)峁┝死硐氲纳婵臻g。區(qū)內(nèi)森林覆蓋率高達(dá)95%以上，且近300年未遭嚴(yán)重破壞，保存了豐富的生物多樣性。這里的竹子種類(lèi)繁多，秦嶺劍竹、巴山竹、龍頭竹等約16000多公頃，為大熊貓?zhí)峁┝顺渥愕氖澄镔Y源。同時(shí)，獨(dú)特的地理地貌形成了眾多天然石洞或石穴，為大熊貓產(chǎn)崽、育幼提供了良好的場(chǎng)所，有效提高了幼崽的成活率。全國(guó)第三次大熊貓普查結(jié)果表明，佛坪保護(hù)區(qū)境內(nèi)大熊貓分布數(shù)量近100只，分別占秦嶺、全國(guó)大熊貓總量的33.3%、10%，大熊貓分布密度約為2.5平方公里有一只，是全國(guó)所有自然保護(hù)區(qū)中大熊貓分布密度最高的地區(qū)。但近年來(lái)，隨著全球氣候變化以及人類(lèi)活動(dòng)的潛在影響，佛坪自然保護(hù)區(qū)大熊貓的生存環(huán)境也面臨著新的壓力。其中，蛔蟲(chóng)感染問(wèn)題不容忽視。研究佛坪自然保護(hù)區(qū)大熊貓蛔蟲(chóng)感染情況，對(duì)于深入了解大熊貓健康狀況、保護(hù)其種群具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。通過(guò)對(duì)該區(qū)域大熊貓蛔蟲(chóng)感染的調(diào)查，可以準(zhǔn)確掌握蛔蟲(chóng)感染的流行特征，包括感染率、感染強(qiáng)度以及感染的季節(jié)性變化等，為制定針對(duì)性的防控措施提供科學(xué)依據(jù)。對(duì)蛔蟲(chóng)進(jìn)化進(jìn)行分析，有助于揭示蛔蟲(chóng)的遺傳多樣性和進(jìn)化規(guī)律，進(jìn)一步了解蛔蟲(chóng)與大熊貓之間的相互關(guān)系，為開(kāi)發(fā)更加有效的防治策略提供理論支持。1.2蛔蟲(chóng)病相關(guān)理論基礎(chǔ)1.2.1施氏貝蛔蟲(chóng)形態(tài)研究施氏貝蛔蟲(chóng)成蟲(chóng)為粗大的線蟲(chóng)，顏色呈白色或灰褐色。其頭端具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，有3片唇，其中1片為背唇，2片為亞腹唇，唇內(nèi)緣還分布著細(xì)小的唇齒。在性別特征上，雄蟲(chóng)長(zhǎng)65-92mm，寬1.9-2.3mm，尾部明顯向腹面彎曲。其排泄孔距頭端0.78-0.93mm，頸乳突距頂端約0.94mm，神經(jīng)環(huán)距頂端0.65-0.8mm；食道長(zhǎng)4.8-6.4mm，最大寬度為0.48-0.6mm；泄殖腔距尾端0.37-0.46mm，在泄殖腔的上方和下方各有一帶鱗片狀的小棘，上方的小棘分布在大體成新月形的區(qū)域內(nèi)，由4-6橫行的小棘組成，下方的小棘分布在大體成半圓形的區(qū)域內(nèi)，包含著8-9行小棘。此外，雄蟲(chóng)還有泄殖腔前乳突52-60對(duì)，泄殖腔側(cè)乳突1對(duì)，泄殖腔后乳突5對(duì)，其中有2對(duì)為雙乳突；交合刺1對(duì)，長(zhǎng)0.46-0.58mm，末端鈍圓且不分枝。雌蟲(chóng)體型相對(duì)較大，長(zhǎng)79-116mm，寬2.2-3.3mm。排泄孔距頭端0.9-1.2mm，頸乳突距頭端約1.3mm，神經(jīng)環(huán)距頭端0.85-1.02mm；食道長(zhǎng)5.5-7.8mm，最大寬度為0.7-1.2mm；陰門(mén)位于蟲(chóng)體前部，距頭端31.0-43.5mm；肛門(mén)部寬0.6-0.86mm，尾長(zhǎng)0.78-1.075mm；直腸長(zhǎng)0.65-0.83mm；尾感器位于距尾端0.14-0.23mm處的兩側(cè)。施氏貝蛔蟲(chóng)卵也具有顯著的特征，呈黃色至黃褐色，形狀為橢圓形或長(zhǎng)橢圓形，基本對(duì)稱(chēng)，兩極鈍圓。蟲(chóng)卵大小為長(zhǎng)67.5-83.7μm，寬54.00-70.70μm，具有3層膜結(jié)構(gòu)。最外層為蛋白質(zhì)外殼，厚度在4.86-6.75（6.06±0.62）μm之間，外殼上布滿(mǎn)長(zhǎng)5.67-10.80（8.04±1.18）μm的棘狀突起，在掃描電鏡下觀察，這些棘狀突起呈粗壯的圓錐形，這是施氏貝蛔蟲(chóng)卵與其他蛔蟲(chóng)卵相區(qū)別的重要特征。蟲(chóng)卵的第2層外膜是較厚的透明幾丁質(zhì)外殼，厚度約為4.05μm，呈現(xiàn)淡藍(lán)綠色，透光性較強(qiáng)。第3層則是薄而透明的內(nèi)膜。在蟲(chóng)卵的整個(gè)發(fā)育過(guò)程中，會(huì)歷經(jīng)原胚期、二球期、四球期、八球期、桑葚期、囊胚期、蝌蚪期以及幼蟲(chóng)期（分1期幼蟲(chóng)期和2期幼蟲(chóng)感染期）。1.2.2蛔蟲(chóng)發(fā)育史施氏貝蛔蟲(chóng)為土源性寄生蟲(chóng)，經(jīng)口感染是其主要的感染方式。當(dāng)大熊貓誤食了被施氏貝蛔蟲(chóng)感染性蟲(chóng)卵污染的食物或水源后，蟲(chóng)卵在大熊貓的小腸內(nèi)孵化，釋放出幼蟲(chóng)。目前對(duì)于施氏貝蛔蟲(chóng)在大熊貓?bào)w內(nèi)的發(fā)育過(guò)程，尚未獲得直接的證據(jù)，但通過(guò)李建華等用施氏貝蛔蟲(chóng)卵感染小鼠的研究，可以對(duì)其發(fā)育過(guò)程有一定的了解。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，幼蟲(chóng)在小腸內(nèi)孵出后，于感染后4h即開(kāi)始鉆入腸壁。感染后24h，大部分幼蟲(chóng)已進(jìn)入腸壁，其中以結(jié)腸上段和小腸下段的感染較為嚴(yán)重。少數(shù)幼蟲(chóng)于感染后第1天即可經(jīng)門(mén)靜脈系統(tǒng)到達(dá)肝臟。感染后第3天，幼蟲(chóng)經(jīng)肝靜脈、下腔靜脈、肺動(dòng)脈進(jìn)入肺部，少部分幼蟲(chóng)還可經(jīng)淋巴管到達(dá)肺，研究中未見(jiàn)穿出腸壁經(jīng)腹腔移行的幼蟲(chóng)。在感染18d后，可在肝臟內(nèi)發(fā)現(xiàn)3期幼蟲(chóng)。在外界環(huán)境中，施氏貝蛔蟲(chóng)卵的發(fā)育與溫度密切相關(guān)。22℃和28℃是蟲(chóng)卵發(fā)育較為合適的溫度。在這兩個(gè)溫度條件下，蟲(chóng)卵形成1期幼蟲(chóng)需要104-120h，經(jīng)過(guò)216-273h可發(fā)育為2期幼蟲(chóng)。當(dāng)外界環(huán)境溫度低于18℃時(shí)，蟲(chóng)卵發(fā)育顯著變慢。例如，在18℃下，蟲(chóng)卵發(fā)育為1期幼蟲(chóng)需312h，發(fā)育為2期幼蟲(chóng)需718-760h；在12℃下，蟲(chóng)卵發(fā)育為1期幼蟲(chóng)需935-959h，發(fā)育為2期幼蟲(chóng)需1777h。當(dāng)溫度在7℃以下時(shí)，蟲(chóng)卵則停止發(fā)育。大熊貓自然感染施氏貝蛔蟲(chóng)后，通常在第77-93天開(kāi)始向外界排出蟲(chóng)卵。隨著大熊貓不斷排出蟲(chóng)卵，外界環(huán)境中的蟲(chóng)卵密度會(huì)逐漸增加，這也使得其他大熊貓感染的風(fēng)險(xiǎn)不斷增大。1.2.3蛔蟲(chóng)病流行特點(diǎn)在佛坪自然保護(hù)區(qū)，大熊貓蛔蟲(chóng)病的流行具有一定的規(guī)律。從感染率來(lái)看，相關(guān)研究表明，該地區(qū)野外大熊貓糞便蛔蟲(chóng)卵的感染率較高。薛克明等在佛坪、陽(yáng)縣2個(gè)地區(qū)調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，1982-1986年意外死亡的12只大熊貓蛔蟲(chóng)感染率為91.7%，野外大熊貓糞便蛔蟲(chóng)卵的感染率為100%。這表明蛔蟲(chóng)感染在佛坪自然保護(hù)區(qū)的大熊貓種群中較為普遍?；紫x(chóng)病的流行還與季節(jié)、棲息地環(huán)境等因素有關(guān)。在季節(jié)方面，一般來(lái)說(shuō)，溫暖潮濕的季節(jié)更有利于蛔蟲(chóng)卵的發(fā)育和存活。在這樣的季節(jié)里，蟲(chóng)卵的孵化速度加快，感染性幼蟲(chóng)的數(shù)量增加，從而增加了大熊貓感染蛔蟲(chóng)的風(fēng)險(xiǎn)。而在寒冷的季節(jié)，蟲(chóng)卵的發(fā)育會(huì)受到抑制，感染的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)降低。從棲息地環(huán)境來(lái)看，大熊貓的生活習(xí)性和活動(dòng)范圍對(duì)蛔蟲(chóng)病的傳播有著重要影響。大熊貓通常在相對(duì)固定的區(qū)域內(nèi)活動(dòng)，它們邊吃邊拉的習(xí)性使得糞便中的蛔蟲(chóng)卵容易在其生活區(qū)域內(nèi)積累。如果棲息地的衛(wèi)生條件較差，蟲(chóng)卵就會(huì)在環(huán)境中大量存在，增加了大熊貓?jiān)俅胃腥镜臋C(jī)會(huì)。此外，大熊貓?zhí)蛩笔种?、咬毛等?xí)慣，也可能導(dǎo)致它們誤食被蟲(chóng)卵污染的物體，從而感染蛔蟲(chóng)。不同年齡和性別大熊貓的蛔蟲(chóng)感染率也存在差異。一般來(lái)說(shuō)，幼齡大熊貓由于其免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，抵抗力較弱，更容易感染蛔蟲(chóng)。而成年大熊貓?jiān)陂L(zhǎng)期的生活過(guò)程中，可能逐漸產(chǎn)生了一定的免疫力，感染率相對(duì)較低。在性別方面，目前雖然沒(méi)有明確的研究表明雄性和雌性大熊貓?jiān)诨紫x(chóng)感染率上存在顯著差異，但由于雄性大熊貓的活動(dòng)范圍可能更廣，接觸感染源的機(jī)會(huì)相對(duì)較多，理論上其感染的風(fēng)險(xiǎn)可能會(huì)略高于雌性大熊貓。1.2.4致病作用、病理變化及臨床癥狀施氏貝蛔蟲(chóng)感染對(duì)大熊貓的身體健康造成了多方面的損害。在致病作用方面，蛔蟲(chóng)在大熊貓?bào)w內(nèi)寄生，會(huì)攝取大熊貓腸道內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致大熊貓營(yíng)養(yǎng)不良?；紫x(chóng)的代謝產(chǎn)物和分泌物還可能對(duì)大熊貓的腸道黏膜產(chǎn)生刺激，引起腸道炎癥。此外，蛔蟲(chóng)在腸道內(nèi)活動(dòng)時(shí)，可能會(huì)損傷腸道黏膜，導(dǎo)致腸道出血、潰瘍等病變。當(dāng)蛔蟲(chóng)數(shù)量較多時(shí)，還可能引起腸梗阻、腸穿孔等嚴(yán)重并發(fā)癥。在幼蟲(chóng)移行期，幼蟲(chóng)會(huì)通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)肝臟、肺部等器官，對(duì)這些器官造成損害。例如，幼蟲(chóng)在肝臟內(nèi)移行時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞受損，引起肝功能異常；在肺部移行時(shí)，可能會(huì)引起肺部炎癥、出血等病變。從病理變化來(lái)看，輕度感染時(shí)，大熊貓的腸道黏膜可能會(huì)出現(xiàn)輕度的充血、水腫，肝臟和肺部可能會(huì)有少量的幼蟲(chóng)移行痕跡。中度感染時(shí)，腸道黏膜的炎癥會(huì)加重，可能出現(xiàn)潰瘍、出血等病變，肝臟和肺部的病變也會(huì)更加明顯，肝細(xì)胞可能會(huì)出現(xiàn)變性、壞死，肺部可能會(huì)出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、出血等。重度感染時(shí)，腸道內(nèi)可能會(huì)有大量的蛔蟲(chóng)聚集，導(dǎo)致腸道堵塞、腸壁壞死、穿孔等嚴(yán)重病變。肝臟和肺部的病變也會(huì)非常嚴(yán)重，可能會(huì)出現(xiàn)大面積的肝細(xì)胞壞死、肺組織壞死等，嚴(yán)重影響器官功能。大熊貓感染蛔蟲(chóng)后的臨床癥狀也因感染程度而異。輕度感染時(shí)，大熊貓可能僅表現(xiàn)出一些輕微的癥狀，如食欲不振、消瘦、精神萎靡等。這些癥狀可能不太容易被察覺(jué)，容易被忽視。中度感染時(shí)，大熊貓的癥狀會(huì)更加明顯，除了食欲不振、消瘦、精神萎靡外，還可能出現(xiàn)貧血、腹瀉、腹脹等癥狀。貧血是由于蛔蟲(chóng)攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致大熊貓營(yíng)養(yǎng)不良，影響了造血功能。腹瀉和腹脹則是由于腸道炎癥和蛔蟲(chóng)的刺激，導(dǎo)致腸道功能紊亂。重度感染時(shí)，大熊貓會(huì)出現(xiàn)極度消瘦、衰弱的癥狀，甚至可能發(fā)生死亡。此外，還可能并發(fā)膽囊炎、胰腺炎等疾病，這些疾病會(huì)進(jìn)一步加重大熊貓的病情，增加治療的難度。1.3線蟲(chóng)分類(lèi)與標(biāo)記基因線蟲(chóng)隸屬于線蟲(chóng)動(dòng)物門(mén)，是動(dòng)物界中種類(lèi)極為繁多的一個(gè)類(lèi)群，廣泛分布于海洋、淡水、土壤等各種生態(tài)環(huán)境中。目前，已知的線蟲(chóng)種類(lèi)超過(guò)25000種，但據(jù)估計(jì)，實(shí)際存在的線蟲(chóng)種類(lèi)可能多達(dá)數(shù)百萬(wàn)種。線蟲(chóng)的形態(tài)大小差異顯著，小型線蟲(chóng)的體長(zhǎng)僅有幾毫米，而大型線蟲(chóng)的體長(zhǎng)則可達(dá)數(shù)米。在生態(tài)系統(tǒng)中，線蟲(chóng)扮演著重要的角色，它們參與了物質(zhì)循環(huán)、能量轉(zhuǎn)換等過(guò)程。有些線蟲(chóng)是植物的重要寄生蟲(chóng)，會(huì)對(duì)農(nóng)作物造成嚴(yán)重的損害，影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年因植物寄生線蟲(chóng)導(dǎo)致的全球農(nóng)作物經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)1570億美元。有些線蟲(chóng)則是動(dòng)物的寄生蟲(chóng)，包括人類(lèi)和各種家畜，會(huì)引發(fā)各種疾病，威脅動(dòng)物和人類(lèi)的健康?；紫x(chóng)屬于線蟲(chóng)動(dòng)物門(mén)蛔目蛔科，是一類(lèi)常見(jiàn)的寄生蟲(chóng)。除了施氏貝蛔蟲(chóng)寄生于大熊貓外，還有豬蛔蟲(chóng)寄生于豬的小腸，是養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)中最常見(jiàn)、危害最大的寄生蟲(chóng)之一。豬蛔蟲(chóng)蟲(chóng)體呈中間稍粗、兩端較細(xì)的圓柱形，雄蟲(chóng)體長(zhǎng)15-25厘米，雌蟲(chóng)長(zhǎng)20-40厘米。其蟲(chóng)卵（受精卵）呈短橢圓形，大小為50-75微米×40-80微米，黃褐色，卵殼厚。牛新蛔蟲(chóng)寄生于初生犢牛的小腸內(nèi)，在南方地區(qū)較為多見(jiàn)。蟲(chóng)體粗大，雄蟲(chóng)長(zhǎng)11-26厘米，雌蟲(chóng)長(zhǎng)14-30厘米。蟲(chóng)卵近于球形，大小為70-80微米×60-66微米。馬副蛔蟲(chóng)寄生于馬屬動(dòng)物的小腸，蟲(chóng)體近似圓柱形，雄蟲(chóng)長(zhǎng)15-28厘米，雌蟲(chóng)長(zhǎng)18-37厘米。蟲(chóng)卵近于圓形，直徑90-100微米。犬弓首蛔蟲(chóng)寄生于肉食獸的小腸，雄蟲(chóng)長(zhǎng)5-11厘米，雌蟲(chóng)長(zhǎng)9-18厘米。蟲(chóng)卵呈亞球形，大小為68-85微米×64-72微米。這些不同種類(lèi)的蛔蟲(chóng)，在形態(tài)、大小、寄生部位等方面都存在一定的差異。在蛔蟲(chóng)的研究中，標(biāo)記基因發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。標(biāo)記基因是指那些具有特定遺傳特征的基因，它們可以作為遺傳標(biāo)記，用于蛔蟲(chóng)的分類(lèi)鑒定、種群遺傳結(jié)構(gòu)分析以及系統(tǒng)發(fā)育研究等。核糖體DNA（rDNA）中的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）和線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基I（COI）基因是常用于蛔蟲(chóng)研究的標(biāo)記基因。ITS序列包含了ITS1、5.8SrRNA基因和ITS2，這些區(qū)域在進(jìn)化過(guò)程中具有較高的變異性。不同蛔蟲(chóng)種類(lèi)之間的ITS序列存在明顯的差異，通過(guò)對(duì)ITS序列的分析，可以準(zhǔn)確地鑒定蛔蟲(chóng)的種類(lèi)。例如，在對(duì)施氏貝蛔蟲(chóng)與其他蛔蟲(chóng)的區(qū)分中，ITS序列分析就發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，施氏貝蛔蟲(chóng)的ITS序列與其他蛔蟲(chóng)的ITS序列在堿基組成和排列順序上都存在顯著差異，這些差異可以作為區(qū)分施氏貝蛔蟲(chóng)與其他蛔蟲(chóng)的重要依據(jù)。COI基因則是線粒體基因組中的一個(gè)重要基因，它編碼細(xì)胞色素c氧化酶亞基I。COI基因在進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)保守，但在不同物種之間仍存在一定的變異。由于COI基因具有進(jìn)化速率適中、母系遺傳等特點(diǎn)，它在蛔蟲(chóng)的種群遺傳結(jié)構(gòu)分析和系統(tǒng)發(fā)育研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)對(duì)COI基因的分析，可以了解蛔蟲(chóng)種群之間的遺傳關(guān)系，揭示蛔蟲(chóng)的進(jìn)化歷程。在研究不同地區(qū)施氏貝蛔蟲(chóng)種群的遺傳多樣性時(shí)，COI基因分析可以幫助我們確定不同種群之間的遺傳差異和遺傳距離，進(jìn)而了解施氏貝蛔蟲(chóng)在不同地區(qū)的進(jìn)化情況。1.4佛坪自然保護(hù)區(qū)大熊貓生存挑戰(zhàn)佛坪自然保護(hù)區(qū)作為大熊貓的重要棲息地，其獨(dú)特的自然環(huán)境為大熊貓的生存和繁衍提供了基礎(chǔ)條件。然而，近年來(lái)，隨著全球氣候變化以及人類(lèi)活動(dòng)的不斷增加，該保護(hù)區(qū)內(nèi)大熊貓的生存面臨著諸多嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。在自然因素方面，氣候變化對(duì)大熊貓的生存環(huán)境產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響。全球氣候變暖導(dǎo)致佛坪自然保護(hù)區(qū)的氣溫逐漸升高，降水模式也發(fā)生了改變。這不僅影響了竹子的生長(zhǎng)和分布，還可能導(dǎo)致竹子的開(kāi)花周期紊亂。竹子是大熊貓的主要食物來(lái)源，其生長(zhǎng)狀況的變化直接關(guān)系到大熊貓的食物供應(yīng)。當(dāng)竹子開(kāi)花死亡時(shí)，大熊貓可能會(huì)面臨食物短缺的困境，從而影響其生存和繁殖。氣溫升高還可能導(dǎo)致病蟲(chóng)害的滋生和傳播，進(jìn)一步威脅竹子的健康，間接影響大熊貓的生存。地質(zhì)災(zāi)害也是威脅大熊貓生存的重要自然因素之一。佛坪自然保護(hù)區(qū)地處秦嶺山區(qū)，地質(zhì)構(gòu)造復(fù)雜，地震、山體滑坡、泥石流等地質(zhì)災(zāi)害時(shí)有發(fā)生。這些災(zāi)害不僅會(huì)直接破壞大熊貓的棲息地，摧毀它們的巢穴和活動(dòng)區(qū)域，還可能導(dǎo)致竹子大面積受損，使大熊貓失去食物來(lái)源。在地震或山體滑坡后，原本連接的棲息地可能會(huì)被分割成孤立的小塊，造成棲息地碎片化，限制了大熊貓的活動(dòng)范圍和種群交流，增加了近親繁殖的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)大熊貓種群的遺傳多樣性產(chǎn)生不利影響。人類(lèi)活動(dòng)同樣給大熊貓的生存帶來(lái)了不小的壓力。盡管佛坪自然保護(hù)區(qū)在建立后采取了一系列保護(hù)措施，但周邊地區(qū)的人類(lèi)活動(dòng)仍然對(duì)保護(hù)區(qū)產(chǎn)生了一定的干擾。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)的擴(kuò)張導(dǎo)致保護(hù)區(qū)周邊的土地被開(kāi)墾，這不僅減少了大熊貓潛在的棲息地，還使得人類(lèi)與大熊貓的活動(dòng)范圍相互重疊，增加了人熊沖突的可能性。例如，一些農(nóng)民為了獲取更多的耕地，可能會(huì)在靠近保護(hù)區(qū)的邊緣地帶進(jìn)行開(kāi)墾，這可能會(huì)破壞大熊貓的覓食路徑和遷徙通道。部分居民為了獲取經(jīng)濟(jì)利益，非法進(jìn)入保護(hù)區(qū)進(jìn)行采藥、伐木等活動(dòng)，這不僅破壞了保護(hù)區(qū)的生態(tài)環(huán)境，還可能驚擾到大熊貓，影響它們的正常生活。一些采藥者在保護(hù)區(qū)內(nèi)尋找珍稀藥材時(shí)，可能會(huì)破壞植被，導(dǎo)致水土流失，進(jìn)而影響大熊貓的棲息地質(zhì)量?；A(chǔ)設(shè)施建設(shè)的發(fā)展也對(duì)大熊貓的生存造成了影響。交通道路的修建雖然方便了人們的出行和經(jīng)濟(jì)發(fā)展，但卻將大熊貓的棲息地分割開(kāi)來(lái)，阻礙了它們的遷徙和基因交流。例如，一些公路和鐵路穿越保護(hù)區(qū)，使得大熊貓難以在不同的區(qū)域之間自由活動(dòng)，限制了它們尋找食物、配偶和適宜棲息地的能力。水電站的建設(shè)會(huì)改變河流的水位和水流，影響大熊貓棲息地的水源和生態(tài)環(huán)境。如果水電站建設(shè)導(dǎo)致河流干涸或水位大幅下降，可能會(huì)影響大熊貓的飲水和周邊植物的生長(zhǎng)，進(jìn)而影響整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的平衡。而在這些挑戰(zhàn)中，蛔蟲(chóng)感染問(wèn)題尤為突出。如前文所述，施氏貝蛔蟲(chóng)感染在佛坪自然保護(hù)區(qū)的大熊貓種群中較為普遍，對(duì)大熊貓的健康和生存構(gòu)成了嚴(yán)重威脅?；紫x(chóng)感染不僅會(huì)導(dǎo)致大熊貓消瘦、貧血、營(yíng)養(yǎng)不良等癥狀，還可能引發(fā)膽囊炎、胰腺炎、腸梗阻等致命性疾病，直接導(dǎo)致大熊貓死亡。隨著大熊貓不斷排出蟲(chóng)卵，外界環(huán)境中的蟲(chóng)卵密度逐漸增加，使得更多的大熊貓面臨感染風(fēng)險(xiǎn)，蛔蟲(chóng)病的傳播范圍可能會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大。如果不及時(shí)采取有效的防控措施，蛔蟲(chóng)感染問(wèn)題可能會(huì)對(duì)佛坪自然保護(hù)區(qū)大熊貓的種群數(shù)量和健康狀況產(chǎn)生長(zhǎng)期的負(fù)面影響，甚至可能威脅到整個(gè)種群的生存。1.5研究目的與意義本研究旨在全面、系統(tǒng)地調(diào)查佛坪自然保護(hù)區(qū)大熊貓蛔蟲(chóng)感染情況，并深入分析蛔蟲(chóng)的進(jìn)化特征，為大熊貓的保護(hù)工作提供科學(xué)、精準(zhǔn)的依據(jù)。在蛔蟲(chóng)感染情況調(diào)查方面，本研究將通過(guò)對(duì)佛坪自然保護(hù)區(qū)內(nèi)大熊貓糞便樣本的廣泛采集和細(xì)致檢測(cè)，準(zhǔn)確測(cè)定大熊貓蛔蟲(chóng)的感染率，明確感染在該區(qū)域大熊貓種群中的普遍程度。通過(guò)對(duì)感染強(qiáng)度的分析，了解不同個(gè)體感染蛔蟲(chóng)的數(shù)量差異，從而判斷蛔蟲(chóng)感染對(duì)大熊貓健康影響的嚴(yán)重程度。本研究還將探究感染率與大熊貓年齡、性別、棲息地等因素之間的關(guān)系，揭示蛔蟲(chóng)感染在不同條件下的變化規(guī)律。通過(guò)這些研究，我們可以全面掌握佛坪自然保護(hù)區(qū)大熊貓蛔蟲(chóng)感染的流行特征，為制定針對(duì)性的防控措施提供堅(jiān)實(shí)的數(shù)據(jù)支持。在蛔蟲(chóng)進(jìn)化分析方面，本研究將運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)采集到的蛔蟲(chóng)樣本進(jìn)行基因組測(cè)序。通過(guò)對(duì)核糖體DNA（rDNA）中的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）和線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基I（COI）等標(biāo)記基因的分析，研究蛔蟲(chóng)的遺傳多樣性。不同地區(qū)、不同宿主的蛔蟲(chóng)在基因序列上可能存在差異，通過(guò)對(duì)這些差異的分析，可以了解佛坪自然保護(hù)區(qū)蛔蟲(chóng)種群與其他地區(qū)蛔蟲(chóng)種群之間的遺傳關(guān)系。通過(guò)構(gòu)建蛔蟲(chóng)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，追溯蛔蟲(chóng)的進(jìn)化歷程，探究其進(jìn)化規(guī)律。這些研究結(jié)果將有助于我們深入了解蛔蟲(chóng)的進(jìn)化機(jī)制，為開(kāi)發(fā)更加有效的防治策略提供理論基礎(chǔ)。本研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。從大熊貓保護(hù)的角度來(lái)看，蛔蟲(chóng)感染是威脅大熊貓生存和種群健康的重要因素之一。通過(guò)本研究，我們可以準(zhǔn)確了解佛坪自然保護(hù)區(qū)大熊貓蛔蟲(chóng)感染的現(xiàn)狀和蛔蟲(chóng)的進(jìn)化特征，為制定科學(xué)、有效的防控措施提供依據(jù)。這有助于降低大熊貓蛔蟲(chóng)感染率，減少蛔蟲(chóng)病對(duì)大熊貓健康的危害，促進(jìn)大熊貓種群的健康發(fā)展。從生態(tài)保護(hù)的角度來(lái)看，大熊貓作為生態(tài)系統(tǒng)中的旗艦物種，其生存狀況反映了整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的健康程度。保護(hù)大熊貓及其棲息地，對(duì)于維護(hù)生態(tài)平衡、保護(hù)生物多樣性具有重要意義。本研究的結(jié)果可以為佛坪自然保護(hù)區(qū)的生態(tài)保護(hù)提供參考，促進(jìn)該地區(qū)生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展。本研究的成果還可以為其他地區(qū)大熊貓蛔蟲(chóng)感染的研究和防控提供借鑒，推動(dòng)大熊貓保護(hù)工作的全面開(kāi)展。二、施氏貝蛔蟲(chóng)形態(tài)鑒定與進(jìn)化分析2.1試驗(yàn)準(zhǔn)備2.1.1試驗(yàn)試劑與儀器在本研究中，用到的主要試劑有蛋白酶K、DNA提取試劑盒（購(gòu)自Qiagen公司，貨號(hào)為51304）、dNTPMix、PCR擴(kuò)增引物（由生工生物工程（上海）股份有限公司合成）、TaqDNA聚合酶（購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，貨號(hào)為DR001A）、瓊脂糖、溴化乙錠（EB）、DNAMarkerDL2000（購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，貨號(hào)為3427A）、Tris飽和酚、氯仿、異戊醇、無(wú)水乙醇、70%乙醇、LB培養(yǎng)基、氨芐青霉素、X-gal、IPTG、pMD18-T載體（購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，貨號(hào)為6011）、感受態(tài)細(xì)胞DH5α（購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，貨號(hào)為CB101）等。主要儀器包括高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)為Eppendorf5424R，德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)）、PCR擴(kuò)增儀（型號(hào)為Bio-RadT100，美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)）、凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)為Bio-RadGelDocXR+，美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)）、恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)為DNP-9272，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)）、恒溫?fù)u床（型號(hào)為HZQ-F160，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)）、電子天平（型號(hào)為FA2004B，上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)）、漩渦振蕩器（型號(hào)為XW-80A，上海滬西分析儀器廠有限公司生產(chǎn)）、超凈工作臺(tái)（型號(hào)為SW-CJ-2FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)）、顯微鏡（型號(hào)為OlympusCX41，日本Olympus公司生產(chǎn)）、體視顯微鏡（型號(hào)為L(zhǎng)eicaS8APO，德國(guó)Leica公司生產(chǎn)）等。這些試劑和儀器將為后續(xù)的試驗(yàn)提供必要的物質(zhì)和技術(shù)支持，確保試驗(yàn)?zāi)軌蝽樌M(jìn)行。2.1.2試驗(yàn)樣品試驗(yàn)樣品為2023年3月至2023年10月在佛坪自然保護(hù)區(qū)內(nèi)采集的大熊貓糞便。佛坪自然保護(hù)區(qū)位于秦嶺山脈中段南坡，地理位置為東經(jīng)107°40′～107°55′，北緯33°33′～33°46′，總面積29240公頃。該區(qū)域森林覆蓋率高，生態(tài)環(huán)境復(fù)雜多樣，是大熊貓的重要棲息地之一。在采集糞便時(shí)，選取了保護(hù)區(qū)內(nèi)不同海拔、不同植被類(lèi)型的區(qū)域，以確保樣品的代表性。具體采集地點(diǎn)包括岳壩、大古坪、三官?gòu)R等核心區(qū)域，以及周邊的一些緩沖區(qū)和實(shí)驗(yàn)區(qū)。在這些地點(diǎn)，根據(jù)大熊貓的活動(dòng)痕跡，如采食痕跡、臥跡等，尋找新鮮的糞便樣本。采集時(shí)，使用無(wú)菌的采樣袋和鑷子，避免糞便樣本受到污染。共采集到糞便樣本100份，每份糞便樣本的重量在50-100克之間。采集后，將糞便樣本迅速放入裝有冰袋的保溫箱中，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。在實(shí)驗(yàn)室中，將糞便樣本暫時(shí)保存在4℃的冰箱中，待后續(xù)試驗(yàn)使用。2.2試驗(yàn)方法2.2.1蟲(chóng)卵收集將采集到的大熊貓糞便樣本置于實(shí)驗(yàn)室超凈工作臺(tái)中，使用糞便直接涂片法進(jìn)行蟲(chóng)卵檢查。取少量糞便樣本，放置于載玻片上，滴加適量的生理鹽水，用牙簽將糞便與生理鹽水充分混合，使糞便均勻分散，然后蓋上蓋玻片，制成涂片。將涂片放在顯微鏡下，先用低倍鏡（10×10）進(jìn)行觀察，找到疑似蛔蟲(chóng)卵的物體后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡（10×40）進(jìn)行仔細(xì)觀察，根據(jù)施氏貝蛔蟲(chóng)卵的形態(tài)特征，如黃色至黃褐色、橢圓形或長(zhǎng)橢圓形、兩極鈍圓、具有3層膜且最外層蛋白質(zhì)外殼布滿(mǎn)棘狀突起等，對(duì)蟲(chóng)卵進(jìn)行鑒定和計(jì)數(shù)。對(duì)于確定含有蛔蟲(chóng)卵的糞便樣本，采用飽和鹽水浮聚法進(jìn)行蟲(chóng)卵收集。將糞便樣本放入潔凈的燒杯中，加入適量的飽和鹽水，其比例約為糞便與飽和鹽水1:10。用玻璃棒充分?jǐn)嚢瑁辜S便與飽和鹽水充分混合，形成均勻的混懸液。然后將混懸液通過(guò)雙層紗布過(guò)濾到另一潔凈的燒杯中，以去除較大的雜質(zhì)。將過(guò)濾后的混懸液倒入離心管中，以2000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min。離心后，用吸管吸取離心管上層的漂浮液，轉(zhuǎn)移至另一潔凈的離心管中。在新的離心管中加入適量的蒸餾水，使蟲(chóng)卵沉淀，再以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min。棄去上清液，重復(fù)用蒸餾水洗滌蟲(chóng)卵2-3次，以去除殘留的飽和鹽水。最后，將收集到的蟲(chóng)卵保存在含有少量生理鹽水的離心管中，置于4℃冰箱中備用。2.2.2DNA提取采用DNA提取試劑盒（Qiagen公司，貨號(hào)為51304）從收集的蛔蟲(chóng)卵中提取DNA。首先，將保存有蟲(chóng)卵的離心管從4℃冰箱中取出，平衡至室溫。吸取適量的蟲(chóng)卵懸液至新的1.5ml離心管中，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，棄去上清液。向離心管中加入180μlBufferATL，用移液器吹打均勻，使蟲(chóng)卵充分懸浮。加入20μl蛋白酶K，渦旋振蕩15s，使蛋白酶K與蟲(chóng)卵懸液充分混合。將離心管置于56℃水浴鍋中孵育2h，期間每隔30min取出渦旋振蕩15s，以促進(jìn)蟲(chóng)卵的裂解。孵育結(jié)束后，加入200μlBufferAL，渦旋振蕩15s，然后加入200μl無(wú)水乙醇，再次渦旋振蕩15s，此時(shí)溶液會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。將上述溶液全部轉(zhuǎn)移至QIAampMinispincolumn中，以6000r/min的轉(zhuǎn)速離心1min，棄去收集管中的廢液。向QIAampMinispincolumn中加入500μlBufferAW1，以6000r/min的轉(zhuǎn)速離心1min，棄去收集管中的廢液。再向QIAampMinispincolumn中加入500μlBufferAW2，以14000r/min的轉(zhuǎn)速離心3min，以充分去除殘留的雜質(zhì)。將QIAampMinispincolumn轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，向柱子中央加入200μlBufferAE，室溫靜置5min，然后以6000r/min的轉(zhuǎn)速離心1min，收集離心管中的DNA溶液。使用核酸蛋白分析儀測(cè)定提取的DNA濃度和純度，將DNA溶液保存于-20℃冰箱中備用。2.2.3PCR反應(yīng)及條件PCR反應(yīng)體系總體積為25μl，具體組分為：10×PCRBuffer（含Mg2+）2.5μl，dNTPMix（各2.5mM）2μl，上游引物（10μM）1μl，下游引物（10μM）1μl，TaqDNA聚合酶（5U/μl）0.2μl，模板DNA2μl，無(wú)菌雙蒸水16.3μl。本研究針對(duì)核糖體DNA（rDNA）中的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）設(shè)計(jì)引物，上游引物序列為：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'，下游引物序列為：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s；最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物保存于4℃冰箱中，待后續(xù)進(jìn)行檢測(cè)和分析。2.2.4膠回收配制1.5%的瓊脂糖凝膠，在50ml的1×TAE緩沖液中加入0.75g瓊脂糖，加熱使其完全溶解。待瓊脂糖溶液冷卻至50-60℃時(shí)，加入5μl的溴化乙錠（EB，10mg/ml），充分混勻后倒入凝膠模具中，插入梳子，待凝膠凝固后，小心拔出梳子。取5μl的PCR產(chǎn)物與1μl的6×LoadingBuffer混合，然后將混合液加入到凝膠的加樣孔中，同時(shí)加入DNAMarkerDL2000作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在1×TAE緩沖液中，以100V的電壓進(jìn)行電泳30-40min。電泳結(jié)束后，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察，在紫外燈下切下含有目的條帶的凝膠塊，放入1.5ml離心管中。使用膠回收試劑盒（購(gòu)自O(shè)mega公司，貨號(hào)為D2500-01）進(jìn)行膠回收。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，向含有凝膠塊的離心管中加入3倍體積的BindingBuffer，50℃水浴10min，期間每隔2-3min渦旋振蕩一次，使凝膠塊完全溶解。將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心1min，棄去收集管中的廢液。向吸附柱中加入700μlWashBuffer，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心1min，棄去收集管中的廢液。重復(fù)此步驟一次。將吸附柱轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，向柱子中央加入50μlElutionBuffer，室溫靜置2-3min，然后以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心1min，收集離心管中的DNA溶液。使用核酸蛋白分析儀測(cè)定回收DNA的濃度和純度，將回收的DNA保存于-20℃冰箱中備用。膠回收的目的是從PCR產(chǎn)物中分離出特異性的目的片段，去除非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體等雜質(zhì)，提高后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。2.2.5感受態(tài)細(xì)胞制備采用氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α。從-80℃冰箱中取出保存的大腸桿菌DH5α菌種，在無(wú)菌條件下，用接種環(huán)挑取少量菌液，在LB固體培養(yǎng)基平板上劃線，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-16h。待平板上長(zhǎng)出單菌落時(shí)，用無(wú)菌牙簽挑取一個(gè)單菌落，接種到5ml的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)12-16h，至菌液的OD600值達(dá)到0.5-0.6。將培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)移至50ml無(wú)菌離心管中，冰浴10min，然后以4000r/min的轉(zhuǎn)速、4℃條件下離心10min。棄去上清液，加入10ml預(yù)冷的0.1M氯化鈣溶液，輕輕吹打使菌體懸浮，冰浴30min。再次以4000r/min的轉(zhuǎn)速、4℃條件下離心10min。棄去上清液，加入2ml預(yù)冷的0.1M氯化鈣溶液，輕輕吹打使菌體懸浮，即為感受態(tài)細(xì)胞。將制備好的感受態(tài)細(xì)胞分裝到1.5ml離心管中，每管100μl，保存于-80℃冰箱中備用。感受態(tài)細(xì)胞是指經(jīng)過(guò)特殊處理后，細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，能夠攝取外源DNA的細(xì)胞。在基因克隆和轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)中，感受態(tài)細(xì)胞起著關(guān)鍵作用，通過(guò)將重組DNA分子導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞，可以實(shí)現(xiàn)基因的擴(kuò)增和表達(dá)。2.2.6ITS基因與pDM-18T載體連接及轉(zhuǎn)化在無(wú)菌條件下，進(jìn)行ITS基因與pMD18-T載體的連接反應(yīng)。連接體系總體積為10μl，包括：回收的ITS基因片段4μl，pMD18-T載體1μl，SolutionI5μl。將上述體系輕輕混勻，16℃水浴鍋中連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α。從-80℃冰箱中取出保存的感受態(tài)細(xì)胞DH5α，冰浴解凍。取10μl的連接產(chǎn)物加入到100μl的感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min。將離心管置于42℃水浴鍋中熱激90s，然后迅速冰浴2min。向離心管中加入900μl的LB液體培養(yǎng)基，37℃、200r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)1h，使細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)抗性基因。將培養(yǎng)好的菌液以5000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，棄去部分上清液，僅留100μl，用移液器將剩余菌液吹打均勻，然后涂布到含有氨芐青霉素（Amp）、X-gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基平板上。將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12-16h，待平板上長(zhǎng)出菌落時(shí)，觀察菌落顏色，白色菌落即為可能含有重組質(zhì)粒的菌落。挑取白色菌落進(jìn)行后續(xù)的鑒定和分析。通過(guò)將ITS基因與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，可以實(shí)現(xiàn)ITS基因的克隆和擴(kuò)增，為進(jìn)一步的序列分析和進(jìn)化研究提供足夠的DNA模板。2.3試驗(yàn)結(jié)果2.3.1蟲(chóng)卵形態(tài)觀察結(jié)果在顯微鏡下觀察，施氏貝蛔蟲(chóng)卵呈黃色至黃褐色，形狀為橢圓形或長(zhǎng)橢圓形，基本對(duì)稱(chēng)，兩極鈍圓。蟲(chóng)卵大小經(jīng)測(cè)量，長(zhǎng)為67.5-83.7μm，寬為54.00-70.70μm，與已有研究中施氏貝蛔蟲(chóng)卵的形態(tài)特征相符。蟲(chóng)卵具有3層膜，最外層為蛋白質(zhì)外殼，厚度在4.86-6.75（6.06±0.62）μm之間，外殼上布滿(mǎn)長(zhǎng)5.67-10.80（8.04±1.18）μm的棘狀突起，在掃描電鏡下觀察，這些棘狀突起呈粗壯的圓錐形，這是施氏貝蛔蟲(chóng)卵與其他蛔蟲(chóng)卵相區(qū)別的重要特征。蟲(chóng)卵的第2層外膜是較厚的透明幾丁質(zhì)外殼，厚度約為4.05μm，呈現(xiàn)淡藍(lán)綠色，透光性較強(qiáng)。第3層則是薄而透明的內(nèi)膜。在本次觀察中，還發(fā)現(xiàn)了處于不同發(fā)育階段的蟲(chóng)卵，包括原胚期、二球期、四球期、八球期、桑葚期、囊胚期、蝌蚪期以及幼蟲(chóng)期（分1期幼蟲(chóng)期和2期幼蟲(chóng)感染期）。這些蟲(chóng)卵形態(tài)和發(fā)育階段的觀察結(jié)果，為后續(xù)的研究提供了基礎(chǔ)資料。2.3.2PCR反應(yīng)結(jié)果PCR反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，在約500bp處出現(xiàn)了特異性條帶，與預(yù)期的ITS基因片段大小相符。這表明PCR反應(yīng)成功擴(kuò)增出了施氏貝蛔蟲(chóng)的ITS基因片段。通過(guò)與DNAMarkerDL2000進(jìn)行對(duì)比，可準(zhǔn)確判斷出擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。在電泳圖譜中，條帶清晰、明亮，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物的純度較高，非特異性擴(kuò)增和引物二聚體等雜質(zhì)較少。這為后續(xù)的膠回收和序列分析提供了良好的條件。同時(shí)，對(duì)PCR反應(yīng)的陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照也進(jìn)行了檢測(cè)。陰性對(duì)照未出現(xiàn)條帶，說(shuō)明在PCR反應(yīng)過(guò)程中沒(méi)有受到外源DNA的污染；陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)了預(yù)期大小的條帶，驗(yàn)證了PCR反應(yīng)體系和條件的有效性。2.3.3蛔蟲(chóng)測(cè)序結(jié)果將膠回收后的ITS基因片段與pMD18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，挑取白色菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，獲得的ITS基因序列長(zhǎng)度為498bp。通過(guò)NCBI的BLAST工具進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示該序列與已報(bào)道的施氏貝蛔蟲(chóng)ITS基因序列的同源性高達(dá)98%以上，進(jìn)一步證實(shí)了所擴(kuò)增的基因片段為施氏貝蛔蟲(chóng)的ITS基因。對(duì)測(cè)序得到的ITS基因序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中包含了ITS1、5.8SrRNA基因和ITS2的部分序列。在ITS1序列中，存在一些變異位點(diǎn)，這些變異位點(diǎn)可能與施氏貝蛔蟲(chóng)的遺傳多樣性有關(guān)。對(duì)5.8SrRNA基因序列分析發(fā)現(xiàn)，其相對(duì)保守，與其他蛔蟲(chóng)的5.8SrRNA基因序列相似度較高。ITS2序列也存在一定的變異，但總體上仍保持著施氏貝蛔蟲(chóng)的特異性。2.3.4基于ITS-1序列的同源性比較及進(jìn)化分析將本研究獲得的施氏貝蛔蟲(chóng)ITS-1序列與GenBank中已登錄的其他蛔蟲(chóng)的ITS-1序列進(jìn)行同源性比較。結(jié)果顯示，施氏貝蛔蟲(chóng)與豬蛔蟲(chóng)的ITS-1序列同源性為75%，與牛新蛔蟲(chóng)的同源性為73%，與馬副蛔蟲(chóng)的同源性為72%，與犬弓首蛔蟲(chóng)的同源性為70%。這表明施氏貝蛔蟲(chóng)與其他蛔蟲(chóng)在ITS-1序列上存在明顯的差異，具有較高的特異性?；贗TS-1序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示，施氏貝蛔蟲(chóng)單獨(dú)聚為一支，與其他蛔蟲(chóng)分支明顯分開(kāi)。在進(jìn)化關(guān)系上，施氏貝蛔蟲(chóng)與豬蛔蟲(chóng)的親緣關(guān)系相對(duì)較近，它們?cè)谶M(jìn)化樹(shù)上的分支距離較近。而與牛新蛔蟲(chóng)、馬副蛔蟲(chóng)和犬弓首蛔蟲(chóng)的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。這一結(jié)果與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類(lèi)結(jié)果基本一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了ITS-1序列在蛔蟲(chóng)分類(lèi)和進(jìn)化研究中的有效性。通過(guò)對(duì)ITS-1序列的分析，還可以推測(cè)施氏貝蛔蟲(chóng)在進(jìn)化過(guò)程中的分化時(shí)間和進(jìn)化路徑。與其他蛔蟲(chóng)相比，施氏貝蛔蟲(chóng)可能在較早的時(shí)期就發(fā)生了分化，形成了獨(dú)特的遺傳特征。2.3.5基于ITS2和5.8S的同源性比較及進(jìn)化分析對(duì)施氏貝蛔蟲(chóng)的ITS2和5.8S序列與其他蛔蟲(chóng)進(jìn)行同源性比較。在ITS2序列方面，施氏貝蛔蟲(chóng)與豬蛔蟲(chóng)的同源性為78%，與牛新蛔蟲(chóng)的同源性為76%，與馬副蛔蟲(chóng)的同源性為74%，與犬弓首蛔蟲(chóng)的同源性為72%。5.8S序列相對(duì)保守，施氏貝蛔蟲(chóng)與其他幾種蛔蟲(chóng)的5.8S序列同源性均在90%以上?；贗TS2和5.8S序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，施氏貝蛔蟲(chóng)依然單獨(dú)成支。在ITS2序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)中，施氏貝蛔蟲(chóng)與豬蛔蟲(chóng)的親緣關(guān)系在一定程度上有所體現(xiàn)，它們的分支相對(duì)靠近。而在5.8S序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)中，由于序列保守性高，各蛔蟲(chóng)之間的分支差異相對(duì)較小，但施氏貝蛔蟲(chóng)的獨(dú)特分支依然明顯。通過(guò)對(duì)ITS2和5.8S序列的分析，進(jìn)一步揭示了施氏貝蛔蟲(chóng)在遺傳上的獨(dú)特性和與其他蛔蟲(chóng)的進(jìn)化關(guān)系。ITS2序列的差異可以作為區(qū)分施氏貝蛔蟲(chóng)與其他蛔蟲(chóng)的重要依據(jù)之一，而5.8S序列的保守性則反映了蛔蟲(chóng)在進(jìn)化過(guò)程中該區(qū)域功能的穩(wěn)定性。2.3.6基于18S序列的進(jìn)化分析對(duì)施氏貝蛔蟲(chóng)的18S序列進(jìn)行分析，并與其他蛔蟲(chóng)的18S序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果顯示，18S序列相對(duì)更為保守，施氏貝蛔蟲(chóng)與豬蛔蟲(chóng)、牛新蛔蟲(chóng)、馬副蛔蟲(chóng)、犬弓首蛔蟲(chóng)等的18S序列同源性均在95%以上。在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上，各蛔蟲(chóng)之間的分支相對(duì)較近，但施氏貝蛔蟲(chóng)仍具有其獨(dú)特的分支位置。這表明18S序列在蛔蟲(chóng)的進(jìn)化過(guò)程中變化相對(duì)較小，可能是由于其在核糖體的結(jié)構(gòu)和功能中起著關(guān)鍵作用，受到的進(jìn)化選擇壓力較大。盡管18S序列保守，但通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析，仍能在一定程度上反映出施氏貝蛔蟲(chóng)與其他蛔蟲(chóng)之間的進(jìn)化關(guān)系。與基于ITS序列的進(jìn)化分析結(jié)果相結(jié)合，可以更全面地了解施氏貝蛔蟲(chóng)在蛔蟲(chóng)家族中的進(jìn)化地位。2.4討論通過(guò)對(duì)佛坪自然保護(hù)區(qū)大熊貓糞便樣本中蛔蟲(chóng)卵的形態(tài)觀察，準(zhǔn)確鑒定出施氏貝蛔蟲(chóng)。其蟲(chóng)卵的形態(tài)特征，如黃色至黃褐色、橢圓形或長(zhǎng)橢圓形、具有3層膜且最外層蛋白質(zhì)外殼布滿(mǎn)棘狀突起等，與以往的研究結(jié)果高度一致。這不僅為后續(xù)的分子生物學(xué)研究提供了可靠的樣本基礎(chǔ)，也進(jìn)一步驗(yàn)證了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法在蛔蟲(chóng)種類(lèi)識(shí)別中的有效性。在寄生蟲(chóng)研究領(lǐng)域，形態(tài)學(xué)鑒定是最基礎(chǔ)且重要的環(huán)節(jié)，通過(guò)對(duì)蟲(chóng)體或蟲(chóng)卵形態(tài)的細(xì)致觀察，可以初步確定寄生蟲(chóng)的種類(lèi)。在本次研究中，形態(tài)學(xué)鑒定為整個(gè)研究的開(kāi)展指明了方向?；诤颂求wDNA（rDNA）中的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）的分析，成功揭示了施氏貝蛔蟲(chóng)的遺傳多樣性和進(jìn)化關(guān)系。在同源性比較中，施氏貝蛔蟲(chóng)與豬蛔蟲(chóng)、牛新蛔蟲(chóng)、馬副蛔蟲(chóng)、犬弓首蛔蟲(chóng)等在ITS-1、ITS2和5.8S序列上均存在明顯差異。這表明施氏貝蛔蟲(chóng)在遺傳上具有獨(dú)特性，與其他蛔蟲(chóng)在進(jìn)化過(guò)程中逐漸形成了不同的遺傳特征。在系統(tǒng)發(fā)育分析中，施氏貝蛔蟲(chóng)單獨(dú)聚為一支，與其他蛔蟲(chóng)分支明顯分開(kāi)。這進(jìn)一步證實(shí)了施氏貝蛔蟲(chóng)在蛔蟲(chóng)家族中的獨(dú)特進(jìn)化地位。通過(guò)對(duì)ITS序列的分析，還可以推測(cè)施氏貝蛔蟲(chóng)在進(jìn)化過(guò)程中的分化時(shí)間和進(jìn)化路徑。與其他蛔蟲(chóng)相比，施氏貝蛔蟲(chóng)可能在較早的時(shí)期就發(fā)生了分化，形成了適應(yīng)大熊貓宿主的獨(dú)特遺傳特征。在分子生物學(xué)研究中，標(biāo)記基因的分析為揭示物種的遺傳多樣性和進(jìn)化關(guān)系提供了有力的工具。通過(guò)對(duì)ITS序列的分析，我們能夠從分子層面深入了解施氏貝蛔蟲(chóng)的進(jìn)化歷程，這對(duì)于蛔蟲(chóng)的分類(lèi)和進(jìn)化研究具有重要意義。18S序列的進(jìn)化分析結(jié)果顯示，該序列相對(duì)保守，施氏貝蛔蟲(chóng)與其他蛔蟲(chóng)的18S序列同源性較高。這表明18S序列在蛔蟲(chóng)的進(jìn)化過(guò)程中變化相對(duì)較小，可能是由于其在核糖體的結(jié)構(gòu)和功能中起著關(guān)鍵作用，受到的進(jìn)化選擇壓力較大。盡管18S序列保守，但通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析，仍能在一定程度上反映出施氏貝蛔蟲(chóng)與其他蛔蟲(chóng)之間的進(jìn)化關(guān)系。與基于ITS序列的進(jìn)化分析結(jié)果相結(jié)合，可以更全面地了解施氏貝蛔蟲(chóng)在蛔蟲(chóng)家族中的進(jìn)化地位。在寄生蟲(chóng)的進(jìn)化研究中，不同的標(biāo)記基因具有不同的特點(diǎn)和應(yīng)用價(jià)值。18S序列的保守性使其在揭示蛔蟲(chóng)的基本進(jìn)化關(guān)系方面具有重要作用，而ITS序列的高變異性則更適合用于種間和種內(nèi)的遺傳差異分析。本研究也存在一定的局限性。在樣本采集方面，雖然選取了佛坪自然保護(hù)區(qū)內(nèi)不同海拔、不同植被類(lèi)型的區(qū)域，但樣本數(shù)量仍相對(duì)有限。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步擴(kuò)大樣本采集范圍和數(shù)量，以更全面地了解佛坪自然保護(hù)區(qū)大熊貓蛔蟲(chóng)感染情況和蛔蟲(chóng)的遺傳多樣性。在研究方法上，本研究主要采用了形態(tài)學(xué)鑒定和基于標(biāo)記基因的分子生物學(xué)分析方法。隨著科技的不斷發(fā)展，未來(lái)可以結(jié)合全基因組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組分析等新技術(shù)，深入研究蛔蟲(chóng)的基因功能、代謝途徑以及與宿主的相互作用機(jī)制。在研究?jī)?nèi)容上，本研究主要關(guān)注了蛔蟲(chóng)的感染情況和進(jìn)化分析。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步探討蛔蟲(chóng)感染對(duì)大熊貓免疫系統(tǒng)、生理機(jī)能等方面的影響，以及環(huán)境因素對(duì)蛔蟲(chóng)感染和傳播的影響。通過(guò)多方面的深入研究，為大熊貓蛔蟲(chóng)病的防控提供更全面、更有效的理論支持。2.5小結(jié)本部分通過(guò)對(duì)佛坪自然保護(hù)區(qū)大熊貓糞便樣本中蛔蟲(chóng)卵的收集、DNA提取、PCR擴(kuò)增、測(cè)序及序列分析等一系列實(shí)驗(yàn)，成功鑒定出施氏貝蛔蟲(chóng)。蟲(chóng)卵形態(tài)觀察結(jié)果與以往研究中施氏貝蛔蟲(chóng)卵的特征高度吻合，證實(shí)了樣本中蛔蟲(chóng)的種類(lèi)。通過(guò)對(duì)ITS-1、ITS2、5.8S和18S等序列的同源性比較及進(jìn)化分析，揭示了施氏貝蛔蟲(chóng)在遺傳上與其他蛔蟲(chóng)的差異，明確了其在蛔蟲(chóng)家族中的獨(dú)特進(jìn)化地位。本研究結(jié)果為深入了解施氏貝蛔蟲(chóng)的生物學(xué)特性、遺傳多樣性和進(jìn)化關(guān)系提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為大熊貓蛔蟲(chóng)病的診斷、防控以及進(jìn)一步的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。三、佛坪自然保護(hù)區(qū)大熊貓施氏貝蛔蟲(chóng)流行規(guī)律及影響因素3.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)3.1.1試驗(yàn)材料本研究用于流行規(guī)律研究的材料主要為在佛坪自然保護(hù)區(qū)內(nèi)采集的大熊貓糞便樣本。在2023年3月至2023年10月期間，研究團(tuán)隊(duì)在佛坪自然保護(hù)區(qū)內(nèi)不同海拔、不同植被類(lèi)型的區(qū)域進(jìn)行了糞便樣本的采集。這些區(qū)域包括岳壩、大古坪、三官?gòu)R等核心區(qū)域，以及周邊的一些緩沖區(qū)和實(shí)驗(yàn)區(qū)。采集時(shí)，研究人員依據(jù)大熊貓的活動(dòng)痕跡，如采食痕跡、臥跡等，仔細(xì)尋找新鮮的糞便樣本。使用無(wú)菌的采樣袋和鑷子進(jìn)行采集，以避免糞便樣本受到污染。最終，共采集到糞便樣本100份，每份糞便樣本的重量在50-100克之間。采集后，迅速將糞便樣本放入裝有冰袋的保溫箱中，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。在實(shí)驗(yàn)室中，將糞便樣本暫時(shí)保存在4℃的冰箱中，待后續(xù)試驗(yàn)使用。除了糞便樣本，還用到了一些試驗(yàn)試劑，如飽和鹽水，用于飽和鹽水浮聚法收集蟲(chóng)卵。在進(jìn)行蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)時(shí)，使用了顯微鏡、載玻片、蓋玻片、生理鹽水等材料。這些試劑和材料的準(zhǔn)備，為后續(xù)研究大熊貓施氏貝蛔蟲(chóng)的流行規(guī)律提供了基礎(chǔ)條件。3.1.2試驗(yàn)方法采用飽和鹽水浮聚法來(lái)調(diào)查大熊貓蛔蟲(chóng)的感染率和感染強(qiáng)度。先將糞便樣本放入潔凈的燒杯中，按照糞便與飽和鹽水1:10的比例加入飽和鹽水。用玻璃棒充分?jǐn)嚢瑁辜S便與飽和鹽水充分混合，形成均勻的混懸液。接著，將混懸液通過(guò)雙層紗布過(guò)濾到另一潔凈的燒杯中，以去除較大的雜質(zhì)。將過(guò)濾后的混懸液倒入離心管中，以2000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min。離心后，用吸管吸取離心管上層的漂浮液，轉(zhuǎn)移至另一潔凈的離心管中。在新的離心管中加入適量的蒸餾水，使蟲(chóng)卵沉淀，再以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min。棄去上清液，重復(fù)用蒸餾水洗滌蟲(chóng)卵2-3次，以去除殘留的飽和鹽水。最后，將收集到的蟲(chóng)卵制成涂片，在顯微鏡下進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。在計(jì)數(shù)時(shí)，使用改良加藤法。取適量處理后的蟲(chóng)卵混懸液，滴在載玻片上，蓋上蓋玻片。在顯微鏡下，先用低倍鏡（10×10）進(jìn)行觀察，找到疑似蛔蟲(chóng)卵的物體后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡（10×40）進(jìn)行仔細(xì)觀察，根據(jù)施氏貝蛔蟲(chóng)卵的形態(tài)特征，如黃色至黃褐色、橢圓形或長(zhǎng)橢圓形、兩極鈍圓、具有3層膜且最外層蛋白質(zhì)外殼布滿(mǎn)棘狀突起等，對(duì)蟲(chóng)卵進(jìn)行鑒定和計(jì)數(shù)。每個(gè)樣本重復(fù)計(jì)數(shù)3次，取平均值作為該樣本的蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)結(jié)果。感染率的計(jì)算方法為：感染率（%）=（感染蛔蟲(chóng)卵的樣本數(shù)÷總樣本數(shù)）×100。感染強(qiáng)度則通過(guò)每克糞便中的蟲(chóng)卵數(shù)（EPG）來(lái)表示。對(duì)于數(shù)據(jù)處理，使用Excel軟件對(duì)采集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)算感染率、感染強(qiáng)度的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差等統(tǒng)計(jì)參數(shù)。采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，運(yùn)用卡方檢驗(yàn)分析不同年齡、性別、棲息地等因素與蛔蟲(chóng)感染率之間的相關(guān)性。以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)這些數(shù)據(jù)處理方法，深入分析佛坪自然保護(hù)區(qū)大熊貓施氏貝蛔蟲(chóng)的流行規(guī)律及影響因素。3.2結(jié)果分析3.2.1流行動(dòng)態(tài)在2023年3月至10月期間，對(duì)佛坪自然保護(hù)區(qū)內(nèi)采集的100份大熊貓糞便樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，總體感染率為75%。其中，3-5月（春季）采集樣本30份，感染樣本22份，感染率為73.33%；6-8月（夏季）采集樣本40份，感染樣本32份，感染率為80%；9-10月（秋季）采集樣本30份，感染樣本21份，感染率為70%。從不同年份的歷史數(shù)據(jù)來(lái)看，雖然本研究?jī)H涉及2023年，但過(guò)往研究表明，該區(qū)域大熊貓蛔蟲(chóng)感染率一直維持在較高水平。如薛克明等在1982-1986年對(duì)佛坪地區(qū)的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，野外大熊貓糞便蛔蟲(chóng)卵的感染率為100%。這可能與施氏貝蛔蟲(chóng)卵對(duì)外界環(huán)境的抵抗力強(qiáng)有關(guān)，蟲(chóng)卵在環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間積累，導(dǎo)致感染風(fēng)險(xiǎn)持續(xù)存在。不同季節(jié)的感染率存在一定波動(dòng)，夏季感染率相對(duì)較高。這可能是因?yàn)橄募練鉁剌^高，降水充沛，有利于蛔蟲(chóng)卵的發(fā)育和孵化。在適宜的溫度和濕度條件下，蟲(chóng)卵能夠更快地發(fā)育為感染性幼蟲(chóng)，增加了大熊貓感染的機(jī)會(huì)。3.2.2溫度對(duì)感染強(qiáng)度和感染率的影響通過(guò)對(duì)不同溫度條件下采集的糞便樣本分析，發(fā)現(xiàn)溫度與感染強(qiáng)度和感染率之間存在一定的相關(guān)性。當(dāng)平均氣溫在18-25℃時(shí)，感染強(qiáng)度（EPG）平均值為350.5，感染率為78%；當(dāng)平均氣溫低于18℃時(shí)，感染強(qiáng)度平均值為280.3，感染率為70%；當(dāng)平均氣溫高于25℃時(shí)，感染強(qiáng)度平均值為380.2，感染率為82%。這表明隨著溫度的升高，感染強(qiáng)度和感染率有上升的趨勢(shì)。施氏貝蛔蟲(chóng)卵在22-28℃時(shí)發(fā)育較為合適，當(dāng)外界環(huán)境溫度在這個(gè)范圍附近升高時(shí)，蟲(chóng)卵發(fā)育速度加快，感染性幼蟲(chóng)數(shù)量增加，從而導(dǎo)致大熊貓更容易感染，且感染強(qiáng)度可能增強(qiáng)。但當(dāng)溫度過(guò)高或過(guò)低時(shí)，都會(huì)對(duì)蟲(chóng)卵的發(fā)育和存活產(chǎn)生不利影響。過(guò)高的溫度可能導(dǎo)致蟲(chóng)卵蛋白質(zhì)變性，影響其發(fā)育；過(guò)低的溫度則會(huì)使蟲(chóng)卵發(fā)育緩慢甚至停止發(fā)育。在低于7℃時(shí)，蟲(chóng)卵就會(huì)停止發(fā)育。3.2.3露點(diǎn)與感染強(qiáng)度相關(guān)分析對(duì)露點(diǎn)與感染強(qiáng)度進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，露點(diǎn)與感染強(qiáng)度之間存在正相關(guān)關(guān)系（r=0.65，P<0.05）。隨著露點(diǎn)的升高，感染強(qiáng)度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。露點(diǎn)反映了空氣中水汽的含量，露點(diǎn)越高，說(shuō)明空氣中水汽越充足，環(huán)境相對(duì)濕度越大。在高濕度的環(huán)境下，蛔蟲(chóng)卵的存活時(shí)間延長(zhǎng)，且有利于其孵化和幼蟲(chóng)的生存。濕潤(rùn)的環(huán)境可以保持蛔蟲(chóng)卵的水分，防止其干燥死亡，同時(shí)也為幼蟲(chóng)的活動(dòng)提供了適宜的條件。當(dāng)露點(diǎn)較高時(shí)，感染強(qiáng)度會(huì)增加，這提示我們?cè)诟邼穸鹊募竟?jié)或區(qū)域，需要更加關(guān)注大熊貓蛔蟲(chóng)感染的防控。3.2.4海拔與感染強(qiáng)度相關(guān)分析研究發(fā)現(xiàn)，海拔與感染強(qiáng)度之間存在一定的負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.58，P<0.05）。隨著海拔的升高，感染強(qiáng)度逐漸降低。在海拔1200-1500米的區(qū)域，感染強(qiáng)度（EPG）平均值為380.5；在海拔1500-1800米的區(qū)域，感染強(qiáng)度平均值為320.3；在海拔1800米以上的區(qū)域，感染強(qiáng)度平均值為260.2。這可能是由于海拔升高，氣溫降低，環(huán)境條件發(fā)生變化，不利于蛔蟲(chóng)卵的發(fā)育和存活。高海拔地區(qū)氣溫較低，可能會(huì)抑制蛔蟲(chóng)卵的孵化和幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)，從而降低了大熊貓的感染強(qiáng)度。海拔較高的地區(qū)大熊貓的活動(dòng)范圍相對(duì)較小，與感染源的接觸機(jī)會(huì)也可能減少。3.2.5鄰近河流距離與感染強(qiáng)度的相關(guān)分析鄰近河流距離與感染強(qiáng)度的相關(guān)分析結(jié)果顯示，兩者之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.62，P<0.05）。距離河流越近，感染強(qiáng)度越高。在距離河流0-500米的區(qū)域，感染強(qiáng)度（EPG）平均值為360.4；在距離河流500-1000米的區(qū)域，感染強(qiáng)度平均值為300.2；在距離河流1000米以上的區(qū)域，感染強(qiáng)度平均值為250.1。這可能是因?yàn)楹恿鞲浇沫h(huán)境相對(duì)濕潤(rùn)，食物資源豐富，大熊貓?jiān)谶@些區(qū)域的活動(dòng)較為頻繁。而頻繁的活動(dòng)增加了大熊貓接觸感染源的機(jī)會(huì)，河流附近的水源可能受到蛔蟲(chóng)卵的污染，大熊貓?jiān)陲嬎畷r(shí)容易感染蛔蟲(chóng)。河流周邊的環(huán)境條件可能更有利于蛔蟲(chóng)卵的傳播和擴(kuò)散。3.2.6多因素相關(guān)分析及回歸方程的建立采用多因素相關(guān)分析方法，綜合考慮溫度、露點(diǎn)、海拔、鄰近河流距離等因素對(duì)感染強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，這些因素共同作用對(duì)感染強(qiáng)度有顯著影響（P<0.01）。通過(guò)逐步回歸分析，建立了感染強(qiáng)度（EPG）與各因素之間的回歸方程：EPG=50.2+10.5×溫度+8.3×露點(diǎn)-6.5×海拔-7.2×鄰近河流距離。該回歸方程可以在一定程度上預(yù)測(cè)佛坪自然保護(hù)區(qū)大熊貓施氏貝蛔蟲(chóng)的感染強(qiáng)度。溫度每升高1℃，感染強(qiáng)度可能增加10.5；露點(diǎn)每增加1個(gè)單位，感染強(qiáng)度可能增加8.3；海拔每升高100米，感染強(qiáng)度可能降低6.5；鄰近河流距離每增加100米，感染強(qiáng)度可能降低7.2。但需要注意的是，該回歸方程是基于本研究的數(shù)據(jù)建立的，實(shí)際應(yīng)用中還需要考慮其他未納入的因素，如大熊貓的年齡、性別、個(gè)體免疫力等。3.3討論本研究對(duì)佛坪自然保護(hù)區(qū)大熊貓施氏貝蛔蟲(chóng)的流行規(guī)律及影響因素進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示該區(qū)域大熊貓蛔蟲(chóng)感染率較高，總體感染率為75%，與過(guò)往研究中該地區(qū)及其他地區(qū)大熊貓蛔蟲(chóng)感染率維持在較高水平的情況相符。施氏貝蛔蟲(chóng)卵對(duì)外界環(huán)境抵抗力強(qiáng)，在環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間積累，使得大熊貓感染風(fēng)險(xiǎn)持續(xù)存在。這表明蛔蟲(chóng)感染問(wèn)題在佛坪自然保護(hù)區(qū)大熊貓種群中依然嚴(yán)峻，需要持續(xù)關(guān)注和采取有效的防控措施。從流行動(dòng)態(tài)來(lái)看，不同季節(jié)的感染率存在一定波動(dòng)，夏季感染率相對(duì)較高。這主要是因?yàn)橄募镜臍夂驐l件，如較高的氣溫和充沛的降水，為蛔蟲(chóng)卵的發(fā)育和孵化提供了適宜的環(huán)境。在適宜的溫度和濕度下，蛔蟲(chóng)卵能夠更快地發(fā)育為感染性幼蟲(chóng)，從而增加了大熊貓感染的機(jī)會(huì)。這提示我們?cè)谙募緫?yīng)加強(qiáng)對(duì)大熊貓蛔蟲(chóng)感染的監(jiān)測(cè)和防控工作?？稍黾訉?duì)大熊貓糞便樣本的檢測(cè)頻率，及時(shí)發(fā)現(xiàn)感染情況。加強(qiáng)對(duì)大熊貓棲息地的管理，清理可能存在的蛔蟲(chóng)卵污染區(qū)域，減少大熊貓接觸感染源的機(jī)會(huì)。溫度、露點(diǎn)、海拔和鄰近河流距離等因素對(duì)感染強(qiáng)度均有顯著影響。溫度與感染強(qiáng)度和感染率呈正相關(guān)，這與施氏貝蛔蟲(chóng)卵在22-28℃發(fā)育較為合適的特性相符。當(dāng)溫度升高接近這個(gè)適宜范圍時(shí)，蟲(chóng)卵發(fā)育速度加快，感染性幼蟲(chóng)數(shù)量增加，導(dǎo)致大熊貓更容易感染且感染強(qiáng)度可能增強(qiáng)。露點(diǎn)與感染強(qiáng)度的正相關(guān)關(guān)系表明，高濕度環(huán)境有利于蛔蟲(chóng)卵的存活、孵化和幼蟲(chóng)的生存。海拔與感染強(qiáng)度的負(fù)相關(guān)關(guān)系可能是由于海拔升高，氣溫降低，不利于蛔蟲(chóng)卵的發(fā)育和存活，同時(shí)大熊貓?jiān)诟吆０蔚貐^(qū)活動(dòng)范圍相對(duì)較小，與感染源接觸機(jī)會(huì)減少。鄰近河流距離與感染強(qiáng)度的負(fù)相關(guān)關(guān)系則可能是因?yàn)楹恿鞲浇h(huán)境濕潤(rùn)，食物資源豐富，大熊貓活動(dòng)頻繁，增加了接觸感染源的機(jī)會(huì)，且河流附近水源可能受到蛔蟲(chóng)卵污染?；谶@些影響因素建立的回歸方程EPG=50.2+10.5×溫度+8.3×露點(diǎn)-6.5×海拔-7.2×鄰近河流距離，雖然可以在一定程度上預(yù)測(cè)佛坪自然保護(hù)區(qū)大熊貓施氏貝蛔蟲(chóng)的感染強(qiáng)度，但實(shí)際應(yīng)用中還存在局限性。該方程是基于本研究的數(shù)據(jù)建立的，而實(shí)際情況中，大熊貓蛔蟲(chóng)感染還可能受到其他因素的影響，如大熊貓的年齡、性別、個(gè)體免疫力、食物資源等。大熊貓年齡較小或免疫力較低時(shí)，可能更容易感染蛔蟲(chóng)且感染強(qiáng)度較大。不同性別的大熊貓?jiān)诨顒?dòng)范圍和行為習(xí)性上可能存在差異，也會(huì)影響其感染蛔蟲(chóng)的幾率。因此，在實(shí)際防控工作中，不能僅僅依賴(lài)該回歸方程，還需要綜合考慮其他因素。應(yīng)進(jìn)一步開(kāi)展研究，收集更多相關(guān)數(shù)據(jù)，完善影響因素模型，以提高對(duì)大熊貓蛔蟲(chóng)感染強(qiáng)度預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。在制定防控措施時(shí)，應(yīng)充分考慮各種因素，采取綜合性的防控策略。為有效防控佛坪自然保護(hù)區(qū)大熊貓施氏貝蛔蟲(chóng)感染，可采取以下措施。加強(qiáng)對(duì)大熊貓棲息地的環(huán)境管理，定期清理糞便，減少蛔蟲(chóng)卵在環(huán)境中的積累。在大熊貓經(jīng)?；顒?dòng)的區(qū)域，設(shè)置專(zhuān)門(mén)的糞便收集點(diǎn)，定期進(jìn)行清理和消毒。可以采用高溫堆肥等方法處理糞便，殺滅其中的蛔蟲(chóng)卵。根據(jù)蛔蟲(chóng)感染的季節(jié)變化和影響因素，在夏季和高濕度、低海拔、靠近河流等感染風(fēng)險(xiǎn)較高的區(qū)域，加強(qiáng)監(jiān)測(cè)和防控力度。增加對(duì)這些區(qū)域大熊貓糞便樣本的檢測(cè)次數(shù)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)感染情況并采取相應(yīng)措施。對(duì)感染的大熊貓進(jìn)行及時(shí)治療，可采用安全有效的驅(qū)蟲(chóng)藥物。定期對(duì)大熊貓進(jìn)行健康檢查，及時(shí)發(fā)現(xiàn)蛔蟲(chóng)感染癥狀，根據(jù)感染強(qiáng)度和大熊貓的身體狀況，合理選擇驅(qū)蟲(chóng)藥物和治療方案。加強(qiáng)對(duì)游客和當(dāng)?shù)鼐用竦男麄鹘逃岣咚麄儗?duì)大熊貓保護(hù)和蛔蟲(chóng)病防控的認(rèn)識(shí)，減少人類(lèi)活動(dòng)對(duì)大熊貓棲息地的干擾。通過(guò)舉辦講座、發(fā)放宣傳資料等方式，向游客和當(dāng)?shù)鼐用衿占按笮茇埍Ｗo(hù)知識(shí)和蛔蟲(chóng)病的傳播途徑、危害及防控方法，引導(dǎo)他們自覺(jué)保護(hù)大熊貓棲息地環(huán)境。3.4小結(jié)本部分通過(guò)對(duì)佛坪自然保護(hù)區(qū)大熊貓糞便樣本的檢測(cè)分析，明確了該區(qū)域大熊貓施氏貝蛔蟲(chóng)的流行規(guī)律及影響因素?？傮w感染率較高，達(dá)到75%，不同季節(jié)感染率存在波動(dòng)，夏季相對(duì)較高。溫度、露點(diǎn)、海拔和鄰近河流距離等因素對(duì)感染強(qiáng)度均有顯著影響，且建立了感染強(qiáng)度與這些因素的回歸方程。這些結(jié)果為佛坪自然保護(hù)區(qū)大熊貓施氏貝蛔蟲(chóng)病的防控提供了科學(xué)依據(jù)，有助于制定針對(duì)性的防控策略，降低大熊貓的感染風(fēng)險(xiǎn)，保護(hù)大熊貓種群的健康。四、結(jié)論與展望4.1研究總結(jié)本研究對(duì)佛坪自然保護(hù)區(qū)大熊貓蛔蟲(chóng)感染情況進(jìn)行了深入調(diào)查，并對(duì)蛔蟲(chóng)進(jìn)化展開(kāi)分析，取得了一系列重要成果。在蛔蟲(chóng)感染調(diào)查方面，通過(guò)對(duì)2023年3月至10月在佛坪自然保護(hù)區(qū)采集的100份大熊貓糞便樣本檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域大熊貓施氏貝蛔蟲(chóng)總體感染率高達(dá)75%，這表明蛔蟲(chóng)感染在該區(qū)域大熊貓種群中較為普遍，蛔蟲(chóng)病依然是威脅大熊貓健康的重要因素。從流行動(dòng)態(tài)來(lái)看，不同季節(jié)感染率存在波動(dòng)，夏季感染率相對(duì)較高，達(dá)到80%。這主要是因?yàn)橄募練鉁剌^高、降水充沛，為蛔蟲(chóng)卵的發(fā)育和孵化創(chuàng)造了適宜的環(huán)境，使得感染性幼蟲(chóng)數(shù)量增加，從而加大了大熊貓感染的幾率。研究還發(fā)現(xiàn)，溫度、露點(diǎn)、海拔和鄰近河流距離等因素對(duì)感染強(qiáng)度有著顯著影響。溫度與感染強(qiáng)度和感染率呈正相關(guān)，當(dāng)平均氣溫在22-28℃時(shí)，感染強(qiáng)度（EPG）平均值較高，這與施氏貝蛔蟲(chóng)卵在該溫度范圍內(nèi)發(fā)育較為合適的特性相符。露點(diǎn)與感染強(qiáng)度呈正相關(guān)，露點(diǎn)越高，空氣中水汽越充足，環(huán)境相對(duì)濕度越大，越有利于蛔蟲(chóng)卵的存活、孵化和幼蟲(chóng)的生存。海拔與感染強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)，隨著海拔升高，氣溫降低，不利于蛔蟲(chóng)卵的發(fā)育和存活，且大熊貓?jiān)诟吆０蔚貐^(qū)活動(dòng)范圍相對(duì)較小，與感染源接觸機(jī)會(huì)減少。鄰近河流距離與感染強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)，河流附近環(huán)境濕潤(rùn)，食物資源豐富，大熊貓活動(dòng)頻繁，增加了接觸感染源的機(jī)會(huì)，且河流附近水源可能受到蛔蟲(chóng)卵污染。通過(guò)多因素相關(guān)分析，建立了感染強(qiáng)度（EPG）與溫度、露點(diǎn)、海拔、鄰近河流距離的回歸方程：EPG=50.2+10.5×溫度+8.3×露點(diǎn)-6.5×海拔-7.2×鄰近河流距離，該方程可在一定程度上預(yù)測(cè)佛坪自然保護(hù)區(qū)大熊貓施氏貝蛔蟲(chóng)的感染強(qiáng)度。在蛔蟲(chóng)進(jìn)化分析方面，通過(guò)對(duì)施氏貝蛔蟲(chóng)蟲(chóng)卵形態(tài)觀察，準(zhǔn)確鑒定出施氏貝蛔蟲(chóng)，其蟲(chóng)卵形態(tài)特征與已有研究高度一致?；诤颂求wDNA（rDNA）中的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）分析，揭示了施氏貝蛔蟲(chóng)的遺傳多樣性和進(jìn)化關(guān)系。在同源性比較中，施氏貝蛔蟲(chóng)與豬蛔蟲(chóng)、牛新蛔蟲(chóng)、馬副蛔蟲(chóng)、犬弓首蛔蟲(chóng)等在ITS-1、ITS2和5.8S序列上均存在明顯差異，表明施氏貝蛔蟲(chóng)在遺傳上具有獨(dú)特性。在系統(tǒng)發(fā)育分析中，施氏貝蛔蟲(chóng)單獨(dú)聚為一支，與其他蛔蟲(chóng)分支明顯分開(kāi)，明確了其在