III

DB42/T2227.1—2024

引言

隨著食用菌產(chǎn)業(yè)在湖北省穩(wěn)步發(fā)展，需規(guī)范化、標準化引導食用菌菌種生產(chǎn)，從源頭上保障食用菌

產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，保障企業(yè)及菇農(nóng)實現(xiàn)較大經(jīng)濟效益，滿足食用菌消費市場要求。該文件制定的目的是規(guī)

范食用菌菌種質量檢驗規(guī)程，整體提升我省食用菌菌種質量。該文件不同部分的劃分，主要依據(jù)為食用

菌品種的不同，亦便于該文件各部分單獨使用。DB42/T2227《食用菌菌種質量檢驗規(guī)范》擬由以下部

分構成。

——第1部分：羊肚菌。本文件規(guī)定了羊肚菌菌種的質量要求、抽樣、檢驗、留樣、判定及標

簽、標志、包裝、運輸、貯存等。本文件僅適用于梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌和七妹羊肚菌等

可人工栽培的羊肚菌菌種的生產(chǎn)、流通和使用。

——第2部分：荷葉離褶傘。本文件規(guī)定了荷葉離褶傘菌種的質量要求、抽樣、檢驗、留樣判定

及標簽、標志、包裝、運輸、貯存等。本文件適用于荷葉離褶傘菌種的生產(chǎn)、流通和使用。

——第3部分：斑玉蕈。本文件規(guī)定了斑玉蕈菌種的術語和定義、質量要求、抽樣、檢驗、留

樣、判定及標簽、標志、包裝、運輸、貯存等。本文件適用于斑玉蕈菌種的生產(chǎn)、流通和使

用。

V

DB42/T2227.1—2024

食用菌菌種質量檢驗規(guī)范

第1部分：羊肚菌

1范圍

本文件規(guī)定了羊肚菌（Morchellaspp.）菌種的質量要求、抽樣、檢驗、留樣、判定及標簽、標志、

包裝、運輸、貯存等。

本文件適用于梯棱羊肚菌（M.importuna）、六妹羊肚菌（M.sextelata）和七妹羊肚菌（M.eximia）

等可人工栽培的羊肚菌菌種的生產(chǎn)、流通和使用。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T191包裝儲運圖示標志

GB5749生活飲用水衛(wèi)生標準

GB/T12728—2006食用菌術語

GB/T37671—2019金針菇菌種

NY/T528—2010食用菌菌種生產(chǎn)技術規(guī)程

NY/T1742—2009食用菌菌種通用技術要求

3術語和定義

GB/T12728—2006、GB/T37671—2019界定的以及下列術語和定義適用于本文件。

羊肚菌Morchellaspp.

又名：麻子菌、羊肚菜、羊肚蘑、陽雀菌、羊蜂窩蛾子等，隸屬于真菌界、子囊菌門、盤菌綱、盤

菌目、羊肚菌科、羊肚菌屬。子囊果圓錐形至寬圓錐形，偶見卵圓形，幼嫩時蒼白色至深灰色，隨著成

熟逐漸變?yōu)樯罨易厣两鹾谏?。菌柄通常基部呈棒狀至近棒狀，表面光滑或偶見白色粉狀顆粒，基部

在成熟過程中逐漸發(fā)育有縱向的脊和腔室，菌柄白色至淺棕色，菌肉白色至浸狀棕色，中空。子囊孢子

橢圓、光滑、同質。

菌核sclerotium

由羊肚菌營養(yǎng)菌絲聚集而成的顆粒狀（或塊狀）黃褐色休眠組織。

種性characterofvariety

食用菌的品種特性。一般包括生理特性、農(nóng)藝性狀和商品性狀。

[來源：GB/T12728—2006，2.5.4]

液體菌種liquidspawn

培養(yǎng)基為液體狀態(tài)的菌種。

1

DB42/T2227.1—2024

[來源：GB/T12728—2006，2.5.30]

搖瓶液體菌種liquidspawnculturingbyerlenmeyerflaskonashaker

由母種移植到瓶裝液體培養(yǎng)基中在搖床上恒溫振蕩擴大培養(yǎng)而成的菌絲體純培養(yǎng)物。

[來源：GB/T37671—2019，3.13]

發(fā)酵罐液體菌種liquidspawnculturingbyfermentationtank

由搖瓶液體菌種移植到發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)而成的菌絲體純培養(yǎng)物。

[來源：GB/T37671—2019，3.14]

通氣量ventilationvolume

液體菌種培養(yǎng)過程中每分鐘通入培養(yǎng)基中的無菌空氣量。用L/min表示。

[來源：GB/T37671—2019，3.15，有修改]

4質量要求

菌種生產(chǎn)用水

菌種生產(chǎn)用水應符合GB5749的規(guī)定。

菌種分類

根據(jù)來源、繁殖代數(shù)與生產(chǎn)目的，羊肚菌菌種分為母種、原種、栽培種；根據(jù)培養(yǎng)基質的形態(tài)，分

為固體菌種和液體菌種。

母種

4.3.1容器規(guī)格應符合NY/T528—2010中的規(guī)定。

4.3.2感官要求應符合表1規(guī)定。

表1母種感官要求

項目要求

菌絲生長量長滿斜面

菌絲體特征淺灰白至淺黃褐色，稀疏，生長旺健

菌絲體表面均勻，平整，表面允許有少量淺黃色（或黃褐色）米?；驂K狀菌核

菌種外觀

菌絲分泌物無

菌落邊緣整齊

雜菌菌落無

斜面背面外觀培養(yǎng)基不干縮，顏色均勻或接種塊部位顏色較深

氣味有羊肚菌菌種特有的清香味，無酸、臭、霉等異味

4.3.3接種量：接種塊大小控制在（3mm～5mm）×（3mm～5mm）。

4.3.4母種培養(yǎng)條件和時間：參考附錄A中A1培養(yǎng)基的配方，15℃～18℃避光恒溫培養(yǎng)，應在5

d～7d長滿斜面培養(yǎng)基表面。

4.3.5母種真實性鑒定：母種的真實性鑒定要求參照5.2.1和5.2.2。

4.3.6母種栽培性狀：母種需經(jīng)出菇試驗，確證種性合格后，方可用于擴大繁殖或出售。

2

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原種

4.4.1固體原種

容器規(guī)格應符合NY/T528—2010中的規(guī)定。

感官要求應符合表2規(guī)定。

表2固體原種感官要求

項目要求

菌絲生長量長滿容器

菌絲體特征生長均勻，稀疏，整齊，淺灰白至淺黃褐色

菌體（菌絲長滿基質）與容器菌體緊貼容器壁，無干縮

菌種外觀培養(yǎng)物表面分泌物無

雜菌菌落無

多數(shù)品種應有淺黃色（或黃褐色）米?；驂K狀菌核，少數(shù)品

菌核

種無菌核

氣味有羊肚菌菌種特有的清香味，無酸、臭、霉等異味

每支母種接原種數(shù)量和接種物大小：6瓶（袋）～8瓶（袋），≥12mm×15mm。

菌絲長滿培養(yǎng)基的時間：采用附錄A中規(guī)定的配方在15℃～18℃避光恒溫培養(yǎng)，菌絲長滿

750ml菌種瓶培養(yǎng)基的時間為14d～20d。

4.4.2液體原種（搖瓶液體菌種）

容器規(guī)格應符合GB/T37671—2019中的規(guī)定。

感官要求應符合表3規(guī)定。

培養(yǎng)基裝液量：容器的40%～60%。

母種接種塊大小和接種量：（5mm～10mm)×（5mm～10mm),4塊～8塊。

液體原種培養(yǎng)條件和時間：采用附錄A中規(guī)定的配方在振蕩頻率100r/min～120r/min的

搖床上，溫度15℃～18℃，避光培養(yǎng)，菌絲長滿培養(yǎng)基的時間為4d～6d。

4.4.3液體原種（發(fā)酵罐液體菌種）

容器規(guī)格應符合NY/T528—2010中的規(guī)定。

表3搖瓶液體菌種感官指標要求

項目要求

色澤菌絲體白色，濾液清澈透明

形態(tài)有大量球狀菌絲體，分布均勻

菌種外觀

雜菌無

氣味有羊肚菌菌種特有的清香味，無酸、臭、霉等異味

感官要求應符合表4規(guī)定。

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表4發(fā)酵罐液體菌種感官指標要求

項目要求

色澤菌絲體白色，濾液清澈透明

菌種外觀形態(tài)有大量球狀菌絲體，分布均勻

雜菌無

氣味有羊肚菌菌種特有的清香味，無酸、臭、霉等異味

培養(yǎng)基裝液量：容器的40%～60%。

液體菌種接種量：與培養(yǎng)基投料量的體積比為0.05%～0.1%。

發(fā)酵罐液體菌種培養(yǎng)條件和時間：采用附錄A中規(guī)定的配方，通氣量0.5L/min～1.2L/min、

罐壓保持在0.02MPa～0.04MPa之間，溫度15℃～18℃,菌絲長滿培養(yǎng)基的時間為4d～6d。

栽培種

4.5.1容器規(guī)格應符合NY/T528—2010中的規(guī)定。

4.5.2感官要求應符合表5規(guī)定。

表5栽培種感官要求

項目要求

菌絲生長量長滿容器

菌絲體特征生長均勻，稀疏，整齊，淺灰白至淺黃褐色

菌體（菌絲長滿基質）與容器菌體緊貼容器壁，無干縮

菌種外觀培養(yǎng)基表面分泌物無

雜菌菌落無

多數(shù)品種應有淺黃色（或黃褐色）米粒或塊狀菌核，少數(shù)品種無菌

菌核

核

氣味有羊肚菌菌種特有的清香味，無酸、臭、霉等異味。

4.5.3每瓶（袋）原種接栽培種數(shù)量：50瓶（袋）～300瓶（袋）。

4.5.4菌絲長滿培養(yǎng)基時間：采用附錄A中規(guī)定的配方在15℃～18℃避光恒溫培養(yǎng)，菌絲長滿培養(yǎng)基

的時間為20d～30d。

5抽樣、檢驗、留樣和判定

抽樣

5.1.1母種按品種、培養(yǎng)條件、接種時間分批編號，原種和栽培種按菌種來源、制種方法和接種時間

分批編號。按批隨機抽取被檢樣品。

5.1.2固體菌種的母種、原種和栽培種的抽樣量分別為該批菌種量的10%，5%，1%。但每批抽樣數(shù)量不

得少于10支（瓶、袋）；超過100支（瓶、袋）的，可進行兩級抽樣。液體菌種的搖瓶菌種的抽樣量

為每批1個～2個搖瓶，發(fā)酵罐菌種為每罐100mL～500mL。

檢驗

5.2.1ITS序列分析

測試菌株的ITS序列分別與梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌或七妹羊肚菌等羊肚菌的ITS序列進行比對，相

似性達97%以上為相應類別的種類。參考附錄B操作。

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5.2.2交配型基因檢測

在ITS序列檢測確定相關菌株為栽培羊肚菌相應種類的基礎上，參考附錄C操作，對測試菌株的DNA

產(chǎn)物分別使用羊肚菌交配型特異性引物對Mat1-1-1TF/R、MAT1-2-1TF/R進行PCR擴增，根據(jù)擴增條帶的

有無，兩對引物擴增條帶同時存在則判定該測試菌種具備完整的交配型基因，是有效菌種；否則視為某

一種交配型基因缺失菌株，不作為有效菌種。

5.2.3感官檢驗

感官檢驗按表6逐項進行。

表6感官要求檢驗方法

檢驗項目檢驗方法檢驗項目檢驗方法

母種、原種、栽培種肉眼觀察、測量、檢查生產(chǎn)記錄

容器肉眼觀察接種量

搖瓶液體菌種、發(fā)酵罐菌種檢查生產(chǎn)記錄

棉塞、硅膠賽、塑料蓋肉眼觀察菌種外觀各項（雜菌除外）肉眼觀察

母種培養(yǎng)基灌入量、液

測量雜菌肉眼觀察，或用放大鏡觀察

體培養(yǎng)基灌入量

母種斜面長度測量氣味鼻嗅

母種斜面背面外觀肉眼觀察//

5.2.4微生物學檢驗

菌絲體形態(tài)、螨蟲檢驗：檢測方法應符合GB/T37671—2019中5.1.4的規(guī)定。

細菌檢驗：檢測方法應符合GB/T37671—2019中5.1.2的規(guī)定。

霉菌檢驗：檢測方法應符合GB/T37671—2019中5.1.3的規(guī)定。

5.2.5菌種培養(yǎng)條件和時間

母種：PDA培養(yǎng)基，參考附錄A中的配方在15℃～18℃條件下培養(yǎng)，觀測菌絲長滿斜面所需

天數(shù)。

原種和栽培種:參考附錄A中的配方任選其一在15℃～18℃培養(yǎng)，觀測菌絲長滿培養(yǎng)基所需

天數(shù)。

母種栽培農(nóng)藝性狀：將被檢母種制作成固體原種，參考附錄A中的配方，制成菌瓶(袋)。按

照常規(guī)方法整地做畦、播種、補營養(yǎng)袋、催菇、出菇管理，根據(jù)表7所列項目，做好栽培記錄。

表7母種栽培農(nóng)藝性狀檢驗記錄

檢驗項目檢驗結果檢驗項目檢驗結果

母種長滿所需時間/d總產(chǎn)/kg

原種長滿所需時間/d平均單產(chǎn)/kg

菌絲長滿畦床土面所需時間/d平均單菇重量/g

菌絲長滿營養(yǎng)袋所需時間/d菇形、色澤、質地

播種至出現(xiàn)原基所需時間/d菌蓋平均直徑/cm

播種至采菇所需時間/d菌柄平均直徑、菌柄長度/cm

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留樣

固體菌種各級菌種應留樣備查，留樣的數(shù)量應每個批號3支（瓶、袋）～5支（瓶、袋），于0℃～

4℃貯存，貯存至使用者在正常生產(chǎn)條件下該批菌種出菇。

判定

判定規(guī)則按質量要求進行。檢驗項目全部符合要求時，為合格菌種，其中任何一項不符合要求，均

為不合格菌種。

6標簽、標志、包裝、運輸和貯存

標簽、標志

6.1.1產(chǎn)品標簽

每支（瓶、袋、罐）菌種應貼有清晰注明以下要素的標簽：

a)產(chǎn)品名稱（菌種類別、菌種名稱、菌株代號）；

b)生產(chǎn)單位；

c)接種日期；

d)執(zhí)行標準。

6.1.2包裝標簽

菌種包裝應貼有清晰注明以下要素的包裝標簽：

a)產(chǎn)品名稱（菌種類別、菌種名稱、菌株代號）；

b)品種適宜種植區(qū)域、種植季節(jié)；

c)執(zhí)行標準；

d)保質期、貯存條件；

e)菌種生產(chǎn)經(jīng)營許可證編號；

f)廠名、廠址、聯(lián)系電話；

g)出廠日期。

6.1.3包裝儲運圖示

按GB/T191的規(guī)定，應注明以下圖示標志：

a)小心輕放標志；

b)防水、防潮、防凍標志；

c)防曬、防高溫標志；

d)防止倒置標志；

e)防止重壓標志。

包裝

6.2.1母種外包裝采用木盒或有足夠強度的紙箱，內(nèi)填棉花、碎紙等緩沖物。

6.2.2原種、栽培種外包裝可采用潔凈、干燥的塑料箱、編織袋、泡沫箱或有足夠強度的紙箱。

運輸

6.3.1不應與有毒、有害、有異味的物品混裝混運。

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6.3.2運輸工具應清潔、衛(wèi)生、無污染物。

6.3.3氣溫達26℃以上時，應用2℃～6℃的冷藏車運輸。

6.3.4運輸中應有防震、防曬、防塵、防雨淋、防雜菌污染的措施。

貯存

6.4.1母種在3℃±1℃冰箱中貯存，貯存期不超過60d。

6.4.2固體原種和固體栽培種的貯存溫度和時間參考NY/T1742—2009中7.4.2的規(guī)定

6.4.3搖瓶液體菌種、發(fā)酵罐液體菌種均應及時使用，不貯存。

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附錄A

（資料性）

羊肚菌菌種培養(yǎng)基配方

表A.1給出了羊肚菌菌種培養(yǎng)基配方。

表A.1羊肚菌菌種培養(yǎng)基配方

配方名稱編號配方詳細內(nèi)容

馬鈴薯（去皮）200g，葡萄糖20g，瓊脂20.0g，硫酸鎂1g，磷酸二氫鉀1g，酵母膏2

A1

g，水1000mL。

母種培養(yǎng)基配方

A2馬鈴薯（去皮）200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000mL。

麥粒60.0%，雜木屑20.0%，玉米芯18%，石膏1.8%，石灰0.2%，含水量55.0%±2%，pH6.0～

A3

固體原種及栽培7.0。

種培養(yǎng)基配方麥粒65.0%，雜木屑23.0%，稻殼10%，石膏1.8%，石灰0.2%，含水量55.0%±2%，pH6.0～

A4

7.0。

黃豆粉0.3%～1%，蔗糖2%～3%，硫酸鎂0.03%～0.1%，磷酸二氫鉀0.03%～0.1%，其

A5

液體菌種培養(yǎng)基余水

配方玉米粉1%，黃豆粉2%，酵母粉0.5%，葡萄糖3%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，其

A6

余水。

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A

B

附錄B

（資料性）

羊肚菌菌種ITS序列分析法

B.1檢測流程

待測菌種→菌絲DNA提取→PCR擴增→序列測定→比對分析→結果判定。

B.2菌體培養(yǎng)

待測菌種固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0g，葡萄糖20.0g，硫酸鎂1.0g，磷酸二氫鉀1.0g，酵母膏

2.0g，瓊脂20.0g，補水至1L，pH自然，121°C高溫高壓滅菌25min，備用。滅菌培養(yǎng)基趁熱分裝至

平板中，冷卻，接種，16℃±2℃黑暗培養(yǎng)5d～10d備用。

B.3DNA提取和純化

CTAB（cetyltrimethylammoniumbromide）法：

a)刮取待測菌種菌絲體，裝于預先裝有少許石英砂的1.5mL離心管中，加入菌絲后再加入少許

石英砂；

b)加入600μL的2×CTAB裂解液:先加入300μL，研磨后再加入300μL。用研磨棒將混合物充

分研磨至均勻的勻漿物。置65°C水浴鍋中水浴1h（其間每隔10min翻轉混勻一次）；

c)從水浴鍋中取出，4℃下12000rpm離心1min，取上清，加入等體積的的酚：氯仿：異戊醇

（體積比25:24:1），翻轉幾次，4℃下12000rpm離心10min。收集上層水相，轉移至新的

1.5mL離心管中。該步驟重復1-2次，直至兩相界面上無沉淀為止；

d)加入3μL1%的RNase水溶液，35°C溫育10min；

e)加入等體積的氯仿抽提一次，收集上層水相入新的離心管中，加入0.5-1倍體積的異丙醇，4°

C下12000rpm離心10min；

f)小心棄去上清液，將離心管壓在干凈的吸水紙上，吸干殘留的上清液；

g)沿離心管內(nèi)壁自上而下緩慢加入1ml75%的冷乙醇，盡量將管壁上的沉淀洗入管底，動作要輕

柔，12000rpm離心2min，棄上清，重復一次；

h)置室溫或真空干燥器中干燥。干燥后加入100μLTE緩沖液溶解，-20°C保存?zhèn)溆茫?/p>

i)取4.5μL和0.5μL的10×LoadingBuffer溶液，于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

B.4PCR擴增

采用真菌核糖體基因間隔區(qū)（ITS）通用引物(ITS1：ATCCGTAGGTGAACCTGCGG/ITS4：

TCCTCCGCTTATTGATATGC)對提取的基因組DNA進行PCR擴增，獲取待測菌種的ITS序列。

反應體系：10×PCRbuffer5μL，10mMdNTPmix4μL；Taq酶0.5μL；引物對引物各1μL；DNA

模板1μL；無菌超純水補足至50μL。

反應條件：94℃4min；94℃30s→54℃30s→72℃1min，35個循環(huán)；72℃10min；4℃5

min。

B.5序列測定

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后,使用DNA純化回收試劑盒回收600bp大小的片段，與

T-載體(TakarapMD-19T)連接后，轉入大腸桿菌E.coliDH5ɑ感受態(tài)細胞中，然后在含有Amp，IPTG,X-

Gal的LB平板上進行藍白斑篩選，并進行菌落PCR篩選出陽性克隆，陽性克隆送至相關基因測序單位采

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用通用測序引物（RV-M：GAGCGGATAACAATTTCACACAGG/M13-47：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC）進行雙

向測序。

B.6序列分析

測序所得的序列通過拼接，去掉載體本身的序列后在NCBI（/BLAST）數(shù)據(jù)庫

網(wǎng)站進行比對，待測菌種與數(shù)據(jù)庫中某菌的序列同源性達到97%以上時，判斷待測菌種與該已知菌歸屬

同一個屬。當待測菌株ITS序列與梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌或七妹羊肚菌對照標準種的ITS序列的相似性

≥97%時，該測定菌株就是梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌或七妹羊肚菌等羊肚菌菌種。

梯棱羊肚菌對照標準種ITS序列的GeneBank登錄號為MH545493.1，其堿基序列是：

ATCATTACCAAGAACCACACAGAAAAGGGCAGCCGAGGGGCCACCAGGGCTAGTAGCTTTACGTTGTTGAACGTCCTGGCCGGAC

CCGGAGCCGCCCCCATCTAAACCCTCTGCGTACCTGTCCCGCCTTGCTTCCCCCGGCTACCCGCTGGGGGGAGGAACAACAACCAAAAC

TCTTTGTGAACAAGCCGACGTCAGAATCATAACAAAACAAAAAAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCCACATCGATGAA

GAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCC

GGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATAAAAACCTCCTCCCCCATCGGGTTTGATTACTATCGTTGGGGGGTTTTGGCCTAATGGGATAG

CGATTGGCAATTAGTTTCCCAATGTCCTAAATAGACGTAGACCCGCCTCCAGATGCGACAGCACCGAGGCCATCAACCGTGGAGTTATG

GGATATATAGGCTTGCAGTAAAATGCTCACCTTTCTCCATACGCCGATGGCACACCGGTCGCAGTTGCGGGCGTAAATTGGAGCCCTTT

TTTCAGGACCCTCGTGGCCTAGCATCCACCATACACAATTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAA。

六妹羊肚菌對照標準種ITS序列的GeneBank登錄號為OM956369.1，其堿基序列是：

CCTCCCGATGAGGGGGGCCTGCGGAAGGATCATTACCAAGAACCACACAGAAAAGGGCTGCTATAGGGGCCGGCAGGGCTAGTAG

CTTTACGTTGTTGAACGTCCTGTTTGGACCCGTTGGCAGCCCCCATCTAAACCCTCTGCGTACCTGTCCCCCCTTGCTTCCCCCGGCAC

CTCGCTGGGGGGAGGAACAACAACCAAAACTCTTTGTGAACAAACAGACGTCAGAATTACAAAAACAAAAAAAAGTTAAAACTTTCAAC

AACGGATCTCTTGGTTCCCACATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCT

TT