皮膚科醫(yī)師晉升副主任醫(yī)師高職稱病例分析專題報告盧西坦棒孢和暗褐毛殼菌所致少見皮膚感染病例分析患者為來自四川的一名1歲半男孩。6天前，患者因瘙癢抓破了左側(cè)下眼瞼近內(nèi)眥處皮膚。1天后局部出現(xiàn)紅腫，患兒就診于眼科，考慮蜂窩組織炎和急性結(jié)膜炎。給予妥布霉素眼液滴眼（每天四次）、莫匹羅星軟膏外涂，并肌注青霉素80萬單位/天（共3天）。然而，患者皮損炎癥進一步加重，腫脹和分泌物更加明顯?；純浩綍r喜在地上玩耍，無遺傳及重大疾病家族史。無藥物過敏史。查體：體溫37.8℃，整個左側(cè)上下眼瞼充血、腫脹、睜眼困難。近內(nèi)眥處皮膚可見稀薄分泌物及黃褐色結(jié)痂（圖1a，略）。因明顯觸痛，患兒哭鬧并拒絕進一步觸摸。眼科裂隙燈檢查提示角膜未受累、結(jié)膜充血。由于患兒哭鬧不配合以及家屬擔(dān)心損傷眼睛，我們僅取得少量標(biāo)本用于真菌鏡檢、培養(yǎng)和掃描電鏡。標(biāo)本接種于含氯霉素和放線菌酮的沙堡培養(yǎng)基（SDA）和馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA），以及血瓊脂平板?？赡苡捎跇?biāo)本的原因，直接鏡檢并未發(fā)現(xiàn)菌絲或孢子，但隨后在掃描電鏡下發(fā)現(xiàn)了菌絲和孢子結(jié)構(gòu)（圖2，略）。在PDA和SDA上27℃培養(yǎng)5天后，在接種點都長出了乳白色菌落，但都沒有霉菌樣菌落生長（圖3a，略）。挑取酵母菌落鏡下可見圓形、厚壁孢子，轉(zhuǎn)種至科馬嘉顯色培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)2天后可見淡紫色顯色（圖3b，略）。血瓊脂平板37℃培養(yǎng)12天后未見細菌菌落生長，但在接種點長出黑色菌落（圖4a，略）。取菌落鏡下觀察，可見細長菌絲和孢子。再轉(zhuǎn)種至不含放線菌酮的PDA和SDA上32℃培養(yǎng)7天后，可見白色氣生菌絲和黑色子囊殼，菌落背面顏色呈琥珀色（圖4b，略）。該菌落在麥芽瓊脂培養(yǎng)基上生長更為迅速。根據(jù)該菌的鏡下形態(tài)學(xué)特點（圖4c、d，略）和文獻上的結(jié)構(gòu)描述，此霉菌樣菌落被鑒定為暗褐毛殼菌?；颊咴诮邮芰?天的抗真菌治療后復(fù)診，皮損已明顯好轉(zhuǎn)。再次取皮損進行培養(yǎng)，但在PDA和SDA（含有及未含有放線菌酮）上均未見菌落生長。針對ITS區(qū)和28SrDNA的D1/D2區(qū)進行真菌通用引物擴增，酵母菌落鑒定為盧西坦棒孢（與CBS1944(No.AY493434.1)和EXOC34(No.AY894824.1)同源性分別為99%和100%）。但對霉菌樣菌落進行ITS區(qū)測序，與暗褐毛殼菌的同源相似性僅為88%（No.EF540753.1），考慮與暗褐毛殼菌提交在GenBank上的DNA數(shù)據(jù)較少有關(guān)，但結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定，可證實該霉菌樣菌落為暗褐毛殼菌。該兩種菌在GenBank上的登錄號分別為FJ595482,FJ595483，且暗褐毛殼菌同時也保存于荷蘭真菌生物多樣性中心（CBS123816）。我們利用半定量Api-Zym系統(tǒng)分別對這兩株菌進行了酶活性檢測。從培養(yǎng)2天后的SDA斜面上采集菌落制成菌懸液，取65μl加入含有不同酶底物的凹盤內(nèi)，37℃下孵育4小時。利用β-糖苷酶作為質(zhì)量控制，滅活微生物作為陰性對照。根據(jù)顏色變化程度，由兩名實驗者分別獨立判斷，并重復(fù)實驗一次已保證穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示，部分酶僅在其中一種菌上出現(xiàn)，如N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和β-葡糖苷酶僅出現(xiàn)在暗褐毛殼菌，酸性磷酸酶僅出現(xiàn)在盧西坦棒孢（表1）。同時對兩株菌進行了藥敏試驗，結(jié)果顯示暗褐毛殼菌對伊曲康唑、酮康唑、咪康唑敏感，對氟康唑不敏感，對5-氟胞嘧啶耐藥。對盧西坦棒孢敏感的藥物是酮康唑、咪康唑、氟康唑，對5-氟胞嘧啶仍是耐藥（表2，略）。當(dāng)時由于患兒的情況緊急，在采集標(biāo)本后我們立即給予治療。根據(jù)患兒對抗細菌治療無效且鏡下見到可疑菌絲結(jié)構(gòu)，我們給與伊曲康唑膠囊口服（50mg/天，共7天；接下來隔日50mg，共8天），并囑患兒家屬每天8次外用3%氟康唑溶液沖洗眼睛。在初步診斷及治療后，多個培養(yǎng)上長出的酵母和霉菌樣菌落證實了我們的真菌感染診斷。對盧西坦棒孢和暗褐毛殼菌的微觀和宏觀形態(tài)鑒定也表明我們選擇伊曲康唑口服和氟康唑外用的正確，因此治療繼續(xù)進行?；純航邮芰丝偭?00mg的伊曲康唑口服治療，最終痊愈（圖1b，略）。隨訪1年，未見復(fù)發(fā)。除了常見的條件致病真菌，如念珠菌、曲霉、新生隱球菌和鐮刀菌，一些少見的真菌也被發(fā)現(xiàn)可引起人感染，甚至在免疫缺陷人群導(dǎo)致嚴重感染。其中，毛殼菌和盧西坦棒孢少見引起人感染，尤其皮膚感染，迄今為止，這兩種菌所致感染的報道都是深部真菌感染。盧西坦棒孢，即葡萄牙念珠菌的有性期，可導(dǎo)致約1%的念珠菌侵襲性感染和念珠菌血癥的。葡萄牙念珠菌所致的播散性念珠菌血癥因為對治療反映欠佳，可導(dǎo)致嚴重后果。在骨髓移植或癌癥患者可出現(xiàn)爆發(fā)性真菌血癥，尤其是在對癌癥患者過度使用抗真菌預(yù)防治療的時候。葡萄牙念珠菌對兩性霉素b耐藥是臨床上值得關(guān)注的事情，不過與氟康唑或其他抗真菌藥如5-氟胞嘧啶聯(lián)用可獲得改善。毛殼菌屬包含80多種，絕大多數(shù)的適宜生長溫度為25℃到35℃。從臨床標(biāo)本分離的毛殼菌多被認為是空氣孢子播散導(dǎo)致的污染，確定為人類感染病原體的報道非常少，自1980年以來報道的大概有20余例。在所有的死亡病例里，該菌都是在患者死亡后才分離鑒定出來，這意味著常規(guī)真菌學(xué)方法對該菌鑒定存在困難。Guarro和Serena等對毛殼菌的體外藥敏試驗顯示其對氟康唑和氟胞嘧啶耐藥，酮康唑、伊曲康唑和咪康唑有抑菌活性，但沒有一種藥具有殺菌活性，包括兩性霉素b。目前還沒有針對毛殼菌感染的很好治療方案，這也可能是毛殼菌侵襲感染高死亡率的原因。

我們的案例是一個眼周的嚴重皮膚感染，由于患兒的特殊情況以及眼部取材的特殊性，通過直接鏡檢并未明確找到菌絲或孢子結(jié)構(gòu)。基于患兒抗細菌治療無效和可疑的鏡下菌絲形態(tài)，我們給與了伊曲康唑和氟康唑治療，并且該方案被隨后的病原菌鑒定和療效所證實肯定。由于患兒本身情況，我們無法進行病理活檢，在抗真菌治療后第二次培養(yǎng)也未有菌落生長，但是抗真菌治療療效、分子測序和形態(tài)學(xué)鑒定都表明這是一個混合真菌感染。毛殼菌屬被認為是致病菌，因為在血瓊脂平板上接種劃線處并沒有其他微生物生長。掃描電鏡下能在眼周痂殼標(biāo)本內(nèi)發(fā)現(xiàn)菌絲，也表明毛殼菌并非來自環(huán)境污染。至于在PDA和SDA上未生長，可能因為培養(yǎng)基所含放線菌酮，可抑制毛殼菌的生長。胞外磷脂酶、β-葡糖苷酶和氨基葡糖苷酶具有如溶解細胞質(zhì)的活性，被認為是一些動物病原真菌的毒力因子。不過，關(guān)于盧西坦棒孢和暗褐毛殼菌分泌的酶及其在致病中的作用知之甚少。多種酶的活性可能與其發(fā)病機制有關(guān)，對多種底物進行消化以供給微生物營養(yǎng)，從而導(dǎo)致宿主的組織如皮膚產(chǎn)生損傷。由表1可見，N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和β-葡糖苷酶僅出現(xiàn)在暗褐毛殼菌，酸性磷酸酶僅出現(xiàn)在盧西坦棒孢，這些酶都是發(fā)病機制中的重要毒力因子。這種各自獨有的活性酶的存在也表明盧西坦棒孢和暗褐毛殼菌均參與了本病例的感染過程。環(huán)境霉菌的毒力因子不僅包括酶活性，也與喜溫生長有關(guān)，這也可解釋為何暗褐毛殼菌在27℃不易生長，而在32℃或37℃下生長良好。多數(shù)低致病性環(huán)境真菌，包括許多毛殼菌，都在22℃~25℃下生長良好