Q/LB.□XXXXX-XXXX目次TOC\o"1-1"\h前言 II1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14原理 15試劑和材料 16儀器設(shè)備 27分析步驟 28計算結(jié)果 49精密度 410檢出限和定量限 5前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由江蘇大學(xué)提出。本文件由江蘇省質(zhì)量協(xié)會歸口。本文件起草單位：江蘇大學(xué)、南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院（南京市質(zhì)量發(fā)展與先進(jìn)技術(shù)應(yīng)用研究院）、南京大學(xué)。本文件主要起草人：王飛軒、歐陽臻、徐衛(wèi)東、萬晶瓊、陳佳俊、朱南、林東翔。高脂肪農(nóng)產(chǎn)品中丙二醛、4-羥基-壬烯醛和4-羥基-己烯醛含量的測定超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法范圍本文件規(guī)定了高脂肪農(nóng)產(chǎn)品中丙二醛、4-羥基-壬烯醛和4-羥基-己烯醛含量的測定的原理、試劑和材料、儀器設(shè)備、分析步驟、結(jié)果計算、精密度、檢出限和定量限。本文件適用于動植物油脂、堅果等高脂肪農(nóng)產(chǎn)品中丙二醛、4-羥基-壬烯醛和4-羥基-己烯醛含量的測定。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗室用水規(guī)格和試驗方法術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。原理試樣先用50%乙醇提取，再將提取液與2,4-二硝基苯肼（DNPH）作用生成黃色腙類衍生物，采用超高效液相色譜-QTRAP三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用對丙二醛（MDA）、4-羥基-壬烯醛（4-HNE）和4-羥基-己烯醛（4-HHE）同時測定，外標(biāo)法定量。試劑和材料5.1水：GB/T6682，一級。5.2甲醇（CH3OH）：色譜純。5.3乙醇（CH3CH2OH）：色譜純。5.4乙腈（CH3CN）：色譜純。5.5甲酸（CH3COOH）：質(zhì)譜純。5.6鹽酸（HCl）：12mol/L。5.7石油醚（沸程30-60℃）：色譜純。5.8二氯甲烷（CH2Cl2）：色譜純。5.92,4-二硝基苯肼（DNPH）：色譜純。5.1010%甲醇溶液：量取10mL甲醇（5.2），加水稀釋，稀釋至100mL。5.1150%乙醇溶液：量取50mL乙醇（5.3），加水稀釋，稀釋至100mL。5.12鹽酸/乙醇溶液：量取10mL鹽酸溶液（5.6），加乙醇（5.3）稀釋，稀釋至100mL。5.132,4-二硝基苯肼（DNPH）溶液：用分析天平（6.2）準(zhǔn)確稱取0.9907g（精確至0.0001g）2,4-二硝基苯肼（5.9），用鹽酸/乙醇溶液溶解（5.12），定容至100mL。5.14丙二醛（MDA，C3H4O2，CAS號：542-78-9）：1000μg/mL，純度≥98%。5.154-羥基-壬烯醛（4-HNE，C9H16O2,CAS號：75899-68-2）：純度≥97%。5.164-羥基-己烯醛（4-HHE，C6H10O2,CAS號：17427-21-3）：純度≥98%。5.17MDA標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1000μg/mL）：移取1mL丙二醛（5.14），避光置于冰箱4℃儲存。有效期3個月。5.18MDA標(biāo)準(zhǔn)使用溶液（10μg/mL）：準(zhǔn)確移取0.10mLMDA（5.17）至100mL容量瓶中，用50%乙醇（5.11）稀釋至10mL，避光置于冰箱4℃儲存。有效期2周。5.194-HNE標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1000μg/mL）：準(zhǔn)確稱取0.0010g（精確至0.0001g）4-HNE（5.15）至1mL容量瓶中，用50%乙醇（5.11）溶解后稀釋至1mL，避光置于冰箱4℃儲存。有效期3個月。5.204-HNE標(biāo)準(zhǔn)使用溶液（10μg/mL）：準(zhǔn)確移取0.10mL4-HNE標(biāo)準(zhǔn)儲備液（5.19）至10mL容量瓶中，用50%乙醇（5.11）稀釋至10mL，避光置于冰箱4℃儲存。有效期2周。5.214-HHE標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1000μg/mL）：準(zhǔn)確稱取0.0010g（精確至0.0001g）4-HHE（5.16）至1mL容量瓶中，用50%乙醇（5.11）溶解后稀釋至1mL，避光置于冰箱4℃儲存。有效期3個月。5.224-HHE標(biāo)準(zhǔn)使用溶液（10μg/mL）：準(zhǔn)確移取0.10mL4-HHE標(biāo)準(zhǔn)儲備液（5.21）至10mL容量瓶中，用50%乙醇（5.11）稀釋至10mL，避光置于冰箱4℃儲存。有效期2周。5.23MDA、4-HNE、4-HHE混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：分別準(zhǔn)確移取MDA、4-HNE、4-HHE標(biāo)準(zhǔn)使用液0.0010mL、0.0050mL、0.010mL、0.050mL、0.10mL、0.15mL、0.25mL、0.50mL、1mL、2mL于10mL容量瓶中，加入50%乙醇（5.11）定容至刻度，該混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列濃度為0.001μg/mL、0.005μg/mL、0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.15μg/mL、0.25μg/mL、0.50μg/mL、1μg/mL、2μg/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。儀器設(shè)備6.1超高效液相色譜儀-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源(ESI)。6.2分析天平：感量為0.0001g和0.1g。6.3渦旋振蕩儀。6.4恒溫水浴鍋。6.5氮吹儀。6.6組織勻漿機(jī)。6.7離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于5000r/min。6.8有機(jī)相針式濾器：0.22μm有機(jī)尼龍濾膜。6.9C18固相萃取柱。6.10固相萃取裝置。分析步驟7.1樣品前處理7.1.1試樣提取a）動植物油脂：準(zhǔn)確稱取均勻的樣品2.00g（精確至0.01g），置于15mL離心管中，準(zhǔn)確加入5mL50%乙醇溶液，避光渦旋混勻5min，混合物以4000g離心5min，吸取上清液備用。b）堅果等固體：準(zhǔn)確稱取樣品50.00g（精確至0.01g）研磨粉碎，置于50mL離心管中，準(zhǔn)確加入15mL石油醚，避光渦旋2min，混合物放置在25℃恒溫?fù)u床上振搖提取1h，靜置10min后在5000r/min離心5min，吸取上清液至新的50mL離心管中，并用5mL石油醚沖洗試樣離心管內(nèi)壁和殘渣，5000r/min離心5min取上清液合并至新的50mL離心管中，氮吹儀吹干后準(zhǔn)確加入5mL50%乙醇溶液，避光渦旋混勻5min，混合物以4000g離心5min，吸取上清液備用。7.1.2試樣衍生化移取樣品（7.1.1）上清液和MDA、4-HNE、4-HHE標(biāo)準(zhǔn)系列溶液分別置于15mL離心管中，加入0.5mLDNPH溶液，避光渦旋混勻5min，置于60℃水浴內(nèi)避光反應(yīng)2h，取出，冷卻至室溫。7.1.3試樣萃取分離向衍生化的樣品（7.1.2）及標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中加入5mL二氯甲烷，渦旋混勻5min后，混合物以4000g離心5min，將二氯甲烷層物質(zhì)轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的15mL離心管中，用氮吹儀吹至近干，用100μL的10%甲醇溶液（5.10）復(fù)溶后以13000r/min離心10min，吸取上清液進(jìn)一步萃取。取C18固相萃取柱（6.9）純化衍生物，用甲醇分2次活化，每次100μL。取10%甲醇溶液平衡固相萃取柱，緩慢將10%甲醇溶液（5.10）溶解的樣品及標(biāo)準(zhǔn)系列溶液上清液裝載至固相萃取柱，10%甲醇溶液（5.10）淋洗去除雜質(zhì)，80%甲醇進(jìn)行洗脫，合并濾液備用。7.1.4去除溶劑并復(fù)溶氮吹儀吹干濾液后，用1mL含0.1%甲酸（5.5）的乙腈溶液復(fù)溶，渦旋3min后，混合物以13000r/m離心10min，取適量上清液過0.22μm濾膜，置于冰箱4℃儲存，待測。7.2超高效液相色譜條件超高效液相色譜儀（6.1）的色譜參考條件如下：色譜柱：ACQUITYUPLCHSST3柱，1.8μm，100mm×2.1mm（內(nèi)徑），或性能相當(dāng)者。流動相A：甲酸（5.5）+水（5.1）（濃度0.1%）；流動相B：甲酸（5.5）+乙腈（5.4）（濃度0.1%）；洗脫梯度應(yīng)符合表1的規(guī)定。柱溫：40℃。流速：0.4mL/min。進(jìn)樣量：1μL。檢測波長：254nm。注：由于測試設(shè)備的多樣性,色譜條件可依超高效液相色譜儀的型號作相應(yīng)調(diào)整。洗脫梯度條件時間min流動相A%流動相B%流速mL/min0.050500.41.050500.45.010900.46.010900.46.550500.410.050500.47.3三重四級桿質(zhì)譜條件三重四級桿質(zhì)譜儀（6.1）的質(zhì)譜參考條件如下：離子源/電離方式：電噴霧離子源（ESI）。掃描模式：多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。離子源溫度：450℃。輔助加熱氣壓強(qiáng)：55psi。氣簾氣壓強(qiáng)：40psi。霧化氣體：氮?dú)?。霧化氣壓強(qiáng)：55psi。質(zhì)譜測定參數(shù)見表2。注：對于不同質(zhì)譜儀器，儀器參數(shù)可能存在差異，測定前應(yīng)將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳。主要參考質(zhì)譜參數(shù)化合物保留時間min定性離子對（m/z）定量離子對（m/z）離子源噴霧電壓V碰撞氣電壓強(qiáng)度去簇電壓V入口電壓V碰撞池出口電壓VMDA衍生物1.78235/159.1、235/143.1235/159.15500中等601010HNE衍生物4.03335.1/182335.1/163335.1/163-4500中等-24-10-11HHE衍生物2.48293.1/182、293.1/163293.1/163-4500中等-20-10-117.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作按照7.2色譜條件和7.3質(zhì)譜條件,將混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（5.23）注入超高效液相色譜儀-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀（6.1）中進(jìn)行測試，測定相應(yīng)的峰面積，以混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（5.23）的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。7.5試樣的測定按照7.2色譜條件和7.3質(zhì)譜條件，將待測樣品（7.1.4）注入超高效液相色譜儀-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀（6.1）中進(jìn)行測試，待測樣品溶液中目標(biāo)物質(zhì)的響應(yīng)值應(yīng)在儀器線性相應(yīng)范圍內(nèi)，否則應(yīng)適當(dāng)稀釋?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作液（5.23）與待測樣品等體積進(jìn)樣。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)譜峰的保留時間和峰面積，對試樣溶液的質(zhì)譜峰根據(jù)保留時間和離子對進(jìn)行定性，外標(biāo)法定量。MDA、4-HNE、4-HHE衍生物混合標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖見圖1。標(biāo)引序號說明：1——MDA衍生物；2——HHE衍生物；3——HNE衍生物。圖1MDA、4-HNE、4-HHE衍生物混合標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖計算結(jié)果試樣中MDA、4-HNE、4-HHE的含量按式（1）計算：（1）式中：X——試樣中MDA或4-HNE或4-HHE含量，單位為納克每克（ng/g）；c——從標(biāo)準(zhǔn)系列曲線中得到的試樣溶液中MDA、4-HNE或4-HHE的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；V——試樣溶液定容體積，單位為毫升（mL）；m——最終試樣溶液所代表的試樣